JP2719225B2 - クラミジア・トラコーマチスの検出方法およびそのためのキット - Google Patents

クラミジア・トラコーマチスの検出方法およびそのためのキット

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    • C12Q1/689Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Description

【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は、増強された蛋白結合能を有するポリスチレ
ン固形支持体上でのポリメラーゼ連鎖反応(PCRと略
す)により増幅されたDNAのハイブリダイゼーション捕
獲方法を提供する。好ましくは、かかる固形支持体は複
数のウェルを有するマクイロタイタープレートである。
PCR反応での増幅中にターゲットDNAを(例えば、ビオチ
ンで)標識した後、標識されたDNAをマイクロタイター
ウェルに受動的に結合されたアンプリコン(amplicon)
特異的オリゴヌクレオチド捕獲プローブへの塩基対ハイ
ブリダイゼーションにより特異的に捕獲する。標識とし
てビオチンが使用される場合は、アビジン:HRP複合体を
加え、そして(a)過酸化水素基質およびo−フェニレ
ンジアミン(OPD)色原体または(b)過酸化水素基質
およびテトラメチルベンジジン色原体(TMB)と反応さ
せる。比色定量シグナルが発生し、これによりPCR増幅D
NAの定量的検出が可能となる。
ビオチニル化PCR産物のプレート捕獲の感度は、サザ
ンブロットハイブリダイゼーションおよびオリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーション(OH)アッセイで放射性
標識プローブを用いた場合の感度に類似することが判明
している。しかしながら、プレート捕獲方法ではいくつ
かの利点が提供される:すなわち(a)より迅速なアッ
セイ時間;(b)放射性標識プローブを使用せず、労働
集約度が比較的少ないアッセイ方法;および(c)ハイ
ブリダイゼーションの客観的、定量的評価。
本発明の別の面は、病原微生物を特徴づける特性DNA
配列の存在を検出することによる特定疾病状態の診断に
関する。この種の微生物の1つ、すなわちクラミジア・
トラコーマチス(Chlamydia trachomatis)に特異的な
プローブおよびプライマーが発見された。
本発明のさらに別の面はDNA配列を検出するためのキ
ットを提供することで、該キットはポリスチレン固形支
持体およひPCR試薬セット(捕獲プローブとハイブリダ
イズするターゲットDNA配列の増幅のために予め選ばれ
た特異的プライマーおよびプローブを含有)を包含す
る。このようなキットは代表的にはPCR反応に必要な1
種以上の酵素、好ましくはTaq(Thermus aquaticus)ポ
リメラーゼのような熱安定性酵素をも包含しよう。マイ
クロタイタープレートを使用する場合、それらは特定タ
ーゲット配列のための捕獲プローブがすでに結合された
マイクロタイタープレートを包含しよう。
[従来の技術] 米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号は、
“ポリメラーゼ連鎖反応”(PCR)として当分野で知ら
れた技法によるDNA配列の増幅方法を開示している。こ
のポリメラーゼ連鎖反応は、相補鎖の多重プライマー伸
長合成によってDNAを特異的に増幅させる技法である(S
aikiら,Science,230:1350〜1354および239:487−491;19
85,1988)。106〜107倍にまで増幅されるPCR産物は、ゲ
ル電気泳動またはここに記載される他の方法により検出
できるばらばらの寸法のDNA断片(アンプリコン)であ
る。簡単に述べると、PCRは、増幅させて次に検出する
ことを意図する既知“ターゲット”配列の両末端に対応
する短鎖オリゴヌクレオチドプライマーの調製を伴う。
この技法では、DNAまたはRNAを細胞、組織、体液などか
ら抽出する。核酸を変性させ、そして過剰モル量のオリ
ゴヌクレオチドプライマーをdNTP(デオキシリボヌクレ
オチド三リン酸)およびDNAポリメラーゼ酵素(好まし
くは、耐熱性Taqポリメラーゼ)と共に加える。その後
熱変性させ、冷却させてプライマーにアニーリングさ
せ、そしてDNAポリメラーザによってプライマー伸長さ
せると、それぞれのプライマーから開始する2本の“長
鎖産物”が生成され、これらはもとの2本のDNA鎖に相
補的である。この方法を繰り返し、2回目のサイクルの
後で、2本のもとのDNA鎖、サイクル1からの2本の長
鎖産物、2本の新たな“長鎖産物”、および2本の“短
鎖産物”が生成される。これらの短鎖産物(アンプリコ
ン)の長さは両プライマーを含めたこれらのプライマー
間のヌクレオチドの数に等しい。付加的なサイクルによ
り、付加的な“長鎖産物”が生成され、サイクル毎に直
線的様式で増加する。しかしながら、アンプリコンの形
成は各サイクルと共に指数的に増加し、この増幅方法に
より、極微量のDNAの検出が可能となる。
PCR技法の使用により、わずかな量で存在する特定DNA
配列の検出が可能である。これらの技法のいくつかは、
ある種の材料に固定された種々のプローブの使用を包含
する。
以下で詳しく述べるように、本発明は、マイクロタイ
ターウェルへの捕獲DNA配列の固定、および標識した
(すなわち、ビオチニル化した)アンプリコンとのハイ
ブリダイゼーションによるその後の検出を利用するもの
である。また、本発明はハイブリダイゼーション工程で
のグアニジンチオシアネートの使用をも包含する。これ
と関係のある方法が文献にいくつか記載されている。2
つのこのような報告は、マイクロタイターウェルへの大
型ターゲットDNAの固定化、続いてビオチニル化オリゴ
ヌクレオチドまたはニックトランスレーションにより標
識したDNAプローブへのこれらのターゲットのハイブリ
ダイゼーションを開示している。
Cookら,Nucleic Acids Research,16:4077−4095(198
8)は、1M酢酸アンモニウム中でターゲットDNAを37℃で
1.5〜2時間インキュベートすることにより、ImmulonR
2プレートのマイクロタイターウェルにバクテリオファ
ージM13ターゲットDNAを固定化した。固定化されたター
ゲットDNAは、末端ビオチン標識化または内部ビオチン
標識化オリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼ
ーション、続いてハイブリダイゼーションの比色定量検
出のためのストレプトアビジン−HRP複合体および過酸
化水素/o−フェニレンジアミン(OPD)の添加後に検出
された。
Nagataら,FEBS Lett.,183:379−382(1985)は、0.1M
MgCl2を含有するPBS中でラムダターゲットDNAをマイク
ロタイターウェルに固定化した。室温で一晩インキュベ
ーションし、次に溶液を除去した後、プレートに紫外線
を照射した。ビオチニル化(ニックトランスレーション
された)ラムダDNAプローブとのハイブリダイゼーショ
ンを行い、その後アビジン−β−ガラクトシダーゼと複
合体を形成させた。基質4−メチルウンベリフェリル−
β−D−ガラクトシドの添加後、蛍光を測定した。
Heveyらの米国特許第4,228,237号は、液体媒体中のリ
ガンドを検出するために、アビジン(酵素に共有結合で
結合)と反応性のビオチンを使用する方法を開示した。
本発明方法は、リガンドが中間体のビオチン標識抗リガ
ンドで標識されるのではなく、直接ビオチンで標識され
る点で相違する。さらに、他の種々の従来文献が特異的
ハイブリダイゼーションプローブおよびその診断用途に
ついて記載している。例えば、米国特許第4,358,535号
(Falkowら)および欧州特許出願第82301804.9号(公開
第63,879号;エール大学)を参照されたい。後者の文献
はアビジンまたはビオチン特異的抗体に結合された酵素
により検出されるビオチン標識DNAプローブの使用を開
示している。
Rankiらの米国特許第4,486,539号は、DNAハイブリダ
イゼーションにより微生物を検出・同定するために、2
種類の重複しない核酸試薬(一方は固形支持体に結合さ
れ、他方は標識される)の使用を開示している。本発明
は、ターゲット核酸自体が標識され、検出用の別の標識
核酸プローブの使用を必要としない点で相違する。
Stabinskyの米国特許第4,751,177号は、ターゲットDN
Aが溶液中でメジエーターポリヌクレオチドおよび標識
プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズされるDNA
検出法を開示した。メジエーターポリヌクレオチドは固
形支持体上に固定化されたポリヌクレオチドと相補的で
ある。本発明は、(a)ターゲットが増幅中に標識さ
れ、検出用に標識されたリポーター基を必要としない;
および(b)捕獲プローブがメジエーターポリヌクレオ
チドを使用せずに固形支持体に直接結合される;という
点で相違する。
グアニジンチオシアネート(GuSCN)は細胞抽出およ
びその後の核酸ハイブリダイゼーションに使用されてい
る。例えば、ThompsonおよびGillespie,Anal.Biochem.,
163:281−291(1987)は、ターゲットDNAまたはRNAを検
出するための放射性標識RNAプローブを調製した。ドッ
トプロットフォーマットにおいて、32P標識プローブを5
M GuSCN/0.1M エチレンジアミン四酢酸(EDTA)二ナト
リウム塩、pH8.0中でハイブリダイズさせた。Pellegrin
oら,BioTechniques,:452−459(1987)は、血球中のH
IV−RNAを検出するための溶液ハイブリダイゼーション
を開示した。血球を5M GuSCN/0.1M EDTA中に溶解させ、
同一溶液中で放射性標識RNAプローブと室温にてハイブ
リダイズさせた。TCA沈澱ハイブリッドを膜上に集め、
シンチレーション計数により放射能を測定した。Gilles
pieの国際特許出願PCT/US87/01023(国際公開W087/0662
1)は、固形支持体に結合されたターゲットDNAを検出す
るために標識プローブを用いる分子ハイブリダイゼーシ
ョンにおけるグアニジンチオシアネートの使用を開示し
た。この特許は分子ハイブリダイゼーションのために3M
〜6.5Mの濃度範囲にわたるGuSCを周囲温度で使用するこ
とについて開示している。このようなハイブリダイゼー
ションの手順には、ニトロセルロースまたはナイロン膜
へのターゲット核酸の結合(ドットブロットまたはサザ
ンブロット)、プレハイブリダイゼーション、GuSCN中
での放射性標識プローブとのハイブリダイゼーション、
洗浄、およびオートラジオグラフィーによる検出が含ま
れる。
[発明の開示] ここで用いる用語“オリゴヌクレオチド”および“プ
ライマー”は、上記の米国特許第4,683,202号において
定義される意味を有しよう。ここで用いる用語“捕獲プ
ローブ”は、プライマーの境界の内側にあるアンプリコ
ンの配列と完全にまたは実質的に相補的なオリゴヌクレ
オチドとして定義されよう。本発明の好適な実施態様で
は、捕獲プローブはその末端にデオキシリボヌクレオチ
ドまたはリボヌクレオチドが付いていないが、付いてい
てもよい。
本発明の実施に際して、プライマーおよびプローブは
増幅しようとするターゲット配列のそれぞれの鎖と“実
質的に”相補的であるように選ばれる。
ここに記載する詳細な実施態様の1つとして、2組の
PCRプライマーおよび捕獲プローブがクラミジア・トラ
コーマチスL1抗原種(serovar)の潜伏プラスミドのヌ
クレオチド配列から選ばれた(Hattら,Nucleic Acids R
esearch,16:4053−4067,1988)。このことによりC.トラ
コーマチスの特異的増幅および検出が可能となった。一
般的な他の目的のためには、個々のターゲットに対する
プライマーおよびプローブの選択が上記の米国特許第4,
683,202号に記載されている。
先に述べたPCRの適用により生成する増幅配列(アン
プリコン)を捕獲するための既知技法の変更および改良
として、本発明は、その好適な実施態様において、ビオ
チン標識アンプリコンを(配列特異的ハイブリダイゼー
ションにより)捕獲するためにマイクロタイタープレー
トのウェルに受動的に結合されたオリゴヌクレオチド捕
獲プローブを利用する。次に、ビオチニル化アンプリコ
ンに対してアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ
を使用し、これと基質(過酸化水素)および色原体(OP
DまたはTMB)との反応により定量的な比色測定シグナル
が生成される。
さらに、上記の米国特許第4,683,202号に記載される
ように、デオキシリボヌクレオチド三リン酸dATP、dCT
P、dGTPおよびTTPをも合成混合物に十分な量で加え、得
られた溶液を鋳型鎖を分離するために約90〜100℃で約
0.5〜10分加熱する。この加熱時間後、溶液をプライマ
ー/鋳型アニーリングに好適な温度に速やかに冷却す
る。この混合物には、プライマー伸長反応を誘導または
触媒するのに好適な物質が加えられ、当分野で知られた
条件下で伸長反応を行わせる。誘導物質はプライマー伸
長産物の合成を達成するように機能する、酵素を含めた
任意の化合物または系であり得る。このための適当な酵
素には、例えばエシェリヒア・コリ(E.coli)DNAポリ
メラーゼI、E.コリDNAポリメラーゼIのクレノウ断
片、T4DNAポリメラーゼ、他の入手可能なDNAポリメラー
ゼ、逆転写酵素、およびその他の酵素類が含まれ、好ま
しくは各核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物を形成す
るのに適した様式でヌクレオチドの取り込みを促進する
熱安定性酵素(すなわち、TaqDNAポリメラーゼ)が包含
される。
新たに合成された核酸鎖とその相補核酸鎖が二本鎖分
子を形成し、これらの鎖は一本鎖分子を生成させるため
の任意の変性手段(好ましくは、熱)を使って分離され
る。
新しい核酸は一本鎖鋳型分子上に合成される。付加的
な酵素、ヌクレオチドおよびプライマーが先に指定した
条件下で反応を進行させるために必要に応じて添加でき
る。この場合も、合成はオリゴヌクレオチドプライマー
の一端で開始されて一本鎖鋳型に沿って進行し、その結
果プライマー伸長によりさらに相補核酸が生成される。
鎖分離および伸長産物合成の工程は、希望する量の増
幅核酸配列を作るのに必要な回数反復すことができる。
一般的な標識技術 一般的に、本発明では、検出可能(かつ好ましくは定
量可能)な指標またはシグナルを生成させ、しかも核酸
に結合されるかまたは取り込まれうる任意の物質(分
子、原子)が使用できる。
本発明の好適な実施態様では、PCR増幅中にビオチン
標識を取り込むアンプリコンを作るために2つの方法が
採用される。第1の場合には、ビオチン−11−dUTP(ビ
オチン標識で化学修飾されたTTP類似体)がPCR反応にお
いてTTPと部分的に置き換わる。ビオチン−11−dUTPは
プライマー伸長反応中にTaqDNAポリメラーゼにより取り
込まれ、生成するDNA産物はビオチンで“内部的に”標
識される。
第2の場合には、化学“リンカーアーム”が、固形支
持体に結合されたオリゴヌクレオチドの5′末端に結合
される。好適な実施態様においては、ここで用いられる
“リンカーアーム”は5′プライマー末端に(ホスホル
アマダイト化学により)化学的に結合されており、かつ
オリゴヌクレオチドに1個以上のアミノ基を共有結合で
連結させうる分子である。アミノ基が次にビオチン−X
−NHSでビオチニル化される。これらの5′ビオチン標
識オリゴヌクレオチドは、PCR反応でプライマーとして
使用したとき、それらの5′末端でビオチニル化された
アンプリコンを生成する。
“リンカーアーム”はオリゴヌクレオチド配列から標
識を隔てるスペーサーとして作用するに足る長さをも
ち、しかも1以上の標識、熱安定性酵素またはリガンド
の結合を受け易い分子であることができる。
本発明の好適な実施態様においては、これら2つのビ
オチン標識方法(ビオチン−11−dUTPの取り込みおよび
5′ビオチン標識プライマー)のいずれか一方または両
方を用いて、PCRの増幅産物を標識することができる。
ビオチンのほかに、本発明では、放射性標識化合物、
発光または蛍光試薬、電子高密度試薬、熱安定性酵素、
リガンド、抗体−ハプテン複合体、およびキレート形成
剤を含めた他の標識も使用できる。代替標識はPCR増幅
の温度条件、並びに変性および捕獲ハイブリダイゼーシ
ョンの条件に適合しうるものでなければならない。
代替標識の1つの例は、ビオチン−11−dUTPと同様に
標識増幅DNAにTaqポリメラーゼにより取り込まれるジゴ
キシゲニン−11−dUTPである。ジゴキシゲニン標識アン
プリコンは次にアルカリホスファターゼと結合したジゴ
キシゲニンに対する抗体との反応に続くここに記載の標
準比色定量検出により検出できる。
代替標識の他の例は32P標識デオキシヌクレオチド三
リン酸であり、これもPCR反応混合物中で未標識デオキ
シヌクレオチド三リン酸と部分的に置き換わるべく使用
できる。捕獲ハイブリダイゼーションの程度は、例えば
捕獲ハイブリダイゼーションおよび洗浄後に、取りはず
し可能なマイクロタイターウェルのシンチレーション計
数(以下の工程2に記載する)によって判定できよう。
ポリスチレン固形支持体 本発明で用いる捕獲プレートまたは固形支持体は、増
強された蛋白結合能を有するポリスチレン固形支持体で
あろう。この種の増強を達成するためのかかる支持体の
処理法は当分野でいろいろ知られている(例えば、60Co
の照射)。
ポリスチレン固形支持体はいくつかの形態をとること
ができる;例えば、マイクロタイタープレート、微小磁
性粒子(Advanced Magnetics,Inc.から入手可能)、ビ
ーズ、ストリップ、ディップスティックなど。
好ましくは、本発明で用いるポリスチレン固形支持体
は複数のウェルを有する蛋白結合能の増強されたマイク
ロタイタープレートであろう。このようなマイクロタイ
タープレートのうちで最適なものは“Dynatech Immulon
R 2"(Dynatech Laboratories,Inc.,Chantilly,VA;Fish
er Scientificから購入)として知られるものである。
一般的なハイブリダイゼーション技法 本発明の好適な実施態様では、アンプリコン特異的オ
リゴヌクレオチド捕獲プローブを、1M酢酸アンモニウム
の溶液中25ngDNA/ウェルの濃度でImmulonR2ポリスチレ
ン製マイクロタイタープレートのウェルに受動的に結合
させる。この種のマイクロタイタープレートは多数のウ
ェルを有しており、従って高表面積を与えかつ数多くの
同時アッセイ(例.96)を可能にする。
捕獲プローブの受動結合に加えて、別の結合方法も使
用することができ、例えば共有結合;媒介蛋白(例.BS
A)を介しての結合;および他の任意の化学的手段によ
る結合;が含まれるが、これらに限定されない。
本発明のハイブリダイゼーション工程、より詳しくは
“捕獲ハイブリダイゼーション”、は好ましくは1Mグア
ニジンチオシアネート、20mMエチレンジアミン四酢酸
(EDTA)二ナトリウム塩、pH8.0の存在下で行なわれ
る。マイクロタイタープレート捕獲ハイブリダイゼーシ
ョンを行うための濃度範囲は好ましくは0.5〜2.0M、最
も好ましくは1.0〜2.0M GuSCNである。
捕獲ハイブリダイゼーションを行うためには、他の試
薬類も使用できる。例えば、グアニジンチオシアネート
の代わりにアンモニウムチオシアネートの溶液(0.5〜
5.0M、最も好ましくは5.0M)が使用できる。
グアニジンチオシアネートの他の可能な代替物質は、
30%(v/v)脱イオンホルムアミド;3×SSPE[1×SSPE
=0.18M NaCl;10mM NaPO4,pH7.7;1mM EDTA];5%(w/
v)硫酸デキトスラン;0.1%Triton X−100(オクチルフ
ェノキシポリエトキシエタノール;Sigma Chemical Co.,
St.Louis,MO)から成る試薬である。
かかるハイブリダイゼーション法には以下の工程が包
含される: 1.捕獲プローブの作製 2.マイクロタイター捕獲プレートの作製 3.増幅され標識されたDNAの希釈および変性 4.捕獲ハイブリダイゼーション 5.洗浄 6.ブロック 7.アビジン:セイヨウワサビペルオキシダーゼの添加 8.洗浄 9.基質および色原体の添加;発色 10.プレート読み取り(定量)。
ここで、これらの工程を詳しく説明することにする。
1.捕獲プローブの作製 本発明の捕獲プローブはプライマーの境界の内側にあ
るアンプリコンの配列と“実質的に”相補的となるよう
に選ばれる。それゆえ、捕獲プローブは捕獲ハイブリダ
イゼーション条件下でアンプリコンと特異的にハイブリ
ダイズするに十分に相補的であらねばならない。好適な
実施態様においては、捕獲プローブは代表的には20〜20
0ヌクレオチドを含有する。
さらに、2種以上の捕獲プローブを使用してもよく、
標識アンプリコンの同一鎖または反対鎖を捕獲するため
に付加的な捕獲プローブを使用することができる。
捕獲プローブはここでは“プライマーの境界の内側に
あるアンプリコンの配列”と定義されるが、プライマー
自体またはプライマー配列を含有するオリゴヌクレオチ
ドも捕獲プローブとして使用できる。しかしながら、か
かるオリゴヌクレオチドを捕獲プローブとして用いる場
合は、それらは反応産物から除去されなかったPCRプラ
イマーとハイブリダイゼーション中に競合するに違いな
いことに注意すべきである。
本発明の捕獲プローブおよびPCRプライマーは、Milli
Gen 7500 DNA Synthesizer(MilliGen/Biosearch,Inc.,
Burlington,MA)を用いて、標準β−シアノエチルホス
ホルアマダイト化学により合成されたが、当分野で知ら
れた他の方法も可能である。使用に先立ち、捕獲プロー
ブおよびPCRプライマーを15%(w/v)ポリアクリルアミ
ドゲルによる電気泳動またはスピンカラムにより部分精
製した(実施例3参照)。最終的な部分精製捕獲プロー
ブおよびプライマーを水に懸濁させ、その濃度を分光光
度計で測定し、そして必要時まで4℃で保存した。
ここに記載の捕獲プローブは合成的に作製されるが、
そうである必要はない。それは標準方法(例えば、制限
エンドヌクレアーゼ消化)により調製された天然に存在
するDNAの断片として得ることもできる。
2.捕獲プレートの作製 オリゴヌクレオチド捕獲プローブは好ましくはDynate
ch ImmulonR 2ポリスチレン製マイクロタイタープレー
ト(Dynatech Laboratories,Inc.,Chantilly,VA;Fisher
Scientificから購入)のウェルに固定される。Immulon
RR 2プレートは単一のプラスチック製プレートに96個の
小型ポリスチレンテストチューブ(ウェル)が配置さ
れ、微量の固相イムノアッセイ操作に一般的に使用する
ために設計されたものである。本発明の好適な実施態様
では、平底ウェル(容量400μl)を有するプレートが
用いられるが、“U"底ウェル(容量300μl)も使用で
きると考えられる。
別の好適な実施態様として、プローブをImmulonRRemo
vawellRストリップ(Dynatech)に固定することもで
き、コノストリップはマイクロタイタープレート法にお
けるRemovawellRストリップホルダー(Dynatech)に取
り付けられる12個のImmulonR2ポリスチレンテストチュ
ーブ(ウェル)を有する取りはずし可能なストリップで
ある。
オリゴヌクレオチド獲得プローブは、1M酢酸アンモニ
ウム(Fisher Scientific,Fair Lawn,NJ)50μl中25ng
/マイクロタイターウェルとなるように希釈する。ま
た、“ブランクウェル”がウェル(擬似ハイブリダイゼ
ーションのために標識PCR産物があとで加えられる)に1
M酢酸アンモニウム(オリゴヌクレオチド捕獲プローブ
を含まない)を加えることにより用意される。これらの
ブランクウェルはマイクロタイタープレートのウェルへ
のビオチニル化DNAの非特異的結合を示すものであり、
プレート読み取り装置(分光光度計)を較正するために
用いられる(以下の工程10参照)。
プレートをマイラープレートシーラー(Dynatech)を
使って密封し、ポリスチレン表面にオリゴヌクレオチド
捕獲プローブを受動固定させるために37℃で一晩インキ
ュベートする。このプレートをすぐに使用しない場合
は、必要時までそれらを4℃で保存する。このようにし
て6週間まで保存したプレートはそれらのDNA捕獲能に
有意な差がなかった。
ハイブリダイゼーションの直前に、プレートのウェル
を200μlの2×SSC[1×SSC=0.15M NaCl;15mMクエン
酸ナトリウム緩衝液,pH7.0]で2回、そして200μlの
2×SSC、0.1%(v/v)Triton X−100で1回洗浄する。
ここに記載のすべてのプレート洗浄は多重チャンネルピ
ペット装置(例.TitertekR)を用いて行われるが、適
当な自動マイクロタイタープレート洗浄機を用いて行う
こともできる。
3.増幅され標識されたDNAの希釈および変性 ビオチニル化PCR産物を1M GuSCN(超高純度級;Boehri
nger Mannheim Biochemicals,Indianapolis,IN)、20mM
EDTA(Sigma)pH8.0(5×原液から調製)中に(1:10
〜1:100またはそれ以上の範囲で)希釈し、100℃で5分
間加熱し、そしてすばやく氷水浴中で冷却させる。[加
熱工程はPCR産物を熱変性させ、すばやい冷却はアンプ
タコン鎖の再アニーリングを抑制して、オリゴヌクレオ
チド捕獲プローブとのハイブリダイゼーションを促進す
る。]上記(工程2)の“ブランク”(捕獲プローブを
含まない)と指定したウェルを含めた各ウェルに100μ
lずつ加えられる。
4.捕獲ハイブリダイゼーション オリゴヌクレオチド捕獲プローブによる、増幅され標
識済みDNAの特異的捕獲は、室温で1〜3時間インキヤ
ベートすることにより行われる。この間に、PCRアンプ
リコンが捕獲プローブと標識アンプリコンとの間の配列
相補性に基づいてオリゴヌクレオチド捕獲プローブによ
って特異的に捕獲される。
5.プレート洗浄 ハイブリダイゼーション後に、すべてのマイクロタイ
ターウェルの内容物を捨て、ウェルを200μlの2×SS
C、0.1%(v/v)Triton X−100で2回そして予め37℃に
温めた200μlの0.2×SSC、0.1%(v/v)Triton X−100
で4回洗浄する。これらの洗浄はマイクロタイターウェ
ルから未結合のビオチニル化産物を除去するために行わ
れる。
6.ブロック プレート洗浄後、プレートのウェルを200μlのPBS溶
液(PBS=0.13M NaCl、7mM Na2HPO4、3mM NaH2PO4、pH
7.0)、2%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)(Sigm
a)、0.1%(v/v)Triton X−100を用いて最低15〜30分
間“ブロック”する。この“ブロック”工程はマイクロ
タイターウェルへのアビジン:HRPの非特異的結合を最小
限度に抑えるのに必要である。
7.アビジン:セイヨウワサビペルオキシダーゼ アビジン:セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)
複合体(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA)を
PBS、0.1%(v/v)Triton X−100で1:2000に希釈して最
終濃度2.5μgアビジン:HRP/mlとする。50μlの希釈ア
ビジン:HRPを各ウェルに加え、室温で30分間インキュベ
ートする。この工程中に、アビジン:HRP複合体がウェル
に捕獲されたビオチニル化産物と強く結合する。本発明
ではアビジン:HRPが使用されるが、代わりにストレプト
アビジン:HRPの複合体も使用できる。同様に、アビジン
(またはストレプトアビジン)と複合体を形成する他の
化合物、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラスト
シダーゼ、ルシフェラーゼ、フルオレセイン、テキサス
レッド、または比色定量、蛍光もしくは発光シグナルを
発することのできる任意の他の物質も使用できる。
8.洗浄 次に、マイクロタイタープレートのウェルを200μl
のPBS、0.1%(v/v)Triton X−100で4回;そして200
μlのPBS、1mM EDTAで1回洗浄し、最終洗浄は室温で
1〜10分間インキュベートする。これらの洗浄は色原体
の添加に先立ってマイクロタイターウェルから未結合の
アビジン:HRPを除去するために行われる。
9.発色 本発明の好適な実施態様では、発色は2種類の色原体
系:(a)過酸化水素/OPD、および(b)過酸化水素/T
MBのいずれか一方を用いて行われる。
(a)過酸化水素/OPD:洗浄緩衝液(工程8に記載)を
除去した後、150μlのOPD試薬[0.15Mリン酸ナトリウ
ム/クエン酸塩緩衝液pH6.0中の1.6mg/ml o−フェニレ
ンジアミン二ナトリウム塩(Sigma)、0.0125%(v/v)
過酸化水素(Fisher Scientific)]を加え、暗室で1
〜30分間発色を進行させる。発色は50μlの4N H2SO4
添加により停止させる。
(b)過酸化水素/TMB:最終洗浄緩衝液(工程8に記
載)が除去された後、100μlのTMB発色試薬を各ウェル
に加える。[TMB発色試薬は等容量のTMBペルオキシダー
ゼ基質(有機基剤中0.4g/lの濃度の3,3′,5,5′−テト
ラメチルベンジジン;Kirkegaard and Perry,Inc.,Gaith
ersburg,MD,から市販されている)と過酸化水素溶液
(クエン酸緩衝液中の0.02%(v/v)過酸化水素:Kirkeg
aard and Perry,Inc.から市販されている)を新たに混
合することにより調製される。]反応を暗室中室温で1
〜30分間進行させた後100μlの1Mリン酸(H3PO4)を加
えて発色を停止させる。
TMB基質は青色の沈澱物を生じる。リン酸を添加する
と黄色への変色が起こり、この時点で光学濃度を450nm
で測定する(以下の工程10参照)。HRP基質OPDおよびTM
Bに加えて、他の可溶性基質には2,2−アジノージ(3−
エチルベンズチアゾリンスルホン酸)(ABTS)および5
−アミノサリチル酸(ASA)が包含される。不溶性基質
には3−アミノ−9−エチルカルバゾール(AEC)およ
び3,3−ジアミノベンジジン(DAB)が包含される。
10.プレート読み取り(定量) 発色を停止させた後、使用した色原体に特定の波長で
分光光度測定が可能な自動マイクロタイタープレートリ
ーダー(例えば、InterMed ImmunoreaderR NJ−2000)
を用いて、各ウェル中の試料の光学濃度(OD)を測定す
る(以下参照)。
ブランクウェル[工程2で述べたように、捕獲プロー
ブの存在しないウェルにビオチニル化PCR産物を添加]
のODも測定する。このシグナル(通常非常に低い)は、
捕獲プローブとのハイブリダイゼーションによってビオ
チニル化アンプリコンが真に捕獲されたことによるシグ
ナルではなく、試料ウェルにビオチニル化産物が“非特
異的に”擬似結合されたシグナルを表す。従って、真の
捕獲ハイブリダイゼーションを正確に定量するには、ブ
ランクウェルのODを試料ウェルのODから差し引く。
分光光度計(プレートリーダー)の適当な波長設定は
比色定量反応に用いた特定の色原体の如何による。従っ
て、過酸化水素/OPDを使用する場合の正しい波長設定は
490nmであり、過酸化水素/TMBを使用する場合の正しい
波長設定は450nmである。
本発明の使用により、病原性微生物、例えば細菌
(例、クラミジア、サルモネラなど)、ウイルス(例.
肝炎ウイルス)、種々の寄生虫(例.マラリア誘発性)
などを特徴づける特異的なDNA配列の存在を検出するこ
とによって、種々の感染性疾患を診断できる。詳細に
は、本発明はヒト免疫不全ウイルス1および2(HIV 1
およびHIV 2)、ヒト向Tリンパ球性ウイルスIおよびI
I(HTLV−IおよびHTLV−II)、B型肝炎ウイルス(HB
V)、C型肝炎ウイルス(HCV)、ヒト・パピローマウイ
ルス(HPV)、およびニューモシスチス・カリニ(Pneum
ocystis carinii)の検出に有用であろう。先に述べた
ように、本発明の別の実施態様として、微生物クラミジ
ア・トラコーマチスの検出に特異的に使用できる新規な
捕獲プローブおよびプライマーが開発された。かかる新
規プローブおよびプライマーを以下の実施例で詳細に説
明することとする。
本発明はまた、臨床用途との関連において特別の利点
を提供するものである。マイクロタイタープレートの使
用により、便利で、迅速、簡単、経済的、かつ自動化可
能なアッセイ法が提供される。このアッセイは慣用の方
法と比べて高精度でしかも高感度であり、通常必要とさ
れる時間よりも少ない時間で実施できる。
以下の実施例は本発明の例示として提供されるもの
で、本発明を制限するものではない。
実施例1 ビオチン−11−dUTPの合成 ビオチン−11−dUTPはLangerら,Proc.Natl.Acad.Sci.
(USA),78:6633−6637(1981)の方法により化学的に
合成しそして100mMトリス−HCl、pH7.5、0.4mM EDTA中
に0.4mMの濃度で懸濁した。ビオチン−11−dUTP:TTPの
比を最適化し、4:1(ビオチン−11−dUTP:TTP)の比を
用いた場合に最大のシグナルが得られた。
実施例2 5′ビオチニル化プライマーの作製 PCRプライマーとして使用されるすべてのオリゴヌク
レオチドは、当業者に知られた標準方法を用いて、標準
β−シアノエチルホスホルアマダイト化学によりMilliG
en 7500自動DNAシンセサイザーで合成した。
ビオチニル化プライマーとして使用するために作製し
たオリゴヌクレオチドを第1図に示すようにして修飾し
た。固形支持体上の合成オリゴヌクレオチドを保護ヘキ
シルアミノホスホルアマダイト[構造1]との反応、続
く標準方法(McBride and Caruthers,Tetrahedron Lett
ers,24:245−248,1983)による酸化および脱保護によっ
てその5′末端で誘導体化して、5′アミノ標準オリゴ
マー[構造2]とした。[2]とビオチン誘導体のN−
ヒドロキシスクシンイミジルエステルとの反応により良
好な収量で5′ビオチニル化オリゴヌクレオチド[構造
3]が得られ、これをポリアクリルアミドゲル電気泳動
により精製した(以下の実施例3参照)。
実施例3 オリゴヌクレオチドの精製 PCRプライマーまたは捕獲プローブとして使用される
オリゴヌクレオチドは、2つの方法:すなわち(a)ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動、または(b)スピンカ
ラムのいずれかで精製した。
(a)ポリアクリルアミドゲル電気泳動:100〜250μg
ずつの各オリゴヌクレオチドを真空乾燥し、最少量のゲ
ル負荷用緩衝液[TBE(89mMトリス−ボレート、89mMホ
ウ酸、2mM EDTA);90%(v/v)脱イオンホルムアミド;
0.02%(w/v)ブロモフェノールブルー]に再懸濁し、1
00℃で5分加熱し、そしてすばやく氷水浴中で冷却し
た。試料を変性性ポリアクリルアミドゲル[TBE中の15
%(w/v)アクリルアミド(アクリルアミド:ビス−ア
クリルアミド、29:1)(IBI,New Haven,CT)、7M尿素
(IBI)]に負荷し、650Vで4時間電気泳動した。DNAは
薄層クロマトグラフィープレート(Eastman Kodak #13
254セルロース)に紫外線をあてて可視化し、写真をと
り、その後全長オリゴヌクレオチドのゲルバンドを切り
出した。ゲル片を粉砕しそのDNAを37℃で一晩水中に溶
出させた。このDNAをC18Sep−PakRカートリッジ(Water
s Associates,Milford,MA)に通すことによりさらに精
製しそして40%(v/v)アセトニトリル(Fisher)中に
溶出させた。真空下で蒸発乾固させた後、DNAを水に懸
濁させ、その濃度を分光光度計で測定した。原液濃度を
水で調整し、必要時まで4℃で保存した。
(b)スピンカラム:いくつかのオリゴヌクレオチド捕
獲プローブおよびプライマーは、スピンカラムについて
の製造者の説明書に従って、低遠心力でスインギングバ
ケットローター内のBio−SpinTM6カラム(Bio−Rad,In
c.,Richmond,CA)を用いて部分精製した。部分精製後、
オリゴヌクレオチドの濃度を分光光度計で測定し、原液
を水で調整しそして必要時まで4℃で保存した。
実施例4 PCR条件 大部分のプライマー対はPCR増幅のための最適温度条
件を決めるために経験的に試験し、その際特にアニーリ
ング温度に注意を払った。
HTLV−1 tax配列の検出のために、プライマーセットS
K43およびSK44(Kwokら,J.Inf.Dis.,158:1193−1197,19
88)を使用した。このプライマー対を使用する場合、10
0μlのPCR反応混合物は:1×反応緩衝液(RB)[10×RB
=500mM KCl;100mMトリス−HCl,pH8.5;25mM MgCl2];20
0μMずつのdATP、dCTP、dGTP、およびTTP;50pモルずつ
のSK43およびSK44;並びに2単位の組換えTaqDNAポリメ
ラーゼ(Recombi−TaqR,Cetus Perkin Elmer,Norwalk,C
T)から成っていた。
ビオチン−11−dUTPを取り込ませる実験では、反応内
容物は上記の通りであるが、200μMのTTPを160μMの
ビオチン−11−dUTPおよび40μMのTTPで置き換えた。
プライマーセットSK43およびSK44の場合、PCR温度条
件は94℃で5分間の初期の長い変性工程で始まり、次に
50℃で25秒間のアニーリング工程、および72℃で1分間
の伸長工程が続いた。続く28回のサイクルでは、温度条
件は94℃で25秒間の変性、50℃で25秒間のアニーリン
グ、および72℃で1分間の伸長から成っていた。最終
(30回目)サイクルは、94℃で25秒間の変性、50℃で25
秒間のアニーリング、および72℃で10分間の長い伸長か
ら成っていた。PCR増幅後、90μlの反応内容物を鉱油
の下から取り出しそしてPCR産物を分析するまで4℃で
保存した。
実施例5 陽性および陰性対照プラスミド鋳型の作製 HTLV−1の全tax遺伝子を含有するプラスミド(pTA
X)を陽性対照鋳型として用いた。プラスミドDNAの濃度
を分光光度計で測定し、そしてPCR反応へ既知コピー数
のターゲットDNAを供給するために水で希釈した。この
ようにして、陽性対照鋳型が作製された。
異種プラスミドもPCR陰性対照としてHTLV−1 taxプラ
イマーセットと共に使用された。このプラスミドpRT−P
OLはHTLV−1ポリメラーゼ(pol)領域の配列を含有し
ていた。。プラスミドDNAの濃度を測定し、pTAXのとこ
ろで記載したように連続希釈した。プラスミドの濃度
は、PCR反応混合物に加えられる特定容量中に既知コピ
ー数が供給されるように計算された(すなわち、98μl
の反応混合物に2μlの鋳型DNAが加えられる)。
実施例6 HTLV−1 taxターゲットの増幅、未標識アンプリコン 3種類のPCR検出系を平行して直接比較するために、
既知コピー数のプラスミドpTAX(実施例5)をPCRで増
幅させた。プラスミド濃度は1反応あたり1300、100、5
0、20または10コピーの鋳型が供給されるように水で調
整した。HTLV−1 taxプライマーセットSK43/SK44(Kwok
ら,J.Inf.Dis.,158:1193−1197,1988を参照)を合成し
てBio−SpinRスピンカラムで精製し(実施例3参照)、
各プライマーをPCR反応混合物に50pモルの濃度で加え
た。
未標識の増幅DNAはPCR増幅に200μMずつの4種類のd
NTPを用いることにより生成された。これらの未標識PCR
産物は、サザンブロットハイブリダイゼーション(実施
例9)およびオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーショ
ン(OH)(実施例10)アッセイの検出感度を調べるのに
用いられた。増幅は実施例4に記載した反応混合物およ
び温度条件を用いて30サイクル行った。
実施例7 HTLV−1 taxの増幅、ビオチン−11−dUTPの取り込み プライマーセットSK43/SK44によるPCR増幅または、ビ
オチン−11−dUTPの取り込みによってビオチニル化アン
プリコンを作製するためにも実施された。このHTLV−1
tax増幅の条件は先に(実施例6)記載した通りである
が、この反応混合物は200μMずつのdATP、dCTPおよびd
GTP;160μMのビオチン−11−dUTP;40μMのTTPを含有
した。ビオチン標識PCR産物をプレート捕獲ハイブリダ
イゼーション(実施例8)およひサザンブロットハイブ
リダイゼーション(実施例9)の検出感度を調べるのに
使用した。増幅は実施例4に記載した反応混合物および
温度条件を用いて30サイクル行った。
実施例8 プレート捕獲アッセイ 捕獲プレートは、Dynatech ImmulonR2プレートのウ
ェルに1M酢酸アンモニウム中のオリゴヌクレオチド“捕
獲プローブ"SK45(Kwokら,J.Inf.Dis.,158:1193−1197,
1988)25ngを結合させ、37℃で一晩インキュベートする
ことにより作製した。ビオチニル化PCR産物(実施例
7)を1Mグアニジンチオシアネート(GuSCN)で1:25お
よび1:100に希釈し、熱変性させ(100℃で5分間)、す
ばやく氷水浴中で冷却した。各試料および対照として10
0μlを4つのマイクロタイターウェル(3つのSK45捕
獲プローブウェルおよび1つの“ブランク”ウェル)の
それぞれに加え、ハイブリダイゼーションのために室温
で2時間インキュベートした。次に、プレートの内容物
を捨て、プレートを洗浄し、ブロックしそして工程9に
記載されるようにしてアビジン:セイヨウワサビペルオ
キシダーゼで処理した。H2O2およびOPDの添加後、プレ
ートリーダーを用いて490nmで発色を測定した。
プレート捕獲ハイブリダイゼーションの結果を以下に
示す。以下の第1表について言及すると、HTLV−1 tax
に特異的なHTLV−1プライマーSK43/SK44を使用して、
相同鋳型(pTAX)との異種鋳型(pRT−POL)を増幅させ
た場合の、ビオチニル化PCR産物のハイブリダイゼーシ
ョンによる捕獲が示される。ビオチン−11−dUTPはPCR
反応に前駆物質として加えられ(実施例7参照)、そし
てPCR条件は実施例4に記載される通りであった。プレ
ート捕獲アッセイは先に記載したようにして行った。試
料をハイブリダイゼーションのために1M GuSCNで1:25お
よび1:100に希釈し、次にプレートを洗浄し、ブロック
しそしてアビジン:HRPで処理した。OD490はH2O2/OPDで3
5分発色させた後に測定した。以下に示した数字は3通
りの試料の平均である。
陰性対照: 鋳型なし 0.007 0.026 104コピーpRT−POL 0.000 0.042 このアッセイの検出限界はクリーンターゲットプラス
ミド20コピーであると見られた(1:25希釈のOD490は0.1
23であった)。“鋳型なし”陰性対照および異種増幅鋳
型を用いた陰性対照は1:25希釈でそれぞれ0.007および
0.000のOD値を生じ、1:100希釈でそれぞれ0.026および
0.042のOD値を生じた。
実施例9 アガロースゲル電気泳動およびサザンブロットハイブリ
ダイゼーション 未標識(実施例6)およびビオチン標識(実施例7)
PCR産物の両方の一部分(25μl)を真空乾燥させ、5
μl水と2μlアガロースゲル負荷用緩衝液[0.25%
(w/v)ブロモフェノールブルー、0.25%(w/v)キシレ
ンシアノール、30%(v/v)グリセロール]中に再懸濁
しそして0.5μg/mlエチジウムブロミドを含有するTBE中
の3%(w/v)NuSieveRTG(FMC BioProducts,Rockland,
ME)/1%(w/v)Sea Kem(FMC)アガロースゲルに負荷
した。ゲルをUVトランスルミネーターを使って可視化
し、写真をとった。次に、ゲルを0.5N NaOH、1M NaCl中
で30分、次に0.5Mトリス−HCl、pH7.5中で30分処理しそ
して当分野で知られた標準方法に従って、高濃度の塩溶
液中でNytranR(Schleicher and Schuell,Inc.,Keene,H
N)ナイロン膜に一晩ブロッティングした。次に、ブロ
ット(“サザンブロット”)を75℃で30分焼きそして6
×SSPE[1×SSPE=0.18M NaCl、10mM NaPO4、pH7.7、1
mM EDTA];1%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)
(Aldrich ChemicalCo.,Milwaukee,WI);10×Denhardt
試薬[1%(w/v)ずつのフィコール(Pharmacia,Pisca
taway,NJ)、ポリビニルピロリドン(Sigma)、およびB
SA(Sigma)];および50μg/mlサケ精子DNA(熱変性
し、すばやく冷却した)を含有する密封した袋の中で37
℃で1〜4時間プレハイブリダイズさせた。
第2図において、PCR増幅は実施例6および7に記載
した通りであり、アガロースゲル電気泳動、ブロッティ
ング、プレハイブリダイゼーション、およびハイブリダ
イゼーションは本実施例に記載した通りであった。
写真の上半分には、実施例7のビオチン標識PCR産物
が示してある:1300、100、50、20および10コピーのpTAX
の増幅産物(それぞれレーン1−5);PCR“鋳型なし”
陰性対照(レーン6)。
写真の下半分には、実施例6の未標識PCR産物が示し
てある:1300、100、50、20および10コピーのpTAXの増幅
産物(それぞれレーン1−5);PCR“鋳型なし”陰性対
照(レーン6)。
アンプタコン特異的プローブSK45を、当分野で知られ
た標準方法により、ポリヌクレオチドキナーゼ(Boehri
nger Mannheim Biochemicals)を使って32P−ATPで標識
した。ハイブリダイゼーションは、この放射性標識プロ
ーブをハイブリダイゼーション緩衝液(6×SSPE、1%
(w/v)SDS)に4.1×10Hcpm/ブロットの割合で加えた。
60℃で2〜3時間ハイブリダイゼーションを行った後、
ブロットを数回厳密に洗浄し、増感スクリーンを用いて
Kodak X−OMAT ARフィルムの下に−80℃で一晩おいた。
一晩露出後のサザンブロットの検出限界は、ビオチニ
ル化されなかったPCR産物(実施例6)ではプラスミドp
TAXターゲット10コピーであり、そしてビオチニル化さ
れたPCR産物(実施例7)ではプラスミドターゲット20
コピーであった。(第2図のオートラジオグラフの写真
を参照されたい。)“鋳型なし"PCR陰性対照はオートラ
ジオグラフィーで検出可能なシグナルを生じなかった。
実施例10 オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ 第3図に関して述べると、OHアッセイの条件(標準プ
ローブの作製、変性およびアニーリング条件、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動の条件)は本実施例で記載され
る通りであった。
示した写真は一晩露出(−80℃、Kodak X−OMATARフ
ィルム、増感スクリーンを使用)したオートラジオグラ
ムであり、これは1300、100、50、20または10コピーのp
TAX(それぞれレーン1−5);“鋳型なし"PCR陰性対
照(レーン6);HTLV−1 taxを構造的に発現する、PCR
により増幅された104個の抽出Jurkat細胞(レーン7);
PCRにより増幅された104個の抽出Jurkat細胞(レーン
8);OHアッセイのための32P−SK45に増幅DNAが添加さ
れなかったOH陰性対照(レーン9);から生成されたシ
グナルを示す。
プライマーセットSK43/SK44(実施例6)からの未標
識PCR産物を、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーシ
ョンアッセイ(OHアッセイ)により分析して、このアッ
セイ法の検出限界を決定した。この方法は液体ハイブリ
ダイゼーション(LH)についてAbbottら,J.Inf.Dis.15
8:1158−1169(1988)により実質的に記載された通りで
ある。44mM EDTA、66mM NaClで希釈した250,000〜400,0
00cpmの32P標識SK45プローブを含有するプローブ混合物
10μlに、30μlのPCR増幅産物を添加した。DNA混合物
を95℃で5分変性させ、直ちに55℃で15分間プローブに
アニーリングさせた。10μlのアガロースゲル負荷用緩
衝液(実施例9参照)を加え、その半量をTBE中の天然1
0%(w/v)ポリアクリルアミドゲル(アクリルアミド:
ビス−アクリルアミド19:1)に負荷した。電気泳動はブ
ロモフェノールブルーがゲル底先端に到達するまで200V
で行った。ゲルの上半分をKodak X−OMAT ARフィルムに
増感スクリーンを用いて−80℃で3時間および一晩露出
させた。
3時間(図示せず)または一晩露出(第3図)後、10
コピーの増幅プラスミドpTAXターゲットを特定バンドと
してはっきり見ることができる。“鋳型なし”および他
の陰性対照にはバンドが現れなかった。
実施例11 アッセイ比較および結果の考察 プレート捕獲アッセイ(実施例8)は、30サイクルの
PCR増幅(実施例6および7)後に最小コピー数のター
ゲットHTLV−1DNAを検出する能力について、より慣用の
なアッセイであるサザンブロットハイブリダイゼーショ
ン(実施例9)およびオリゴヌクレオチドハイブリダイ
ゼーション(OH)アッセイ(実施例10)と比較した。試
験した3つの検出系(プレート捕獲アッセイ、サザンブ
ロットおよびOHアッセイ)はそれぞれ、30サイクルのPC
R増幅後に小コピー数のクリーンターゲットプラスミド
を検出するそれらの能力において本質的に類似してい
た。プレート捕獲は20コピー、サザンブロットは10〜20
コピー、そしてOHは10コピーのクリーンターゲットを検
出することが分かった。3つの検出系のうちで、プレー
トアッセイが最も速く、数時間で最終結果が得られる。
さらに、サザンブロットおよびOHアッセイが主観的なオ
ートラジオグラムバンドを生ずるのに対して、プレート
アッセイは数字によるOD値を生ずる。従って、本発明に
より試料の“陽性度”の客観的数値測定、および陽性度
の下限に関する客観的カットオフ値の計算が可能とな
る。(このカットオフ値は計算された統計的有意性の度
合により試料が陰性であるとみなされる最大OD値であ
る。) また、プレートアッセイにより与えられるOD値によ
り、診断テストの確認の際に重要な“シグナル対ノイ
ズ”比の定量的測定が可能となる。サザンブロットハイ
ブリダイゼーションおよびOHアッセイの場合は、“シグ
ナル対ノイズ”は単にオートラジオグラフィーからのシ
グナルの視認による評価により概算できるにすぎない。
実施例12 クラミジア・トラコーマチス配列の検出 クラミジア・トラコーマチスを特異的に検出するため
に、2組のプライマーおよび捕獲プローブを合成した。
オリゴヌクレオチド配列はC.トラコーマチスL1抗原種の
潜伏プラスミドから選ばれた(Hattら,Nucleic Acids R
esearch,16:4053−4067,1988)。
プライマーセットAは下記プライマーを用いると、20
8bpの特定アンプリコンを生成した: CP−24(25マー、+極性、塩基195−219) 5′GGG ATT CCT GTA ACA ACA AGT CAG G 3′、すなわ
ち、このプライマーは下記配列に結合するか、または該
配列から伸長(elongation)を引き起こすオリゴヌクレ
オチドである: 5′C CTG ACT TGT TGT TAC AGG AAT CCC 3′、 CP−27(26マー、−極性、塩基377−402) 5′CCT CTT CCC CAG AAC AAT AAG AAC AC 3′、すなわ
ち、このプライマーは下記の配列に結合するか、または
該配列から伸長を引き起こすオリゴヌクレオチドであ
る: 5′GT GTT CTT ATT GTT CTG GGG AAG AGG 3′。
プライマーセットAからの208bp特定アンプリコンは捕
獲プローブCP−35を用いて検出した: CP−35(26マー、−極性、塩基235−260) 5′CAT AGC ACT ATA GAA CTC TGC AAG CC 3′、 すなわち、このプローブは下記の配列に結合するオリゴ
ヌクレオチドである: 5′GG CTT GCA GAG TTC TAT AGT GCT ATG 3′。
クラミジアプライマーセットBは下記プライマーを用
いると、173bpの特定アンプリコンを生成し: CP−37(23マー、+極性、塩基678−700) 5′GTC CTG CTT GAG AGA ACG TGC GG 3′。
すなわち、このプライマーは下記配列に結合するか、ま
たは該配列から伸長を引き起こすオリゴヌクレオチドで
ある: 5′CC GCA CGT TCT CTC AAG CAG GAC 3′ CP−38(24マー、−極性、塩基827−850) 5′CTC CCA GCT TAA GAA CCG TCA GAC 3′。
すなわち、このプライマーは下記配列に結合するか、ま
たは該配列から伸長を引き起こすオリゴヌクレオチドで
ある: 5′GTC TGA CGG TTC TTA AGC TGG GAG 3′。
プライマーセットBからの173bp特定アンプリコンは
捕獲プローブCP−39を用いて検出した: CP−39(23マー、−極性、塩基726−748) 5′TGT CTT CGT AAC TCG CTC CGG AA 3′、 すなわち、このプローブは下記配列に結合するオリゴヌ
クレオチドである: 5′TT CCG GAG CGA GTT ACG AAG ACA 3′。
プライマーセットBはターゲットプラスミドpCHL−1
を増幅させるのに使用した。5′ビオチニル化プライマ
ーを用いて、30サイクルのPCRによりターゲットを増幅
させ、ビオチニル化産物を捕獲ハイブリダイゼーション
により試験した(第2表)。10分の発色(TMB/H2O2
後、20ほどの少ない出発コピーのpCHL−1が無視しうる
ほどわずかのバックグラウンドシグナル(1:25希釈、OD
450=0.009)しか伴わずに検出できた(1:25希釈、OD
450=0.140)。
陰性対照 鋳型なし 0.009 0.000 実施例13 クラミジア・トラコーマチスに感染したMcCoy細胞およ
び臨床単離物の検出 C.トラコーマチスに感染したか、または感染していな
いMcCoy細胞を100μg/mlのプロテイナーゼK、1%Twee
n−20、を含有する2SP(20mMリン酸ナトリウム緩衝液、
pH7.2、2Mスクロース)中で溶解させそして55℃で1時
間、次に95℃で10分間インキュベートした。30サイクル
のPCR増幅においてプライマーセットA(実施例12)を
使用し、増幅産物を実施例8記載のプレートアッセイに
より試験した。10分の発色後、10および100個の感染McC
oy細胞は、105個の非感染McCoy細胞にスパイクした場
合、両方とも(GuSCN中への産物の1/25および1/100希釈
の両方に関して)>2.000のOD450値を生じた。抽出およ
び増幅された非感染細胞(105細胞)のみでは<0.050の
OD450値を生じた。
細胞変性効果(CPE)の程度を[“陰性”(CPEなし)
から4+(最も顕著なCPE)までの範囲で]予め等級を
付けた臨床標本を、同様に抽出しそしてプライマーセッ
トAを用いる30サイクルのPCRにより増幅させた。この
アッセイの結果を第3表に示す: 要約すると、PCRの増幅産物を標識しそして検出する
新規方法がここに開示される。これらの標識および捕獲
方法により慣用の検出方法に比較していくつかの利点が
提供される: 1.ビオチニル化およびマイクロタイタープレートへのPC
R産物の捕獲はより迅速なアッセイである。OHアッセイ
が約6〜24時間、サザンブロッティングおよびハイブリ
ダイゼーションが48時間くらいであるのに比べ、本発明
によるプレートアッセイは2時間で達成される。
2.プレートアッセイはより労働集約的でなく、多数の試
料の分析を自動化することができる。
3.試験した他の2つのアッセイ法と異なり、プレートア
ッセイ法は高い比活性を有する危険な放射性標識プロー
ブの調製、精製または取扱いを必要としない。
4.プレートアッセイを介したビオチニル化産物の捕獲に
より、ハイブリダイゼーションの客観的定量的評価;試
料の陽性度についての統計的カットオフ値の算出;およ
びアッセイ“シグナル対ノイズ”比の定量的計算ができ
る。
当分野で習熟した者には明らかであるように、本発明
の多くの修飾および変更がその精神および範囲を逸脱す
ることなく行われうる。ここに記載した特定の実施態様
は単に例示として提供されたものであり、本発明は添付
の特許請求の範囲によってのみ制限されるものである。
【図面の簡単な説明】
第1図は、オリゴヌクレオチドPCRプライマーのビオチ
ニル化を可能にするように修飾された化学リンカーアー
ムの調製を示す。 第2図は、NytranR膜に結合されたPCR産物のオートラジ
オグラムの結果を示す。 第3図は、実施例6のPCR産物を用いたオリゴヌクレオ
チドハイブリダイゼーション(OH)アッセイの結果を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マイケル アンソニー サルズィンスキ ー アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10977,スプリング バリー,アラン ロード 61 (56)参考文献 特開 昭63−243875(JP,A) Res.Microbiol,Vo l.140 (1989−Jan) P.7− 16

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】クラミジア・トラコーマチス(Chlamydia
    trachomatis)のターゲット核酸配列を検出するための
    検査キットであって、次の配列: に結合するかまたは上記配列から伸長を引き起こすオリ
    ゴヌクレオチドであるPCRプライマー、および上記ター
    ゲット配列と実質的に相補的な核酸配列を有するオリゴ
    ヌクレオチド捕獲プローブを結合させた複数のウェルを
    有するマイクロタイタープレート、を含んでなる検査キ
    ット。
  2. 【請求項2】PCRによる前記ターゲット核酸配列の増幅
    および捕獲プローブとターゲット配列とのハイブリダイ
    ゼーションを実施するための少なくとも1つの試薬をさ
    らに包含する、請求項1に記載の検査キット。
  3. 【請求項3】TaqポリメラーゼおよびdNTPをさらに包含
    する、請求項2に記載の検査キット。
  4. 【請求項4】1以上のdNTPが標識物質を含む、請求項3
    に記載の検査キット。
  5. 【請求項5】少なくとも1つの前記PCRプライマーが
    5′末端でリンカーアーム修飾を介してビオチン化され
    ている、請求項1に記載の検査キット。
  6. 【請求項6】前記マイクロタイタープレートが増強され
    た蛋白結合能を有するポリスチレンから構成されてい
    る、請求項1に記載の検査キット。
  7. 【請求項7】前記プローブが次の配列: に結合するオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載
    の検査キット。
  8. 【請求項8】次の配列: に結合するかまたは上記配列から伸長を引き起こすオリ
    ゴヌクレオチドである、クラミジア・トラコーマチスの
    核酸ターゲット配列のPCR増幅において使用するための
    プライマー。
  9. 【請求項9】請求項8のプライマーを用いて増幅された
    DNA配列のハイブリダイゼーションアッセイに用いるた
    めの、次の配列: に結合するオリゴヌクレオチドであるプローブ。
  10. 【請求項10】PCR増幅およびハイブリダイゼーション
    アッセイによりクラミジア・トラコーマチスを検出する
    方法であって、該PCR増幅において次の配列: に結合するかまたは上記配列から伸長を引き起こすオリ
    ゴヌクレオチドであるプライマーを使用することを特徴
    とする方法。
  11. 【請求項11】前記ハイブリダイゼーションアッセイが
    さらに捕獲プローブを使用し、該捕獲プローブが次の配
    列: に結合するオリゴヌクレオチドである、請求項10に記載
    の方法。
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