NO302204B1 - Diagnostisk sett for påvisning av nukleinsyresekvenser fra Chlamydia trachomatis - Google Patents
Diagnostisk sett for påvisning av nukleinsyresekvenser fra Chlamydia trachomatis Download PDFInfo
- Publication number
- NO302204B1 NO302204B1 NO904240A NO904240A NO302204B1 NO 302204 B1 NO302204 B1 NO 302204B1 NO 904240 A NO904240 A NO 904240A NO 904240 A NO904240 A NO 904240A NO 302204 B1 NO302204 B1 NO 302204B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- primers
- diagnostic kit
- dna
- bind
- hybridization
- Prior art date
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 title claims abstract description 14
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 title claims abstract description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 title claims description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 53
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 33
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 11
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 10
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 9
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 6
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 32
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 abstract description 17
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 abstract description 14
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 abstract description 9
- 239000011616 biotin Substances 0.000 abstract description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 abstract description 9
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 abstract description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 45
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 12
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 7
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 4
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OXEUETBFKVCRNP-UHFFFAOYSA-N 9-ethyl-3-carbazolamine Chemical compound NC1=CC=C2N(CC)C3=CC=CC=C3C2=C1 OXEUETBFKVCRNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 2
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- -1 deoxyribonucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 2
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- KBOPZPXVLCULAV-UHFFFAOYSA-N mesalamine Chemical compound NC1=CC=C(O)C(C(O)=O)=C1 KBOPZPXVLCULAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004963 mesalazine Drugs 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- WZIMSXIXZTUBSO-UHFFFAOYSA-N 2-[[bis(carboxymethyl)amino]methyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O WZIMSXIXZTUBSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-2-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2N(CC)C(S(O)(=O)=O)SC2=C1 PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229920002799 BoPET Polymers 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000702224 Enterobacteria phage M13 Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 239000005041 Mylar™ Substances 0.000 description 1
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 1
- AZRNEVJSOSKAOC-VPHBQDTQSA-N [[(2r,3s,5r)-5-[5-[(e)-3-[6-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]hexanoylamino]prop-1-enyl]-2,4-dioxopyrimidin-1-yl]-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C(\C=C\CNC(=O)CCCCCNC(=O)CCCC[C@H]2[C@H]3NC(=O)N[C@H]3CS2)=C1 AZRNEVJSOSKAOC-VPHBQDTQSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N ammonium thiocyanate Chemical compound [NH4+].[S-]C#N SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 150000001615 biotins Chemical class 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229940079938 nitrocellulose Drugs 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- UYDLBVPAAFVANX-UHFFFAOYSA-N octylphenoxy polyethoxyethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCOCCOCCOCCO)C=C1 UYDLBVPAAFVANX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Dental Preparations (AREA)
- Transplanting Machines (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår diagnose av infeksjon med Chlamydia tranchoraatis ved påvisning av tilstedeværelse av spesielle DNA-sekvenser som karakteriserer mikroorganismen som forårsaker sykdommen.
Oppfinnelsen angår fremskaffelsen av et diagnostisk sett for DNA-sekvenspåvisning, som omfatter fast polys tyren støttemateriale og fortrinnsvis et sett av PCR-reagenser, innbefattende spesifikke primere og prober som angitt i krav 1.
US patenter nr. 4.683.195 og 4.683.202 omtaler fremgangsmåter for å amplifisere DNA-sekvenser ved en fremgangsmåte som nå er kjent i faget somn "polymerase chain reaction"
(PCR) . PCR er en fremgangsmåte hvor DNA spesifikt amplifiseres ved mangfoldig primer-forlengelses-synteser av komplementære kjeder (Saiki et al., Science, 230: 1350-1354 og 239; 487-491; 1985, 1988) . PCR-produktet, amplifisert opp til IO<6>- IO<7>ganger, er et DNA-fragment av spesiell størrelse (amplikon) som kan påvises ved gelelektroforese eller på annen måte som beskrevet heri. Kort fortalt innebærer PCR fremstilling av korte oligonukleotidprimere som tilsvarer motsatte ender av en kjent "mål"-sekvens som man ønsker å amplifisere og deretter påvise. Ved denne feremgangsmåte ekstraheres DNA eller RNA fra celler, vev, kroppsvæsker og lignende. Nukleinsyren denatureres, og oligonukleotidprimerene tilsettes i molart overskudd, sammen med dNTPs (deoksyribonukleotid-trifosfater) og et DNA-polymeraseenzym, såsom fortrinnsvis varmestabil Ta<q->polymerase. Etter påfølgende varmedenaturering, kjøling for å oppnå sammenkobling til primere og primerforlengelse ved DNA-polymerase produseres to "lange produkter", som begyn-ner med de respektive primere, komplementært til de to opprinnelige kjeder. Denne fremgangsmnåte gjentas, og etter en andre cyklus produseres to opprinnelige kjeder, to lange produkter fra cyklus 1, to nye "lange produkter" og
to "korte produkter". Lengden på disse korte produkter (amplikoner) er lik antallet nukleotider mellom og inklusive begge primere. Med ytterligere cykluser produseres ytterligere "lange produkter", og de øker lineært med hver cyklus. Dannelsen av ampliconer øker immidlertid med eksponensiell hastighet for hver cyklus, og ved hjelp av denne amplifisering er det mulig å påvise ytterst små mengder av DNA.
Ved hjelp av PCR-teknikk er det mulig å påvise spesifikke DNA-sekvenser som forefinnes i minimale mengder. Flere av disse teknikker innebærer bruk av forskjellige hybridiserte prober som er bundet til visse materialer.
Cook et al., Nucleic Acids Research, 16.: 4077-4095 (1988), immobiliserte bakteriofag M13-mål-DNA i mikrotiterbrønner på Immulonc-2-plater ved å inkubere mål-DNA i 1 M ammoniumacetat i 1,5-2 timer ved 37°C. Det immobiliserte mål-DNA ble påvist etter hybridisering til terminal-biotin-merkede eller internal-biotin-merkede oligonukleotidprober, etterfulgt av tilsetning av streptavidin-HRP-kompleks og hydrogen-peroksyd/o-fenylendiamin (OPD) for kolorimetrisk påvisning av hydbridisering.
Nagata et al., FEBS Lett., 183: 370-382 (1985) immobiliserte lambda-mål-DNA i mikrotiterbrønner i PBS inneholdende 00,1 M MgCl2. Etter inkubering over natten ved værelsestemperatur, etterfulgt av fjerning av løsningen, ble platen bestrålt med ultraviolett lys. Hybridisering med en biotinylert (hakk-translatert) lambda DNA-probe ble etter- fulgt av kompleksdannelse med avidin-beta-galaktosidase. Fluores-censen ble målt etter tilsetning av substratet, 4-metylumb-elliferyl-beta-D-galaktosid.
Hevey et al., U.S. patent No. 4.228.237 beskriver en fremgangsmåte som anvender biotin som reagerer til avidin (kovalent bundet til et enzym) for å påvise en ligand i flytende medium. Foreliggende fremgangsmåte adskiller seg ved det at liganden er direkte merket med biotin, ikke mellomliggende biotinmerket anti-ligande. Videre beskriver forskjellige andre tidligere publikasjoner spesifikke hybridiseringsprober og diagnostisk anvendelse derav; f.eks. U.S. pat. nr. 4.358.535 (Falkow et al.) og europeisk patentsøknad nr. 82301804.9 (publikasjon nr. 63.879; Yale University). Sistnevnte beskriver bruk av biotinmerkede DNA-prober påvist ved enzymer som er bundet til avidin-eller biotinspesifikke antistoffer.
Ranki et al., US patent nr. 4.486.539, beskriver anvendelse av to ikke overlappende nukleinsyrereagenser (en bundet til et fast bærerstoff og den andre merket) for å påvise og identifisere mikrober ved DNA-hybridisering. Foreliggende oppfinnelse adskiller seg ved at målnukleinsyren i seg selv er merket og krever ikke anvendelse av en ytterligere merket nukleinsyreprobe for påvisning.
Stabinsky, US patent nr. 4.751.177, beskriver en DNA-påvisningsmetode hvor mål-DNAet hybridiseres til et mediator-polunukleotid og til et merket probe-polynukleotid. Mediator-polynukleotidet er i sin tur komplementært. til et polynukleotid som er immoibilisert på et fast bærermate-riale. Foreliggende oppfinnnelse adskiller seg ved at (a) mål-DNAet merkes under amplifikasjonen; ingen merket reportergruppe er nødvendig for påvisning, og (b) innfangningsproben er bundet direkte til et fast bærermater-iale uten bruk av et mediator-polynukleotid.
Guanidin tiocyanat (GuSCN) er blitt brukt i celleekstrak-sjon og påfølgende nukleinsyrehybridisering. For eksempel frem- stilte Thomson and Gillespie, Anal. Biochem. 163: 281-191 (1987) isotopmerkede RNA-prober for å påvise mål-DNA eller -RNA. I "dot-blot<n->format ble den<32>P-merkede probe hybridisert i 5 M GuSCN/0,1 M etylendiamintetraeddik-syre (EDTA) , dinatriumsalt, pH 8,0. Pellegrino et al.,
BioTechniques, 5: 452-459 (1987), beskrev en hybridisering
i oppløsning for å påvise HIV-RNA i blodceller. Blodceller ble oppløst i 5 M GuSCN/0,1 M EDTA og hybridisert med en isotopmerket RNA-probe i samme løsning ved værelsestemperatur. TCA-felte hybrider ble oppsamlet på membraner, og radioaktiviteten ble bestemt ved seintillasjontelling. Gillespie, International Patent Application nr. PCT/US87/- 01023 (International Publication nr. WO 87/06621) beskrev anvendelse av guanidin-tiocyanat for molekylærhybridisering ved hjelp av en merket probe for å påvise mål-DNA bundet til et fast bærerstoff. Patentet beskriver anvendelse av GuSCN for molekylær hybridisering over et konsentrasjons-område på 3 M - 6,5 M ved være Ises temperatur. Formatet for slik hybridisering omfatter å binde målnukleinsyrer til nitro-cellulose eller en nylonmembran ("dot-blot" eller "Southern blot"), prehybridisering, hybridisering til en isotopmerket probe i GuSCN, vasking og påvisning ved autoradiografi.
Kort beskrivelse av tegningene
Figur 1 viser fremstiling av en kjemisk forbindelsesarm som ble modifisert for å muliggjøre biotinylering av oligonukleotid-PCR-primere. Figur 2 viser resultatene av et autoradiogram av PCR-produkter bundet til en Nytran^,-membran. Figur 3 viser resultatene av oligonukleotidhybridiserings-(OH)-assay med PCR-produkter fra eksempel 6.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Uttrykkene "oligonukleotid" og "primer" som er brukt heri, har den betydning som er definert i det tidligere nevnte US patent nr. 4.683.202. Uttrykket "innfangningsprobe" som er brukt heri, kan defineres som et oligonukleotid som er ufullstendig eller i alt vesentlig komplementær til sekven-sen av amplikonet innen grensene for primerene. I forelig gende foretrukne utførelsesform har innfangningsproben ikke endeelement, men kan utstyres med endeelement med deoksy-ribonukleotider eller ribonukleotider.
Ved utførelse av foreliggende oppfinnelse velges primerne og proben slik et de er "substansielt" komplementære til de forskjellig kjeder av målsekvensen som skal amplifiseres.
For en av de spesielle utf ørelsesf ormer som er beskrevet her, ble det valgt to sett av PCR-primere og innfangningsprober fra nukleotidsekvensen av den kryptiske plasmid av Chlamydia trachomatis LI serovar (Hatt et al., Nucleic Acids Research, 16: 4053-4067, 1988. Dette muliggjorde den spesifikke amplifisering og påvisning av C. tracomatis.
Det amplifikerbare materiale som i tidligere nevnte US patent nr. 4.683.202, tilsettes deoksyribonukleotid-trifos-fåtene dATP, dCTP, dGTP og TTP til synteseblandingen i passende mengder, og den resulterende løsning oppvarmes til ca. 90-100°C i ca. 0,5 - 10 minutter for å adskille temp-latkjeder. Etter denne oppvarmingsperiode avkjøles løsnin-gen raskt til den tempe- råtur som er foretrukket for sammenkobling av templatprimeren. Til denne løsning tilsettes et egnet middel for å indusere eller katalysere primer-f orlengelsesreaksjonen, og reaksjonen kan foregå under betingelser som er kjent i faget. Induksjonsmidlet kan være enhver forbindelse eller system som kan fungere for å oppnå syntese av primerforlengelsesproduktet, inklusive enzymer. Passende enzymer for dette formål omfatter f.eks. Esche-richia coli (E. coli) DNA-polymerase I, Klenow-fragment av E. coli DNA-polymer-aser, reverstranskriptase, og andre enzymer, inklusive fortrinnsvis varmestabile enzymer (f.eks, Taq DNA-polymerase) som vil underlette innlemmelse av nukleotidene på egnet måte for å danne primer-f or len - gelsesproduktene som er komplementære til enhver nukle-insyrekj ede.
Den nylig syntetiserte kjede og dens komplementære nuklein-syrekjede danner et dobbeltkjedet molekyl, hvis kjeder skilles ved enhver denaturert prosess som gir enkeltkjedede molekyler, fortrinnsvis varme.
Nye nukleinsyrer syntetiseres på de enkeltkjedede templat-molekyler. Ytterligere enzym, nukleotider og primere kan tilsettes hvis nødvendig for å få reaksjonen til å gå under de betingelser som er beskrevet ovenfor. Igjen vil syntesen begynne ved én ende av oligonukleotid-primeme og vil fortsette langs de enkelte kjeder av templatet for å fremkalle ytterligere komplmentære nukleinsyrer ved primerforlengelse.
Trinnene for kjedeseparering og forlengelsesproduktsyntese kan gjentas så ofte som nødvendig for å fremstille den ønskede mengde av den amplifiserte nukleinsyresekvens.
Fast støttemateriale av<p>olystyren
Oppfangningsplaten eller bæreren som anvendes i foreliggende oppfinnelse, kan være et fast støttemateriale av polystyren. Forskjellige behandlinger av slikt støttemate-riale for å oppnå slik forsterkning er kjent i faget (f.eks. bestråling med<60>Co).
Støt trematerialet for polystyren som anvendes i foreliggende oppfinnelse vil være en mikrotiter-plate med et stort antall brønner, og de mest foretrukne av slike mikrotiterplater er de som er kjent som "Dynatech Immulonc2" (Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA, produsert av Fisher Scientific).
Generelle hybridiserin<g>steknikker
I en foretrukket utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse bindes en amplikon-spesifikk oligonukleotid-oppfang-ningsprobe passivt til brønner på en Immulon^, 2 polystyren-mikrotiterplate med en konsentrasjon på 25 ng DNA/brønn, i en løsning av IM ammoniumacetat. Slike mikrotiterplater har
en stort antall brønner og gir således både høy overflate og muliggjør et stort antall av samtidige assays, f.eks. 96) .
Hybridiseringstrinnet ifølge foreliggende oppfinnelse, nærmere bestemt "innfangningshybridiseringen", oppnås fortrinnsvis i nærvær av 1 M guanidin-tiocyanat, 20 mM etylen-diamintetraeddiksyre (EDTA)-dinatriumsalt, pH 8,0. Konsentrasjonsområdet for å oppnå innfangningshybridisering på miktrotiterplate er fortrinnsvis 0,5 til 2,0 molar GuSCN og mest foretrukket 1,0 til 2,0 M.
Andre reagenser kan også anvendes for å oppnå innf angnings-hybridisering. For eksempel kan en løsning av ammonium-tiocyanat (0,5 til 5,0 M, mest foretrukket 5,0 M) anvendes i stedet for guanidin-tiocyanat.
Andre mulige erstatninger for guanidin-tiocyanat er et reagens som består av: 30% (v/v) deionisert formamid;
3 x SSPE [1 x SSPE= 0,18 M NaCl; 10 mM NaP04, pH 7,7; 1 mM
EDTA]; 5% (w/v) dekstransulfat; 0,1% Triton X-100 (oktyl-fenoksypolyetoksyetanol; Sigma Chemical Co., .St. Louis,
MO) .
Formatet for slik hybridisering omfatter følgende trinn:
1.Fremstilling av innfangningsproben
2. Fremstilling av mikrotiterinnfangningsplater
3. Fortynning og denaturering av amplifisert, merket DNA
4. Innfangningshybridisering
5. Vasking
6. Blokkering
7. Tilsetning av avidin:pepperrot-peroksidase
8. Vasking
9. Tilsetning av substrat og kromogen; farvefremkalling
10. Plateavlesning (kvantifisering)
Disse trinn skal nå beskrives i detalj.
1. Fremstilling av innfancmingsprobe
Innfangningsprobene heri velges slik at de er "substansielt" komplementære til sekvenser at amplikonet innenfor grensene for primerne. Derfor må innf angningsprobene være tilstrekkelig kompleentære for spesifikt å hybridisere til amplikonet under innfangningshybridiserings-betingelsene. I den utførelsesform som for tiden er foretrukket, inneholder innfangningsproben vanligvis 20-200 nukleotider.
Videre kan mer enn en innf angningsprobe anvendes, og ytterligere innfangningsprober kan anvendes for å innfange den samme eller motstatte kjede av det merkede amplikon.
Foreliggende innf angningprober og PCR-primere er blitt syntetisert i en-MilliGen 7500 DNA Synthesizer (MilliGen/- Biosearch, Inc. Burlington, MA) ved hjelp av normal beta-cyanoetylfosforamaditt-kjemi, skjønt andre fremgangsmåter som er kjent av fagmannen er mulige. Før anvendelse ble oppfangningsprobene og PCR-primerne delvis renset, enten ved elektroforese gjennom 15% (w/v) polyakrylamidgeler eller ved rotasjonskolonne (se eksempel 3). De sluttelige delvis rensede innf angningsprober og primere ble suspendert i vann, konsentrasjonen ble bestemt spektrofotometrisk, og løsningen ble lagret ved 4°C inntil bruk.
2. Fremtilling av oppsamligsplaten
Oleonukleotidoppsamlingsproben festes fortrinnsvis til brønnen på en Dynatech Immulon£ 2 - mikrotiterplate (Dynatech Laboratories, Inc., Chatilly, VA, produsert av Fusher Scientific) . Immulon<L2 - platen er en anordning med 96 miniatyr-polystyrenprøverør (brønner) i en eneste plastpla-te, fremstilt for generell bruk i fastfase-immunoassay fremgangsmåter for mikrovolum. I den foretrukne utførelse- sform ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes plater med flate brønnbunner (400/il volumkapasitet) , men det antas at U-formede brønnbunner også kan anvendes (300 fil volumkapasitet) .
Som en annen foretrukken utførelsesform kan proben også festes til Immulon^2 Removawelld- strimler (/Dynatech), som er fjernbare strimler på tolv Immunolon^polystyren-prøverør (brønner) som er anpasset til Removawellc-strim-melholderne (Dynatech) i et mikrotiterplateformat.
Oligonukleotid-innfangningsproben fortynnes slik at den gir 25 ng pr. mikrotiterbrønn i 50/il M ammoniumacetat (Fisher
Scientific, Fair Lawn, NJ) . "Blinde brønner" fremstilles også ved å tilsette 1 M ammoniumacetat (Uten oligonukleotid- innf angningsprobe) til visse brønner (til hvilke merkede PCR-produkter vil bli tilsatt senere for narre-hybridisering). Disse blinde brønner er indikasjon på ikke-spesifikk binding av biotinylert DNA til brønner i mikrotiterplater og anvendes for å kalibrere avlesningsinstrumen-tet for platene
(spektrofotometer) (se nedenunder, trinn 10) .
Platen forsegles med mylarplatef orsegler (Dynatech) og inkuberes ved 37°C over natten for passiv fiksering av oligonukleotidinnfangningsproben til polystyrenoverflaten. Hvis platene ikke anvendes med en gang, lagres de ved 4°C inntil bruk. Plater som var lagret på denne måte i opptil 6 uker, viste ingen signifikant forskjell når det gjaldt deres evne til å innfange DNA.
Like før hybridiseringen vaskes brønnene i platene to ganger med 200 fil 2 x SSC [1 x SSC= 0,15 M NaCl; 15 mM natriumcitratbuf f er, pH 7,0] og en gang med 200/il 2 x SSC, 0,1%
(v/v) Triton X-100. All platevask som er beskrevet her, gjøres med en pipetteanordning med mange kanaler (f.eks.
Titertekc.) , eller kan gjøres med en egnet automatisk mikrotiterplate-vasker.
3. Fortynning og denaturerintg av amplifisert, merket DNA
De biotinylerte PCR-produkter fortynnes (i området fra 1:10 til 1:100 eller mer) i 1 M GuSCN (Ultra-pure grade; Boehri-nger Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN), 20 mM EDTA (Sigma), pH 8,0 (fremstilt fra en 5 x sterkere stamlø-sning), oppvarmes ved 100°C i 5 min og avkjøles raskt i et isvannbad. (Oppvarmingstrinnet medfører varmedenaturering av PCR-produktene, og den raske avkjøling hemmer sammenkobling på nytt av ampiikonkjedene, og begunstiger hybridiser-eing til oligonukleotid-innfangningsproben).
Alikvoter på 100/il overføres til hver brønn, inklusive brønnene som er bestemt som blindprøver (ingen innfangningsprobe) som beskrevet ovenfor (trinn 2).
4. Innfangningshybridisering
Spesifikk innfangning av amplifisert, merket DNA ved en oligonukkleotidinnfangningsprobe oppnås ved inkubering ved værelsestemperatur i 1-3 timer. I løpet av - denne tid innfanges PCR-amplikoner spesifikt av oligonukleotidinnfangningsproben, basert på sekvenskomplementaritet mellom innfangningsproben og merket ampiikon.
5. Platevasking
Etter hybridiseringen fjernes innholdet i alle mikrotiter-brønner, og brønnene vaskes to ganger med 200/il 2 x SSC. 0,1% (v/v) Triton X-100; og fire ganger med 200/il 0,2 x SSC, 0,1% (v/v) Triton X-100, som tidligere er blitt oppvarmet til 37°C. Disse vaskinger utføres for å fjerne ubundne biotinylerte produkter fra mikrotiterbrønnene.
6. Blokkering
Etter platevaskingen "blokkeres" brønnene i platen i minst
15-30 minutter med 200 pil av en løsning av PBS, (PBS= 0,13 M NaCL, 7 mM Na2HP04, 3 mM NaH2P04, pH 7,0), 2% (w/v)
serumalbumin fra okse (BSA) (Sigma), 0,1% (v/v) Triton X-100. Dette "blokkerings"-trinn er nødvendig for å minimali-sere ikke-spesifikk binding av avidin:HRP til mikrotiter-brønnene.
7. Avidin:pepperrotperoksidase
Avidin:pepperrotperoksidase (HRP)-kompleks (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) fortynnes 1:2000 i PBS, 0,1%
(v/v) Triton X-100 til en sluttkonsentrasjon på 2,5 fig avidin: HRP/ml. 50 mikroliter fortynnet avidin:HRP tilsettes til hver brønn og inkuberes i 30 minutter ved værelses temperatur. I løpet av dette trinn bindes avidin :HRP-kompolek-set tett til innf angede biotinylerte porodukter i brønnen. Mens avidin:HRP anvendes i foreliggende oppfinnelse, kan et kompleks av streptavidin:HRP anvendes i stedet. Likeledes kan andre forbindelser i kompleksform med avidin (eller
streptavidin) anvendes, inklusive: alkalisk fosfatase, . beta-galaktosidase, luciferase, fluorscein, Texas Red eller et annet middel som er i stand til å fremkalle et kolorimetrisk, fluoriserende eller luminiserende signal.
8. Vasking
Brønnene i mikrotiterplaten vaskes deretter fire ganger med 200/il PBS, 0,1% Triton X-100, og en gang med 100/il PBS, 1 mM EDTA og inkuberes med den siste vaskeløsning ved værelsestemperatur i 1-10 minutter. Disse vaskinger utføres for å fjerne ubundet avidin:HRP fra mikrotiterbrønnene før tilsetning av kromogen.
9. Farvefremkalling
" Farvefremkalling, i den foretrukne utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse, utføres med ett av de to kromo-gene systemer: (a) hydrogenperoksyd/OPD og (b) hydrogenperoksyd/TMB.
( a) Hvdrogenperoksvd/ OPD. Etter at vaskebufferen (beskrevet i trinn 8) er blitt fjernet, tilsettes 150 fil OPD-reagens [1,6 mg/ml o-fenylen-diamin-dinatriumsalt (Sigma), 0,0125% (v/v) hydrogenperoksyd (Fisher Scientific) i 0,15 M natriumfosfat/citrat-buffer, pH 6,0], og farvefremkallingen får fortsette i mørke i 1-30 minutter. Farvefremkallingen stoppes ved tilsetning av 50/ti 4 N H2S04.
( b) Hydrogen- peroksvd/ TMB. Etter at siste vaskebuffer (beskrevet i trinn 8) er blitt fjernet, tilsettes 100 fil TMB farvereagens til hver brønn. [TMB-farvereagens består av friskt blandende like volumer TMB-peroksydasesubstrat
(3,3', 5,5'-tetrametylbenzidin i en konsentrasjon på 0,4 g/l i en organisk base; i handelen fra Kirkegaard and Perry, Inc., Gaithersburg, MD) og hydrogenperoksydløsning [0,02% (v/v) hydrogenperoksyd i sitronacetatbuffer, i handelen fra Kirkegaard og Perry, Inc.]. Reaksjonen får pågå ved værelsestemperatur i mørke i 1-30 minutter, hvoretter farvefremkallingen stoppes ved tilsetning av 100 fil IM fosforsyre (H3P04) .
TMB-substratet fremkaller en feining med blå farve. Ved tilsetning av fosforsyre fremkommer en farveforandring til gult, med en optisk tetthet som måles ved 450 nm (see nedenfor, trinn 10). I tillegg til HRP-substrater, OPD og TMB, omfatter andre løselige substrater: 2,2-azino-di (3-etylbenztiazolin-sulfonsyre) (ABTS) og 5-aminosalisylsyre (ASA) . Uløseige substrater omfatter 3-amino-9-etylkarbazol (AEC) og 3,3-diaminobenziden (DAB) .
10. Plateavlesning ( kvantifisering)
Etter at farvefremkallingen er stoppet, bestemmes den "^ optiske tetthet (OD) i prøvene i hver brønn ved avlesingen i en automatisk mikrotiterplate-avleser som er i stand til spektrofotometrisk bestemmelse (f.eks. InterMed Immuno-readeri, NJ-2000) ved bølgelengder som er spesifikke for den anvendte kromogen (se nedenfor).
Den optiske tetthet i de blinde brønner [biotynilerte PCR-produkter tilsatt til brønnen uten innfangningsprobe, som beskrevet i trinn 2] bestemmes også. Dette signal (vanligvis meget lavt) er en indikasjon på falsk "ikke-spesifikk" binding av biotynilerte produkter til prøve-brønnene, og ikke signaler som er resultat av ekte innfangning av biotynilerte amplikoner ved hybridisering med en innfangningsprobe. Derfor subtraheres den optiske tetthet av de blinde brønner fra den optiske tetthet av prøvebrønnene for å gi en nøyaktig kvantifisering av ekte innf angningshybrid-isering.
Den egnede bølgelengdeinnstilling for spektrofotometeret (plateavleser) er avhengig av det spesifikke kromogen som anvendes for den kolorimetriske reaksjon. Hvis man anvender hydrogenperoksyd/OPD, er den korrekte bølgelengdeinnstil-ling således 490 nm; hvis man anvender hydrogenperoksyd/TMB er den korrekte bølgelengdeinnstilling 450 nm.
De følgende eksempler beskrives for å illustrere oppfinnelsen.
Eksempel 1
Syntese av biotin- ll- dUTP
Biotin-ll-dUTP ble kjemisk syntetisert ved fremgangsmåten beskrevet av Langer et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 78:6633-6637 (1981) og ble suspendert i en konsentrasjon av 0,4 mM i 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,4 mM EDTA. Forholdet biotin-ll-dUTP:TTP ble optimalisert, og det høyeste signal ble oppnådd med et forhold på 4:1 (biotin-ll-dUTP:TTP).
Eksempel 2
Fremstilling av 5'- biotinylerte primere
Alle oligonukleotider som ble anvendt som PCR-primere ble syntetisert i en MilliGen 7500 automatisert DNA-syntetis-erer ved normal beta-cyanoetyl-fosforamaditt-kjemi, med fremgangsmåter som er kjent i faget.
01 igonukleot idene som ble fremstilt for anvendelse som biotinylerte primere, ble modifisert som vist i fig. 1. De syntetiske oligonukleotider på fast støttemateriale ble derivatisert ved 5'-enden ved omsetning med det beskyttede heksylaminofosforamaditt [struktur 1] , etterfulgt av oksydasjon og deblokkering i henhold til standard fremgangsmåter (McBride and Caruthers, Tetrahedron Letters, 24: 245-248, 1983) for å gi 5'-amino-merkede oligomerer [struktur 2] . Reaksjonen aw [2] med N-hydroksysuccinimidylestere av biotinderivater ga 5'-biotinylerte oligonukleotider [struktur 3] med godt utbytte, som ble renset ved polyakry-lamidgelelektroforese. (Se nedenfor, eksempel 3-) .
Eksempel 3
Rensing av oligonukleotider
01 igonuklotidene som ble anvendt som PCR-primere eller innfangingsprober ble renset på en av to måter: (a) polyakrylamid-gelelektroforese eller (b) rotasjonskolonne.
( a) Polyakrylamid- gelelektroforese. Alikvoter på 100-250 pig av hvert oligonukleotid ble tørket i vakuum, suspendert på nytt i et lite volum gelladningsbuf f er [TBE (89 mM Tris-borat, 89 mM borsyre, 2 mM EDTA) ; 90% (v/v) deionisert formamid; 0,02% (/w/v) bromfenol-blått] , oppvarmet ved 100°C i 5 min og raskt avkjølt i et isvannbad. Prøvene ble
overført til et denaturerende polyakrylamidgel [25% (w/v)
akrylamid (akrylamid: bis-akrylamid, 29:1) (IBI, New Haven, CT) , 7 M urea (IBI) i TBE] og elektroforesert ved 650 Volt i fire timer. DNA'et ble gjort synlig ved UV-belysning over en tynnsjiktskromatografi-plate (Eastman Kodak #13254 cellulose), fotografert og gelbåndet med oligonukleotidet i full lengde ble fjernet. Geldelen ble knust, og DNA'et ble eluert i vann over natten ved 37°C. DNA'et ble ytterligere renset ved å la det passere over en C18Sep-Pak^-patron (Waters Associates, Milford, MA), og eluert i 40%
(v/v) acetonitril (Fisher). Etter inndampning til tørrhet i vakuum ble DNA'et suspendert i vann, og dets konsentrasjon ble bestemt spektrofotometrisk. Stamkonsentrasjoner ble innstilt med vann og lagret ved 4°C inntil bruk.
( b) Rotasionskolonne. Noen oligonukleotid-innfangningsprober og primere ble delvis renset med Bio-Spin™ 6-kolonne (Bio-Rad, Inc., Richmond, CA) i en svingende skovlrotor ved lav sentrifugalkraft, ifølge produsentens instruksjoner for rotasjonskolonnen. Etter delvis rensing ble konsentrasjonen av oligonukleotidene bestemt spektrofotometrisk, og stam- løsninger ble fremstilt med vann og lagret ved 4°C inntil bruk.
Eksempel 4
PCR- betingelser
De fleste primerpar ble undersøkt empirisk for å bestemme deres optimale temperaturbetingelser for PCR-amplifisering, spesielt med hensyn til tilkoblingstemperaturen.
Med aktuelle primerpar for Chlamydia trachomatis besto en hundre/il PCR-reaksjonsblanding av: lx reaksjonsbuf fer (RB) [10 x RB= 500 mM KC1; 100 mM Tris-HCl, pH 8,5; 25 mM MgCl2] ; 200 /iM av hver av dATP, dCTP, dGTP og TTP; 50 pmol hver av SK43 og SK44 og 2 enheter rekombinant Taq-DNA-polymerase (RecombiTaq,;, Cetus Perkin Eimer, Norwalk, CT) .
For eksperimenter hvor biotin-ll-dUTP var innlemmet, var
reaksjonsblandingene som ovenfor unntatt at 200 jzM TTP var erstattet med 160 M biotin-ll-dUTP, 40fiM TTP.
For det aktuelle primersett begynte PCR-temperatursysternet med en innledende utstrakt denaturer ing ved 94 °C i 5 minutter, etterfulgt av et tilkoblingstrinn ved 50°C i 25 sekunder, og et forlengelsestrinn ved 72°C i 1 minutt. For de neste 28 cykler besto temperatursysternet av: Denaturering ved 94°C i 25 sek, tilkobling ved 50°C i 25 sek og forlengelse ved 72°C i 1 min. Den avsluttende (trettiende) cyklus var: Denaturering ved 94°C i 25 sek, tilkobling ved 50°C i 25 sek og en øket forlengelse ved 72°C i 10 min. Etter PCR-amplifisering ble 90/xl av reaksjonsblandingen fjernet fra under mineraloljen og lagret ved 4°C til analysen av PCR-produktene fant sted.
Eksempel 5
Fremstilling av positive og negative kontroll- plasmid-templater
Et plasmid som inneholdt hele den aktuelle gensekvens fra Chlamydia tranchomatis ble brukt som positivt kontrolltemplat. Konsentrasjonen av plasmid-DNA ble bestemt spek-trof otometrisk, og fortynninger ble gjort i vann for å få kjente kopimengder av mål-DNA for PCR-reaksjoner. På denne måte ble det fremstilt et positivt kontrolltemplat.
Eksempel 6
Påvisning av Chlamydia trachomatis- sekvenser
To sett av primere og innfangningsprober ble syntetisert for å spesifikt påvise Chlamydia trachomatis. Oligonukleo-tidsekvensene ble valgt fra det kryptiske plasmid av C. trachomatis Li seroval (Hatt et al., Nucleic Acids Research, 16:4053-4067, 1988).
Primersett A genererte et 208 bp spesifikt amplicon ved hjelp av følgende primere:
CP- 24 (25-mer, + polaritet, base 195-219)
dvs. primeren er ethvert oligonukleotid som vil bindes til eller forårsake forlenging ved følgende sekvens: dvs. primeren er ethvert oligonukleotid som vil bindes til eller forårsake forlengning ved følgende sekvens: Primersett A 208 bp-spesifikt amplikon ble påvist med innfangningsprobe CP-35: dvs. proben er ethvert oligonukleotid som vil bindes til følgende sekvens:
Chlamydiaprimersett B genererte et 173 bp-spesifikt amplikon ved hjelp av følgende primere:
CP- 37 (23-mer, + polaritet, base 678-700)
dvs. primeren er ethvert oligonukleotid som vil bindes til eller forårsake forlengning ved følgende sekvens: dvs. primeren er ethvert oligonukleotid som vil bindes til eller forårsake forlengning ved følgende sekvens:
Primersett B 173 bp-amplikon ble påvist med innf angningsprobe CP-39: dvs. primeren er ethvert oligonukleotid som vil bindes til følgende sekvens:
Primersett B ble anvendt for å amplifisere målplasmid pCHL-1. Ved hjelp av 5'-biotinylerte primere ble målsubstansen
amplifisert med 30 cykluser i PCR, og de biotinylerte produkter ble undersøkt ved innf angsningshybr idi sering
(tabell 2) . Etter ti minutters fremkalling (TMB/H202) var så få som 20 utgangskopier av pCHL-1 påvisbare (1:25 fortynning, OD450= 0.140), med ubetydelig bakgrunns-signal
(O<D>450= 0.009 for 1:25 fortynning).
Eksempel 7
Påvisning av McCov- celler ocr kliniske isolater infisert med Chlamydia trachomatis
McCoy-celler, enten uinokulert eller infisert med C. tracho-matis, ble lysert i 2SP (20 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,2, 2M sukrose) som inneholder 100/xg/ml Proteinase K, 1% Tween-20 og ble inkubert ved 55°C i 1 time, etterfukgt av inkubering ved 95°C i 10 min. Primersett A (eksempel 12) ble anvendt i en PCR-amplifisering på 30 cykluser, og produktene ble undersøkt ved plateassay som beskrevet i eksempel 8. Etter ti minutters farvefremkalling ga både 10 og 100 infiserte McCoy-celler, når de var innblandet i IO<5>uinfi- serte McCoy-celler, OD450-verdier >2.000 (for både 1/25- og 1/100-fortynninger av produktet i GuSCN). Ekstra-herte og amplifiserte uinfiserte celler alene (10<5->celler) ga O<D>450-verdier på <0,050.
Kliniske prøver som tidligere var klassifisert etter sin grad av cytopatiske effekter (CPE) [i området fra "negativ"
(ingen CPE) til 4+ (mest fremtredende CPE)], ble likeledes ekstrahert og amplifisert i 30 cykluser i CPC, idet man anvendte primersett A. Resultatene av dette assay er vist i tabell 3.
Sammenfattet er nye måter å merke og påvise amplifiserings-produkter fra Chlamydia trachomatis ved PCR beskrevet heri. Disse merkings- og innfangningsmåter tilveiebringer flere fordeler over konvensjonelle påvisningsmetoder: 1. Biotinyleringen og innfangningen av PCR-produkter på mikrotiterplater er et raskere assay. Plateassayet ifølge foreliggende oppfinnelse kan utføres i løpet av 2 timer, sammenlignet med ca. 6 -24 timer for OH-assay,. og så mye som 48 timer for Southern blotting og hybridisering. 2. Plateassay-f ormatet er mindre arbeidskrevende og kan automatiseres for analyse av store prøveantall. 3. Til forskjell fra de andre to assay-formatene som ble undersøkt, krever plateassay-formatet ikke preparering, rensing eller håndtering av farlige radioaktive prober med høy spesifikk aktivitet. 4. Innfangningen av biotinylerte produkter via plateassay tilveiebringer en objektiv, kvantitativ hybridiserings-bestemmelse; beregning av et statistisk grensepunkt for positivitet i prøvene og kvantitativ beregning av assayets "støysignal"-andel.
Claims (12)
1. Diagnostisk sett for påvisning av en målnukleinsyre-sekvens fra Chlamydia trachomatis,karakterisert vedat settet omfatter PCR-primere, hvor nevnte primere er oligonukleotider som vil binde til eller forårsake forlengelse via sekvens-settene
som utgjør sett A, eller
som utgjør sett B,
samt en mikrotiterplate som har et antall brønner og som har bundet til seg en oligonukleotid-innfangningsprobe med en nukleinsyresekvens som i hovedsak er komplementær til nevnte målsekvens.
2. Diagnostisk sett ifølge krav 1,karakterisert vedat det ytterligere omfatter reagenser for å utføre PCR-amplifikasjon og hybridisering av nevnte innfangningsprobe og nevnte målsekvens.
3. Diagnostisk sett ifølge krav 2,karakterisert vedat det ytterligere omfatter Taq-polymerase samt dNTP'er.
4. Diagnostisk sett ifølge krav 3,karakterisert vedat en eller flere av nevnte dNTP'er omfatter en markør.
5. Diagnostosk sett ifølge krav 1,karakterisert vedat minst én av nevnte PCR-primere er biotinylert via en tilknytningsarm-modifisering ved 5' ende.
6. Diagnostisk sett ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte mikrotiterplate omfatter polystyren med øket proteinbindende kapasitet.
7. Diagnostisk sett ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte probe er et oligonukleotid som vil binde til den følgende sekvens
for sett A, eller
for sett B.
8. Primere til bruk i PCR-amplif ikering av Chlamydia trachomatis nukleinsyre-sekvenser,karakterisert vedat nevnte primere er oligonukleotider som vil binde seg til eller forårsake forlengelse via de følgende sekvenser:
9. Prober som er anvendelige ved hybridiseringsassays av DNA-sekvenser amplifikert med primere ifølge krav 8,karakterisert vedat probene er oligonukleotider som vil binde til følgende sekvens:
10. Primere for anvendelse ved PCR-amplifikering av Clamydia trachomatis nukleinsyre målsekvenser,karakterisert vedat nevnte primere er oligonukleotider som vil binde seg til eller forårsake forlengelse via de følgende sekvenser:
11. Prober som er anvendelige i hybridiseringsassays av DNA-sekvenser amplifikert med primere ifølge krav 10,karakterisert vedat proben er et oligonukleotid som vil binde til den følgende sekvens:
12. Anvendelse av diagnostisk sett ifølge ethvert av kravene 1 til 7 ved påvisning av Chlamydia trachomatis.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/414,542 US5232829A (en) | 1989-09-29 | 1989-09-29 | Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO904240D0 NO904240D0 (no) | 1990-09-28 |
| NO904240L NO904240L (no) | 1991-04-02 |
| NO302204B1 true NO302204B1 (no) | 1998-02-02 |
Family
ID=23641905
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO904240A NO302204B1 (no) | 1989-09-29 | 1990-09-28 | Diagnostisk sett for påvisning av nukleinsyresekvenser fra Chlamydia trachomatis |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5232829A (no) |
| EP (2) | EP0875583B1 (no) |
| JP (1) | JP2719225B2 (no) |
| AT (2) | ATE345398T1 (no) |
| AU (2) | AU6329090A (no) |
| BR (1) | BR9004881A (no) |
| CA (1) | CA2026280C (no) |
| DE (2) | DE69033387T2 (no) |
| DK (2) | DK0420260T3 (no) |
| ES (2) | ES2140372T3 (no) |
| IL (1) | IL95800A (no) |
| NO (1) | NO302204B1 (no) |
| NZ (2) | NZ235463A (no) |
| ZA (1) | ZA907706B (no) |
Families Citing this family (101)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4038804A1 (de) * | 1990-10-09 | 1992-04-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur genus- oder/und spezies-spezifischen detektion von bakterien in einer probenfluessigkeit |
| US5753433A (en) * | 1909-12-05 | 1998-05-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method for the sensitive detection of nucleic acids |
| US5750338A (en) * | 1986-10-23 | 1998-05-12 | Amoco Corporation | Target and background capture methods with amplification for affinity assays |
| US5714380A (en) * | 1986-10-23 | 1998-02-03 | Amoco Corporation | Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification |
| US5800992A (en) | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
| US6309822B1 (en) | 1989-06-07 | 2001-10-30 | Affymetrix, Inc. | Method for comparing copy number of nucleic acid sequences |
| US6346413B1 (en) | 1989-06-07 | 2002-02-12 | Affymetrix, Inc. | Polymer arrays |
| US5424186A (en) | 1989-06-07 | 1995-06-13 | Affymax Technologies N.V. | Very large scale immobilized polymer synthesis |
| US6416952B1 (en) | 1989-06-07 | 2002-07-09 | Affymetrix, Inc. | Photolithographic and other means for manufacturing arrays |
| US6551784B2 (en) | 1989-06-07 | 2003-04-22 | Affymetrix Inc | Method of comparing nucleic acid sequences |
| US6040138A (en) * | 1995-09-15 | 2000-03-21 | Affymetrix, Inc. | Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays |
| US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
| US5744101A (en) * | 1989-06-07 | 1998-04-28 | Affymax Technologies N.V. | Photolabile nucleoside protecting groups |
| US6406844B1 (en) | 1989-06-07 | 2002-06-18 | Affymetrix, Inc. | Very large scale immobilized polymer synthesis |
| US5547839A (en) | 1989-06-07 | 1996-08-20 | Affymax Technologies N.V. | Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection |
| US5232829A (en) * | 1989-09-29 | 1993-08-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes |
| US6506558B1 (en) | 1990-03-07 | 2003-01-14 | Affymetrix Inc. | Very large scale immobilized polymer synthesis |
| IT1248685B (it) * | 1990-06-04 | 1995-01-26 | Tecnogen Scpa | Procedimento per la identificazione di sequenze polinucleotidiche e dispositivo relativo |
| FR2663040B1 (fr) * | 1990-06-11 | 1995-09-15 | Bio Merieux | Procede de detection d'une sequence nucleotidique selon la technique d'hybridation sandwich. |
| US5695926A (en) * | 1990-06-11 | 1997-12-09 | Bio Merieux | Sandwich hybridization assays using very short capture probes noncovalently bound to a hydrophobic support |
| JPH0499500A (ja) * | 1990-08-17 | 1992-03-31 | Kikkoman Corp | アビジンまたはアビジン標識体の定量法およびビオチンまたはビオチン標識体の定量法 |
| US5635348A (en) * | 1990-10-05 | 1997-06-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method and probes for identifying bacteria found in blood |
| NZ240079A (en) * | 1990-10-09 | 1993-07-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method for the detection of a nucleic acid or part thereof |
| US5474895A (en) * | 1990-11-14 | 1995-12-12 | Siska Diagnostics Inc. | Non-isotopic detection of nucleic acids using a polystyrene support-based sandwich hybridization assay and compositions useful therefor |
| DE69132843T2 (de) | 1990-12-06 | 2002-09-12 | Affymetrix, Inc. (N.D.Ges.D.Staates Delaware) | Identifizierung von Nukleinsäuren in Proben |
| FR2679255B1 (fr) * | 1991-07-17 | 1993-10-22 | Bio Merieux | Procede d'immobilisation d'un fragment nucleique par fixation passive sur un support solide, support solide ainsi obtenu et son utilisation. |
| DE69232753T2 (de) * | 1991-11-01 | 2003-05-15 | Diatech Pty. Ltd., Brisbane | Feststoff-phase erweiterungsverfahren |
| US6468740B1 (en) | 1992-11-05 | 2002-10-22 | Affymetrix, Inc. | Cyclic and substituted immobilized molecular synthesis |
| US6943034B1 (en) | 1991-11-22 | 2005-09-13 | Affymetrix, Inc. | Combinatorial strategies for polymer synthesis |
| US5677195A (en) * | 1991-11-22 | 1997-10-14 | Affymax Technologies N.V. | Combinatorial strategies for polymer synthesis |
| AU2844792A (en) * | 1991-12-11 | 1993-06-17 | Becton Dickinson & Company | Probes to chlamydia trachomatis |
| JPH07502414A (ja) * | 1991-12-23 | 1995-03-16 | バイエル コーポレイション | 溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイに用いるためのクラミジアプローブ |
| KR100289793B1 (ko) * | 1992-01-29 | 2001-12-01 | 테츠오 토미나가 | 폴리누클레오티드고정지지체 |
| WO1993020234A1 (en) * | 1992-03-31 | 1993-10-14 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | A rapid, high capacity nucleic acid based assay |
| DE4212555A1 (de) * | 1992-04-15 | 1993-10-21 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren |
| EP0656068B1 (en) * | 1992-07-24 | 1999-12-15 | University Of South Australia | Amplification and detection process |
| JPH08503606A (ja) * | 1992-10-09 | 1996-04-23 | アモコ・コーポレーション | 検定法 |
| US5545528A (en) * | 1993-04-15 | 1996-08-13 | Hitachi Chemical Research Center | Rapid screening method of gene amplification products in polypropylene plates |
| WO1994026934A2 (en) * | 1993-05-06 | 1994-11-24 | Baxter Diagnostics Inc. | Human papillomavirus detection assay |
| US5550040A (en) * | 1993-06-23 | 1996-08-27 | Hoffman-La Roche Inc. | Method, reagents and kits for the detection of Neisseria gonorrhoeae |
| US5601978A (en) * | 1993-09-03 | 1997-02-11 | Abbott Laboratories | Oligonucleotides and methods for the detection of chlamydia trachomatis |
| WO1995006753A1 (en) * | 1993-09-03 | 1995-03-09 | The United States of America, represented by The Secretary, Department of Health & Human Services | Method and compositions for primer specific solid-phase detection of pcr products |
| FR2716263B1 (fr) * | 1994-02-11 | 1997-01-17 | Pasteur Institut | Procédé d'alignement de macromolécules par passage d'un ménisque et applications dans un procédé de mise en évidence, séparation et/ou dosage d'une macromolécule dans un échantillon. |
| US5480783A (en) * | 1994-03-31 | 1996-01-02 | The Perkin-Elmer Corporation | Method for reducing background signals in DNA replication/detection assays |
| US6037127A (en) * | 1994-03-31 | 2000-03-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for detection of non-denatured nucleic acid fragments |
| US5547861A (en) | 1994-04-18 | 1996-08-20 | Becton, Dickinson And Company | Detection of nucleic acid amplification |
| US7378236B1 (en) | 1994-06-17 | 2008-05-27 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Method for analyzing gene expression patterns |
| US7323298B1 (en) | 1994-06-17 | 2008-01-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Microarray for determining the relative abundances of polynuceotide sequences |
| US20030026782A1 (en) * | 1995-02-07 | 2003-02-06 | Arthur M. Krieg | Immunomodulatory oligonucleotides |
| ATE206764T1 (de) * | 1994-07-16 | 2001-10-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Verfahren zum sensitiven nachweis von nukleinsäuren |
| US5514551A (en) * | 1994-10-14 | 1996-05-07 | Gen-Probe Incorporated | Compositions for the detection of Chlamydia trachomatis |
| US8236493B2 (en) | 1994-10-21 | 2012-08-07 | Affymetrix, Inc. | Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA |
| CA2163393C (en) * | 1994-11-30 | 2003-04-22 | Colleen Marie Nycz | Amplification and detection of mycobacteria nucleic acids |
| US6022689A (en) * | 1995-04-07 | 2000-02-08 | University Of New Mexico | Situ hybridization slide processes |
| US5989813A (en) * | 1995-07-13 | 1999-11-23 | Molecular Innovations, Inc. | Detection of amplified nucleic acid sequences using bifunctional haptenization and dyed microparticles |
| US6027879A (en) * | 1995-08-09 | 2000-02-22 | The Regents Of The University Of California | Detection and isolation of nucleic acid sequences using a bifunctional hybridization probe |
| US5800989A (en) * | 1995-11-15 | 1998-09-01 | Becton, Dickinson And Company | Method for detection of nucleic acid targets by amplification and fluorescence polarization |
| EP0880598A4 (en) | 1996-01-23 | 2005-02-23 | Affymetrix Inc | RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM |
| US5814490A (en) * | 1996-06-11 | 1998-09-29 | Becton, Dickinson And Company | Amplification and detection of chlamydia trachomatis nucleic acids |
| WO1998006435A2 (en) * | 1996-08-14 | 1998-02-19 | Vanderbilt University | COMPOSITIONS OF ANTICHLAMYDIAL AGENTS FOR THE DIAGNOSIS AND MANAGEMENT OF INFECTION CAUSED BY $i(CHLAMYDIA) |
| WO1998013527A2 (en) * | 1996-09-24 | 1998-04-02 | Rapigene, Inc. | Compositions and methods for enhancing hybridization specificity |
| US6361940B1 (en) | 1996-09-24 | 2002-03-26 | Qiagen Genomics, Inc. | Compositions and methods for enhancing hybridization and priming specificity |
| EP0952228A3 (en) * | 1996-09-24 | 1999-12-15 | Rapigene, Inc. | Compositions and methods for enhancing hybridization specificity |
| US6143496A (en) | 1997-04-17 | 2000-11-07 | Cytonix Corporation | Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly |
| US6391655B1 (en) | 1997-07-30 | 2002-05-21 | Corning Incorporated | Oxidized styrenic polymers for DNA binding |
| US6096501A (en) * | 1997-11-04 | 2000-08-01 | Becton Dickinson And Company | Assay for Chlamydia trachomatis by amplification and detection of Chlamydia trachomatis crytpic plasmid |
| DE19811732A1 (de) * | 1998-03-18 | 1999-09-30 | November Ag Molekulare Medizin | Mikrotiterplatte und Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen |
| US6261769B1 (en) | 1998-03-31 | 2001-07-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Intergenic spacer target sequence for detecting and distinguishing Chlamydial species or strains |
| DE19824900B4 (de) * | 1998-06-04 | 2006-05-04 | Roche Diagnostics Gmbh | DNA-Nachweis über einen Strangreassoziationskomplex |
| US6545264B1 (en) | 1998-10-30 | 2003-04-08 | Affymetrix, Inc. | Systems and methods for high performance scanning |
| DE19916929A1 (de) * | 1999-04-15 | 2000-10-19 | Bayer Ag | Ein automatisierbarer Schnelltest zum Nachweis von Krebserkrankungen auf der Basis von Telomerase(hTC) mRNA mit spezifischen Primern und Sonden |
| US6248537B1 (en) | 1999-05-28 | 2001-06-19 | Institut Pasteur | Use of the combing process for the identification of DNA origins of replication |
| FR2803913B1 (fr) | 2000-01-13 | 2002-08-16 | Pasteur Sanofi Diagnostics | Procede d'immobilisation de reactif(s) affin(s) sur phase solide hydrophobe |
| US7611869B2 (en) | 2000-02-07 | 2009-11-03 | Illumina, Inc. | Multiplexed methylation detection methods |
| US8076063B2 (en) | 2000-02-07 | 2011-12-13 | Illumina, Inc. | Multiplexed methylation detection methods |
| US7955794B2 (en) | 2000-09-21 | 2011-06-07 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| US7582420B2 (en) | 2001-07-12 | 2009-09-01 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| DK1259643T3 (da) * | 2000-02-07 | 2009-02-23 | Illumina Inc | Fremgangsmåde til detektion af nukleinsyre ved anvendelse af universel priming |
| EP1164201A1 (en) * | 2000-06-14 | 2001-12-19 | Facultés Universitaires Notre-Dame de la Paix | Reverse detection for identification and/or quantification of nucleotide target sequences on biochips |
| GB0016836D0 (en) | 2000-07-07 | 2000-08-30 | Lee Helen | Improved dipstick assays (1) |
| US6682889B1 (en) | 2000-11-08 | 2004-01-27 | Becton, Dickinson And Company | Amplification and detection of organisms of the Chlamydiaceae family |
| JP2002176985A (ja) * | 2000-12-14 | 2002-06-25 | Hitachi Software Eng Co Ltd | Ｐｃｒ増幅された塩基配列の検出方法及び検出キット |
| US20030104354A1 (en) * | 2001-11-30 | 2003-06-05 | Reliance Life Sciences Private Limited | Method and device for the rapid clinical diagnosis of human cytomegalovirus (hCMV) infection in biological samples |
| CA2467814A1 (en) * | 2001-12-03 | 2003-06-12 | Illumina, Inc. | Multiplexed methylation detection methods |
| KR100532664B1 (ko) * | 2002-09-09 | 2005-12-02 | 주식회사 바이오메드랩 | 클라미디아 트라코마티스 탐지용 프로브, 이를 포함하는 클라미디아 트라코마티스 탐지용 키트, 및 이를 이용한 클라미디아 트라코마티스의 탐지방법 |
| US7807802B2 (en) | 2002-11-12 | 2010-10-05 | Abbott Lab | Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae |
| JP2004261017A (ja) | 2003-02-27 | 2004-09-24 | Arkray Inc | クラミジア・トラコマティスの検出方法およびそのためのキット |
| MXPA05010429A (es) | 2003-03-31 | 2005-11-04 | Hoffmann La Roche | Composiciones y metodos para detectar ciertos flavivirus que incluyen miembros del serogrupo del virus de la encefalitis japonesa. |
| US7820030B2 (en) * | 2003-04-16 | 2010-10-26 | Handylab, Inc. | System and method for electrochemical detection of biological compounds |
| US7939251B2 (en) | 2004-05-06 | 2011-05-10 | Roche Molecular Systems, Inc. | SENP1 as a marker for cancer |
| US7338763B2 (en) | 2004-06-02 | 2008-03-04 | Eppendorf Array Technologies S.A. | Method and kit for the detection and/or quantification of homologous nucleotide sequences on arrays |
| US20060134650A1 (en) * | 2004-12-21 | 2006-06-22 | Illumina, Inc. | Methylation-sensitive restriction enzyme endonuclease method of whole genome methylation analysis |
| JP2009531464A (ja) | 2006-03-29 | 2009-09-03 | メリアル リミテッド | 連鎖球菌に対するワクチン |
| JP2010537637A (ja) | 2007-08-27 | 2010-12-09 | アプライド バイオシステムズ インコーポレイテッド | Ｐｃｒのための方法および組成物 |
| WO2009099037A1 (ja) | 2008-02-08 | 2009-08-13 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | クラミドフィラ・キャビエ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたクラミドフィラ・キャビエの検出方法 |
| US8906621B2 (en) * | 2009-01-06 | 2014-12-09 | Qimin You | Cross priming amplification of target nucleic acids |
| CN102918155B (zh) | 2010-03-23 | 2015-12-16 | 和光纯药工业株式会社 | 沙眼衣原体检测用引物和探针、以及使用该引物和探针的沙眼衣原体的检测方法 |
| AT512416B1 (de) | 2012-02-13 | 2013-10-15 | Greiner Bio One Gmbh | Anordnung und verfahren zum nachweis von mikroorganismen in einem kulturgefäss |
| EA028686B1 (ru) * | 2014-11-14 | 2017-12-29 | Общество с ограниченной ответственностью "ИнтерЛабСервис" | Набор реагентов для выявления днк chlamydia trachomatis и его применение |
| AU2017290753B2 (en) * | 2016-06-30 | 2021-12-09 | Visby Medical, Inc. | Devices and methods for nucleic acid extraction |
| US10323272B1 (en) * | 2018-01-31 | 2019-06-18 | Enzo Biochem, Inc. | Nucleic acid probes for in situ hybridization |
Family Cites Families (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4154795A (en) * | 1976-07-23 | 1979-05-15 | Dynatech Holdings Limited | Microtest plates |
| US4228237A (en) * | 1978-09-21 | 1980-10-14 | Calbiochem-Behring Corp. | Methods for the detection and determination of ligands |
| US4358535A (en) * | 1980-12-08 | 1982-11-09 | Board Of Regents Of The University Of Washington | Specific DNA probes in diagnostic microbiology |
| FI63596C (fi) * | 1981-10-16 | 1983-07-11 | Orion Yhtymae Oy | Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser |
| US4725388A (en) * | 1982-10-12 | 1988-02-16 | Dynatech Laboratories, Inc. | Non-fluorescent vessels for holding test samples in fluorescent assays |
| GB8311905D0 (en) * | 1983-04-29 | 1983-06-02 | Cox R A | Isolation and detection of nucleotide sequence |
| FI71768C (fi) * | 1984-02-17 | 1987-02-09 | Orion Yhtymae Oy | Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning. |
| GB8507706D0 (en) * | 1985-03-25 | 1985-05-01 | Genetics Int Inc | Magnetic nucleic acid sequences |
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4751177A (en) * | 1985-06-13 | 1988-06-14 | Amgen | Methods and kits for performing nucleic acid hybridization assays |
| US4797355A (en) * | 1985-06-13 | 1989-01-10 | Amgen Inc. | Methods for attaching polynucleotides to supports |
| US4822731A (en) * | 1986-01-09 | 1989-04-18 | Cetus Corporation | Process for labeling single-stranded nucleic acids and hybridizaiton probes |
| FI76119C (fi) * | 1986-02-27 | 1988-09-09 | Orion Yhtymae Oy | Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet. |
| CA1284931C (en) * | 1986-03-13 | 1991-06-18 | Henry A. Erlich | Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids |
| CA1301606C (en) * | 1986-05-02 | 1992-05-26 | David H. Gillespie | Chaotropic method for evaluating nucleic acids in a biological sample |
| WO1988003957A1 (en) * | 1986-11-24 | 1988-06-02 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms |
| FR2607518B1 (fr) * | 1986-12-01 | 1989-10-20 | Transgene Sa | Vecteur viral et adn recombinant codant pour la proteine p25 du virus agent causal du s.i.d.a., culture cellulaire infectee, proteine obtenue, vaccin et anticorps obtenus |
| AU622104B2 (en) * | 1987-03-11 | 1992-04-02 | Sangtec Molecular Diagnostics Ab | Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore |
| JPH07107537B2 (ja) * | 1987-08-03 | 1995-11-15 | イーストマン コダック カンパニー | アビジン−及びビオチン−固定試薬，分析要素並びにその使用法 |
| CA1339351C (en) * | 1987-10-15 | 1997-08-26 | Michael S. Urdea | Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same |
| IT1224253B (it) * | 1988-04-08 | 1990-09-26 | Sclavo Spa | Oligonucleotidi sintetici utili per la determinazione di chlamydia trachomatis in un campione biologico |
| ATE173508T1 (de) * | 1988-05-20 | 1998-12-15 | Hoffmann La Roche | Befestigung von sequenzspezifischen proben |
| KR920700360A (ko) * | 1989-03-22 | 1992-02-19 | 하리크 프리드리히 | 미끄럼 베어링 |
| US5232829A (en) * | 1989-09-29 | 1993-08-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes |
| CA2031659A1 (en) * | 1990-01-26 | 1991-07-27 | John B. Findlay | Water-insoluble reagent, nucleic acid probe, test kit and diagnostic and purification methods |
-
1989
- 1989-09-29 US US07/414,542 patent/US5232829A/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-09-26 NZ NZ235463A patent/NZ235463A/en unknown
- 1990-09-26 IL IL9580090A patent/IL95800A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-09-26 CA CA002026280A patent/CA2026280C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-26 ZA ZA907706A patent/ZA907706B/xx unknown
- 1990-09-26 NZ NZ247522A patent/NZ247522A/en unknown
- 1990-09-27 AU AU63290/90A patent/AU6329090A/en not_active Abandoned
- 1990-09-27 DK DK90118620T patent/DK0420260T3/da active
- 1990-09-27 AT AT98111076T patent/ATE345398T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-27 DE DE69033387T patent/DE69033387T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-27 EP EP98111076A patent/EP0875583B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-27 ES ES90118620T patent/ES2140372T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-27 AT AT90118620T patent/ATE187499T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-27 DE DE69034232T patent/DE69034232T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-27 DK DK98111076T patent/DK0875583T3/da active
- 1990-09-27 ES ES98111076T patent/ES2275292T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-27 EP EP90118620A patent/EP0420260B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-28 NO NO904240A patent/NO302204B1/no not_active IP Right Cessation
- 1990-09-28 BR BR909004881A patent/BR9004881A/pt not_active Application Discontinuation
- 1990-09-29 JP JP2262934A patent/JP2719225B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-09-02 AU AU72804/94A patent/AU685144B2/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0875583A2 (en) | 1998-11-04 |
| DE69033387T2 (de) | 2000-03-30 |
| IL95800A (en) | 1994-10-07 |
| ES2275292T3 (es) | 2007-06-01 |
| DK0420260T3 (da) | 2000-03-27 |
| JP2719225B2 (ja) | 1998-02-25 |
| ATE345398T1 (de) | 2006-12-15 |
| CA2026280C (en) | 2003-04-15 |
| DE69034232D1 (de) | 2006-12-28 |
| AU7280494A (en) | 1994-11-24 |
| ATE187499T1 (de) | 1999-12-15 |
| BR9004881A (pt) | 1991-09-10 |
| DE69033387D1 (de) | 2000-01-13 |
| US5232829A (en) | 1993-08-03 |
| EP0420260A2 (en) | 1991-04-03 |
| EP0420260B1 (en) | 1999-12-08 |
| EP0875583B1 (en) | 2006-11-15 |
| NZ235463A (en) | 1994-03-25 |
| CA2026280A1 (en) | 1991-03-30 |
| AU6329090A (en) | 1991-04-11 |
| EP0420260A3 (en) | 1991-09-18 |
| AU685144B2 (en) | 1998-01-15 |
| DK0875583T3 (da) | 2007-02-26 |
| IL95800A0 (en) | 1991-06-30 |
| EP0875583A3 (en) | 1999-02-17 |
| NZ247522A (en) | 1994-03-25 |
| ES2140372T3 (es) | 2000-03-01 |
| NO904240L (no) | 1991-04-02 |
| DE69034232T2 (de) | 2007-03-01 |
| JPH03206898A (ja) | 1991-09-10 |
| ZA907706B (en) | 1991-06-26 |
| NO904240D0 (no) | 1990-09-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO302204B1 (no) | Diagnostisk sett for påvisning av nukleinsyresekvenser fra Chlamydia trachomatis | |
| US5858652A (en) | Detection and amplification of target nucleic acid sequences | |
| EP0457824B2 (en) | Detection of a nucleic acid sequence or a change therein | |
| EP0521111B1 (en) | Polynucleotide capture assay employing in vitro amplification | |
| US5858732A (en) | Wide dynamic range nucleic acid detection using an aggregate primer series | |
| EP0359789B1 (en) | Amplification and detection of nucleic acid sequences | |
| US6100099A (en) | Test strip having a diagonal array of capture spots | |
| US7951541B2 (en) | Assay kit for use in method of detecting a target nucleic acid | |
| US5547860A (en) | Sulphocoumarin-containing nucleotides and their use in processes for detecting nucleic acids | |
| EP0436547B1 (en) | Process for rapid nucleic acid detection | |
| US10358675B2 (en) | Oligonucleotides for controlling amplification of nucleic acids | |
| US20020182615A1 (en) | All in one nucleic acid amplification assay | |
| Dahlen et al. | Detection of human immunodeficiency virus type 1 by using the polymerase chain reaction and a time-resolved fluorescence-based hybridization assay | |
| Gudibande et al. | Rapid, non-separation electrochemiluminescent DNA hybridization assays for PCR products, using 3′-labelled oligonucleotide probes | |
| US6096501A (en) | Assay for Chlamydia trachomatis by amplification and detection of Chlamydia trachomatis crytpic plasmid | |
| EP1426448A1 (en) | Method for lowering the effects of sequence variations in a diagnostic hybridization assay, probe for use in the assay and assay | |
| JPH0714359B2 (ja) | 修飾核酸の製造方法 | |
| US5814490A (en) | Amplification and detection of chlamydia trachomatis nucleic acids | |
| WO1990011374A1 (en) | Polymerase chain reaction products incorporating reporter moieties and affinity seperation | |
| US6379892B1 (en) | Methods, kits and compositions of matter useful for determining Chlamydia pneumoniae | |
| AU723602B2 (en) | Biotin-labelled DNA by polymerase chain reaction and detection thereof | |
| IE903415A1 (en) | Nucleic acid detection method using unequal primer¹concentrations in polymerase chain reaction | |
| JPH1023894A (ja) | 試料中の複数種の核酸を検出する方法 | |
| CA2012984A1 (en) | Process for rapid nucleic acid detection by incorporating a reporter moiety into amplified target nucleic acid followed by affinity capture |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |