JPH03206898A - クラミジア・トラコーマチスの検出方法およびそのためのキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、増強された蛋白結合能を有するポリスチレン
固形支持体上でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲと略す
）により増幅されたＤＮＡのハイブリダイゼーション捕
獲方法を提供する。好ましくは、かかる固形支持体は複
数のウェルを有するマイクロタイタープレートである。

ＰＣＲ反応での増幅中にターゲットＤＮＡを（例えば、
ビオチンで）標識した後、標識されたＤＮＡをマイクロ
タイターウェルに受動的に結合されたアンブリコン（ａ
ｍｐｌｉｃｏｎ）特異的オリゴヌクレオチド捕獲プロー
ブへの塩基対ハイブリダイゼーションにより特異的に捕
獲する。標識としてビオチンが使用される場合は、アビ
ジン：ＨＲＰ複合体を加え、そして（ａ）過酸化水素基
質および。−フェニレンジアミン（ＯＰ　Ｄ）色原体ま
たは（ｂ）過酸化水素基質およびテトラメチルベンジジ
ン色原体（ＴＭＢ）と反応させる。比色定量シグナルか
発生し、これによりＰＣＲ増幅ＤＮＡの定量的検出か可
能となる。

ビオチニル化ＰＣＲ産物のプレート捕獲の感度は、サザ
ンブロットハイプリダイゼーションおよびオリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーション（ＯＨ）アッセイで放射
性標識プローブを用いた場合の感度に類似することが判
明している。しかしながら、プレート捕獲方法ではいく
つかの利点か提供される：すなわち（ａ）より迅速なア
ッセイ時間；（ｂ）放射性標識プローブを使用せず、労
働集約度が比較的少ないアッセイ方法；および（Ｃ）ハ
イブリダイゼーションの客観的、定量的評価。

本発明の別の面は、病原微生物を特徴とする特定ＤＮＡ
配列の存在を検出することによる特定疾病状態の診断に
関する。この種の微生物の１つ、すなわちクラミジア・
１〜ラコーマチス（Ｃｈ　ｌａｍｙｄ　ｉａｔｒａｃｈ
ｏｍａｔｉｓ）に特異的なプローブおよびプライマーか
発見された。

本発明のさらに別の面はＤＮＡ配列を検出するためのキ
ットを提供することで、該キットはポリスチレン固形支
持体およびＰＣＲ試薬セット（捕獲プローブとハイブリ
ダイズするターゲットＤＮＡ配列の増幅のために予め選
ばれた特異的プライマーおよびプローブを含有）を包含
する。このようなキットは代表的にはＰＣＲ反応に必要
な１種以上の酵素、好ましくはＴ　ａ　ｑ　（Ｔｈｅｒ
ｍｕｓ　ａｑｕａ−ｔｉｃｕｓ）ポリメラーゼのような
熱安定性酵素をも包含しよう。マイクロタイタープレー
トを使用する場合、それらは特定ターゲット配列のため
の捕獲プローブかすてに結合されたマイクロタイタープ
レートを包含しよう。

［従来の技術］ 米国特許第４　、６８３．１９５号および同第４．６８
３．２０２号は、゛ポリメラーゼ連鎖反応”　（ＰＣＲ
）として当分野で知られた技法によるＤＮＡ配列の増幅
方法を開示している。このポリメラーゼ連鎖反応は、相
補鎖の多重プライマー伸長１含成によってＤＮＡを特異
的に増幅させる技法である（Ｓａｉｋｉら。

５ｃｉｅｎｃｅ、　２３０：１３５０−１３５４および
２３９：４８７−４９１；　１９８５、１９８８）。１
０’〜１０１倍にまで増幅されるＰＣＲ産物は、ゲル電
気泳動またはここに記載される他の方法により検出でき
るばらばらの寸法のＤＮＡ断片（アンブリコン）である
。簡単に述べると、ＰＣＲは、増幅させて次に検出する
ことを意図する既知“ターゲット”配列の両末端に対応
する短鎖オリゴヌクレオチドプライマーの調製を伴う。

この技法では、ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞、組織、体液
などから抽出する。核酸を変性させ、そして過剰モル量
のオリゴヌクレオチドプライマーをｄＮＴＰ（デオキシ
リボヌクレオチド三リン酸）およびＤＮＡポリメラーゼ
酵素（好ましくは、耐熱性Ｔａｑポリメラーゼ）と共に
加える。その後熱変性させ、冷却させてプライマーにア
ニーリングさせ、そしてＤＮＡポリメラーゼによってプ
ライマー伸長させると、それぞれのプライマーから開始
する２本の゛°長鎖産物″が生成され、これらはもとの
２本のＤＮＡ鎖に相補的である。この方法を繰り返し、
２回目のサイクルの後で、２本のもとのＤＮＡ鎖、サイ
クル１からの２本の長鎖産物、２本の新たな“長鎖産物
”、および２本の゛短鎖産物″が生成される。これらの
短鎖産物（アンブリコン）の長さは両プライマーを含め
たこれらのプライマー間のヌクレオチドの数に等しい。

付加的なサイクルにより、付加的な“長鎖産物”が生成
され、サイクル毎に直線的様式で増加する。しかしなが
ら、アンブリコンの形−成は各サイクルと共に指数的に
増加し、この増幅方法により、極微量のＤＮＡの検出が
可能となる。

ＰＣＲ技法の使用により、わずかな量で存在する特定Ｄ
ＮＡ配列の検出が可能である。これらの技法のいくつか
は、ある種の材料に固定された種々のプローブの使用を
包含する。

以下で詳しく述べるように、本発明は、マイクロタイタ
ーウェルへの捕獲ＤＮＡ配列の固定、および標識した（
すなわち、ビオチニル化した）アンブリコンとのハイブ
リダイゼーションによるその後の検出を利用するもので
ある。また、本発明はハイブリダイゼーション工程での
グアニジンチオシアネートの使用をも包含する。これと
関係のある方法が文献にい（つか記載されている。２つ
のこのような報告は、マイクロタイターウェルへの大型
ターゲットＤＮＡの固定化、続いてビオチニル化オリゴ
ヌクレオチドまたはニックトランスレーションにより標
識したＤＮＡプローブへのこれらのターゲットのハイブ
リダイゼーションを開示している。

Ｃｏｏｋら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ、　　１６：４０７７−４０９５　（１９８８
）は、１Ｍ酢酸アンモニウム中でターゲットＤＮＡを３
７℃で１，５〜２時間インキュベートすることにより、
　ＩｍｍｕｌｏｎＲ２プレートのマイクロタイターウェ
ルにバクテリ゛オファージＭ１３ターゲットＤＮＡを固
定化した。固定化されたターゲットＤＮＡは、末端ビオ
チン標識化または内部ビオチン標識化オリゴヌクレオチ
ドプローブへのハイブリダイゼーション、続いてハイブ
リダイゼーションの比色定量検出のためのストレプトア
ビジン−ＨＲＰ複合体および過酸化水素１０−フェニレ
ンジアミン（ＯＰＤ）の添加後に検出された。

Ｎａｇａｔａら、　　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、　　１８
３：　３７９−３８２　（１９８５）は、０．１Ｍ　Ｍ
ｇＣ１ｚを含有するＰＢＳ中でラムダターゲットＤＮＡ
をマイクロタイターウェルに固定化した。室温で一晩イ
ンキユベーションし、次に溶液を除去した後、プレート
に紫外線を照射した。

ビオチニル化にツクトランスレーションされた）ラムダ
ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションを行い、そ
の後アビジン−β−ガラクトシダーゼと複合体を形成さ
せた。基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラ
クトシドの添加後、蛍光を測定した。

Ｈｅｖｅｙらの米国特許第４　、２２８．２３７号は、
液体媒体中のリガンドを検出するために、アビジン（酵
素に共有結合で結合）と反応性のビオチンを使用する方
法を開示した。本発明方法は、リガンドが中間体のビオ
チン標識抗リガンドで標識されるのではなく、直接ビオ
チンで標識される点で相違する。さらに、他の種々の従
来文献が特異的ハイブリダイゼーションプローブおよび
その診断用途について記載している。例えば、米国特許
第４．３５８゜５３５号（Ｆａｌｋｏｗら）および欧州
特許出願第８２３０１８０４．９号（公開第６３．８７
９号；エール大学）を参照されたい。後者の文献はアビ
ジンまたはビオチン特異的抗体に結合された酵素により
検出されるビオチン標識ＤＮＡプローブの使用を開示し
ている。

Ｒａｎｋｉ　らの米国特許第４　、４８６．５３９号は
、ＤＮＡハイブリダイゼーションにより微生物を検出・
同定するために、２種類の重複しない核酸試薬（−方は
固形支持体に結合され、他方は標識される）の使用を開
示している。本発明は、ターゲット核酸自体が標識され
、検出用の別の標識核酸プローブの使用を必要としない
点で相違する。

５ｔａｂｉｎｓｋＹの米国特許第ｙｌ　、　７５１．１
７７号は、ターゲットＤＮＡが溶液中でメジエータ−ポ
リヌクレオチドおよび標識プローブポリヌクレオチドに
ハイブリダイズされるＤＮＡ検出法を開示した。メジエ
ータ−ポリヌクレオチドは固形支持体上に固定化された
ポリヌクレオチドと相補的である。本発明は、（ａ）タ
ーゲットが増幅中に標識され、検出用に標識されたリポ
ータ−基を必要としない：および（ｂ）捕獲プローブが
メジエータ−ポリヌクレオチドを使用せずに固形支持体
に直接結合される；という点で相違する。

グアニジンチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）は細胞抽出お
よびその後の核酸ハイブリダイゼーションに使用されて
いる。例えば、ＴｈｏｍｐｓｏｎおよびＧ１１ｌｅｓｐ
ｉｅ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　　１６３：
　２８１−２９１　（１９８７）は、ターゲットＤＮＡ
またはＲＮＡを検出するための放射性標識ＲＮＡプロー
ブを調製した。ドツトプロットフォーマットにおいて、
２２Ｐ標識プローブを５　Ｍ　ＧｕＳＣＮｌｏ、　ＩＭ
　　：Ｌチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ニナトリウ
ム塩、ｐＨ８，０中でハイブリダイズさせた。Ｐｅｌｌ
ｅｇｒｉｎｏら、　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ。

５　：　４５２−４５９　（１９８７）は、血球中のＨ
ＩＶ−ＲＮＡを検出するための溶液ハイブリダイゼーシ
ョンを開示した。血球を５　Ｍ　ＧｕＳＣＮｌｏ、　Ｌ
Ｍ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ中に溶解させ、同一溶液中で放射
性標識ＲＮＡプローブと室温にてハイブリダイズさせた
。ＴＣＡ沈澱ハイブリッドを膜上に集め、シンチレーシ
ョン計数により放射能を測定した。Ｇ１１ｌｅｓｐｉｅ
の国際特許出願ＰＣＴ／１Ｊｓ８７１０１０２３　（国
際公開ＷＯ３７１０６６２１）は、固形支持体に結合さ
れたターゲットＤＮＡを検出するために標識プローブを
用いる分子ハイブリダイゼーションにおけるグアニジン
チオシアネートの使用を開示した。この特許は分子ハイ
ブリダイゼーションのために３Ｍ〜６．５ＭＬｙ）濃度
範囲にわたるＧｕＳＣＮを周囲温度で使用することにつ
いて開示している。このようなハイブリダイゼーション
の手順には、ニトロセルロースまたはナイロン膜へのタ
ーゲット核酸の結合（ドツトプロットまたはサザンプロ
ット）、プレハイブリダイゼーション、ＧｕＳＣＮ中て
の放射性標識プローブとのハイブリダイゼーション、洗
浄、およびオートラジオグラフィーによる検出が含まれ
る。

［発明の開示］ ここで用いる用語゛オリゴヌクレオチド″および゛プラ
イマー″は、上記の米国特許第４　、６８３．２０２号
において定義される意味を有しよう。ここで用いる用語
゛捕獲プローブは、プライマーの境界の内側にあるアン
ブリコンの配列と完全にまたは実質的に相補的なオリゴ
ヌクレオチドとして定義されよう。本発明の好適な実施
態様では、捕獲プローブはその末端にデオキシリボヌク
レオチドまたはりポヌクレオチドが付いていないか、付
いていてもよい。

本発明の実施に際して、プライマーおよびプローブは増
幅しようとするターゲット配列のそれぞれの鎖と゛実質
的に”相補的であるように選ばれる。

ここに記載する詳細な実施態様の１つとして、２組のＰ
ＣＲプライマーおよび捕獲プローブがクラミジア・トラ
コーマチスＬｌ抗原種（５ｅｒｏｖａｒ）の潜伏プラス
ミドのヌクレオチド配列から選ばれた（Ｈａｔｔら、　
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　　
１６：４０５３４０６７、１９８８）。このことにより
Ｃ，トラコーマチスの特異的増幅および検出か可能とな
った。−射的な他の目的のためには、個々のターゲット
に対するプライマーおよびプローブの選択が上記の米国
特許第４　、６８３．２０２号に記載されている。

先に述べたＰＣＲの適用により生成する増幅配列（アン
ブリコン）を捕獲するための既知技法の変更および改良
として、本発明は、その好適な実施態様において、ビオ
チン標識アンブリコンを（配列特異的ハイブリダイゼー
ションにより）捕獲するためにマイクロタイタープレー
トのウェルに受動的に結合されたオリゴヌクレオチド捕
獲プローブを利用する。次に、ビオチニル化アンブリコ
ンに対してアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ
を使用し、これと基質（過酸化水素）および色原体（Ｏ
Ｐ、ＤまたはＴＭＢ）との反応により定量的な比色測定
シグナルが生成される。

さらに、上記の米国特許第４　、６８３．２０２号に記
載されるように、デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄ
ＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびＴＴＰをも合成混合
物に十分な量で加え、得られた溶液を鋳型鎖を分離する
ために約９０〜１００°Ｃで約０．５〜１０分加熱する
。この加熱時間後、溶液をプライマー／鋳型アニーリン
グに好適な温度に速やかに冷却する。この混合物には、
プライマー伸長反応を誘導または触媒するのに好適な物
質か加えられ、当分野で知られた条件下で伸長反応を行
わせる。

誘導物質はプライマー伸長産物の合成を達成するように
機能する、酵素を含めた任意の化合物または系てあり得
る。このための適当な酵素には、例えばエシェリヒア・
コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ、コ
リＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片、Ｔ４　ＤＮＡ
ポリメラーゼ、他の入手可能なりＮＡポリメラーゼ、逆
転写酵素、およびその他の酵素類か含まれ、好ましくは
各核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物を形成するのに
適した様式でヌクレオチドの取り込みを促進する熱安定
性酵素（すなわち、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ）が包
含される。

新たに合成された核酸鎖とその相補核酸鎖が二本鎖分子
を形成し、これらの鎖は一本鎖分子を生成させるための
任意の変性手段（好ましくは、熱）を使って分離される
。

新しい核酸は一本鎖鋳型分子上に合成される。

付加的な酵素、ヌクレオチドおよ、びプライマーが先に
指定した条件下で反応を進行させるために必要に応じて
添加できる。この場合も、合成はオリゴヌクレオチドプ
ライマーの一端で開始されて一本鎖鋳型に沿って進行し
、その結果プライマー伸長によりさらに相補核酸が生成
される。

鎖分離および伸長産物合成の工程は、希望する量の増幅
核酸配列を作るのに必要な回数反復すことができる。

一般的な標識技術 一般的に、本発明では、検出可能（かつ好ましくは定量
可能）な指標またはシグナルを生成させ、しかも核酸に
結合されるかまたは取り込まれうる任意の物質（分子、
原子）か使用できる。

本発明の好適な実施態様では、ＰＣＲ増幅中にビオチン
標識を取り込むアンブリコンを作るために２つの方法が
採用される。第１の場合には、ビオチン−１１−ｄＵＴ
Ｐ　（ビオチン標識で化学修飾されたＴＴＰ類似体）が
ＰＣＲ反応においてＴＴＰと部分的に置き換わる。ビオ
チン−１１−ｄＵＴＰはプライマー伸長反応中にＴａｑ
　ＤＮＡポリメラーゼにより取り込まれ、生成するＤＮ
Ａ産物はビオチンで“内部的に“標識される。

第２の場合には、化学“リンカ−アーム”が、固形支持
体に結合されたオリゴヌクレオチドの５′末端に結合さ
れる。好適な実施態様においては、ここで用いられる“
リンカ−アーム”は５プライマー末端に（ホスホルアマ
ダイト化学により）化学的に結合されており、かつオリ
ゴヌクレオチドに１個以上のアミノ基を共有結合で連結
させうる分子である。アミノ基か次にビオチン−Ｘ−Ｎ
Ｈ３てビオチニル化される。これらの５′ビオチン標識
オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応でプライマーとして
使用したとき、それらの５′末端でビオチニル化された
アンブリコンを生成する。

゛′リンカーアーム”はオリゴヌクレオチド配列から標
識を隔てるスペーサーとして作用するに足る長さをもち
、しかも１以上の標識、熱安定性酵素またはリガンドの
結合を受は易い分子であることができる。

本発明の好適な実施態様においては、これら２つのビオ
チン標識方法（ビオチン−１１−ｄＵＴＰの取り込みお
よび５′ビオチン標識プライマー）のいずれか一方また
は両方を用いて、ＰＣＲの増幅産物を標識することがで
きる。

ビオチンのほかに、本発明では、放射性標識化合物、発
光または蛍光試薬、電子高密度試薬、熱安定性酵素、リ
ガンド、抗体−ノ１ブテン複合体、およびキレート形成
剤を含めた他の標識も使用できる。代替標識はＰＣＲ増
幅の温度条件、並び（こ変性および捕獲ハイブリダイゼ
ーションの条件に適合しうるちのでなければならない。

代替標識の１つの例は、ビオチン−１１−ｄＵＴＰと同
様に標識増幅ＤＮＡにＴａｑポリメラーゼにより取り込
まれるジゴキ・シゲニンー１ｌ−ｄＵＴＰである。ジゴ
キシゲニン標識アンブリコンは次にアルカリホスファタ
ーゼと結合したジコ゛キシゲニンに対する抗体との反応
に続くここに記載の標準比色定量検出により検出できる
。

代替標識の他の例は３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド三
リン酸であり、これもＰＣＲ反応混合物中で未標識デオ
キシヌクレオチド三リン酸と部分的に置き換わるべく使
用できる。捕獲／％イブリダイセーションの程度は、例
えば捕獲ハイブリダイゼーションおよび洗浄後に、取り
はずし可能なマイクロタイターウェルのシンチレーショ
ン計数（以下の工程２に記載する）によって判定できよ
う。

ポリスチレン固形支持体 本発明で用いる捕獲プレートまたは固形支持体は、増強
された蛋白結合能を有するポリスチレン固形支持体であ
ろう。この種の増強を達成するためのかかる支持体の処
理法は当分針でいろいろ知られている（例えば、６０Ｃ
Ｏの照射）。

ポリスチレン固形支持体はいくつかの形態をとることが
できる：例えば、マイクロタイタープレート、微小磁性
粒子（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、　Ｉｎ
ｃ。

から入手可能）、ビーズ、ストリップ、デイツプスティ
ックなど。

好ましくは、本発明で用いるポリスチレン固形支持体は
複数のウェルを有する蛋白結合能の増強されたマイクロ
タイタープレートであろう。このようなマイクロタイタ
ープレートのうちて最適なものは’Ｄｙｎａｔｅｃｈ　
ＩｍｍｕｌｏｎＲ２”　（ＤｙｎａｔｅｃｈＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ
；　　ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）と
して知られるものである。

−射的なハイブリダイゼーション技法 本発明の好適な実施態様では、アンブリコン特異的オリ
ゴヌクレオチド捕獲プローブを、１Ｍ酢酸アンモニウム
の溶液中２５ｎｇ　ＤＮＡ／ウェルの濃度でＩｍｍｕｌ
ｏｎＲ２ポリスチレン製マイクロタイタープレートのウ
ェルに受動的に結合させる。この種のマイクロタイター
プレートは多数のウェルを有しており、従って高表面積
を与えかつ数多くの同時アッセイ（例、９６）を可能に
する。

捕獲プローブの受動結合、に加えて、別の結合方法も使
用することができ、例えば共有結合：媒介蛋白（例、Ｂ
ＳＡ）を介しての結合；および他の任意の化学的手段に
よる結合：が含まれるか、これらに限定されない。

本発明のハイブリダイゼーション工程、より詳しくは“
捕獲ハイブリダイゼーション”、は好ましくは１Ｍグア
ニジンチオシアネート、２０ｍＭエチレンジアミン四酢
酸（ＥＤＴＡ）ニナトリウム塩、ｐＨ８，０の存在下で
行なわれる。マイクロタイタープレート捕獲ハイブリダ
イゼーションを行うための濃度範囲は好ましくは０．５
〜２．０Ｍ、最も好ましくは１．０〜２、ＯＭ　ＧｕＳ
ＣＮである。

捕獲ハイブリダイゼーションを行うためには、他の試薬
類も使用できる。例えば、グアニジンチオシアネートの
代わりにアンモニウムチオシアネートの溶液（０，５〜
５．０Ｍ、最も好ましくは５．０Ｍ）が使用できる。

グアニジンチオシアネートの他の可能な代替物質は、３
０％（Ｖ／Ｖ）脱イオンホルムアミド；３×ＳＳ　Ｐ　
Ｅ　［１ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ＝０．１８Ｍ　ＮａＣ１；
　１０ｍＭ　ＮａＰＯ４゜ｐＨ７，７；　１ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡ］　　；　５％（ｗ／ｖ）硫酸デキストラン；０
．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（オクチルフェノキシ
ポリエトキシエタノール；　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）から成る
試薬である。

かかるハイブリダイゼーション法には以下の工程か包含
される： ■、捕獲プローブの作製 ２、マイクロタイター捕獲プレートの作製３、増幅され
標識されたＤＮＡの希釈および変性４、捕獲ハイブリダ
イゼーション ５、洗浄 ６、ブロック ７、アビジン：セイヨウワサビベルオキシダーゼの添加 ８、洗浄 ９、基質および色原体の添加；発色 １０、プレート読み取り（定量）。

ここで、これらの工程を詳しく説明することにする。

１、捕獲プローブの作製 本発明の捕獲プローブはプライマーの境界の内側にある
アンブリコンの配列と゛実質的にパ相補的となるように
選ばれる。それゆえ、捕獲プローブは捕獲ハイブリダイ
ゼーション条件下でアンブリコンと特異的にハイブリダ
イズするに十分に相補的であらねばならない。好適な実
施態様においては、捕獲プローブは代表的には２０〜２
００ヌクレオチドを含有する。

さらに、２種以上の捕獲プローブを使用してもよく、標
識アンブリコンの同−鎖または反射鏡を捕獲するために
付加的な捕獲プローブを使用することかできる。

捕獲プローブはここでは゛プライマーの境界の内側にあ
るアンブリコンの配列”と定義されるが、プライマー自
体またはプライマー配列を含有するオリゴヌクレオチド
も捕獲プローブとして使用できる。しかしながら、かか
るオリゴヌクレオチドを捕獲プローブとして用いる場合
は、それらは反応産物から除去されなかったＰＣＲプラ
イマーとハイブリダイゼーション中に競合するに違し）
なし１ことに注意すべきである。

本発明の捕獲プローブおよびＰＣＲプライマーは、Ｍｉ
ｌｌｉＧｅｎ　７５００　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚ
ｅｒ　（ＭｉｌｌｉＧｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、　　
Ｉｎｃ、、　Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、　ＭＡ）を用しＡ
て、標準β−シアノエチルホスホルアマダイト化学によ
り合成されたか、当分野で知られた他の方法も可能であ
る。使用に先立ち、捕獲プローブおよびＰＣＲブライマ
ーを１５％（Ｗ／Ｖ）ポリアクリルアミドゲルによる電
気泳動またはスピンカラムにより部分精製した（実施例
３参照）。最終的な部分精製捕獲プローブおよびプライ
マーを水に懸濁させ、その濃度を分光光度計で測定し、
そして必要時まで４°Ｃで保存した。

ここに記載の捕獲プローブは合成的に作製されるか、そ
うである必要はない。それは標準方法（例えば、制限エ
ンドヌクレアーゼ消化）により調製された天然に存在す
るＤＮＡの断片として得ることもできる。

２、捕獲プレートの作製 オリゴヌクレオチド捕獲・プローブは好ましくはＤｙｎ
ａｔｅｃｈ　［ｍｍｕｌｏｎＲ２ポリスチレン製マイク
ロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、。

Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、　ＶＡ　；　Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）のウェルに固定される。Ｉ
ｍｍｕｌｏｎＲＲ２プレートは単一のプラスチック製プ
レートに９６個の小型ポリスチレンテストチューブ（ウ
ェル）が配置され、微量の固相イムノアッセイ操作に一
般的に使用するだめに設計されたものである。本発明の
好適な実施態様では、平底ウェル（容量４００μｍ）を
有するプレートが用いられるが、“Ｕ”底ウェル（容量
３００μｍ）も使用できると考えられる。

別の好適な実施態様として、プローブをＩｍｍｕｌｏｎ
”ＲｅｍｏｖａｗｅｌｌＲストリップ（Ｄｙｎａｔｅｃ
ｈ）に固定することもでき、このストリップはマイクロ
タイタープレート法におけるＲｅｍｏｖａｗｅｌｌＲス
トリップホルダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）に取り付けられ
る１２個のＩｍｍｕｌｏｎＲ２ポリスチレンテストチュ
ーブ（ウェル）を有する取りはずし可能なストリップで
ある。

オリゴヌクレオチド捕獲プローブは、１Ｍ酢酸アンモニ
ウム（Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　Ｆａｉ
ｒ　Ｌａｗｎ。

ＮＪ）　５０μｍ中２５ｎｇ／マイクロタイターウェル
となるように希釈する。また、“ブランクウェル”がウ
ェル（擬似ハイブリダイゼーションのために標識ＰＣＲ
産物があとて加えられる）に１Ｍ酢酸アンモニウム（オ
リゴヌクレオチド捕獲プローブを含まない）を加えるこ
とにより用、意される。これらのブランクウェルはマイ
クロタイタープレートのウェルへのビオチニル化ＤＮＡ
の非特異的結合を示すものであり、プレート読み取り装
置（分光光度計）を較正するために用いられる（以下の
工程１０参照）。

プレートをマイラープレートシーラー（Ｄｙｎａｔｅｃ
ｈ）を使って密封し、ポリスチレン表面にオリゴヌクレ
オチド捕獲プローブを受動固定させるために３７°Ｃで
一晩インキユベートする。このプレートをすぐに使用し
ない場合は、必要時までそれらを４°Ｃで保存する。こ
のようにして６週間まで保存したプレートはそれらのＤ
ＮＡ捕獲能に有意な差がなかった。

ハイブリダイゼーションの直前に、プレートのウェルを
２００μｍの２ＸＳＳＣ［１ＸＳＳＣ＝０、１５Ｍ　Ｎ
ａＣ１；　１５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液。

ｐＨ７，０］で２回、そして２００μｍの２ＸＳＳＣ。

０．１％（ｖ／ｖ）　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００で１回
洗浄する。ここに記載のすべてのプレート洗浄は多重チ
ャンネルピペット装置（例、　Ｔｉｔｅｒｔｅｋ″）を
用いて行われるか、適当な自動マイクロタイタープレー
ト洗浄機を用いて行うこともてきる。

３、増幅され標識されたＤＮＡの希釈および変性ビオチ
ニル化ＰＣＲ産物をＩ　Ｍ　ＧｕＳＣＮ（超高純度縁；
　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　　
ＩＮ）、２０ｍＭ　Ｅ　ＤＴＡ　（Ｓｉｇｍａ）ｐ　Ｈ
８，０（５×原液から調製）中に（１：１０〜１：１０
０またはそれ以上の範囲で）希釈し、１００°Ｃて５分
間加熱し、そしてすばやく氷水浴中で冷却する。し加熱
工程はＰＣＲ産物を熱変性させ、すばやい冷却はアンプ
リコン鎖の再アニーリングを抑制して、オリゴヌクレオ
チド捕獲プローブとのハイブリダイゼーションを促進す
る。］上記（工程２）の゛ブランク”　（捕獲プローブ
を含まない）と指定したウェルを含めた各ウェルに１０
０μｍずつ加えられる。

４、捕獲ハイブリダイゼーション オリゴヌクレオチド捕獲プローブによる、増幅され標識
済みＤＮＡの特異的捕獲は、室温で１〜３時間時間イン
ベヤベートことにより行われる。

この間に、ＰＣＲアンブリコンが捕獲プローブと標識ア
ンブリコンとの間の配列相補性に基づいてオリゴヌクレ
オチド捕獲プローブによって特異的に捕獲される。

５、プレート洗浄 ハイブリダイゼーション後に、すべてのマイクロタイタ
ーウェルの内容物を捨て、ウェルを２００μｍの２ＸＳ
ＳＣ１０，１％（ｖ／ｖ）　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００
で２回そして予め３７°Ｃに温めた２００μｌの０．２
　Ｘ　５ＳＣ１０，１％（ｖ／ｖ）　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ
−１００で４回洗浄する。

これら化洗浄はマイクロタイターウェルから未結合のビ
オチニル化産物を除去するために行われる。

６、ブロック プレート洗浄後、プレー・トのウェルを２００μｍのＰ
ＢＳ溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ　＝０．１３Ｍ　ＮａＣ１，７ｍ
Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４，３ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７
，０）、２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　
Ａ　）（Ｓｉｇｍａ）、０．１％（ｖ／ｖ）　Ｔｒｉｔ
ｏｎＸ−１００を用いて最低１５〜３０分間′ブロック
パする。

この゛ブロックバエ程はマイクロタイターウェルへのア
ビジン：ＨＲＰの非特異的結合を最小限度に抑えるのに
必要である。

７　アビジン：セイヨウワサビペルオキシダーゼアビジ
ン：セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体
（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ
、。

Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ）をＰＢＳ、０．１％（
ｖ／ｖ）　ＴｒｉｔｏｎＸ−１００でｌ　：　２０００
に希釈して最終濃度２．５μｇアビジン：ＨＲＰ／ｍｌ
とする。５０μｍの希釈アビジン：ＨＲＰを各ウェルに
加え、室温で３０分間インキュベートする。この工程中
に、アビジン：ＨＲＰ複合体がウェルに捕獲されたビオ
チニル化産物と強く結合する。本発明ではアビジン：Ｈ
ＲＰが使用されるが、代わりにストレプトアビジン：Ｈ
ＲＰの複合体も使用できる。同様に、アビジン（または
ストレプトアビジン）と複合体を形成する他の化合物、
例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ
、ルシフェラーゼ、フルオレセイン、テキサスレッド、
または比色定量、蛍光もしくは発光シグナルを発するこ
とのできる任意の他の物質も使用できる。

８、洗浄 次に、マイクロタイタープレートのウェルを２００μｍ
のＰＢＳ、０．１％（ｖ／ｖ）　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１
００で４回；そして２００μｍのＰＢＳ、１ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡで１回洗浄し、最終洗浄は室温で１〜ｌＯ分間イ
ンキュベートする。これらの洗浄は色原体の添加に先立
ってマイクロタイターウェルから未結合のアビジン：Ｈ
ＲＰを除去するために行われる。

９、発色 本発明の好適な実施態様では、発色は２種類の色原体系
：（ａ）過酸化水素１０ＰＤ、および（ｂ）過酸化水素
／ＴＭＢのいずれか一方を用いて行われる。

（ａ）　　過酸化水素１０ＰＤ：洗浄緩衝液（工程８に
記載）を除去した後、１５０μｌのＯＰＤ試薬［０，１
５Ｍリン酸ナト”リウム／クエン酸塩緩衝液ｐＨ６，０
中の１．６ｍｇ／ｍ１ｏ−フェニレンジアミンニナトリ
ウム塩（Ｓｉｇｍａ）、０．０１２５％（ｖ／ｖ）過酸
化水素（Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）］を加
え、暗室で１〜３０分間発色を進行させる。

発色は５０μｍの４　Ｎ　Ｈ２ＳＯ，の添加により停止
させる。

（ｂ）　　過酸化水素／ＴＭＢ　：最終洗浄緩衝液（工
程８に記載）か除去された後、１００μｌのＴＭＢ発色
試薬を各ウェルに加える。［ＴＭＢ発色試薬は等容量の
ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（有機基剤中０．４ｇ／ｌ
の濃度の３゜３＝、５．５−−テトラメチルベンジジン
・Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ、　Ｉｎ
ｃ、、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ。

ＭＤ、から市販されている）と過酸化水素溶液（クエン
酸緩衝液中の０．０２％（Ｖ／Ｖ）過酸化水素；　Ｋｉ
ｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ、　Ｉｎｃ、か
ら市販されている）を新たに混合することにより調製さ
れる。］反応を暗室中室温で１〜３０分間進行させた後
１００μｍ（７）１Ｍリン酸（Ｈ，ＰＯ４）　。

を加えて発色を停止させる。

ＴＭＢ基質は青色の沈澱物を生じる。リン酸を添加する
と黄色への変色が起こり、この時点で光学濃度を４５０
ｎｍで測定する（以下の工程１０参照）、ＨＲＰ基質ｏ
ＰＤおよびＴＭＢに加えて、他の可溶性基質には２，２
−アジノージ（３−エチルベンズチアプリンスルホン酸
ＸＡ　Ｂ　Ｔ　Ｓ　）および５−アミノサリチル酸（Ａ
ＳＡ）が包含される。不溶性基質には３−アミノ−９−
エチルカルバゾール（ＡＥＣ）および３，３−ジアミノ
ベンジジン（ＤＡＢ）が包含される。

１０、プレート読み取り（定量） 発色を停止させた後、使用した色原体に特定の波長で分
光光度測定か可能な自動マイクロタイタープレートリー
ダー（例えば、ＩｎｔｅｒＭｅｄ　Ｉｍｍｕｎ。

ｒｅａｄｅｒＲＮＪ−２０００）を用いて、各ウェル中
の試料の光学濃度（ＯＤ）を測定する（以下参照）。

ブランクウェルし工程２て述べたように、捕獲プローブ
の存在しないウェルにビオチニル化ＰＣＲ産物を添加］
のＯＤも測・定する。このシグナル（通常非常に低い）
は、捕獲プローブとのハイブリダイゼーションによって
ビオチニル化アンブリコンが真に捕獲されたことによる
シグナルてはなく、試料ウェルにビオチニル化産物か゛
非特異的にパ擬似結合されたシグナルを表す。従って、
真の捕獲ハイブリダイゼーションを正確に定量するには
、ブランクウェルのＯＤを試料ウェルのＯＤから差し引
く。

分光光度計（プレートリーダー）の適当な波長設定は比
色定量反応に用いた特定の色原体の如何による。従って
、過酸化水素１０ＰＤを使用する場合の正しい波長設定
は４９０１ｍであり、過酸化水素／ＴＭＢを使用する場
合の正しい波長設定は４５０ｎｍである。

本発明の使用により、病原性微生物、例えば細菌（例、
クラミジア、サルモネラなど）、ウィルス（例、肝炎ウ
ィルス）、種々の寄生虫（例、マラリア誘発性）などを
特徴とする特異的なりＮＡ配列の存在を検出することに
よって、種々の感染性疾患を診断できる。詳細には、本
発明はヒト免疫不全ウィルス１および２（ＨＩＶＩおよ
びＨＩＶ２）、ヒト向Ｔリンパ球性ウィルスＩおよび■
（ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−Ｉ［）　、Ｂ型肝炎ウ
ィルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）、ヒト
・パピローマウィルス（ＨＰＶ）　、およびニューモシ
スチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉ
ｎｉｉ）の検出に有用であろう。先に述べたように、本
発明の別の実施態様として、微生物クラミジア・トラコ
ーマチスの検出に特異的に使用できる新規な捕獲プロー
ブおよびプライマーが開発された。かかる新規プローブ
およびプライマーを以下の実施例で詳細に説明すること
とする。

本発明はまた、臨床用途との関連において特別の利点を
提供するものである。マイクロタイタープレートの使用
により、便利で、迅速、簡単、経済的、かつ自動化可能
なアッセイ法か提供される。

このアッセイは慣用の方法と比べて高精度でしかも高感
度であり、通常必要とされる時間よりも少ない時間で実
施できる。

以下の実施例は本発明の例示として提供されるもので、
本発明を制限する・ものではない。

実施例１ ビオチン−２１−（ＩＵＴＰの合成 ビオチン−１１−ｄＵＴＰはＬａｎｇｅｒら、　Ｐｒｏ
ｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、　７８
：６６３３−６６３７　（１９８１）の方法により化学
的に合成しそして１００ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７
，５，０，４ｍＭ　ＥＤＴＡ中に０．４ｍＭの濃度で懸
濁した。ビオチン−１１−ｄＵＴＰ　：　ＴＴＰの比を
最適化し、４：１　（ビオチン−１１−ｄＵＴＰ　：　
ＴＴＰ）の比を用いた場合に最大のシグナルが得ら゛れ
た。

実施例２ ５′ビオチニル化プライマーの作製 ＰＣＲブライマーとして使用されるすべてのオリゴヌク
レオチドは、当業者に知られた標準方法を用いて、標準
β−シアノエチルホスホルアマダイト化学によりＭｉｌ
ｌｉＧｅｎ　７５００自動ＤＮＡシンセサイザーで合成
した。

ビオチニル化プライマーとして使用するために作製した
オリゴヌクレオチドを第１図に示すようにして修飾した
。固形支持体上の合成オリゴヌクレオチドを保護へキシ
ルアミノホスホルアマダイト［構造１］との反応、続く
標準方法（ＭｃＢｒｉｄｅａｎｄ　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ
、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　２４
：　２４５２４８、１９８３）による酸化および脱保護
によってその５′末端で誘導体化して、５′アミノ標識
オリコマ−［構造２コとした。［２コとビオチン誘導体
のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルとの反応に
より良好な収量で５′ビオチニル化オリゴヌクレオチド
［構造３］が得られ、これをポリアクリルアミドゲル電
気泳動により精製した（以下の実施例３参照）。

実施例３ オリゴヌクレオチドの精製 ＰＣＲブライマーまたは捕獲プローブとして使用される
オリゴヌクレオチドは、２つの方法：すなわち（ａ）ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動、または（ｂ）スピンカ
ラムのいずれかで精製した。

（ａ）　　ポリアクリルアミドゲル電気泳動：　　１０
０〜２５０μｇずつの各オリゴヌクレオチドを真空乾燥
し、最少量のゲル、負荷用緩衝液［ＴＢＥ（８９ｍＭ　
）リス−ボレート、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭ　ＥＤＴＡ
）；９０％（ｖ／ｖ）脱イオンホルムアミド、０．０２
％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー］に再懸濁し、１
００°Ｃで５分加熱し、そしてすばやく氷水浴中で冷却
した。試料を変性性ポリアクリルアミドゲル［ＴＢＥ中
の１５％（Ｗ／Ｖ）アクリルアミド（アクリルアミド：
ビス−アクリルアミド、２９　：　１　）　　（ＩＢＩ
、　Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ。

ＣＴ）、７Ｍ尿素（ＩＢＩ）］　＋：負荷し、６５０Ｖ
テ４時間電気泳動した。ＤＮＡは薄層クロマトグラフィ
ープレー）　（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　＃１３２
５４セルロース）に紫外線をあてて可視化し、写真をと
り、その後全長オリゴヌクレオチドのゲルバンドを切り
出した。ゲル片を粉砕しそしてＤＮＡを３７°Ｃで一晩
水中に溶出させた。

このＤＮＡをＣ＋ｓ　Ｓｅｐ　Ｐａｋ”カートリッジ（
Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、　Ｍｉｌｆｏｒ
ｄ、　ＭＡ）に通すことによりさらに精製しそして４０
％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル（Ｆｉｓｈｅｒ）中に溶出
させた。真空下で蒸発乾固させた後、ＤＮＡを水に懸濁
させ、その濃度を分光光度計で測定した。原液濃度を水
で調整し、必要時まで４°Ｃで保存した。

（ｂ）　　スピンカラム：いくつかのオリゴヌクレオチ
ド捕獲プローブおよびプライマーは、スピンカラムにつ
いての製造者の説明書に従って、低遠心力でスインギン
グパケットローター内のＢｌｏ−５ｐｉｎ”　６カラム
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　Ｉｎｃ、。

Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）を用いて部分精製した。部
分精製後、オリゴヌクレオチドの濃度を分光光度計で測
定し、原液を水で調整しそして必要時まで４°Ｃで保存
した。

実施例４ ＰＣＲ条件 大部分のプライマ一対はＰＣＲ増幅のための最適温度条
件を決めるために経験的に試験し、その際特にアニーリ
ング温度に注意を払った。

ＨＴＬＶ−１ｔａｘ配列の検出のために、プライマーセ
ット５Ｋ４３およびＳ　Ｋ４４　（Ｋｗｏｋら、　Ｊ、
Ｉｎｆ。

Ｄｉｓ、、　１５８：１１９３−１１９７．　１９８８
）を使用した。このプライマ一対を使用する場合、１０
０μｍのＰＣＲ反応混合物は＝１×反応緩衝液（ＲＢ）
［ｌＯＸＲＢ＝５００ｍＭ　ＫＣＩ　：　１００ｍＭ　
）リス−ＨＣｌ、ｐＨ８，５；２５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ］
　　；　２００μＭずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、およびＴＴＰ；５０ｐモルずつノ５Ｋ４３および５
Ｋ４４．並びに２単位の組換えＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼ（Ｒｅｃｏｍｂｉ−ＴａｑＲ，Ｃｅｔｕｓ　Ｐｅｒｋ
ｉｎ　Ｅｌｍｅｒ、　Ｎｏｒｗａｌｋ、　ＣＴ）から成
っていた。

ビオチン−１１−ｄＵＴＰを取り込ませる実験では、反
応内容物は上記の通りであるが、２００μＭのＴＴＰを
１６０μＭのビオチン−１１−ｄＵＴＰおよび４０μＭ
のＴＴＰで置き換えた。

プライマーセット５Ｋ４３および５Ｋ４４の場合、ＰＣ
Ｒ温度条件は９４°Ｃで５分間の初期の長い変性工程で
始まり、次に５０°Ｃで２５秒間のアニーリング工程、
および７２°Ｃで１分間の伸長工程が続いた。

続＜２８回のサイクルでは、温度条件は９４°Ｃで２５
秒間の変性、５０°Ｃで２５秒間のアニーリング、およ
び７２°Ｃで１分間の伸長から成っていた。最終（３０
回目）サイクルは、９４°Ｃで２５秒間の変性、５０°
Ｃで２５秒間のアニーリング、および７２°Ｃで１０分
間の長い伸長から成っていた。ＰＣＲ増幅後、９０μｍ
の反応内容物を鉱油の下から取り出しそしてＰＣＲ産物
を分析するまで４°Ｃで保存した。

実施例５ ＨＴＬＶ−１の全ｔａｘ遺伝子を含有するプラスミド（
ｐＴＡＸ）を陽性対照鋳型として用いた。

プラスミドＤＮＡの濃度を分光光度計で測定し、そして
ＰＣＲ反応へ既知コピー数のターゲットＤＮＡを供給す
るために水で希釈した。このようにして、陽性対照鋳型
が作製された。

異種プラスミドもＰＣＲ陰性対照としてＨＴＬＶ−１ｔ
ａｘブライマーセツトと共に使用された。

このプラスミドｐＲＴ−ＰＯＬはＨＴＬＶ−１ポリメラ
ーゼ（ｐｏｔ）領域の配列を含有していた。プラスミド
ＤＮＡの濃度を測定し、Ｉ）ＴＡＸのところで記載した
ように連続希釈した。プラスミドの濃度は、ＰＣＲ反応
混合物に加えられる特定容量中に既知コピー数が供給さ
・れるように計算された（すなわち、９８μｌの反応混
合物に２μｍの鋳型ＤＮＡか加えられる）。

実施例６ ＨＴＬＶ−１ｔａｘターゲットの増幅、未標識アンブリ
コン ３種類のＰＣＲ検出検出子行して直接比較するために、
既知コピー数のプラスミドｐＴＡＸ　（実施例５）をＰ
ＣＲで増幅させた。プラスミド濃度は１反応あたり１３
００．１００．５０．２０または１０コピーの鋳型が供
給されるように水で調整した。ＨＴＬＶ−１ｔａｘプラ
イマーセツト５Ｋ４３／５Ｋ４４（Ｋｗｏｋら、　　Ｊ
、　　Ｉｎｆ、　Ｄｉｓ、、　　１５８：１１９３−１
１９７．　１９８８を参照）を合成してＢｌｏ−３ｐｉ
ｎＲスピンカラムで精製しく実施例３参照）、各ブライ
マーをＰＣＲ反応混合物に５０ｐモルの濃度で加えた。

未標識の増幅ＤＮＡはＰＣＲ増幅に２００μＭずつの４
種類のｄＮＴＰを用いることにより生成された。これら
の未標識ＰＣＲ産物は、サザンブロットハイプリダイゼ
ーション（実施例９）およびオリゴヌクレオチドハイブ
リダイゼーション（ＯＨ）（実施例１０）アッセイの検
出感度を調へるのに用いられた。増幅は実施例４に記載
した反応混合物および温度条件を用いて３０サイクル行
った。

実施例７ ＨＴＬＶ−１ｔａｘの増幅、ビオチン−１１−ｄＵＴＰ
の取り込み プライマーセット５Ｋ４３／５Ｋ４４によるＰＣＲ増幅
はまた、ビオチン−１１−ｄＵＴＰの取り込みによって
ビオチニル化アンブリコンを作製するためにも実施され
た。このＨＴＬＶ−１ｔａｘ増幅の条件は先に（実施例
６）記載した通りであるか、この反応混合物は２００μ
ＭずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、１６０μ
Ｍのビオチン−１１−ｄＵＴＰ、４０μＭのＴＴＰを含
有した。ビオチン標識ＰＣＲ産物をプレート捕獲ハイブ
リダイゼーション（実施例８）およびサザンブロットハ
イプリダイゼーション（実施例９）の検出感度を調へる
のに使用した。増幅は実施例４に記載した反応混合物お
よび温度条件を用いて３０サイクル行った。

実施例８ プレート捕獲アッセイ 捕獲プレートは、Ｄｙｎａｔｅｃｈ　ＩｍｍｕｌｏｎＲ
２プレートのウェルに１Ｍ酢酸アンモニウム中のオリゴ
ヌクレオチド“捕獲プローブＳ　Ｋ　４５　（Ｋｗｏｋ
ら。

Ｊ、　　Ｉｎｆ、　Ｄｉｓ、、　１５８：１１９３−１
１９７．１９８８）　２５ｎｇを結合させ、３７°Ｃで
一晩インキユベートすることにより作製した。ビオチニ
ル化ＰＣＲ産物（実施例７）をＩＭグアニジンチオシア
ネー）　（ＧｕＳＣＮ）で１：２５および１：１００に
希釈し、熱変性させ（１００°Ｃで５分間）、すばやく
氷水浴中で冷却した。各試料および対照として１００μ
ｌを４つのマイクロタイターウェル（３つの５Ｋ４５捕
獲プローブウエルおよび１つの“ブランク”ウェル）の
それぞれに加え、ハイブリダイゼーションのために室温
で２時間インキュベートした。次に、プレートの内容物
を捨て、プレートを洗浄し、ブロックしそして工程９に
記載されるようにしてアビジン：セイヨウワサビベルオ
キシダーゼで処理した。Ｈ２Ｏ２およびＯＰＤの添加後
、プレートリーダーを用いて４９０ｎｍで発色を測定し
た。

プレート捕獲ハイブリダイゼーションの結果を以下に示
す。以下の第１表について言及すると、ＨＴＬＶ−１ｔ
ａｘに特異的なＨＴＬＶ−１プライマー５Ｋ４３／５Ｋ
４４を使用して、相同鋳型（ｐＴＡＸ）と異種鋳型（ｐ
ＲＴ−ＰＯＬ）を増幅させた場合の、ビオチニル化ＰＣ
Ｒ産物のハイブリダイゼーションによる捕獲が示される
。ビオチン−１１−ｄＵＴＰはＰＣＲ反応に前駆物質と
して加えられ（実施例７参照）、そしてＰＣＲ条件は実
施例４に記載される通りであった。プレート捕獲アッセ
イは先に記載したようにして行った。試料をハイブリダ
イゼーションのためにｌ　Ｍ　ＧｕＳＣＮで１：２５お
よび１：１００に希釈し、次にプレートを洗浄し、ブロ
ックしそしてアビジン：ＨＲＰで処理した。ＯＤ、、、
はＨ２Ｏ２／　ＯＰ　Ｄで３５分発色させた後に測定し
た。以下に示した数字は３通りの試料の平均である。

第１表 陰性対照： 鋳型なし　　　　　０．００７　　　　　０．０２６１
０４コピーｐＲＴ−ＰＯＬ　　０００００　　　　　　
０．０４２このアッセイの検出限界はクリーンターゲ・
ノドプラスミド２０コピーであると見られた（１：２５
希釈のＯＤ、、。は０．１２３であった）。“鋳型なし
”陰性対照および異種増幅鋳型を用いた陰性対照は１・
２５希釈でそれぞれ０．００７およびｏ、　ｏｏｏＯＯ
Ｄ値を生じ、１　：　１００希釈でそれぞれ０．０２６
および０．０４２のＯＤ値を生じた。

実施例９ １３００コピーｐＴＡＸ １００：ｌピーｐＴＡＸ ５０コピーｐＴＡＸ ２０コピーｐＴＡＸ ｌＯコピーｐＴＡＸ １、６９３　　　　　　　０．４４４ ０、３４３　　　　　　　０．１１７ ０、３００　　　　　　　０．０５３ ０、１２３　　　　　　　０．０４０ ０、０３１　　　　　　　０．０２９ 未標識（実施例６）およびビオチン標識（実施例７）Ｐ
ＣＲ産物の両方の一部分（２５μｍ）を真空乾燥させ、
５μｍ水と２μｍアガロースゲル負荷用緩衝液［０，２
５％（Ｗ／Ｖ）ブロモフェノールプル、０．２５％（ｗ
／ｖ）キシレンシアツール、３０％（ｖ／ｖ）グリセロ
ールコ中に再懸濁しそして０．５μｇ　／　ｍｌエチジ
ウムプロミドを含有するＴＢＥ中の３％（ｗ／ｖ）　Ｎ
ｕＳｉｅｖｅＲＴＧ　（ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ
、　Ｒｏｃｋｌａｎｄ。

ＭＥ）／　１％（ｗ／ｖ）　Ｓｅａ　Ｋｅｎ　（ＦＭＣ
）アガロースゲルに負荷した。ゲルをＵＶトランスルミ
ネーターを使って可視化し、写真をとった。次に、ゲル
を０．５Ｎ　ＮａＯＨＳＩ　Ｍ　ＮａＣ１中で３０分、
次に０．５Ｍ　）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５中で３０分
処理しそして当分野で知られた標準方法に従って、高濃
度の塩溶液中でＮｙｔｒａｎＲ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ、　Ｉｎｃ、。

Ｋｅｅｎｅ、　ＨＮ）ナイロン膜に一晩ブロツティング
した。次に、プロット（“サザンプロット”）を７５°
Ｃで３０分焼きそして６ｘＳＳＰＥ　ｃｔ　ｘＳＳＰＥ
　＝０．１８Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　ＮａＰＯａ、ｐ
Ｈ７，７，１ｍＭＥＤＴＡ］　　；　１％（ｗ／ｖ）　
　ド、デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳＸＡｌｄｒｉｃｈ
　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、、　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　
ＷＩ）；　ＩＯＸ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬［１％（ｗ／
ｖ）ずつのフィコール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓ
ｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）、ポリビニルピロリドン（Ｓ
ｉｇｍａ）、およびＢＳＡ　（Ｓｉｇｍａ）］　　；お
よび５０μｇ　／　ｍｌサケ精子ＤＮＡ　（熱変性し、
すばやく冷却した）を含有する密封した袋の中で３７°
Ｃで１〜４時間プレハイブリダイズさせた。

第２図において、ＰＣＲ増幅は実施例６および７に記載
した通りであり、アガロースゲル電気泳動、プロッティ
ング、プレハイブリダイゼーション、およびハイブリダ
イゼーションは本実施例に記載した通りであった。

写真の上半分には、実施例７のビオチン標識ＰＣＲ産物
が示しである：　１３００．１００．５０．２０および
ＩＯコピーのｐＴＡＸの増幅産物（それぞれレーン１−
５）；ＰＣＲ“鋳型なし”陰性対照（レーン６）。

写真の下半分には、実施例６の未標識ＰＣＲ産物が示し
である：　１３００．１００．５０．２０および１０コ
ピーのｐＴＡＸの増幅産物（それぞれレーン１−５）；
ＰＣＲ“鋳型なし”陰性対照（レーン６）。

アンブリコン特異的プローブ５Ｋ４５を、当分野で知ら
れた標準方法により、ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ）を使って３２Ｐ−ＡＴＰで標識した。ハイ
ブリダイゼーションは、この放射性標識プローブをハイ
ブリダイゼーション緩衝液（６ｘＳＳＰＥＳ　１％（ｗ
／ｖ）ＳＤＳ）に４、ＩＸ　１０Ｈｃｐｍ／プロットの
割合で加えた。６０°Ｃで２〜３時間ノ１イブリダイゼ
ーションを行った後、プロットを数回厳密に洗浄し、増
感スクリーンを用いてＫｏｄａｋ　Ｘ−ＯＭＡＴ　ＡＲ
フィルムの下に一８０°Ｃで一晩おいた。

−晩露出後のサザンプロットの検出限界は、ビオチニル
化されなかったＰＣＲ産物（実施例６）てはプラスミド
ｐＴＡＸターゲット１０コピーであり、そしてビオチニ
ル化されたＰＣＲ産物（実施例７）ではプラスミドター
ケラト２０コピーであった。（第２図のオートラジオグ
ラフの写真を参照されたい。）パ鋳型なし”ＰＣＲ陰性
対照はオー）〜ラジオグラフィーで検出゛可能なシグナ
ルを生じなかった。

実施例１０ オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ 第３図に関して述べると、ＯＨアッセイの条件（標識プ
ローブの作製、変性およびアニーリング条件、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動の条件）は本実施例で記載され
る通りであった。

示シタ写真は一晩露出（−８０°Ｃ，Ｋｏｄａｋ　Ｘ−
ＯＭＡＴＡＲフィ、ルム、増感スクリーンを使用）した
オートラジオグラムであり、これは１３００．　　ｔｏ
ｏ、５０．２０または１０コピーのｐＴＡＸ　（それぞ
れレーン１−５）；”鋳型なし”ＰＣＲ陰性対照（レー
ン６）；ＨＴＬＶ−１ｔａｘを構造的に発現する、ＰＣ
Ｒにより増幅された１０４個の抽出Ｊｕｒｋａｔ細胞（
レーン７）；ＰＣＲにより増幅された１０４個の抽出Ｊ
ｕｒｋａｔ細胞（レーン８）；ＯＨア・ノセイのための
３２Ｐ　−Ｓ　Ｋ４５に増幅ＤＮＡが添加されなかった
○Ｈ陰性対照（レーン９）：から生成されたシグナルを
示す。

プライマーセットＳ　Ｋ４３／Ｓ　Ｋ４４　（実施例６
）からの未標識ＰＣＲ産物を、オリゴヌクレオチドハイ
ブリダイゼーションアッセイ（ＯＨア・ノセイ）により
分析して、このアッセイ法の検出限界を決定した。この
方法は液体ハイブリダイゼーション（ＬＨ）についてＡ
ｂｂｏｔｔら、　Ｊ、　Ｉｎｆ、Ｄｉｓ、　１５８：１
１５８−１１６９　（１９８８）により実質的に記載さ
れた通りである。４４ｍＭＥＤＴＡ、６６ｍＭ　ＮａＣ
１で希釈した２５０、０００〜４（）０．０００　ｃ　
ｐ　ｍの２２ｐ標識５Ｋ４５プローブを含有するプロー
ブ混合物１０μｌに、３０μｍのＰＣＲ増幅産物を添加
した。ＤＮＡ混合物を９５°Ｃで５分変性させ、直ちに
５５°Ｃで１５分間プローブにアニーリングさせた。１
０μｍのアガロースゲル負荷用緩衝液（実施例９参照）
を加え、その半量をＴＢＥ中の天然１０％（Ｗ／Ｖ）ポ
リアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビス−アクリ
ルアミド１９：１）に負荷した。電気泳動はブロモフェ
ノールブルーかゲル底先端に到達するまで２００ｖで行
った。

ゲルの上半分をＫｏｄａｋ　Ｘ−ＯＭＡＴ　ＡＲフィル
ムに増感スクリーンを用いて一８０°Ｃで３時間および
一晩露出させた。

３時間（図示せず）または−晩露出（第３図）後、１０
コピーの増幅プラスミドｐＴＡＸターゲットを特定バン
ドとしてはっきりと見ることができる。゛鋳型なし”お
よび他の陰性対照にはバンドか現れなかった。

実施例１１ アッセイ比較および結果の考察 プレート捕獲アッセイ（実施例８）は、３０サイクルの
ＰＣＢ増幅（実施例６および７）後に最小コピー数のタ
ーゲットＨＴＬＶ−Ｉ　ＤＮＡを検出する能力について
、より慣用のなアッセイであるサザンブロットハイプリ
ダイゼーション（実施例９）およびオリゴヌクレオチド
ハイブリダイゼーション（ＯＨ）アッセイ（実施例１０
）と比較した。

試験した３つの検出系（プレート捕獲アッセイ、サザン
プロットおよびＯＨアッセイ）はそれぞれ、３０サイク
ルのＰＣＲ増幅後に小コピー数のクリーンターゲットプ
ラスミドを検出するそれらの能力において本質的に類似
していた。プレート捕獲は２０コピー、サザンプロット
は１０〜２０コピー、そしてＯＨはｌＯコピーのクリー
ンターゲットを検出することが分かった。３つの検出系
のうちで、プレートアッセイが最も速く、数時間で最終
結果が得られる。さらに、サザンプロットおよびＯＨア
ッセイが主観的なオートラジオグラムバンドを生ずるの
に対して、プレートアッセイは数字によるＯＤ値を生ず
る。従って、本発明により試料の“°陽性度”の客観的
数値測定、および陽性度の、下限に関する客観的カット
オフ値の計算が可能となる。

（このカットオフ値は計算された統計的有意性の度合に
より試料が陰性であるとみなされる最大ＯＤ値である。

） また、プレートアッセイにより与えられるＯＤ値により
、診断テストの確認の際に重要な゛シグナル対ノイズ比
の定量的測定が可能となる。サザンブロットハイプリダ
イゼーションおよびＯＨアッセイの場合は、“シグナル
対ノイズ°゛は単にオートラジオグラフィーからのシグ
ナルの視認による評価により概算できるにすぎない。

実施例１２ クラミジア・トラコーマチス配列の検出クラミジア・ト
ラコーマチスを特異的に検出するために、２組のプライ
マーおよび捕獲プローブを合成した。オリゴヌクレオチ
ド配列はＣ，）ラコーマチスＬｌ抗原種の潜伏プラスミ
ドから選ばれた（Ｈａｔｔら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１６：４０５３４０６７
、　１９８８）。

プライマーセットＡは下記プライマーを用いると、２０
８ｂｐの特定アンブリコンを生成した二ＣＰ　−２４（
２５マー、十極性、塩基１９５−２１９）５　＝　ＧＧ
Ｇ　ＡＴＴ　ＣＣＴ　ＧＴＡ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＡＧＴ
　ＣＡＧ　Ｇ　３−すなわち、このプライマーは下記配
列に結合するか、または該配列から伸長（ｅｌｏｎｇａ
ｔｉｏｎ）を引き起こすオリゴヌクレオチドである： ５−　ＣＣＴＧ　ＡＣＴ　ＴＧＴ　ＴＧＴ　ＴＡＣＡＧ
Ｇ　ＡＡＴ　ＣＣＣ３′ＣＰ　−２７（２６マー　−極
性、塩基３７７−４０２）５　＝　ＣＣＴ　ＣＴＴ　Ｃ
ＣＣＣＡＧ　ＡＡＣＡＡＴ　ＡＡＧ　ＡＡＣＡＣ３−す
なわち、このプライマーは下記の配列に結合するか、ま
たは該配列から伸長を引き起こすオリゴヌクレオチドで
ある： ５　＝　ＧＴ　ＧＴＴ　ＣＴＴ　ＡＴＴ　ＧＴＴ　ＣＴ
Ｇ　ＧＧＧ　ＡＡＧ　ＡＧＧ　３−プライマーセットＡ
からの２０８ｂｐ特定アンブリコンは捕獲プローブＣＰ
−３５を用いて検出した：ＣＰ　−３５（２６マー　−
極性、塩基２３５−２６０）５−ＣＡＴ　ＡＧＣＡＣＴ
　ＡＴＡ　　ＧＡＡ　ＣＴＣＴＧＣＡＡＧ　ＣＣ３＝す
なわち、このプローブは下記の配列に結合するオリゴヌ
クレオチドである： ５−　ＧＧ　ＣＴＴ　ＧＣＡ　ＧＡＧ　ＴＴＣＴＡＴ　
ＡＧＴ　ＧＣＴ　ＡＴＧ　３　′クラミジアブライマー
セットＢは下記プライマーを用いると、　１７３ｂｐの
特定アンブリコンを生成し： ＣＰ　−３７（２３マー、十極性、塩基６７８−７００
）５−　ＧＴＣＣＴＧ　ＣＴＴ　ＧＡＧ　ＡＧＡ　ＡＣ
Ｇ　ＴＧＣＧＧ　３−０すなわち、このプライマーは下
記配列に結合するか、または該配列から伸長を引き起こ
すオリゴヌクレオチドである： ５−　ＣＣＧＣＡ　ＣＧＴ　ＴＣＴ　ＣＴＣＡＡＧ　Ｃ
ＡＧ　ＧＡＣ３”ＣＰ　−３８（２４マー　−極性、塩
基８２７−８５０）５−　ＣＴＣＣＣＡ　ＧＣＴ　ＴＡ
Ａ　ＧＡＡ　ＣＣＧ　ＴＣＡ　ＧＡＣ３”。

すなわち、このプライマーは下記配列に結合するか、ま
たは該配列から伸長を引き起こすオリゴヌクレオチドで
ある： ５−　ＧＴＣＴＧＡ　ＣＧＧ　ＴＴＣＴＴＡ　ＡＧＣＴ
ＧＧ　ＧＡＧ　３　＝プライマーセットＢからの１７３
ｂｌ）特定アンブリコンは捕獲プローブＣＰ−３９を用
いて検出した：ＣＰ　−３９（２３マー　−極性、塩基
７２６−７４８）５　＝　ＴＧＴ　ＣＴＴ　ＣＧＴ　Ａ
ＡＣＴＣＧ　ＣＴＣＣＧＧ　ＡＡ　３すなわち、このプ
ローブは下記配列に結合するオリゴヌクレオチドである
： ５−　ＴＴ　ＣＣＧ　ＧＡＧ　ＣＧＡ　ＧＴＴ　ＡＣＧ
　ＡＡＧ　ＡＣＡ　３プライマーセツトＢはターゲット
プラスミドｐＣＨＬ−１を増幅させるのに使用した。５
′ビオチニル化プライマーを用いて、３０サイクルのＰ
ＣＲによりターゲットを増幅させ、ビオチニル化産物を
捕獲ハイブリダイゼーションにより試験した（第２表）
。１０分の発色（ＴＭＢ／＋１□０２）後、２０はどの
少ない出発コピーのｐＣＨＬ−１か無視しうるほとわず
かのバックグラウンドシグナル（１：２５希釈、ＯＤ４
．。＝０．００９）　Ｌか伴わずに検出できた（１：２
５希釈、ＯＤ　４ｓｏ＝０．１４０）。

（本頁以下余白） １０４コピーｐＣＨＬ １０３コピーｐＣＨＬ １０２コピーｐｃｔ（Ｌ ５０コピーｐＣＨＬ ２０コピーｐｃｔ（Ｌ 陰性対照 鋳型なし 実施例１３ 第２表 Ｄ４５０ １：２５ ＞１，５００ ＞１．５００ ０、６８６ θ、２１５ ０．１４０ ０、００９ Ｄ４５０ １　：　ｔｏ。

＞１．５００ １、２８６ ０．１７０ Ｇ、　０５０ ０、０３５ ｏ、　ｏｏ。

Ｃ，トラコーマチスに感染したか、または感染していな
いＭｃＣｏｙ細胞を１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼ
Ｋ、１％Ｔｗｅｅｎ−２０、を含有する２　Ｓ　Ｐ　（
２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，２，２Ｍス
クロース）中で溶解させそして５５°Ｃで１時間、次に
９５°Ｃで１０分間インキュベートした。３０サイクル
のＰＣＲ増幅においてプライマーセットＡ（実施例１２
）を使用し、増幅産物を実施例８記載のプレートアッセ
イにより試験した。１０分の発色後、ＩＯおよび１００
個の感染ＭｃＣｏＹ細胞は、１０５個の非感染ＭｃＣｏ
ｙ細胞にスパイクした場合、両方とも（ＧｕＳＣＮ中へ
の産物のｌ／２５および１／１００希釈の両方に関して
）＞２．０００のＯＤ４．。値を生じた。抽出および増
幅された非感染細胞（１０５細胞）のみでは＜０．０５
０のＯＤ　４ｓ　ｏ値を生じた。

細胞変性効果（ＣＰＥ）の程度を［゛陰性”（ＣＰＥな
し）から４＋（最も穎著なＣＰＥ）までの範囲で］予め
等級を付けた臨床標本を、同様に抽出しそしてプライマ
ーセットＡを用いる３０サイクルのＰＣＲにより増幅さ
せた。このアッセイの結果を第３表に示す： （本質以下余白） 第３表 ０Ｄ４５゜ ４＋　　　　　　　　　９０μｌ　　　　　　　＞２．
０００　　　　　　１．６８６１＋９０μｌ　　　　　
Ｏ，１４５０，０８６陰性　　　　　　　　９０μｌ　
　　　　　　＜０．０５０　　　　　　＜０．０５０４
＋１０μｍ　　　　＞２．０００　　　１．４１７１＋
　　　　　　　　　１０μｍ　　　　　　　＜０．０５
０　　　　　　＜０．０５０陰性　　　　ｌＯμｌ　　
　　＜０．０５０　　　＜０．０５０要約すると、ＰＣ
Ｒの増幅産物を標識しそして検出する新規方法がここに
開示される。これらの標識および捕獲方法により”慣用
の検出方法に比較していくつかの利点が提供される： １、ビオチニル化およびマイクロタイタープレートへの
ＰＣＲ産物の捕獲はより迅速なア・ノセイである。ＯＨ
アッセイが約６〜２４時間、サザンブロッティングおよ
びノヅブリダイゼーションか４８時間くらいであるのに
比べ、本発明によるプレートアッセイは２時間で達成さ
れる。

２、プレートアッセイはより労働集約的でなく、多数の
パ料の分析を自動化することができる。

３、試験した他の２つのアッセイ法と異なり、プレー１
〜アツセイ法は高い比活性を有する危険な放射性標識プ
ローブの調製、精製または取扱いを必要としない。

４、プレートアッセイを介したビオチニル化産物の捕獲
により、ハイブリダイゼーションの客観的定量的評価；
試料の陽性度についての統計的カットオフ値の算出；お
よびアッセイ“シグナル対ノイズ比の定量的計算ができ
る。

当分野で習熟した者には明らかであるように、本発明の
多くの修飾および変更がその精神および範囲を逸脱する
ことなく行われつる。ここに記載した特定の実施態様は
単に例示として提供されたものであり、本発明は添付の
特許請求の範囲によってのみ制限されるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマ−のビオ
チニル化を可能にするように修飾された化学リンカ−ア
ームの調製を示す。 第２図は、ＮｙｔｒａｎＲ膜に結合されたＰＣＲ産物の
オートラジオグラムの結果を示す。 第３図は、実施例６のＰＣＲ産物を用いたオリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーション（ＯＨ）アッセイの結果
を示す。 ＩＧ　１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生物学的試料から増幅された標識されたターゲット
   核酸配列を検出する方法であって： 前記ターゲット核酸配列を、ポリスチレン固形支持体に
   結合させた、前記ターゲット配列と実質的に相補的な核
   酸配列も有する少なくとも１種のオリゴヌクレオチド捕
   獲プローブとハイプリダイズさせ；そして 前記ターゲット配列に関わる標識の存在を判定する； ことを含んで成る方法。 ２、前記ポリスチレン固形支持体が複数のウェルを有す
   るマイクロタイタープレートである、請求項１記載の方
   法。 ３、前記ポリスチレン固形支持体が増強された蛋白結合
   能を有する、請求項１記載の方法。 ４、前記マイクロタイタープレートが増強された蛋白結
   合能を有する、請求項２記載の方法。 ５、前記ハイブリダイゼーシヨンが多数の重複しない捕
   獲プローブの使用により達成される、請求項１記載の方
   法。 ６、前記捕獲プローブがポリスチレン製マイクロタイタ
   ープレートのウェルに受動的に結合されたものである、
   請求項２記載の方法。 ７、前記捕獲プローブが末端にデオキシリボヌクレオチ
   ド三リン酸のホモポリマーが付いているものである、請
   求項１記載の方法。 ８、前記ターゲット核酸配列がＤＮＡまたはＲＮＡであ
   る、請求項１記載の方法。 ９、ハイブリダイゼーション工程に先立って、二本鎖Ｄ
   ＮＡを熱変性させて一本鎖ＤＮＡを形成させることをさ
   らに包含する、請求項１記載の方法。 １０、前記ハイブリダイゼーシヨンがグアニジンチオシ
   アネートの存在下に行われる、請求項１記載の方法。 １１、前記標識物質が放射性標識化合物、発光試薬、蛍
   光試薬、電子高密度試薬、熱安定性酵素、リガンド、抗
   体−ハプテン複合体、およびキレート形成剤より成る群
   から選ばれる、請求項１記載の方法。 １２、前記標識物質がビオチンである、請求項１記載の
   方法。 １３、前記ビオチン標識がポリメラーゼ連鎖反応による
   前記ターゲット配列の増幅中に該核酸ターゲット配列に
   取り込まれるか、または結合される、請求項１２記載の
   方法。 １４、前記ビオチン標識がポリメラーゼ連鎖反応増幅中
   にビオチン−１１−ｄＵＴＰを加えることにより前記核
   酸ターゲット配列に取り込まれる、請求項１３記載の方
   法。 １５、前記反応がＴａｑポリメラーゼの存在下に行われ
   る、請求項１２記載の方法。 １６、取り込まれなかったビオチンがハイブリダイゼー
   シヨン後で標識測定の前に洗浄することにより除去され
   る、請求項１４記載の方法。 １７、前記ビオチン標識がポリメラーゼ連鎖反応増幅中
   に５′ビオチニル化プライマーを使用することにより前
   記核酸ターゲット配列に取り込まれる、請求項１３記載
   の方法。 １８、ビオチン標識を用い前記検出がアビジン−セイヨ
   ウワサビペルオキシダーゼ複合体を加え、色原体試薬と
   基質とを反応させて比色定量シグナルを発生させること
   により達成される、請求項１２記載の方法。 １９、ビオチン標識を用いる前記検出がアルカリホスフ
   ァターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、フ
   ルオレセイン、およびテキサスレッドより成る群の一員
   と複合体形成させたアビジンまたはストレフトアビジン
   を加えることにより達成される、請求項１２記載の方法
   。 ２０、色原体試薬と基質を加えるに先立ち未結合のアビ
   ジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼを除去するため
   に洗浄工程が行われる、請求項１８記載の方法。 ２１、前記色原体試薬が３，３′、５，　５′−テトラ
   メチルベンジジンであり、前記基質が過酸化水素であり
   、前記反応が比色定量シグナルが発生するような様式で
   行われる、請求項１８記載の方法。 ２２、前記色原体試薬がｏ−フェニレンジアミンであり
   、前記基質が過酸化水素であり、前記反応が比色定量シ
   グナルが発生するような様式で行われる、請求項１８記
   載の方法。２３、前記ウェルが取りはずしでき、前記検
   出が該取りはずし可能なウェルのシンチレーシヨン計数
   によって捕獲ハイブリダイゼーションの程度を判定する
   ことをさらに包含する、請求項２記載の方法。 ２４、前記捕獲ハイブリダイゼーションの定量が生成シ
   グナルの強度の光学濃度測定によって判定される、請求
   項１８記載の方法。 ２５、前記捕獲ハイブリダイゼーションの定量が生成シ
   グナルの強度の光学濃度測定によって判定される、請求
   項１９記載の方法。 ２６、捕獲プローブアッセイにおいてターゲット核酸配
   列のハイブリダイゼーシヨンの程度を定量的に測定する
   方法であって： 受動的に結合された捕獲プローブのための固形支持体と
   して複数のウェルを有するマイクロタイタープレートを
   利用し； 該プレートを、標識されたターゲット核酸配列を含有す
   る生物学的試料と接触させて検出可能なシグナルを発生
   させ；そして 発生したシグナルを計数するか、または定量的に測定す
   る； ことを含んで成る方法。 ２７、次の工程： （ａ）ターゲット核酸配列を含有する生物学的試料を用
   意し； （ｂ）該ターゲット配列を有する核酸の増幅を行わせる
   ために選択されたプライマーを用いて前記試料に対して
   ポリメラーゼ連鎖反応を実施し、そしてかかる増幅に後
   程検出可能な標識物質を取り込ませ： （ｃ）該ターゲット配列と実質的に相補的な核酸配列を
   有するオリゴヌクレオチド捕獲プローブを用意し； （ｄ）該捕獲プローブをポリスチレン製マイクロタイタ
   ープレートのウェルに結合させ；（ｅ）グアニジンチオ
   シアネートの存在下に、前記捕獲プローブを結合させた
   マイクロタイタープレートと工程（ｂ）の増幅産物とを
   接触させ；そして （ｆ）前記標識の検出により前記ターゲット配列の存在
   を判定する； ことを含んで成る核酸ハイブリダイゼーションアッセイ
   。 ２８、前記ターゲット配列が、後程の検出のために、タ
   ーゲット配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅中にＴａｑポ
   リメラーゼによるビオチン−１１−ｄＵＴＰの取り込み
   によって標識される、請求項２７記載のハイブリダイゼ
   ーシヨンアッセイ。 ２９、前記ターゲット配列が、後程の検出のために、タ
   ーゲット配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅中に５′ビオ
   チニル化オリゴヌクレオチドプライマーの取り込みによ
   って標識される、請求項２７記載のハイブリダイゼーシ
   ョンアッセイ。 ３０、ターゲット核酸配列を検出するための診断用キッ
   トであって、該ターゲット配列を有する核酸を増幅させ
   るために選ばれたＰＣＲプライマー、および該ターゲッ
   ト配列と実質的に相補的な核酸配列を有するオリゴヌク
   レオチド捕獲プローブを結合させた複数のウェルを有す
   るマイクロタイタープレートを含んでなる上記キット。 ３１、ＰＣＲ増幅および前記捕獲プローブと前記ターゲ
   ット配列とのハイブリダイゼーションを実施するための
   試薬類をさらに包含する、請求項３０記載の診断用キッ
   ト。 ３２、ＴａｑポリメラーゼおよびｄＮＴＰをさらに包含
   する、請求項３１記載の診断用キット。 ３３、前記ｄＮＴＰの１種またはそれ以上が標識物質を
   含む、請求項３２記載の診断用キット。 ３４、前記ＰＣＲプライマーの少なくとも１種が５′末
   端でリンカーアーム修飾を介してビオチニル化されてい
   る、請求項３０記載の診断用キット。 ３５、前記マイクロタイタープレートが増強された蛋白
   結合能を有するポリスチレンから構成される、請求項３
   ０記載の診断用キット。 ３６、クラミジア・トラコーマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉ
   ａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の検出に適しており、前記
   プライマーが次の配列： ５′ＣＣＴＧＡＣＴＴＧＴＴＧＴＴＡＣＡＧＧＡＡＴＣ
   ＣＣ３′および５′ＧＴＧＴＴＣＴＴＡＴＴＧＴＴＣＴ
   ＧＧＧＧＡＡＧＡＧＧ３′に結合するかまたは上記配列
   から伸長を引き起こすオリゴヌクレオチドである、請求
   項３０記載の診断用キット。 ３７、前記プローブが次の配列： ５′ＧＧＣＴＴＧＣＡＧＡＧＴＴＣＴＡＴＡＧＴＧＣＴ
   ＡＴＧ３′に結合するオリゴヌクレオチドである、請求
   項３６記載の診断用キット。 ３８、クラミジア・トラコーマチスの検出に適しており
   、前記プライマーが次の配列： ５′ＣＣＧＣＡＣＧＴＴＣＴＣＴＣＡＡＧＣＡＧＧＡＣ
   ３′および５′ＧＴＣＴＧＡＣＧＧＴＴＣＴＴＡＡＧＣ
   ＴＧＧＧＡＧ３′に結合するかまたは上記配列から伸長
   を引き起こすオリゴヌクレオチドである、請求項３０記
   載の診断用キット。 ３９、前記プローブが次の配列： ５′ＴＴＣＣＧＧＡＧＣＧＡＧＴＴＡＣＧＡＡＧＡＣＡ
   ３′に結合するオリゴヌクレオチドである、請求項３８
   記載の診断用キット。 ４０、次の配列： ５′ＣＣＴＧＡＣＴＴＧＴＴＧＴＴＡＣＡＧＧＡＡＴＣ
   ＣＣ３′および５′ＧＴＧＴＴＣＴＴＡＴＴＧＴＴＣＴ
   ＧＧＧＧＡＡＧＡＧＧ３′に結合するかまたは上記配列
   から伸長を引き起こすオリゴヌクレオチドである、クラ
   ミジア・トラコーマチス核酸ターゲット配列のＰＣＲ増
   幅において使用するためのプライマー。 ４１、次の配列： ５′ＧＧＣＴＴＧＣＡＧＡＧＴＴＣＴＡＴＡＧＴＧＣＴ
   ＡＴＧ３′に結合するオリゴヌクレオチドである、請求
   項４０記載のプライマーを用いて増幅されたＤＮＡ配列
   のハイブリダイゼーションアッセイに有用なプローブ。 ４２、次の配列： ５′ＣＣＧＣＡＣＧＴＴＣＴＣＴＣＡＡＧＣＡＧＧＡＣ
   ３′および５′ＧＴＣＴＧＡＣＧＧＴＴＣＴＴＡＡＧＣ
   ＴＧＧＧＡＧ３′に結合するかまたは上記配列から伸長
   を引き起こすオリゴヌクレオチドである、クラミジア・
   トラコーマチス核酸ターゲット配列のＰＣＲ増幅におい
   て使用するためのプライマー。 ４３、次の配列： ５′ＴＴＣＣＧＧＡＧＣＧＡＧＴＴＡＣＧＡＡＧＡＣＡ
   ３′に結合するオリゴヌクレオチドである、請求項４２
   記載のプライマーを用いて増幅されたＤＮＡ配列のハイ
   ブリダイゼーションアッセイに有用なプローブ。 ４４、ＰＣＲ増幅およびハイブリダイゼーシヨンアッセ
   イによるクラミジア・トラコーマチスの検出方法であっ
   て、該ＰＣＲ増幅において次の配列 ５′ＣＣＴＧＡＣＴＴＧＴＴＧＴＴＡＣＡＧＧＡＡＴＣ
   ＣＣ３′および５′ＧＴＧＴＴＣＴＴＡＴＴＧＴＴＣＴ
   ＧＧＧＧＡＡＧＡＧＧ３′に結合するかまたは上記配列
   から伸長を引き起こすオリゴヌクレオチドであるプライ
   マーを使用することを含んで成る方法。 ４５、前記ハイブリダイゼーションアッセイがさらに捕
   獲プローブを使用し、該捕獲プローブが次の配列 ５′ＧＧＣＴＴＧＣＡＧＡＧＴＴＣＴＡＴＡＧＴＧＣＴ
   ＡＴＧ３′に結合するオリゴヌクレオチドである、請求
   項４４記載の方法。 ４６、ＰＣＲ増幅およびハイブリダイゼーションアッセ
   イによるクラミジア・トラコーマチスの検出方法であっ
   て、該ＰＣＲ増幅において次の配列 ５′ＣＣＧＣＡＣＧＴＴＣＴＣＴＣＡＡＧＣＡＧＧＡＣ
   ３′および５′ＧＴＣＴＧＡＣＧＧＴＴＣＴＴＡＡＧＣ
   ＴＧＧＧＡＧ３′に結合するかまたは上記配列から伸長
   を引き起こすオリゴヌクレオチドであるプライマーを使
   用することを含んで成る方法。 ４７、前記ハイブリダイゼーシヨンアッセイがさらに捕
   獲プローブを使用し、該捕獲プローブは次の配列 ５′ＴＴＣＣＧＧＡＧＣＧＡＧＴＴＡＣＧＡＡＧＡＣＡ
   ３′に結合するオリゴヌクレオチドである、請求項４６
   記載の方法。 ４８、核酸ターゲット配列と実質的に相補的な核酸配列
   を有するオリゴヌクレオチド捕獲プローブを結合させた
   複数のウェルを有しており、増幅された核酸ターゲット
   配列のハイブリダイゼーシヨンアッセイに有用なマイク
   ロタイタープレート。 ４９、ポリスチレンから構成され、かつ増強された蛋白
   結合能を有する、請求項４８記載のマイクロタイタープ
   レート。 ５０、次の配列： ５′ＧＧＧＡＴＴＣＣＴＧＴＡＡＣＡＡＣＡＡＧＴＣＡ
   ＧＧ３′５′ＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＡＣＡＡＴＡ
   ＡＧＡＡＣＡＣ３′５′ＧＴＣＣＴＧＣＴＴＧＡＧＡＧ
   ＡＡＣＧＴＧＣＧＧ３′および５′ＣＴＣＣＣＡＧＣＴ
   ＴＡＡＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＣ３′より成る群から選
   ばれた配列を含有するプライマー。 ５１、次の配列： ５′ＣＡＴＡＧＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＴＣＴＧＣＡＡ
   ＧＣＣ３′および５′ＴＧＴＣＴＴＣＧＴＡＡＣＴＣＧ
   ＣＴＣＣＧＧＡＡ３′より成る群から選ばれた配列を含
   有するプローブ。 ５２、５′末端に標識を有する、請求項５０記載のプラ
   イマー。 ５３、特に実施例に関して記載される本発明。