NL9301957A - Werkwijze voor het identificeren van micro-organismen, en daarvoor bruikbare hulpmiddelen. - Google Patents

Werkwijze voor het identificeren van micro-organismen, en daarvoor bruikbare hulpmiddelen. Download PDF

Info

Publication number
NL9301957A
NL9301957A NL9301957A NL9301957A NL9301957A NL 9301957 A NL9301957 A NL 9301957A NL 9301957 A NL9301957 A NL 9301957A NL 9301957 A NL9301957 A NL 9301957A NL 9301957 A NL9301957 A NL 9301957A
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
nucleic acid
primers
amplification
dna
electrophoresis
Prior art date
Application number
NL9301957A
Other languages
English (en)
Original Assignee
U Gene Research Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by U Gene Research Bv filed Critical U Gene Research Bv
Priority to NL9301957A priority Critical patent/NL9301957A/nl
Priority to PCT/NL1994/000283 priority patent/WO1995013396A2/en
Publication of NL9301957A publication Critical patent/NL9301957A/nl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Description

Werkwijze voor het identificeren van micro-organismen, endaarvoor bruikbare hulpmiddelen
GEBIED VAN DE UITVINDING
De uitvinding ligt op het gebied van de detectie enidentificatie van micro-organismen en heeft betrekking op eenwerkwijze voor het aantonen en identificeren van micro-organismen in een monster, alsmede op hulpmiddelen voor gebruikin een dergelijke werkwijze.
STAND VAN DE TECHNIEK
De klassieke methode voor het aantonen en identificeren vanmicro-organismen, met name in klinische monsters, zoals urine,feces, sputum en bloed, alsmede in voedingsmiddelen, gebeurtdoor kweken in verrijkings- en selectieve media, gevolgd doorbiochemische identificatie.
Soms is de biochemische identificatie, die op de kweek-stappen volgt, vervangen door een immunologische identificatiemet behulp van antilichamen, zoals in een Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) of een Enzyme Immuno Assay (EIA), of dooreen genetische identificatie met behulp van bacteriesoort-specifieke DNA probes in een hybridisatie analyse of bacterie-soort-specifieke primers in een polymerase chain reactie (PCR).
Een belangrijk nadeel van de kweekstappen, die nodig zijnvoordat de bacteriën kunnen worden geïdentificeerd, is huntijdrovende karakter. Sommige bacteriën, zoals Mycobacteriumtuberculosis, vereisen enkele weken kweek.
In principe kan de PCR, die een in vitro amplificatiebehelst, gebruikt worden om de kweekstappen te verkorten ofzelfs overbodig te maken. Hiervoor is echter nodig, indiensoort-specifieke primers worden gebruikt, dat men op voorhand dein het monster te zoeken bacteriesoort kent, want anders zullende soort-specifieke primers een negatief resultaat geven.
Indien men daarentegen gebruik maakt van universeleprimers, d.w.z. primers die gekozen zijn binnen evolutionairgeconserveerde DNA sequenties, verkrijgt men wel een positiefresultaat, maar geen identificatie (zie K. Chen, H. Neimark, P. Rumore, C.R. Steinman. 1989. Broad range DNA probes fordetecting and amplifying eubacterial nucleic acids. FEMSMicrobiology Letters 57:19-24).
Door Chen et al zijn DNA hybridisatie probes gebruikt diehomoloog zijn met geconserveerde delen van bacterieel 16Sribosomaal RNA (rRNA) sequenties. Het gebruik van deze 16S rRNAgen sequenties heeft een aantal voordelen. Het 16S rRNA genwordt in alle bacteriën aangetroffen. Het gen bestaat uitgeconserveerde delen, die onderbroken worden door soort¬specifieke sequenties. Over het algemeen zijn er meerderekopieën van het gen aanwezig in de bacteriële cel. Hierdoor kaneen betere/hogere gevoeligheid gehaald worden in verhouding totniet-ribosomale sequenties.
Als alternatief kan het rRNA zelf gebruikt worden als basisvoor amplificatie. Hiertoe dient dan wel eerst een DNA kopie vanhet rRNA gemaakt te worden. Dit kan met behulp van een reversetranscriptase, zoals avian myeloblastosis virus reverse trans¬criptase (AMV-RT), of een thermostabiel DNA polymerase dat dezeactiviteit bezit, bijvoorbeeld Tth-polymerase. Dit leidt tot eenverdere verbetering van de gevoeligheid, omdat er tot 10.000kopieën van het rRNA in de bacteriële cel aanwezig kunnen zijn.
De gebruikte hybridisatie probes of primers zijn gerichttegen sequenties, die niet bij eukaryoten (ergo ook .niet bij demens) gevonden worden. Deze primers kunnen dus gebruikt worden voor het aantonen van de aanwezigheid van onbekende bacteriën ineen monster.
Voor een gerichte behandeling van patiënten met bijv.antibiotica is het echter noodzakelijk om de identiteit van debacteriën te kennen. Om de bacteriën te identificeren zal hetzijde nucleotidensequentie bepaald moeten worden, hetzij hetgeamplificeerde product van de PCR gehybridiseerd moeten wordenmet een groot aantal soort-specifieke DNA probes.
De eerstgenoemde methode (bepaling van de nucleotiden¬sequentie) is tijdrovend en kostbaar.
De methode, waarbij gebruik gemaakt wordt van specifiekeprobes, die hybridiseren met de soort-specifieke delen van degeamplificeerde rRNA sequentie, is beschreven voor een(theoretische) PCR-gebaseerde assay voor het vaststellen vanbacteremie door Roche Molecular Systems (D.ü. Leong. 1992.
Design of a PCR assay for the rapid detection of bacteremia.Infection in Medicine 7:43-48).
Een nadeel van deze methode is dat men moet beschikken overeen groot aantal (tientallen) soort-specifieke probes om deverschillende bacteriesoorten te kunnen identificeren. Het doorLeong beschreven systeem is dan ook nog niet in de praktijkgebracht.
Snelle identificatie, bijvoorbeeld bij bacteremie ofnekkramp, is vaak gewenst en zowel de bekende kweekmethode alsde huidige DNA technologie geven geen praktische oplossing voordit probleem.
KORTE SAMENVATTING VAN DE UITVINDING
De onderhavige uitvinding verschaft een werkwijze voor hetidentificeren van een in een monster aanwezig micro-organisme,omvattende het onderwerpen van in het monster aanwezig nucleïnezuurvan het micro-organisme aan nucleïnezuur amplificatie ondertoepassing van een of meer sets van universele primers, diegebaseerd zijn op een gen van het te identificeren micro- organisme dat zowel geconserveerde als variabele gebieden omvat,waarbij de primers gekozen zijn in geconserveerde gebieden dieeen variabel gebied insluiten, het in enkelstrengs vorm brengen van het produkt van denucleïnezuur amplificatie, het onderwerpen van het in enkelstrengs vorm gebrachteamplificatieprodukt aan een elektroforese welke in staat is omenkelstrengs nucleïnezuren van gelijke lengte van elkaar tescheiden op grond van verschillen in nucleotidensequentie, het detecteren van het geëlektroforeerde nucleïnezuur, enhet vergelijken van de positie van het geëlektroforeerdenucleïnezuur met die van een set referentie-nucleïnezuren vanbekende micro-organismen.
De micro-organismen kunnen bacteriën, virussen, fungi,actinomyceten of eencellige parasieten zijn, maar bestaan bijvoorkeur uit bacteriën.
De sets van universele primers zijn in het geval van deidentificatie van bacteriën bij voorkeur gebaseerd op het 16SrRNA gen van bacteriën. Een zeer geschikte set van primers isgebaseerd op de gebieden 1173-1192 en 1370-1389 van het 16S rRNAgen en bestaat dan bij voorkeur uit de primers ER1: AGG CCC GGG AAC GTA TTC AC [SEQ ID NO:l], enER2: GAG GAA GGT GGG GAT GAC GT [SEQ ID NO:2].
Het heeft overigens de voorkeur, vanwege een optimalespecificiteit en differentiatie tussen verschillende soorten vanbacteriën, dat in de nucleïnezuur amplificatie ten minste tweesets van primers worden gebruikt. De meerdere sets van primerskunnen tegelijk in een multiplex amplificatie worden toegepast.Meerdere sets van primers kunnen ook worden toegepast in een’nested' nucleïnezuur amplificatie waarbij een eersteamplificatie met een eerste set primers wordt gevolgd door eentweede amplificatie met een tweede set primers, waarbij deprimers van de tweede set gebaseerd zijn op gebieden die tussendie van de eerste set primers zijn gelegen. Een dergelijke 'nested' nucleïnezuur amplificatie leidt tot een verbeterdedetectie limiet (gevoeligheid).
De nucleïnezuur amplificatie bestaat bij voorkeur uit eenpolymerase chain reactie (PCR) onder toepassing van een DNApolymerase, meer in het bijzonder een thermostabiel DNApolymerase, zoals Taq-polymerase, Vent-polymerase, Tth-polymerase, of SuperTag-polymerase (Superrag is een merknaam).Bij voorkeur wordt het DNA polymerase onderworpen aan eenvoorbehandeling waardoor contaminerend DNA en/of RNA wordtverwijderd.
Het target nucleïnezuur bestaat in de PCR uit DNA, te wetengenomisch DNA van het micro-organisme (zoals het 16S rRNA gen)of cDNA, gesynthetiseerd door reverse transcriptie van RNA vanhet micro-organisme (zoals uit het 16S rRNA zelf gesynthetiseerdCDNA).
De nucleïnezuur amplificatie kan echter ook wordenuitgevoerd volgens een transcription-based amplification system(TAS), zoals volgens een self-sustained sequence replication(3SR) reactie, een nucleic acid system based amplification(NASBA) of een template mediated amplification (TMA). Het targetnucleïnezuur kan in dat geval uit RNA of DNA van het micro-organisme bestaan.
Werkwijzen volgens het transcription-based amplificationsystem (TAS) omvatten een DNA synthese stap en een RNAtranscriptie stap. In de werkwijze wordt een oligonucleotideprimer, die een polymerase binding site (een promotor) bevat,gehybridiseerd met een target RNA molekuul of een gedenatureerdtarget DNA molekuul. Na de hybridisatie van de primer aan hettarget molekuul wordt door reverse transcriptie met behulp vanreverse transcriptase een cDNA streng gesynthetiseerd. Nadenaturatie (door verwarming) wordt een tweede oligonucleotidemet het nieuw gesynthetiseerde cDNA gehybridiseerd. Door opnieuwreverse transcriptase (of DNA polymerase) toe te voegen wordteen dubbelstrengs DNA molekuul gesynthetiseerd. Door een RNApolymerase toe te voegen worden vervolgens RNA kopieën gegenereerd. Vier cycli van dit proces zijn voldoende om eenmiljoen-voudige amplificatie te realiseren.
De self-sustained sequence replication (3SR) methode is eenmodificatie van TAS. Het belangrijkste verschil is dat de 3SRwerkwijze isotherm (37-42°C) wordt uitgevoerd en dat het RNAtarget wordt afgebroken. RNase H wordt gebruikt om het RNA inhet (door het reverse transcriptase gevormde) RNA-cDNA hybridemolekuul af te breken en daardoor een omzetting van het cDNA ineen dubbelstrengs DNA molekuul mogelijk te maken. Alsbijzonderheid wordt hier ook in de tweede primer een promotorsequentie aangebracht zodat transcriptie vanaf twee uiteindenvan het dubbelstrengs DNA molekuul kan verlopen. Het RNA, dat indeze reactie ontstaat, wordt weer omgezet in een RNA-cDNAhybride molekuul, zodat de reactie zichzelf in stand houdt. In15 minuten wordt ongeveer een honderdduizend-voudige RNAamplificatie bereikt.
Ten behoeve van de detectie van het geamplificeerde engeëlektroforeerde nucleïnezuur kunnen tijdens de nucleïnezuuramplificatie gelabelde primers of gelabelde nucleotiden wordentoegepast. Bijvoorbeeld kunnen radioactief gelabelde primers ofnucleotiden worden toegepast, of primers, die met een fluoro-chroom, een chemiluminescente stof, biotine of digoxigeninegelabeld zijn.
Het geamplificeerde en geëlektroforeerde nucleïnezuur kan,indien het niet gelabeld is, worden gedetecteerd door kleuring,bijvoorbeeld door zilverkleuring, ethidiumbromidekleuring ofStains-all kleuring.
Voor de elektroforese van enkelstrengs nucleïnezuur wordtbij voorkeur gebruik gemaakt van een polyacrylamide gel elektro¬forese onder niet-denaturerende condities.
Indien het produkt van de amplificatie uit dubbelstrengsDNA bestaat, wordt dit bijv. door verhitting in enkelstrengsvorm gebracht voordat het aan de genoemde elektroforese wordtonderworpen. Indien het produkt van de amplificatie uit enkelstrengs RNA bestaat, kan dit rechtstreeks aan de genoemdeelektroforese worden onderworpen.
Het in het monster aanwezige nucleïnezuur van het micro-organisme wordt bij voorkeur uit het monster geïsoleerd voordathet aan nucleïnezuur amplificatie wordt onderworpen. Het monsterkan bijv. bestaan uit een klinisch monster, zoals urine, feces,sputum of bloed, of een voedingsmiddel.
De uitvinding verschaft ook een hulpmiddel, geschikt voorgebruik in de nieuwe werkwijze volgens de uitvinding, omvattendeeen verzameling elektroforese patronen van nucleïnezuren van alsreferentie dienende micro-organismen.
Voorts verschaft de uitvinding een verzameling van hulp¬middelen, geschikt voor gebruik in de nieuwe werkwijze volgensde uitvinding, omvattende een nucleïnezuur amplificatie kit met een of meer sets vanuniversele primers, die gebaseerd zijn op een gen van het teidentificeren micro-organisme dat zowel geconserveerde alsvariabele gebieden omvat, waarbij de primers gekozen zijn ingeconserveerde gebieden die een variabel gebied insluiten, een elektroforese kit voor een elektroforese welke in staatis om enkelstrengs nucleïnezuren van gelijke lengte van elkaarte scheiden op grond van verschillen in nucleotidensequentie,middelen voor het detecteren van gelabeld of ongelabeldgeëlektroforeerd nucleïnezuur, en een verzameling elektroforese patronen van nucleïnezurenvan als referentie dienende micro-organismen.
GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING
De onderhavige uitvinding maakt gebruik van PCR (of eenandere nucleïnezuur amplificatie methode) onder toepassing vangeschikt gekozen universele primers, gecombineerd met eenelektroforese van het amplificatie produkt, waarin sequentie-afhankelijke verschillen in mobiliteit ("Sequence DependentDifferences in Mobility" [SDDM]) van enkelstrengs DNA (ssDNA)optreden.
Overigens is recent een soortgelijke werkwijze, de PCR-enkelstrengs DNA conformatie polymorfisme methode (PCR-single-stranded conformation polymorphism [PCR-SSCP]), als eenmogelijke werkwijze voor het aantonen van punt-mutatiesbeschreven (M. Orita, H. Iwahana, H. Kanazawa, K. Hayashi, T. Sekiya. 1989. Detection of polymorphisms of human DNA by gelelectrophoresis as single-strand conformation polymorphisms.Proceedings National Academy of Sciences USA 86:2766-2770).
PCR-SSCP is ontworpen voor het aantonen van éen enkelepuntmutatie. De PCR-SSCP kijkt naar een kleine verandering in demobiliteit van het ssDNA met de punt-mutatie ten opzichte van'wild-type' ssDNA. Deze techniek wordt gebruikt voor hetaantonen van éen enkele punt-mutatie in oncogenen en bijerfelijke ziekten.
De DNA sequentie, die een mogelijke puntmutatie bevat,wordt eerst geamplificeerd met behulp van de PCR. Hetgeamplificeerde produkt wordt vervolgens gedenatureerd tot tweeenkelstrengs DNAs en geanalyseerd met behulp van niet-denaturerende polyacrylamide gel electroforese.
Onder niet-denaturerende condities heeft het DNA eensecondaire structuur die het gevolg is van de nucleotiden-sequentie en de samenstelling van de oplossing waarin het DNAzich bevindt. Een verandering in de nucleotidensamenstellinghoeft echter niet altijd een verandering in de secondairestructuur tot gevolg te hebben. De mobiliteit van het ssDNAtijdens gel electroforese hangt af van de gevormde secondairestructuur. Het valt niet te voorspellen hoe de secondairestructuur de mobiliteit beïnvloedt. De verwachte verandering inmobiliteit is echter gering omdat de lengte van het ssDNAfragment een overheersende rol in de bepaling van de mobiliteitspeelt.
In een aantal gevallen is het dan ook niet mogelijk omondanks de aanwezigheid van een punt-mutatie een verschil inmobiliteit te vinden (K. Hayashi. 1992. PCR-SSCP: A method for detection of mutations. Genetic Analysis Techniques andApplications 9:73-79).
Volgens de uitvinding wordt een dergelijke elektroforesestap gebruikt voor het identificeren (i.e. het benoemen) vanbacteriesoorten, niet voor het aantonen van éen enkele punt-mutatie zoals in PCR-SSCP gebeurt.
Het principe van de onderhavige methode (PCR-SDDM) voor hetidentificeren van bacteriën is als volgt. Met behulp vanuniversele primers, die in geconserveerde gebieden van het 16SrRNA gen gekozen zijn, wordt een DNA sequentie geamplificeerd,die een soort-specifieke sequentie insluit. Het geamplificeerdeDNA wordt gedenatureerd (in enkelstrengs vorm gebracht) enonderworpen aan niet-denaturerende gel electroforese.
Verondersteld wordt dat de soort-specifieke sequentieaanleiding geeft tot verschillende secondaire structuren enmobiliteiten in de gel. Door de mobiliteit van een bepaald ssSNAten opzichte van éen of meerdere referentie DNA moleculen ofmerkers (markers) vast te stellen en deze te relateren aan eendata bestand met de mobiliteit van ssDNAs afkomstig van bekendebacteriesoorten, kan de identiteit van de onbekende bacterievastgesteld worden.
In tegenstelling tot de (klassieke) PCR-SSCP wordt nietgekeken naar de aan- of afwezigheid van éen enkele punt-mutatiedoor een geringe mobiliteitsverandering van een ssDNA molecuulten gevolge van deze mutatie vast te stellen, maar naar demobiliteit van een (in principe willekeurig) ssDNA molecuul tenopzichte van een set merkers om vervolgens aan de hand van dezemobiliteit de identiteit van een bacterie vast te stellen.
Detectie methoden
Voor het detecteren van het geëlektroforeerde DNA or RNAkan een kleuringstechniek worden gebruikt, bijvoorbeeld eenzilverkleuring of een ethidiumbromidekleuring. Naast dezekleuringsmethoden zijn er in de literatuur nog een groot aantalandere kleuringen voor het aantonen van DNA of RNA in gels beschreven. Een aantal van deze methoden is ook geschikt voorhet aantonen van ssDNA in PCR-SDDM.
Een alternatieve kleuring is met Stains-all [l-ethyl-2-(1-ethylnaphthol[1,2-d]thiazolin-2-ylidene)-2-methylpropenyl]naphthol[l,2-d]thiazoliumbromide; Sigma, St. Louis, MO).
Directe labelling van het PCR product is mogelijk doorgebruik te maken van radio-activiteit, fluorochromen, chemi-luminescentie labels, biotine en digoxigenine systemen.
Indien de PCR reactie wordt uitgevoerd bij aanwezigheid vaneen geschikt radio-actief label zoals 35S, 32P, 33P-deoxynucleotide trifosfaten (dNTP) of 32P, 33P-gelabelde primerskan het ssDNA band patroon worden vastgelegd met autoradiografieof een β-scanner. Het autoradiogram kan vervolgens met eenscanner ingelezen worden in de computer en met geschikte soft¬ware geanalyseerd. Hierdoor is een directe toekenning van eensoortnaam aan een ssDNA banden patroon mogelijk. De gegevens vaneen β-scanner kunnen over het algemeen direct voor analyse in decomputer ingevoerd worden.
Het gebruik van chemiluminescente labels, bijvoorbeeldacridinium esters, is alleen mogelijk in combinatie met primers(de primers worden dus gelabeld, want de aanwezigheid van hetlabel heeft invloed op de mobiliteit). De chemiluminescentiewordt of met een film vastgelegd of door middel van een camerasysteem. In beide gevallen kunnen de data met behulp vancomputer apparatuur geanalyseerd worden.
Labelling van de primers met een fluorochroom, bijv.fluoresceine isothiocyanaat (FITC) (het fluorochroom heeftinvloed op de mobiliteit van het ssDNA), heeft belangrijkevoordelen. Electroforese en analyse van de resultaten kunnen dangekoppeld worden door gebruik te maken van een automatische DNAsequencer. Het principe van een automatische DNA sequencer isdat met een geschikt fluorochroom gelabelde DNA moleculen dooreen polyacrylamide gel geëlectroforeerd worden. Onder aan de gelwordt het fluorochroom aangestraald met laserlicht van eengeschikte golflengte. De fluorescentie intensiteit wordt bepaald en doorgegeven aan een computer. De tijd die een DNA molecuulnodig heeft om de laser te passeren is hier een maat voor demobiliteit.
Het gebruik van biotine en digoxigenine systemen is welmogelijk maar minder praktisch, omdat na de gel electroforesehet DNA overgeblot moet worden naar een nitrocellulose of nylonmembraan. Na het blotten wordt de positie van de DNA fragmentenzichtbaar gemaakt door de blot te incuberen met een conjugaatvan een enzym en hetzij avidine hetzij een anti-digoxigenineantilichaam, gevolgd door de omzetting van een substraat van hetin het conjugaat gebruikte enzym.
Alternatieven tijdens en voor de PCR
PCR amplificatie kan, behalve met Tag-polymerase, ook metandere thermostabiele DNA polymerases uitgevoerd worden, bijv.Vent-polymerase, Ttii-polymerase, Super Tag-polymerase. Doorgebruik te maken van andere preparaten met thermostabiele DNApolymerases is het vaak mogelijk om contaminatie van hetpolymerase preparaat met DNA of RNA, afkomstig van de voorisolatie van het polymerase gebruikte bacteriële cel, tevoorkomen. In voorkomende gevallen zal het noodzakelijk zijn omhet preparaat met de thermostabiele DNA polymerase te behandelenmet DNase of RNase om contaminerend DNA of RNA te verwijderen.DNase wordt vervolgens door een hitte-behandeling geïnactiveerd.Het RNase kan geïnactiveerd worden door het toevoegen van eenremmer zoals RNasine.
De differentiatie tussen verschillende bacteriesoorten(specificiteit) kan verbeterd worden door een tweede set primerste gebruiken. In principe is het mogelijk om beide sets primerstegelijk te gebruiken (multiplex PCR), waardoor er meer dan éenDNA fragment tegelijk wordt geamplificeerd.
De detectie limiet van het systeem (gevoeligheid) kanverbeterd worden door een zogeheten "nested PCR” uit te voeren.Bij deze opzet worden eveneens twee sets primers gebruikt. Detweede set primers ligt dan tussen de posities van de primers in de eerste set. De eerste set wordt bijv. gedurende 30 cycligebruikt en een deel van het PCR monster wordt vervolgens vooreen tweede amplificatie van 30 of 35 cycli met de tweede setprimers gebruikt.
In plaats van DNA is het ook mogelijk om RNA als "target"sequentie te gebruiken. Het gebruik van het rRNA heeft alsvoordeel dat er tot 10.000 kopieën per cel aanwezig kunnen zijn.Het rRNA wordt dan met behulp van reverse transcriptase omgezetin een cDNA, dat vervolgens dient als uitgangsmateriaal voor debovenbeschreven PCR methoden.
Een alternatieve methode is echter de 3SR methode (T.R.Gingeras, K.M. Whitfield, D.Y. Kwoh. 1990. Unique features ofthe self-sustained sequence replication (3SR) reaction in the invitro amplification of nucleic acids. Ann. Biol. Clin. 48: 498501; J.C. Guatelli, K.M. Whitfield, D.Y. Kwoh, K.J.
Barringer, D.D. Richman, T.R. Gingeras. 1990. Isothermal, invitro amplification of nucleic acids by a multi-enzyme reactionmodeled after retroviral replication. Proceedings NationalAcademy of Sciences USA 87:1874-1878) en de "nucleic acid systembased amplification" (NASBA) (T. Kievits, B. van Gemen, D. vanStrijp, R. Schukking, M. Dircks, H. Adriaanse, L. Malek, R.Sooknanan, P. Lens. NASBA™ isothermal enzymatic in vitro nucleicacid amplification optimized for the diagnosis of HIV-1infection. 1991. Journal of Virological Methods 35:273-286).
Het principe van 3SR en de NASBA is vergelijkbaar en beidezijn afgeleid van het transcription-based amplification system(TAS) (D.Y. Kwoh, G.R. Davis, K.M. Whitfield, H.L. Chapelle, L.J. Di Michele, T.R. Gingeras. 1989. Transcription-basedamplification system and detection of amplified humanimmunodeficiency virus type 1 with a bead-based sandwichhybridization format. Proceedings National Academy of SciencesUSA 86:1173-1177).
Kort weergegeven is het principe van de NASBA als volgt.
Met behulp van een specifieke primer Pl, die aan de 5'-kant eenT7 promotorsequentie bezit, wordt onder toepassing van AMV- reverse transcriptase (AMV-RT) een dubbelstrengs DNA-RNA hybridegemaakt van het target RNA molecuul. RNase H breekt vervolgensde RNA streng van dit hybride af. De tweede specifieke primer P2kan met het ontstane ss-cDNA hybridiseren (annealen) en de DNA-afhankelijke DNA polymerase activiteit van AMV-RT maakt het ss-cDNA dubbelstrengs. Het product is een dubbelstrengs DNAmolecuul met een T7 promotor. Door het gebruik van T7 RNApolymerase ontstaat een 100 tot 1000-voudige toename van hetspecifieke RNA. Dit RNA kan weer gebruikt worden door AMV-RTvoor het genereren van nieuwe cDNA moleculen. Hierdoor onstaateen cyclische fase en een enorme toename van de hoeveelheid RNA.Het hele proces speelt zich af bij bijv. 41°C. Het RNA productwordt uiteindelijk gedetecteerd c.q. geanalyseerd. Met enkelekleine modificaties kan ook dubbelstrengs DNA in plaats van RNAals uitgangsmateriaal dienen.
Het NASBA systeem heeft als mogelijk bijkomend voordeel dathet RNA gebruikt wordt voor SDDM identificatie. Voor SSCP isbeschreven dat het gebruik van RNA tot grotere verschillen inmobiliteit leidt (G. Sarkar, H.-S. Yoon, S.S. Somer. 1992.Screening for mutations by RNA single-strand conformationpolymorphism (rSSCP): comparison with DNA-SSCP. Nucleic Acidsresearch 20:871-878).
Detectie van andere micro-orqanismen
Hoewel de belangrijkste toepassing van de uitvinding zalbestaan uit het identificeren en van elkaar onderscheiden vanbacteriesoorten (species), is de uitvinding ook bruikbaar voorhet onderscheiden van genera of van stammen.
Behalve voor de identificatie van bacteriën is de methodein principe ook geschikt voor de identificatie van schimmels(fungi, actinomyceten) en eencellige parasieten. De universeleprimers die hierin beschreven zijn, kunnen echter niet gebruiktworden, omdat eukaryoten het voor de bacteriën gekozen soort¬specifieke deel van het rRNA missen. Schimmels hebben geeninserties in de rRNA sequentie ten opzichte van humaan (zoogdier) rRNA. Wel kunnen soort-specifieke sequenties wordenaangewezen, die geflankeerd worden door geconserveerdesequenties, waar universele eukaryote primers gekozen kunnenworden. Contaminatie van de monsters door humaan rRNA of rRNADNA leidt echter tot extra producten in de PCR-SDDM, die deinterpretatie van de gegevens kunnen beïnvloeden. Voor sommigeparasieten, zoals Plasmodium (de veroorzaker van malaria), zijnwel unieke inserties in het rRNA beschreven, maar in zulkeomstandigheden ligt het meer voor de hand om met Plasmodiumspecifieke primers kijken. Ook hier zal men dus voornoemdeuniversele eukaryote primers moeten gebruiken.
Toepassing van de onderhavige methode bij virussen wordtbemoeilijkt door de sterke heterogeniteit van virussen. Dezehebben over het algemeen geen gemeenschappelijke sequenties. Eenuitzondering vormen enterovirussen, waarvoor universele primersbeschreven zijn.
De onderhavige werkwijze zal echter bij virussen welgebruikt kunnen worden voor (epidemiologische) typering vanisolaten, bijv. voor het onderscheiden van verschillendeserotypen van adenovirus, human papilloma virus (HPV) en humanimmunodeficiency virus type 1 en 2 (HIV). In dergelijke gevallenzullen species-specifieke primers gebruikt moeten worden diestam-specifieke sequenties insluiten.
Kwantitatieve PCR-SDDM
De PCR-SDDM kan aangepast worden om kwantitatief dehoeveelheid DNA c.q. RNA in een monster te bepalen en daarmeehet aantal micro-organismen dat aanwezig is. Dit kan bijv.belangrijk zijn bij de kwaliteitsbewaking van water of hetvolgen van anti-microbiële therapie. Hiertoe dient voor de PCRstap een bekende hoeveelheid DNA respectievelijk RNA toegevoegdte worden. Het PCR product moet echter wel een andere mobiliteitin de gel hebben dan het te kwantificeren DNA. Door hetverkregen signaal te meten (radio-activiteit: meten van α, β ofγ-straling of densitometrie op het autoradiogram; fluorochroom: fluorescentie intensiteit; zilverkleuring en ethidiumbromide:densitometrie) en te relateren aan het signaal dat verkregenwordt met bekende hoeveelheden DNA c.q. RNA, die voor de PCRgebruikt worden, is de in het monster aanwezige hoeveelheid DNAc.q. RNA te bepalen en daarmee het aantal micro-organismen.
VOORBEELDEN
Monster voorbereiding bii gebruik van.lossekolonies of rein- cul£ur.e.s.
Gram-negatieve bacteriën werden overnacht op bloed agarplaten gekweekt bij 37°C, vervolgens van de platen geschraapt engelyseerd in gedeïoniseerd water met 5-10% chelex 100 (Biorad,Richmond, CA) door 5 minuten bij 95°C te verhitten.
Gram-positieve bacteriën werden in 0,01% natriumdodecyl-sulfaat (SDS) en 5-10% chelex 100 gelyseerd door 5 minuten op95°C te verhitten. Na de lysis werd 0,5% Nonidet P-40 (Sigma,
St. Louis, MO) toegevoegd om remming van het Tag-polymerase doorSDS te voorkomen.
Bloedmonster voorbereiding voor detectie bacteremia met behulpvan de PCR
De monster voorbereiding bestond uit lysis van de bloed¬cellen gevolgd door een filterconcentratie van eventueelaanwezige bacteriën. Met behulp van deze methode konden(relatief) grote volumina bloed gelyseerd worden. Tenminste 2 mlbloed kon met deze methode opgewerkt worden.
EDTA of citraat bloed werd 1:1 verdund met 1% Nonidet P40(NP40; Sigma, St. Louis, MO) en ingevroren. Na ontdooien werdhet monster 5 minuten bij 4000 x g en een temperatuur van +4°Cgecentrifugeerd. De pellet werd één keer gewassen met 0,5% NP40,en vervolgens gedurende 5 minuten bij 4000 x g gecentrifugeerd,waarna één keer met fysiologisch zout gewassen en vervolgens 5minuten bij 4000 x g gecentrifugeerd werd. De verkregen pelletwerd geresuspendeerd in 200 μΐ 1 x PCR buffer (10 mM Tris-HCl(pH 8,3), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 0,01% (gewicht/volume) gelatine) en 15 minuten geïncubeerd met 300 μg DNase I bij 37°C.Hierna werd de suspensie door een 0,22 μιη Duraporemembraanfilter (GVHP filter) (Millipore, Bedford, MA)gefiltreerd, en het filter werd vervolgens twee keer gewassenmet fysiologisch zout. Het filter werd naar een 0,5 mleppendorfbuisje overgebracht en de eventueel aanwezige bacteriënwerden in 50 μΐ 5%-10% chelex in gedeïoniseerd water gèlyseerddoor 10 minuten bij 95°C te verhitten. Na een centrifugatie van30 seconden bij ongeveer 12.000 x g werd 20 μΐ van hetsupernatant gebruikt voor PCR amplificatie.
PCR
De PCR werd gedurende 35 cycli uitgevoerd met primersgericht tegen geconserveerde 16S rRNA gen sequenties (Chen et al1989, FEMS Microbiology Letters 57: 19-24).
ER1: AGG CCC GGG AAC GTA TTC AC (nucleotide no. 1173-1192) enER2: GAG GAA GGT GGG GAT GAC GT (complementair aan nucleotideno. 1370-1389) .
Elke cyclus bestond uit 1 minuut 94°C, 10 seconden 72°C, 1minuut 55°C. Het PCR reactie mengsel (50 μΐ) bestond uit: 10 mMTris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 0,01% (gewicht/volume) gelatine, 100 μΜ van elke primer, 1 U Taq-polymerase (Perkin-Elmer Cetus, Emmeryville, CA) en 100 μΜ vanelke dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).
Amplificatie van het target DNA resulteerde in een DNAfragment van ongeveer 218 bp (kleine verschillen afhankelijk vande bacteriesoort zijn mogelijk).
Analyse met behulp van gel electroforese
Na amplificatie werd 5-10 μΐ van het PCR mengsel toegevoegdaan 5 μΐ sequencing monster buffer (95% formamide, 5 mM EDTA,0,05% broomfenolblauw en 0,05% xyleen cyanol FF) en 5 minutenbij 95°C verhit. Het gedenatureerde DNA werd vervolgens directop ijs geplaatst en na 10 minuten op een gel gebracht vooranalyse.
Analyse werd uitgevoerd met drie verschillende typen poly¬acrylamide gelen. In alle gevallen werd 10% glycerol toegevoegdom de resolutie te verbeteren. De gebruikte geltypen zijn:
- 6% bisacrylamide/acrylamide (1 : 29), 0,05% ammoniumpersulfaaten 0,005% TEMED in 54 mM Tris, 54 mM boraat, 1,2 mM EDTA
(0,6xTBE pH 8,3).
- 6% hydrolink longranger gel (JT Baker, Deventer, Nederland),0,05% ammoniumpersulfaat en 0,005% TEMED in 54 mM Tris, 54 mMboraat, 1,2 mM EDTA (Ο,βχΤΒΕ pH 8,3).
- 0,5 x MDE (Mutation Detection Enhancement) gel (JT Baker),0,05% ammoniumpersulfaat en 0,005% TEMED in 54 mM Tris, 54 mMboraat, 1,2 mM EDTA ( Ο,βχΤΒΕ pH 8,3 ).
Bij gebruik van polyacrylamide gelen en longranger gelenwerd met spacers van 0,4 mm een betere resolutie verkregen danmet spacers van 0,75 mm.
Electroforese werd uitgevoerd bij kamertemperatuur met 0,6x TBE buffer bij 1,5 W constant vermogen gedurende 1,5-2 uurvoor een 6 x 8 cm gel en bij 5 W constant vermogen gedurende 3-4uur voor een 20 x 20 cm gel.
Na de electroforese werd de positie (een maat voor demobiliteit) van het ssDNA in de gel vastgesteld met ethidium-bromidekleuring of zilverkleuring.
De ethidiumbromidekleuring werd als volgt uitgevoerd. Degel werd 5 minuten ondergedompeld in een oplossing van 1 μg/mlethidiumbromide in 0,6 x TBE buffer en vervolgens ontkleurd in0,6 x TBE gedurende 15 min. DNA banden werden zichtbaar gemaaktmet UV-licht.
Bij de zilverkleuring werden de gelen eerst gefixeerd in50% methanol gedurende 30 minuten bij 37°C en vervolgens tweemaal gewassen met gedeïoniseerd water. De gelen werden voor 15-30 minuten behandeld bij 37°C met 0,1% zilvernitraat, 0,056%NaOH en 0,375% NH4OH. Kleurontwikkeling vond plaats doorincubatie met 0,005% citroenzuur en 0,019% formaldehyde. Degelen werden gewassen met gedeïoniseerd water en de kleur¬ontwikkeling werd gestopt met 50% methanol en 5% azijnzuur.
Volgens een alternatieve zilverkleuringsmethode werden degelen eerst gefixeerd in 10% azijnzuur gedurende 20 minuten envervolgens drie maal gewassen met gedeioniseerd water gedurende2 minuten. De gelen werden 30 minuten behandeld metzilvernitraat (1 g/1), 1,5 ml 37% mierezuur per liter. De gelwerd gedurende 20 seconden gewassen met gedeioniseerd water.Kleurontwikkeling vond plaats door 2-5 minuten incubatie met 30g/1 natriumcarbonaat, 1,5 ml 37% mierezuur per liter en 2 mg/1Na2S2Ü3.5H2O. De kleurontwikkeling werd gestopt door de gelengedurende 5 minuten met 10% azijnzuur te behandelen. Alleincubaties werden bij kamertemperatuur uitgevoerd.
Resu.1hat-.en: De methode werd toegepast op 57 bacteriestammen gekozen uit 27 soorten en 15 geslachten. Dit resulteerde in 22verschillende ssDNA band patronen zoals weergegeven in Tabel 1.
Tabel 1. De verschillende ssDNA band patronen verkregen bijanalyse van verschillende bacteriesoorten.
patroon soort_aantal stammen getast 1 Staphylococcus epldermidis 3 2, 3 Staphylococcus aureus 3 4 Klebsiella oxytoca 2 5 Klebsiella pneumoniae 3 6 Enterobacter cloacae 3 I Enterobacter aerogenes 2 7 Enterobacter agglomerans 1 7 Enterobacter gergovia 1 8 Proteus vulgaris 3 8 Proteus mirabilis 2 9 Citrobacter freundii 2 10 Escherichia coli 6 10 Salmonella choleraesuis 4 10 Shigella dysenteriae 1 10 Shigella flexneri 1 II Listeria monocytogenes 1 11 Listeria innocua 1 12 Enterobacter sakazaki 1 13 Bacteroides fragilis 1 14 Acinetobacter calcaoceticus 2 15 Clostridium difficile 2 16 Morganella morganii 2 17 Streptococcus groep A 2 18 Pseudomonas fluorescens 1 19,20 Pseudomonas putida 1 21 Pseudomonas malthophilia 3 22 Pseudomonas aeruginosa 3
De ssDNA band patronen waren soort-specifiek, behalve datde geteste Proteus spp. hetzelfde patroon te zien gaven. Dit wasook het geval voor de Listeria spp.f enkele van de Enterobacterspp. en de Escherichia coli/Salmonella choleraesuis/Shigellagroep. De identieke patronen voor Listeria monocytogenes enListeria innocua waren te verwachten gezien het feit dat deaanwezigheid van enkele virulentie genen het enige verschilvormt tussen beide soorten. Ook de identieke patronen tussenEscherichia coli en Shigella spp. waren te verwachten omdatbeide soorten op genetisch niveau ±99% identiek zijn en dus tot1 en dezelfde soort gerekend moeten worden. De overeenkomst vanEscherichia-coli met Salmonella choleraesuis was minderverwacht, hoewel beide soorten zeer nauw verwant zijn.
Om een goed onderscheid tussen de Proteus spp., deEnterobacter spp. van patroon 7 en de Salmonellacholeraesuis/Escherichia coli groep te maken, is mogelijk eenbetere resolutie gedurende electroforese noodzakelijk of er iseen tweede set primers noodzakelijk om voldoende verschil tekunnen vinden.
In tegenstelling tot de bovengenoemde resultaten werdenvoor Staphylococcus aureus en Pseudomonas putida tweeverschillende patronen gevonden. In sommige gevallen werden nogandere banden gevonden, die echter wel reproduceerbaar waren.Deze banden kunnen behulpzaam zijn bij een betere differentiatievan de verschillende bacteriesoorten.
Uit deze resultaten concluderen we dat het mogelijk is omde hier beschreven PCR-SDDM methode te gebruiken voor deidentificatie van bacteriën. Hiertoe zijn een beperkt aantalsets primers nodig welke resulteren in éen of enkele ssDNA bandpatronen voor elke soort. De aanwezigheid van grote hoeveelhedenbacteriën, die niet geïdentificeerd behoeven te worden, kanechter interfereren.
SEQUENTIE LIJSTSEQ ID NO:1 LENGTH: 20 nucleotidesTYPE: nucleotidesSTRANDEDNESS: singleAGGCCCGGGA ACGTATTCAC 20 SEQ ID NO :2 LENGTH: 20 nucleotidesTYPE: nucleotidesSTRANDEDNESS: singleGAGGAAGGTG GGGATGACGT 20 Q τ n 1 q r 7

Claims (29)

1. Werkwijze voor het identificeren van een in een monsteraanwezig micro-organisme, omvattende het onderwerpen van in het monster aanwezig nucleïnezuurvan het micro-organisme aan nucleïnezuur amplificatie ondertoepassing van een of meer sets van universele primers, diegebaseerd zijn op een gen van het te identificeren micro-organisme dat zowel geconserveerde als variabele gebieden omvat,waarbij de primers gekozen zijn in geconserveerde gebieden dieeen variabel gebied insluiten, het in enkelstrengs vorm brengen van het produkt van denucleïnezuur amplificatie, het onderwerpen van het in enkelstrengs vorm gebrachteamplificatieprodukt aan een elektroforese welke in staat is omenkelstrengs nucleïnezuren van gelijke lengte van elkaar tescheiden op grond van verschillen in nucleotidensequentie, het detecteren van het geëlektroforeerde nucleïnezuur, enhet vergelijken van de positie van het geëlektroforeerdenucleïnezuur met die van een set referentie-nucleïnezuren vanbekende micro-organismen.
2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de genoemde micro-organismen uit bacteriën, virussen, fungi, actinomyceten ofeencellige parasieten bestaan.
3. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de genoemde micro-organismen uit bacteriën bestaan.
4. Werkwijze volgens conclusie 3, waarin de genoemde sets vanuniversele primers gebaseerd zijn op het 16S rRNA gen vanbacteriën.
5. Werkwijze volgens conclusie 4, waarin een set primers wordttoegepast, die gebaseerd is op de gebieden 1173-1192 en 1370-1389 van het 16S rRNA gen.
6. Werkwijze volgens conclusie 5, waarin de set van primersbestaat uit de primers ER1: AGG CCC GGG AAC GTA TTC AC, enER2: GAG GAA GGT GGG GAT GAC GT.
7. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij in de nucleïnezuuramplificatie ten minste twee sets van primers worden gebruikt.
8. Werkwijze volgens conclusie 7, waarbij de meerdere sets vanprimers tegelijk in een multiplex amplificatie worden toegepast.
9. Werkwijze volgens conclusie 7, waarbij een 'nested'nucleïnezuur amplificatie wordt uitgevoerd door een eersteamplificatie met een eerste set primers te doen volgen door eentweede amplificatie met een tweede set primers, waarbij deprimers van de tweede set gebaseerd zijn op gebieden die tussendie van de eerste set primers zijn gelegen.
10. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de nucleïnezuuramplificatie bestaat uit een polymerase chain reactie (PCR)onder toepassing van een DNA polymerase.
11. Werkwijze volgens conclusie 10, waarbij gebruik wordtgemaakt van een thermostabiel DNA polymerase.
12. Werkwijze volgens conclusie 11, waarbij Taq-polymerase,Vent-polymerase, Tth-polymerase, of SuperTag-polymerase wordttoegepast.
13. Werkwijze volgens conclusie 10, waarbij het genoemde DNApolymerase wordt onderworpen aan een voorbehandeling waardoorcontaminerend DNA en/of RNA wordt verwijderd.
14. Werkwijze volgens conclusie 10, waarbij het targetnucleïnezuur bestaat uit DNA, gekozen uit genomisch DNA van hetmicro-organisrne en cDNA, gesynthetiseerd door reversetranscriptie van RNA van het micro-organisrne.
15. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de nucleïnezuuramplificatie wordt uitgevoerd volgens een transcription-basedamplification system (TAS).
16. Werkwijze volgens conclusie 15, waarbij de nucleïnezuuramplificatie wordt uitgevoerd volgens een self-sustainedsequence replication (3SR) reactie, een nucleic acid system based amplification (NASBA) of een template mediatedamplification (TMA).
17. Werkwijze volgens conclusie 15, waarbij het targetnucleïnezuur bestaat uit RNA of DNA van het micro-organisme.
18. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij, ten behoeve van dedetectie van het geamplificeerde en geëlektroforeerdenucleïnezuur, tijdens de nucleïnezuur amplificatie gelabeldeprimers of gelabelde nucleotiden worden toegepast.
19. Werkwijze volgens conclusie 18, waarbij tijdens denucleïnezuur amplificatie radioactief gelabelde primers ofnucleotiden worden toegepast.
20. Werkwijze volgens conclusie 18, waarbij tijdens denucleïnezuur amplificatie primers worden toegepast, die gelabeldzijn met een fluorochroom, een chemiluminescente stof, biotineof digoxigenine.
21. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het geamplificeerdeen geëlektroforeerde nucleïnezuur wordt gedetecteerd doorkleuring.
22. Werkwijze volgens conclusie 21, waarbij het detecteren vanhet geamplificeerde en geëlektroforeerde nucleïnezuur wordtuitgevoerd door zilverkleuring, ethidiumbromidekleuring ofStains-all kleuring.
23. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij voor de genoemdeelektroforese van enkelstrengs nucleïnezuur gebruik wordtgemaakt van een polyacrylamide gelelektroforese onder niet-denaturerende condities.
24. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het produkt van deamplificatie uit dubbelstrengs DNA bestaat, dat door verhittingin enkelstrengs vorm wordt gebracht voordat het aan de genoemdeelektroforese wordt onderworpen.
25. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het produkt van deamplificatie uit enkelstrengs RNA bestaat, dat vervolgens aan degenoemde elektroforese wordt onderworpen.
26. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het in het monsteraanwezige nucleïnezuur van het micro-organisme uit het monster wordt geïsoleerd voordat het aan nucleïnezuur amplificatie wordtonderworpen.
27. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het monster bestaatuit een klinisch monster, zoals urine, feces, sputum of bloed,of een voedingsmiddel.
28. Hulpmiddel, geschikt voor gebruik in de werkwijze volgensconclusie 1, omvattende een verzameling elektroforese patronenvan nucleïnezuren van als referentie dienende micro-organismen.
29. Verzameling van hulpmiddelen, geschikt voor gebruik in dewerkwijze volgens conclusie 1, omvattende een nucleïnezuur amplificatie kit met een of meer sets vanuniversele primers, die gebaseerd zijn op een gen van het teidentificeren micro-organisme dat zowel geconserveerde alsvariabele gebieden omvat, waarbij de primers gekozen zijn ingeconserveerde gebieden die een variabel gebied insluiten, een elektroforese kit voor een elektroforese welke in staatis om enkelstrengs nucleïnezuren van gelijke lengte van elkaarte scheiden op grond van verschillen in nucleotidensequentie,middelen voor het detecteren van gelabeld of ongelabeldgeëlektroforeerd nucleïnezuur, en een verzameling elektroforese patronen van nucleïnezurenvan als referentie dienende micro-organismen.
NL9301957A 1993-11-11 1993-11-11 Werkwijze voor het identificeren van micro-organismen, en daarvoor bruikbare hulpmiddelen. NL9301957A (nl)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL9301957A NL9301957A (nl) 1993-11-11 1993-11-11 Werkwijze voor het identificeren van micro-organismen, en daarvoor bruikbare hulpmiddelen.
PCT/NL1994/000283 WO1995013396A2 (en) 1993-11-11 1994-11-11 A method for identifying microorganisms, and aids useful thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL9301957A NL9301957A (nl) 1993-11-11 1993-11-11 Werkwijze voor het identificeren van micro-organismen, en daarvoor bruikbare hulpmiddelen.
NL9301957 1993-11-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NL9301957A true NL9301957A (nl) 1995-06-01

Family

ID=19863128

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL9301957A NL9301957A (nl) 1993-11-11 1993-11-11 Werkwijze voor het identificeren van micro-organismen, en daarvoor bruikbare hulpmiddelen.

Country Status (2)

Country Link
NL (1) NL9301957A (nl)
WO (1) WO1995013396A2 (nl)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE38442E1 (en) * 1994-06-22 2004-02-24 Mount Sinai School Of Medicine Nucleic acid amplification method hybridization signal amplification method (HSAM)
US5942391A (en) 1994-06-22 1999-08-24 Mount Sinai School Of Medicine Nucleic acid amplification method: ramification-extension amplification method (RAM)
US5876924A (en) * 1994-06-22 1999-03-02 Mount Sinai School Of Medicine Nucleic acid amplification method hybridization signal amplification method (HSAM)
US6593086B2 (en) 1996-05-20 2003-07-15 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Nucleic acid amplification methods
GB9420774D0 (en) * 1994-10-14 1994-11-30 Univ Wales Method of detecting and identifying spore forming bacteria
DE19716456C2 (de) * 1997-04-21 2002-05-08 Schmitt Heinz Josef Verwendung einer Kombination von Primern zum Nachweis von Erregern von Infektionskrankheiten
GB9719044D0 (en) * 1997-09-08 1997-11-12 Inst Of Ophthalmology Assay
WO1999035285A2 (en) * 1998-01-08 1999-07-15 Merck Sharp & Dohme De Espana, S.A.E. Hybridization probes which differentiate between the actinomadura madurae group of bacteria and maduromycetes
WO2000065088A2 (en) * 1999-04-26 2000-11-02 Amersham Pharmacia Biotech Ab Primers for identifying typing or classifying nucleic acids
DE19945916A1 (de) 1999-09-24 2001-04-05 Biotecon Diagnostics Gmbh Nukleinsäuremoleküle zum Nachweis von Bakterien und phylogenetischen Einheiten von Bakterien
WO2001023608A2 (en) * 1999-09-27 2001-04-05 Merck Sharp & Dohme De Espana, S.A.E. Hybridization probes which specifically detect strains of the genera microbispora, microtetraspora, nonomuria and planobispora
DE10027113A1 (de) * 1999-12-23 2001-09-27 Andreas Hoeft Verfahren zur Bestimmung von mikrobieller DNS/RNS, Kit dafür und Verwendung des Verfahrens
US7666588B2 (en) 2001-03-02 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy
AU2013231102B2 (en) * 2001-03-02 2016-04-28 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals
US7226739B2 (en) 2001-03-02 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations
US20030027135A1 (en) 2001-03-02 2003-02-06 Ecker David J. Method for rapid detection and identification of bioagents
US20040121309A1 (en) 2002-12-06 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents in blood, bodily fluids, and bodily tissues
US7217510B2 (en) 2001-06-26 2007-05-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for providing bacterial bioagent characterizing information
JP2006516193A (ja) 2002-12-06 2006-06-29 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド ヒトおよび動物における病原体の迅速な同定方法
US8057993B2 (en) 2003-04-26 2011-11-15 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of coronaviruses
US7964343B2 (en) 2003-05-13 2011-06-21 Ibis Biosciences, Inc. Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US8158354B2 (en) 2003-05-13 2012-04-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US7205111B2 (en) * 2003-07-24 2007-04-17 Marshfield Clinic Rapid identification of bacteria from positive blood cultures
US8288523B2 (en) 2003-09-11 2012-10-16 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of bacteria
US8546082B2 (en) 2003-09-11 2013-10-01 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US8097416B2 (en) 2003-09-11 2012-01-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US8163895B2 (en) 2003-12-05 2012-04-24 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of orthopoxviruses
US7666592B2 (en) 2004-02-18 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent
US7714275B2 (en) 2004-05-24 2010-05-11 Ibis Biosciences, Inc. Mass spectrometry with selective ion filtration by digital thresholding
US20050266411A1 (en) 2004-05-25 2005-12-01 Hofstadler Steven A Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA
US7811753B2 (en) 2004-07-14 2010-10-12 Ibis Biosciences, Inc. Methods for repairing degraded DNA
US7309589B2 (en) * 2004-08-20 2007-12-18 Vironix Llc Sensitive detection of bacteria by improved nested polymerase chain reaction targeting the 16S ribosomal RNA gene and identification of bacterial species by amplicon sequencing
EP1869180B1 (en) 2005-03-03 2013-02-20 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of polyoma viruses
US8084207B2 (en) 2005-03-03 2011-12-27 Ibis Bioscience, Inc. Compositions for use in identification of papillomavirus
AU2006272776B2 (en) 2005-07-21 2012-01-19 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid identification and quantitation of nucleic acid variants
WO2007118222A2 (en) 2006-04-06 2007-10-18 Ibis Biosciences, INC Compositions for the use in identification of fungi
US9149473B2 (en) 2006-09-14 2015-10-06 Ibis Biosciences, Inc. Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens
JP5680304B2 (ja) 2007-02-23 2015-03-04 アイビス バイオサイエンシズ インコーポレイティッド 迅速な法医学的ｄｎａ分析法
US9598724B2 (en) 2007-06-01 2017-03-21 Ibis Biosciences, Inc. Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids
US8550694B2 (en) 2008-09-16 2013-10-08 Ibis Biosciences, Inc. Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, systems, and methods
EP2344893B1 (en) 2008-09-16 2014-10-15 Ibis Biosciences, Inc. Microplate handling systems and methods
WO2010033627A2 (en) 2008-09-16 2010-03-25 Ibis Biosciences, Inc. Sample processing units, systems, and related methods
WO2010093943A1 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Ibis Biosciences, Inc. Ionization probe assemblies
WO2010104798A1 (en) 2009-03-08 2010-09-16 Ibis Biosciences, Inc. Bioagent detection methods
WO2010114842A1 (en) 2009-03-30 2010-10-07 Ibis Biosciences, Inc. Bioagent detection systems, devices, and methods
US9194877B2 (en) 2009-07-17 2015-11-24 Ibis Biosciences, Inc. Systems for bioagent indentification
US8950604B2 (en) 2009-07-17 2015-02-10 Ibis Biosciences, Inc. Lift and mount apparatus
US9416409B2 (en) 2009-07-31 2016-08-16 Ibis Biosciences, Inc. Capture primers and capture sequence linked solid supports for molecular diagnostic tests
US9080209B2 (en) 2009-08-06 2015-07-14 Ibis Biosciences, Inc. Non-mass determined base compositions for nucleic acid detection
WO2011047307A1 (en) 2009-10-15 2011-04-21 Ibis Biosciences, Inc. Multiple displacement amplification
BR112012009023A2 (pt) * 2009-10-22 2019-09-24 Biotools Biotechnologial & Medical Laboratories S A método pra detecção. diferenciação e identificação de eubactérias específica de táxons em uma amostra biológica por meio de técnicas de análise de sequenciamento e kit
WO2011115840A2 (en) 2010-03-14 2011-09-22 Ibis Biosciences, Inc. Parasite detection via endosymbiont detection
JP5399312B2 (ja) * 2010-04-26 2014-01-29 日東電工株式会社 粘着シート
EP3938532A4 (en) * 2019-03-15 2022-11-30 Polyskope Labs SELECTIVE ENRICHMENT BROTH FOR THE DETECTION OF ONE OR MORE PATHOGENS

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990001560A1 (en) * 1988-07-29 1990-02-22 David John Evans Bacterial dna probe
WO1990015157A1 (en) * 1989-05-31 1990-12-13 Gene-Trak Systems Universal eubacteria nucleic acid probes and methods
EP0479117A1 (en) * 1990-10-05 1992-04-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and reagents for identifying bacteria
WO1993005179A1 (en) * 1991-08-29 1993-03-18 THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES:National Institutes of Health A method for discriminating and identifying alleles in complex loci

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990001560A1 (en) * 1988-07-29 1990-02-22 David John Evans Bacterial dna probe
WO1990015157A1 (en) * 1989-05-31 1990-12-13 Gene-Trak Systems Universal eubacteria nucleic acid probes and methods
EP0479117A1 (en) * 1990-10-05 1992-04-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and reagents for identifying bacteria
WO1993005179A1 (en) * 1991-08-29 1993-03-18 THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES:National Institutes of Health A method for discriminating and identifying alleles in complex loci

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
G. SARKAR ET AL.: "Screening for mutations by RNA single-strand conformation polymorphism (rSSCP): comparison with DNA-SSCP", NUCL. ACIDS RES., vol. 20, no. 4, 25 February 1992 (1992-02-25), IRL PRESS, OXFORD, ENGLAND;, pages 871 - 878 *
K. CHEN ET AL.: "Broad range DNA probes for detecting and amplifying eubacterial nucleic acids", FEMS MICROBIOLGY LETTERS, vol. 57, no. 1, January 1989 (1989-01-01), ELSEVIER, AMSTERDAM, NL;, pages 19 - 24 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO1995013396A3 (en) 1995-06-08
WO1995013396A2 (en) 1995-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NL9301957A (nl) Werkwijze voor het identificeren van micro-organismen, en daarvoor bruikbare hulpmiddelen.
US6699670B2 (en) Quantitative assay for the simultaneous detection and speciation of bacterial infections
Wolcott Advances in nucleic acid-based detection methods
US5298392A (en) Process for detection of water-borne microbial pathogens and indicators of human fecal contamination in water samples and kits therefor
JP4481491B2 (ja) 核酸の検出方法
JP3070529B2 (ja) ミコバクテリウム・カンサシイの種特異的検出
EP0630971A2 (en) Method, reagents and kits for detection of neisseria gonorrhoea
US10550438B2 (en) Methods and compositions for detecting bacterial nucleic acid
JP2011510630A (ja) 試料中に存在する目的ヌクレオチド配列を検出するための核酸プローブの使用
Tomioka et al. A multiplex polymerase chain reaction microarray assay to detect bioterror pathogens in blood
US20240117447A1 (en) Polynucleotides for the amplification and detection of neisseria gonorrhoeae
JPH08510386A (ja) ポリメラーゼ鎖反応によるサルモネラ菌の同定
US7879581B2 (en) Nucleic acid amplification and detection of mycobacterium species
AU8955998A (en) Assay for Chlamydia trachomatis by amplification and detection of Chlamydia trachomatis nucleic acid
Gill et al. Enzyme-linked immunosorbent assay of nucleic acid sequence-based amplification for molecular detection of M. tuberculosis
Feng et al. A universal random DNA amplification and labeling strategy for microarray to detect multiple pathogens of aquatic animals
WO2005083114A1 (en) Method, kit and system for enhanced nested pcr
AU781192B2 (en) Nucleic acid amplification and detection of mycobacterium species
US9593384B2 (en) Metronidazole resistance in trichomonas vaginalis and single nucleotide polymorphisms
Knight Molecular genetic methods for detection and identification of viable but nonculturable microorganisms
EP1252331B1 (en) Methods and compositions for detection of mycobacterium avium complex species
JPH05184399A (ja) ジアルジン遺伝子含有ジアルジアの検出方法
JP2552787B2 (ja) 結核菌の特異的検出法
US20220396828A1 (en) Method of determining the presence of a hyper-virulent clostridioides difficile strain of the b1/nap1/027 group in a sample
CN116606947A (zh) 一组检测铜绿假单胞杆菌的引物探针及其检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
A1B A search report has been drawn up
BV The patent application has lapsed