HU218266B - DNS gyorsteszt kinolonrezisztens Staphylococcus aureus kórokozók kimutatására klinikai mintákban - Google Patents

DNS gyorsteszt kinolonrezisztens Staphylococcus aureus kórokozók kimutatására klinikai mintákban Download PDF

Info

Publication number
HU218266B
HU218266B HU9501875A HU9501875A HU218266B HU 218266 B HU218266 B HU 218266B HU 9501875 A HU9501875 A HU 9501875A HU 9501875 A HU9501875 A HU 9501875A HU 218266 B HU218266 B HU 218266B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
seq
dna
oligonucleotide
quinolone
amplification
Prior art date
Application number
HU9501875A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9501875D0 (en
HUT71861A (en
Inventor
Klaus-Dieter Bremm
Rainer Endermann
Wolfgang Springer
Original Assignee
Bayer Ag.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Ag. filed Critical Bayer Ag.
Publication of HU9501875D0 publication Critical patent/HU9501875D0/hu
Publication of HUT71861A publication Critical patent/HUT71861A/hu
Publication of HU218266B publication Critical patent/HU218266B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

A találmány kinolonrezisztens Staphylococcus aureus klinikai mintákbantörténő gyors kimutatására szolgáló eljárásra, valamint az eljárásbanalkalmazható primer oligonukleotidokra és DNS-szondákra vonatkozik. ŕ

Description

A találmány tárgya primer oligonukleotidok, DNS-szondák és teszteljárás kinolonrezisztens Staphylococcus öwrews'-kórokozók gyors kimutatására klinikai mintákban.
A fluor-kinolonok súlyos bakteriális fertőzések kezelésében alkalmazható, hatékony antibakteriális szerek. Fluor-kinolonokkal, például ciprofloxacinnal meticillinrezisztens Staphylococcus-ok által okozott fertőzéseket is kezelnek.
Hasonlóképpen, mint a korábbi kinolonok, például a nalidixinsav esetén, mind gyakrabban találnak olyan Staphylococcus aureus-törzseket, amelyek rezisztensek a fluor-kinolonokkal szemben.
Időközben számos klinikán problémák merültek fel olyan meticillinrezisztens Staphylococcus-okteá kapcsolatban, amelyek fluor-kinolonokkal szemben is rezisztenssé váltak. A fluor-kinolon-rezisztencia fokozódása azért különös jelentőségű, mert a meticillinrezisztens és kinolonrezisztens Staphylococcus-fertőzések ellen csak kevés antibakteriális szer hatékony.
Ezért különösen fontos, hogy minél előbb hatékony antibiotikumkezelést vezessünk be. A kinolonrezisztens Staphylococcus-ók klasszikus diagnosztizálása idő- és munkaigényes, melynek során a törzseket lemezen tenyésztik, majd fiziológiai azonosítását végzik olyan tesztrendszerekkel, mint például az „api staph” (BioMérieux), továbbá az antibiotikumrezisztenciát sorozathígítással (MHK-értékek) vagy agardiffuziós tesztekkel (inhibíciós udvar) határozzák meg. Alternatív módszerként vetődik fel annak a lehetősége, hogy a kinolinrezisztens Staphylococcus aureus (QRSA) giráz enzime alapján egy géntesztet dolgozzunk ki, amely in vitro tenyésztés nélkül, közvetlenül a mintán teszi lehetővé a gyors diagnosztizálást.
A ciprofloxacin egy 4-kinolon-antibiotikum, amely a DNS-giráz enzim A2B2-tetramer szerkezetét gátolja. A DNS-giráz a DNS felcsavarodását segíti elő a kettős szálú DNS-ben létrejövő átmeneti hidak kialakulásának katalizálásával.
Kimutatták, hogy a Staphylococcus aureus kinolonrezisztenciáját molekuláris szinten a giráz A alegység mutációja okozza [Sreedharan, S., M. Oram, B. Jensen, L. R. Peterson, L. M. Fisher, J. Bacteriol., 7260-7262. (1990)]. További okként jelölték meg a nor A génmutációkat, amelyek egy membránnal kapcsolatos transzportfolyamatot érintenek, és így az antibiotikum felvételt, illetve belső akkumulációját gátolják [Yoshida, Η , M. Bogaki, S. Nakamura, K. Ubukata, M. Konno, J. Bacteriol. 172., 6942 -6949. (1990)]. Ezenkívül egy további génlókuszon megjelenő olyan mutációt is leírtak, amely egy még nem ismert mechanizmus alapjái okoz kinolonrezisztenciát [Trucksis, M., J. S. Wolfson, D. C. Hooper, J. Bacteriol. 173., 5854-5960. (1991)].
Mivel a Staphylococcus-ok giráz A génjében levő 84 és -85 kodonoknak az említett pontmutációja ciprofloxacinrezisztenciával kapcsolatos, az ezen pontmutáciok környezetében levő 2394-2658 nukleotidterületet pontosabban megvizsgáltuk.
kinolonrezisztens, meticillinre és ciprofloxacinra vonatkozó, különböző MIC-értékekkel (minimális gátlókoncentráció) rendelkező Staphylococcus aureus-izolátumon végzett kísérleteinkben a giráz A-ban négy mutációtípust (lásd az 1. táblázatot) mutattunk ki PCRszekvenálással, mágneses gyöngyök felhasználásával, Hultman T. és munkatársai módosított módszerével [Hultman T., Stahl S., Homes E., Uhlen M., Nucleic Acids Rés., 17., 4937-4946. (1989)]. Egy további, a 2540-helyzetben végbement pontmutáción alapuló mutációtípus nem eredményez a proteinben aminosavcserét és nincs hatással a giráz rezisztenciatulajdonsága ira. Három mutáció alapján egy pontmutáció-speciffius amplifikációs tesztet dolgoztunk ki a C/T, T/G és G/A mutációk kimutatására.
Ezzel a teszttel minden, a ciprorezisztencia szempontjából releváns girázmutáció kimutatható Staphylococcus aureus esetén.
1. táblázat
Ciprorezisztencia-mutációk a giráz A-ban (A Staphylococcus aureus-giráz szekvenciájának szekvenált 2394-2658 területe) A Staphylococcus aureus-giráz szekvenciájának 2526-2547 területe
GGTGACTCATCTATTTATGAAG
GGTGACTCATCTATCTATGAAG
GGTGACTTATCTATTTATGAAG
STAPH. AUREUS LITERATUR Cipro-MIC (pg/ml)
STAPH. AUREUS No. 25532 0,5
STAPH. AUREUS No. 25035 <0,25
STAPH. AUREUS No. 25085 0,25
STAPH. AUREUS No. 23 2,0
STAPH. AUREUS No. 37 2,0
STAPH. AUREUS No. 3 1,0
STAPH. AUREUS No. 16 0,5
STAPH. AUREUS No. 25470 0,5
STAPH. AUR EUS No. 25471 0,5
STAPH. AUREUS No. 133 <0,25
STAPH. AUREUS No. 25768 >128
STAPH. AUREUS No. 25911 >128
STAPH. AUREUS No. 25922 >128
STAPH. AUREUS No. 25936 >128
STAPH. AUREUS No. 25949 >128
HU 218 266 Β
GGTGACTTATCTATCTATGAAG
1. táblázat (folytatás)
STAPH. AUREUS No. 25920 Cipro-MIC (pg/ml) 128
STAPH. AUREUS No. 30 >64
STAPH. AUREUS No. 25893 64
STAPH. AUREUS No. 25894 64
STAPH. AUREUS No. 25909 64
STAPH. AUREUS No. 25913 64
STAPH. AUREUS No. 25921 64
STAPH. AUREUS No. 25948 64
STAPH. AUREUS No. 44 32
STAPH. AUREUS No. 64 32
STAPH. AUREUS No. 25923 32
STAPH. AUREUS No. 25912 16
STAPH. AUREUS No. 25919 16
STAPH. AUREUS No. 25924 16
STAPH. AUREUS No. 25926 16
STAPH. AUREUS No. 25928 16
STAPH. AUREUS No. 25934 16
STAPH. AUREUS No. 25906 8
STAPH. AUREUS No. 25910 8
STAPH. AUREUS No. 25929 64
STAPH. AUREUS No. 25703 32
STAPH. AUREUS No. 24 16
STAPH. AUREUS No. 25917 16
STAPH. AUREUS No. 25925 16
STAPH. AUREUS No. 25930 16
STAPH. AUREUS No. 25932 16
STAPH. AUREUS No. 25916 8
STAPH. AUREUS No. 25927 8
STAPH. AUREUS No. 25915 64
STAPH. AUREUS No. 25918 16
STAPH. AUREUS No. 25914 32
STAPH. AUREUS No. 25908 16
GGTGACTCATCTATTTATAAAG
GGTGATTCATCTATTTATAAAG
GGTGACGCATCTATTTATGAAG
TCA > TTA ATT > ATC GAA > AAA
SZERIN > LEUCIN IZOLEUCIN > IZOLEUCIN GLUTAMIN > LISIN
TCA > GCA GAC > C AT
SZERIN > ALANIN ASZPARAGIN > ASZPARAGIN
Ezzel a génteszttel 150 különböző, kinolonrezisztens, 4 és 128 pg/ml közötti MIC-értékű (lásd 2. táblázatot is) Staphylococcus-t (QRSA) (beleértve az 1. táblázat törzseit) vizsgáltunk. A törzsek 95%-a C/T mutációt mutat a 2533-helyzetben. 4 törzs (2,6%) T/G mutációt mutat a 2532-helyzetben és 3 törzs (2%) G/A mutációt a 2544-helyzetben. 5 törzs (3,3%) más, nem a girázban levő mutációt mutat, ahogyan ezt az ezen törzsek későbbi PCR-szekvenálásával meghatároztuk.
Vagyis a teszt detekciós érzékenysége a 3 kimutatandó mutáció alapján 97,7%.
2. táblázat QRSA génteszt
Staphylococcus aureus Mcthicillin- MIC Cipro-MIC Gcntcszt QRSA
811 >32 32 C/T
794 >32 16 C/T
Staphylococcus aureus Mcthicillin- MIC Cipro-MIC Gcntcszt QRSA
822 >32 16 -
818 >32 >64 C/T
807 32 64 C/T
830 16 >64 C/T
801 >32 32 C/T
804 >32 >64 C/T
800 >32 16 G/A
793 16 >64 C/T
788 >32 64 C/T
792 >32 >64 C/T
789 >32 64 C/T
798 32 >64 C/T
843 >32 >64 C/T
HU 218 266 Β
2. táblázat (folytatás)
Staphylococcus aureus Mcthicillin- M1C Cipro-MIC Géntcszt QRSA
838 4 16 T/G
784 >32 32 -
813 8 >64 C/T
791 >32 32 C/T
844 16 >64 C/T
821 32 16 -
845 >32 64 C/T
816 >32 64 C/T
815 >32 64 C/T
833 >32 64 -
814 >32 64 C/T
839 32 64 C/T
834 >32 64 C/T
829 >32 64 C/T
828 >32 >64 C/T
827 >32 32 C/T
826 >32 64 C/T
825 >32 64 C/T
837 >64 >32 C/T
836 >32 >64 C/T
790 >32 64 -
787 >32 >64 C/T
846 32 64 C/T
842 >32 64 C/T
841 >32 64 C/T
785 >32 >64 C/T
835 >32 >64 C/T
808 >32 >64 C/T
803 >32 >64 C/T
797 >32 >64 C/T
795 32 64 C/T
802 >32 >64 C/T
817 >32 64 C/T
812 >32 >64 C/T
810 >32 >64 C/T
824 >32 >64 C/T
823 32 64 C/T
819 >32 >64 C/T
Kinolonszcn- zitív törzsek Mcthicillin- MIC Cipro-MIC Gcntcszt QRSA
25 532 16 0,25 -
25 035 4 0,25 -
Kinolonszcn- zitív törzsek Mcthicillin- MIC Cipro-MIC Gcntcszt QRSA
25 085 64 0,25 -
133 0,25 0,25 -
25 470 32 0,5 -
25 471 0,5 0,5 -
16 32 0,5 -
A találmány kinolonrezisztens Staphylococcus-ok klinikai mintákban közvetlenül történő, gyors kimutatására szolgáló specifikus primerekre, illetve oligo- és polinukleotidszondákra és ezek alkalmazására vonatkozik.
1. A primereket a giráz A gén génszekvenciájából kémiai szintézissel állítottuk elő.
Az előnyös primereket a következő területekről választottuk:
a) specifikus a C/T mutációtípusra (primer 1,1. szekvercia),
b) specifikus a T/G mutációtípusra (primer 2, 2. szekve rcia),
c) specifikus a G/A mutációtípusra (primer 3, 3. szekvercia),
d) specifikus a kinolonrezisztens és szenzitív girázra mint az ellenkező szál primere (primer 4, 4. szekvencia ).
2. Az oligonukleotidszondát a 2553-2588 területről kémiai szintézissel állítottuk elő (5. szekvencia). Ezt a területet minden primerről amplifikáltuk. Ez a terület specifikus a Staphylococcus aureus-ra. Az alternatív nukleotidszondát (6. szekvencia) a 2515-3048 nukleotidterület PCR-amplifikációjával állítottuk elő.
3. A kinolonrezisztens törzsek genomi DNS-ét Staphylococcusok-ra adaptált nukleinsaveljárással izoláltuk.
4. A giráz A gén részeinek amplifikálását a specifikus primer 1-3-mal, amelyek a kódoló területről származnak, és 3’-végükön a rezisztenciamutációt hordozzák (C helyett T, T helyett G és G helyett A), valamint egy specifikus 4. primerrel végeztük, amely a giráz A gén nemkódoló száláról származik, amelyet az amplifikálásoknál ellentétes szálprimerként alkalmaztunk.
5. Az amplifikálást ismert amplifikálási módszerekké , előnyösen a PCR-DNS-amplifikálási módszerrel (E°-200 362) végeztük.
6. A specifikus amplifikálási termék kimutatását a következőképpen végeztük:
a) az amplifikálási termék közvetlen elektroforézise agarózgélen és interkaláló ágensekkel, például etidium-bromiddal végzett festés;
b) az amplifikálás során fluoreszcens nukleotidokkal vagy fluoreszcens jelzőanyagokkal jelzett primerekkel jelzett amplifikálási termék fluoreszcenciás meghatározása. Az amplifikálási terméket az ezenfelül beépített biotin (primer vagy nukleotid) segítségével választjuk el;
c) az amplifikálás során megjelölt amplifikálási termék hibridizálása a fent említett biotinilezett
HU 218 266 Β oligonukleotidszondához. A hibridizációs komplexet sztreptavidinnel bevont, mágneses részecskékkel választjuk el;
d) a képződött hibridizációs komplexnek mint a kinolonrezisztens Staphylococcus-ok jelenléte vagy mennyisége mértékének meghatározását alkalikus foszfatázzal kapcsolt antidigoxigeninantitesttel végzett kemilumineszcencia-teszttel végezzük.
A génszonda-diagnosztika - különösen az amplifikációs technikával kapcsolatosan - gyors, specifikus és nagy érzékenységű módszer, ami DNS/RNS-szinten teszi lehetővé a kórokozók korai felismerését. A módszer közvetlenül, in vitro tenyésztés nélkül a kísérleti anyagon hajtható végre. DNS/RNS-hibridizálási módszeren alapszik, azaz komplementer, egyszálú nukleinsavak specifikus in vitro kötődésén Watson-Crick-féle bázispárok képződése közben. A képződött DNS/DNS, illetve DNS/RNS kettős szálakat hibrideknek nevezzük. Egy kórokozó specifikus DNS-ének vagy RNS-ének hibridizálási reakcióval végzett detektálásához komplementer szekvenciaspecifikus génszondákat alkalmazunk. Ezek a génszondák vagy rövid, 10-50 nukleotid hosszúságú, kémiai úton szintetizált oligonukleotidszondák, vagy rekombináns úton előállított, 0,5-10 kb hosszúságú DNS/RNS fragmensek.
A génszondákat fotokémiai úton [N. Dattagupta, P. Μ. M. Rae, E. D. Huguenel, E. Carlson, A. Lyga, J. S. Shapiro, J. P. Albarella, Analytical Biochem., 177., 85. (1989)], vagy enzimesen nick-transzlációval [Rigby P. W. J. et al., J. Mól. Bioi. 113., 237. (1977)], vagy random primer technikával [Feinberg és Vogelstein, Anal. Biochem. 132., 6. (1983)] radioaktív vagy nem radioaktív jelzéssel látjuk el. E célra alkalmas a 32P-nukleotidtrifoszfátokkal; a digoxigenin-dUTP-vel, biotin-dUTPvel, fluoreszcein-dUTP-vel végzett nem radioaktív; vagy enzimekkel, például alkalikus foszfatázzal vagy torma-peroxidázzal végzett jelölés.
A kórokozó kimutatandó nukleinsava és a kórokozóra specifikus génszonda közötti specifikus hibridizációhoz a nukleinsavakat először denaturálással (hővel vagy alkalikus kezeléssel) különálló szálakra választjuk szét, majd szigorú körülmények között - melyeket a hőmérséklet, a puffer ionerőssége és a szerves oldószer határoz meg - egészen specifikusan hibridizáltatjuk egymáshoz. Megfelelő hibridizációs feltételek között a génszonda csak a komplementer szekvenciával rendelkező, kimutatandó DNS-hez vagy RNS-hez kötődik. Ez a hibridizációs reakció különböző tesztelrendezésekben, például egy hordozóhoz, például nitrocellulózhoz kapcsolt cél-DNS-hez vagy génszondához történő szilárd fázisú hibridizálással vagy folyadékfázisban végzett hibridizálással valósítható meg. A kiértékelés a génszonda egy fent említett riportermolekulával történő megjelölése alapján az itt ismertetett reverz fázisú hibridizációs rendszerben a cél-DNS-en, amelyet az amplifikálás során digoxigenin-dUTP-vel jelölünk és a génszondán keresztül történik, amelyet a mágneses részecskékhez való kötődéshez biotinnal jelölünk. A célDNS-ből és jelölt génszondából álló hibridizációs komplexet a nem kötött génszonda eltávolítása után az alkalmazott riportermolekula alapján kvantitatív módon meghatározzuk. Ez a kiértékelés fluoreszcenciás vagy radioaktív jelölés esetén történhet közvetlenül, illerve közvetetten enzimtesztekkel és olyan antitestkenjugátumokkal immunológiai úton, amelyek enzimeket, például alkalikus foszfatázt tartalmaznak, és színre.ikciót vagy kemilumineszcenciás reakciót tesznek lehetővé.
Ezzel a génszonda-diagnosztikummal a teszt érzékenysége 105—106 csíraszámnagyságrendben van, az egyes gének detektálása alapján. A teszt érzékenysége DNS- vagy RNS-amplifikációs módszerekkel - például PCR- (EP 200 362), LCR- (EP 320 308), NASBA-(EP 329 822), Qp- (PCT 87/06270), vagy HAS-módszerrel (EP 427 074) - történő kombinálással fokozható. Ezekkel a módszerekkel a kimutatandó DNS-nek akár 109-szeres sokszorozása érhető el. így az amplifikálás és a hibridizálás kombinálása lehetővé teszi már egyes DNS-molekulák detektálását is.
Mivel fertőzések esetén a vérben ÍO'-IO3 csíra/ml csraszám fordul elő, ezzel a módszerrel a kinolonrezisztens fertőzések korai felismerése válik lehetővé.
Ezenkívül ezen primerek, oligo- és polinukleotidszondák alkalmazását és a ciprorezisztens Staphylococcus-ok klinikai mintákban történő kimutatására szolgáló teszteljárást mutatjuk be. Az eljárás egy további előnye, hogy a mintában a kinolonrezisztens fertőző csírák mennyiségének szemikvantitatív meghatározását tesz lehetővé.
A primerek kiválasztása és szintézise
Az alkalmas specifikus primerek kiválasztásához az
1. táblázatban felsorolt kinolonrezisztens Staphyloeozeus awrews-izolátumok giráz A génjének nukleotidszekvenciáját alkalmaztuk. Ezen mutációs szekvenciák és a vad típusú nukleotidszekvenciák [Ε. E. C. Margerrison, R. Hopewell, L. M. Fisher, J. Bacteriol. 1596-1603. (1992)] alapján választottuk ki azon primereket, amelyek 3’-végükön pontmutációs bázist hordoznak. A C/T mutációs típushoz az 1. szekvencia szerinti pr mert szintetizáltuk. A T/G mutációs típushoz a
2. szekvencia szerinti prímért szintetizáltuk. A G/A mutál iós típushoz a 3. szekvencia szerinti prímért szintetizá tűk. A mutációt hordozó szekvencia amplifikálásához ellenkező szálprimerként a 4. szekvencia szerinti pr mer 4-et szintetizáltuk, amely az összes primer szí;ttre (1+4,2+4,3+4) nézve közös.
A kiválasztott primer kémiai szintézisét S. L. Beaucage és M. Caruthers foszfor-amidit-módszerével végeztük [Tetrahedron Letters, 22., 1859. (1981)]. QRSA genomi DNS-amplifikálása
A giráz A gén részeinek amplifikálásához a fent említett primereket mindig primer szett 1 (primer 1+4), primer szett 2 (primer 2+4) és primer szett 3 (primer 3+4) formájában alkalmaztuk a QRSA girázok három mutációs típusának specifikus amplifikáláshoz. Ezek a kinolonszenzitív girázgének genomi DNS-ével nem adna < az agarózgélen látható amplifikálási terméket. A genomi DNS a három primer szettel a megfelelő mutációt hordozó girázgén esetén mindig erős amplifikálási csí5
HU 218 266 3 kot mutat, és így nem csak a kinolonrezisztenciát, hanem egyúttal a girázban jelen levő pontmutációt is kimutatja.
PCR-amplifikálás esetén a négy dNTP (dezoxiadenozin-trifoszfát, dezoxi-guanozin-trifoszfát, dezoxicitidin-trifoszfát és timidin-trifoszfát) mellett például digoxigenin-dUTP is beépíthető az amplifikálási termékbe. Ezáltal az amplifikálási termék egy anti-digoxigenin-antitesttel, amely például alkalikus foszfatázzal lehet kapcsolva, kemilumineszcencia-teszt segítségével, szubsztrátként AMPPD-t alkalmazva, vagy színreakció útján bróm-klór-indolil-foszfáttal és nitro-kéktetrazóliummal értékelhető ki.
Lehetőség van arra is, hogy fluoreszcenciás jelzéssel ellátott nukleozid-trifoszfátokat, például fluoreszceindUTP-t vagy kumarin-dUTP-t építsünk be az amplifikálási termékbe, és az amplifikálási terméket az etidium-bromidos festésnél sokkal nagyobb érzékenységgel azonosítsuk. Biotinilezett primerek alkalmazásánál tehát lehetőség van arra, hogy a fluoreszcenciásan jelzett, biotinilezett amplifikálási terméket sztreptavidinnel bevont, mágneses részecskékkel leválasszuk, és fluoreszcenciás fotométerrel mennyiségileg meghatározzuk.
Az oligonukleotidszonda kiválasztása és szintetizálása
A pimer szettek amplifikálási termékére specifikus oligonukleotidokat a 2553-2588 területről választottuk ki, amely mindhárom mutációspecifikus amplifikálási termékre közös. Egy 36-meres, az 5. szekvencián bemutatott szekvenciát szintetizáltunk, amely a három amplifikálási termékre specifikus.
A kémiai szintézist S. L. Beaucage és M. Caruthers foszfor-amidit-módszerével végeztük [lásd: Tetrahedron Letters, 22., 1859. (1981).
Az oligonukleotidszondák segítségével lehetővé válik, hogy a mutációspecifikus amplifikálási termékeket specifikusan hibridizáljuk. Az eljárás, amelynek során a mutációspecifikus primerekkel a giráz A gén részeit először amplifíkáljuk, majd az amplifikálási termékeket az oligonukloetidszondákkal specifikusan hibridizáljuk, a következő előnyökkel rendelkezik az egyszerű amplifikációs diagnosztikával szemben.
Az amplifikálási tennék gélben végzett, közvetlen kiértékelése során a teszt érzékenysége mintegy 1000 csíra/ml minta. Oligonukleotidszondával végzett hibridizálás és kemilumineszcenciás kiértékelés kombinálásával ezzel szemben már 10 csíra/ml minta kimutatható.
Egy alternatív polinukleotidszonda kiválasztása és szintetizálása
Az oligonukleotidszonda alternatívájaként a 2515-3048 nukleotidszekvenciából, amely az összes mutációspecifikus amplifikálási termékre közös, egy 534 bázis hosszúságú polinukleotidszondát választottunk ki. A polinukleotidszonda szintézisét PCR-amplifikálással a primer 1(1. szekvencia) és a primer 4 (4. szekvencia) segítségével végeztük. Az amplifikálás során egyúttal biotin-dUTP-t építettünk be az amplifikált génszondába a kemilumineszcencia-teszthez.
QRSA detektálása
A QRSA közvetlenül a giráz A gén részeinek amplifikálása után a találmány szerinti három primer szett segítségével tetszés szerinti analitikai eljárással meghatározható.
Egy lehetséges kiértékelési módszer az agarózgélen ele ktroforetikusan elválasztott amplifikálási termékek interkalációs ágensekkel, például etidium-bromiddal végzett festése.
Egy másik módszer fluoreszcenciás jelzéssel ellátott nukleozid-trifoszfátok beépítése az amplifikálási termékbe. Ezáltal a teszt érzékenysége jelentősen fokozha ó.
Egy további lehetőség abban áll, hogy az amplifikálás hoz a fluoreszcenciásan jelzett primereket vagy biotinilezett primerek és fluoreszcenciásan jelzett nukleotidok kombinációját alkalmazzuk úgy, hogy egy végállású biotinilezett, fluoreszcenciásan jelzett amplifikálási termék képződjék, amely sztreptavidinnel kapcsolt, mágneses részecskéken megköthető és elválasztható, és a fluoreszcencia szemikvantitatív módon meghatározható.
A legérzékenyebb módszer, amely egyúttal szemikvantitatív kiértékelést tesz lehetővé, a három mutációspecifikus primer szett amplifikálási termékének ismertetett hibridizálása az ismertetett oligonukleotidszondákkal. Ez a módszer ezenkívül lehetővé teszi a QRSA mennyiségi becslését a klinikai mintákban. Ha az amplifikálás során például digoxigenin-dUTP-t építünk be és biotinilezett oligonukleotidszondát alkalmazunk, a hibridizálási komplex sztreptavidinnel bevont, mágnesei részecskékkel elválasztható és alkalikus foszfatázzal kapcsolt anti-digoxigenin-antitestek alkalmazásává , AMPPD mint szubsztrát segítségével kemilumineszcenciásan szemikvantitatív módon kiértékelhető. Ha egyúttal sejtstandardként meghatározott sejtszámú mintákat amplifikálunk és kemilumineszcenciásan kiértél· elünk, a kemilumineszcencia-jelből a klinikai minta csíraszáma szemikvantitatív módon meghatározható.
A találmány szerinti megoldást az ábrákon és a példákkal közelebbről szemléltetjük.
Az ábrák ismertetése
1. ábra
Az amplifikációs teszt közvetlen kiértékelése. Három kinolonrezisztens 5. at/rei/s-kórokozó és egy kinolonszenzitív vad törzs 103 sejtnek megfelelő DNS-ét a poatmutáció-specifikus 1. primer szett (primer, 1. szekvencia és 4. szekvencia), 2. primer szett (primer, 2. szekvencia és 4. szekvencia) és 3. primer szett (primer,
3. szekvencia és 4. szekvencia) segítségével amplifikáituk, majd agarózgél-elektroforézissel analizáltuk. Az etidium-bromiddal megfestett agarózgélen csík akko · látható, ha a rezisztens törzs a pontmutációt a giráz A génben tartalmazza. A kinolonszenzitív, vad típusú
S. aureus (WT25035) a három primer szetttel nem ad amplifikációs csíkot, mert a vad típusú girázban nincs pontmutáció. A 25768 jelű S. aureus-törzs C/T mutációt, a 25908 jelű törzs T/G mutációt, míg a 25918 jelű törzs pedig G/A mutációt tartalmaz.
2A. és 2B. ábra
Három, kinolonrezisztens S. aureus-kórokozó, a 25 768 jelű (1), a 25908 jelű (2) és a 25918 jelű törzs (3), valamint egy kinolonszenzitív 5. aureus vad típusú
HU 218 266 8 törzs (25035) (4) körülbelül 1000 sejtnek (2A. ábra), illetve körülbelül 100 sejtnek (2B. ábra) megfelelő DNSét amplifikáltuk, és egyúttal az amplifikálási termékbe digoxigenin-dUTP-t építettünk be. Az amplifikálási termékeket egy biotinilezett oligonukleotidszondával (5. szekvencia) hibridizáltuk, és a hibridizációs komplexet sztreptavidinnel bevont, mágneses részecskékkel leválasztottuk. Az amplifikálási termék képződését a 6. példa szerinti módon a kemilumineszcencia-jel alapján mértük. Kemilumineszcencia-jel csak akkor képződik, ha a rezisztens törzs a pontmutációt a giráz A génben tartalmazza, és így a megfelelő 1., 2. vagy 3. primer párral amplifikálódott. A kinolonszenzitív 25035 jelű
S. aureus-törzs nem ad kemilumineszcencia-jelet a három primer szetttel, mert a vad típusú girázban nincs pontmutáció. A 25768 jelű 5. aureus-törzs egy C/T mutáció alapján, a 25908 jelű törzs egy T/G mutáció alapján, míg a 25918 jelű törzs egy G/A mutáció alapján rezisztens, amint ez a megfelelő primer szettekkel történt amplifikálásból látható.
1. példa
Starteroligonukleotidok (primerek) szintetizálása
A kiválasztott starteroligonukleotidok (primerek) kémiai szintézisét S. L. Beaucage és M. Caruthers foszfor-amidit-módszerével végeztük [Tetrahedron Letters, 22., 1859. (1981)]. A következő nukleotidszekvenciákat szintetizáltuk:
PCR-primer 1, a C/T mutációra specifikus: 1. szekvencia,
PCR-primer 2, a C/G mutációra specifikus: 2. szekvencia,
PCR-primer 3, a G/A mutációra specifikus: 3. szekvencia,
PCR-primer 4, az összes mutáció ellentétes szálának primerje: 4. szekvencia.
2. példa
A QRSA-hoz szolgáló oligonukleotidszonda kiválasztása és szintetizálása
Az oligonukleotidszondát a 2553-2588 nukleotidterületről választottuk ki, amely az összes mutációspecifikus amplifikálási termékben megtalálható, és a Staphylococcus aureus giráz A génjére specifikus.
A kiválasztott oligonukleotidszondák kémiai szintézisét S. L. Beaucage és M. Caruthers foszfor-amiditmódszerével végeztük [Tetrahedron Letters, 22., 1859. (1981)]. A következő nukleotidszekvenciát szintetizáltuk : GTACGTATGGCTCAAGATTTCAGTTATCGTTATCCG 36-meres oligonukleotid a 2553-2588 nukleotidterületről (5. szekvencia).
Az oligonukleotidszondát a 3’-végen Bollum módszerével jelzéssel láttuk el [The enzymes (Boyer ed.) 10. kötet, 145. oldal, Academic Press New York], A végcsoportot nem radioaktív módon biotin-dUTP-vei jelöltük [Chang, L. M. S., Bollum, T. J., J. Bioi. Chem. 246., 909. (1971)].
μΐ térfogatban 10 μΐ reakciópuffer (káliumkakodilát 1 mol/1; Tris/HCl 125 mmol/1; szarvasmarhaszérumalbumin 1,25 mg/ml, pH = 6,6; 25 °C), 1-2 pg oligonukleotid, 25 egység terminális transzferáz,
2,5 mmol/1 CoCl2 és 1 pl biotin-dUTP (1 mmol/1) segítségével 60 perc alatt 37 °C-on körülbelül 50%-os 3’végjelölést értünk el.
3. példa
A QRSA-hoz szolgáló polinukleotidszonda kiválasztása és szintetizálása
A polinukleotidszondát a 2515-3048 nukleotidterül étről választottuk, amely az összes mutációspecifikus amplifikálási termékben jelen van és a S. aureus giiáz A génjére specifikus.
A szintézist a 4. példa szerinti módon a primer 1(1. szekvencia) és a primer 4 (4. szekvencia) segítségével végzett PCR-amplifikálással végeztük. A 6. példa szerinti kemilumineszcencia-teszthez az amplifikálás során az amplifikált génszondába biotin-dUTP-t építettünk be.
4. példa
QRSA-specifikus DNS-amplifikálás PCR-technikával
A cél-DNS amplifikálását polimeráz láncreakcióval (PCR) végeztük (EP-200 362; 201 184).
A PCR-reakcióhoz a következő anyagokat mértük be: 100 pg genomi DNS kinolonrezisztens Staphyloco.’Cíz.s-okból, 0,17 pmol primer 1-4 (1-4. szekvenciák), 2,5 egység Taq-polimeráz (Cetus/Perkin-Elmer gyártmány), valamint 200-200 pmol/l dNTP-k összesen 100 pl PCR-pufferben (50 mmol/1 KC1, 10 mmol/1 Tr s/HCl, pH=8,3, 2 mmol/1 MgCl2 és 0,01% zselatin). Az amplifikálást egy PCR-processzorban (Cetus/Perkiri-Elmer gyártmány) végeztük. Összesen 3 PCR-öszszt/állítást alkalmaztunk: a három girázmutációra specifikus primer szett 1-et (primer 1+4), primer szett 2-t (piimer 2+4) és primer szett 3-at (primer 3+4).
A 6. példa szerinti kemilumineszcencia-teszthez a PCR-termék jelölésére még 0,15 pmol digoxigenindL TP-t is adagoltunk.
A DNS kezdeti összeolvasztásához az elegyeket 2,5 percig 95 °C-on tartottuk, majd a DNS-t ciklusonként 95 °C-on denaturáltuk, 1 percig 58 °C-on primer összeolvasztást és 1 percig 72 °C-on primer meghosszabbítást végeztünk. 25 ciklus után az elegyeket 4 °C-ra lehű öttük.
5. példa
Az amplifikálási termékek közvetlen kiértékelése
A DNS-amplifikálási termékek közvetlen kiértékeléséhez az amplifikálás után interkalációs ágenseket, például etidium-bromidot adagoltunk, illetve az amplifikálás során fluoreszcenciásan jelzett nukleotid-trifoszfátokat, például fluoreszcein-dUTP-t vagy hidroxi-kumarin-dUTP-t építettünk be. Alkalmazhatunk biotindCTP-t vagy digoxigenin-dUTP-t is, és antitesttel kapcsolt alkalikus foszfatázzal színreakció-kiértékelést végezhetünk. Kisebb érzékenységnél megfelelő, fluoreszcenciásan jelzett primer is alkalmazható.
Az amplifikálási terméket 0,8%-os agarózgélre vittül·, és 30 percig 100 mA-nél elektroforézisnek vetet7
HU 218 266 Β tűk alá. A kinolonszenzitív és kinolonrezisztens Staphylococcus-ok fluoreszcenciajelét UV-átvilágító alatt közvetlenül kiértékeltük.
6. példa
DNS-amplifikálási termékek kemilumineszcenciagénszondái
Alkalmas célampifikálási módszerek, mint például polimeráz láncreakció (PCR) (EP-200 326), LCR (EP-320 308) és génszondatechnika kombinálásával szignifikáns érzékenységnövelés érhető el az eredeti génszonda-kiértékeléshez képest.
A folyadékhibridizálási teszteket fordított fázisú tesztek formájában 100 ng 3’-biotinilezett génszondákkal és a 4. példa szerinti módon amplifikált DNS-sel 50 μΐ térfogatban végeztük.
percig 100 °C-on végzett melegítés, majd 0 °Cra történt lehűtés után 50 μΐ 2x hibridizálóelegyet [50 ml 20 χ SSC, 1 g blokkolóreagens (Boehringer), 2 ml 10%-os lauroil-szarkozin, 200 μΐ 20%-os SDS kétszer desztillált vízzel 100 ml-re kiegészítve] adagoltunk, és 5-10 percig 37 °C-on hibridizáltuk (oligonukleotidszonda). A mágneses gyöngyöket 1 χ hibridizálóeleggyel előkezeltük, és egy mágnes fölött végzett elválasztás után a folyadékot lepipettáztuk, a hibridizálási összeállítást és 100 μΐ lx hibridizálóelegyet hozzáadtuk, és 5 -10 percig szobahőmérsékleten, enyhe mozgatás közben inkubáltuk. A kapcsolt hibridizációs komplexet a gyöngyökkel elválasztottuk, a maradék folyadékot lepipettáztuk, és B pufferrel (0,1 SSC; 0,1% SDS) egyszer mostuk.
Végül blokkolási reakciót és antitestreakciót végeztünk a hibridizálás kimutatására kemilumineszcencia alapján. A DNS-sel feltöltött gyöngyökhöz 1x500 μΐ puffer 2-t [0,1 mol/1 maleinsav; 0,15 mol/1 NaCl; pH = 7,5 ; 1 % blokkolóreagens (Boehringer)] adtunk, és az elegyet 10 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd elválasztottuk, lepipettáztuk, és 500 μΐ mosópufferrel 2x30 másodpercig, majd 1x2 percig kezeltük, enyhe mozgatás közben. Ezután 100 μΐ detekciós oldattal (1:100 AMPPD puffer 3-ban) 10 percig 37 °C-on vízfürdőben inkubáltuk, majd a kemilumineszcenciát lumineszcens fotométerben 477 nm-nél (Lumacounter Lumac-tól) mértük.
Ezzel a teszttel 106—10' Staphylococcus-sefxiek megfelelő DNS-mennyiségek detektálhatok. Azonos, 10 csíra/ml-vér detektálási határ érhető el nem specifikus vér-DNS hozzáadása után. A vér-DNS csak csekély háttérjelet ad a hibridizálási tesztben.
7. példa
Staphylococcus-nukleinsavak izolálása
Staphylococcus-sza\ fertőzött mintát, például fertőzött vért 8000 fordulat/perc sebességgel 5-10 percig centrifugáltunk, a felülúszót lepipettáztuk, és elöntöttük. Az üledékhez (körülbelül 180-200 μΐ) 50 μΐ, 15% szacharózt tartalmazó TE-puffert, 20 μΐ lizozim + lizosztafin elegyet (10 + 5 mg/ml, kétszer desztillált vízben) adtunk, és 15 percig 37 °C-on inkubáltuk. A további feldolgozást a Diagen cég Qiamp-DNS-készletével végeztük. 25 μΐ proteináz K és 235 μΐ AL-puffer adagolása után az elegyet keverés közben 10 percig 70 °C-on hevítettük. Ezután jégen lehűtöttük, és 240 μΐ 100%-os etanolt adtunk hozzá, és rövid keverés után Qiagen-oszlopra vittük fel. Az oszlopot 1 percig 8000 fordulat zperc sebességgel centrifugáltuk, és az eluátumot elöntöttük. 700 μΐ AW-mosópuffert vittünk fel, és 1 percig 8000 fordulat/perc sebességgel újra centrifugáltuk. Ezután ugyanannyi AW-pufferrel mostuk, és 1 percig 8000 fordulat/perc sebességgel, majd 10 másodpercig 14 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk, és az eluátumot elöntöttük. Ezután az oszlopra 200 μΐ, kétszer desztillált vizet vittünk fel, és 1 percig 8000 fordulat'perc sebességgel centrifugáltuk. Az eluátum tartalmazza az amplifikáláshoz alkalmazható tisztított nuklei nsavoldatot.
8. példa
QRSA kimutatása klinikai mintákban
QRSA-DNS-t klinikai mintából a 7. példa szerinti módón izoláltunk. A öfap/iy/ococcwí-DNS-lizátumot alkalmas amplifikálási módszerrel, például a 4. példa szerinti módon QRSA-specifikus oligonukleotid-primerekkel amplifikáltuk. Az amplifikált nukleinsavakat az
5. szekvencia szerinti oligonuklentidszondával hibridizáituk, és a szigorú körülmények között az amplifikált Síí:g)/;v/ococc«.s-nukleinsavakból és a génszonda-DNSből kialakult, specifikus hibridizációs komplexet a D\ nal cég mágneses részecskéivel elválasztottuk, és a
6. példa szerinti módon kemilumineszcenciás kiértékeléssel kvantitatív módon meghatároztuk.
A QRSA-val azonosított vérlizátumokban giráz A génre specifikus hibridizációs jeleket még lO'/ml csírakoncentrációnál is kimutattunk.
9. példa
QRSA kimutatása kvantitatív módon
QRSA-t izoláltunk a 7. példa szerinti módon klinikai mintából, például vérből, és a 4. és 6. példa szerinti módon végzett amplifikálás után kemilumineszcenciatesztet végeztünk. A klinikai minták mellett párhuzamosan olyan mintákat amplifikáltunk és analizáltunk kemiluinineszcencia-teszttel, amelyek 106—10 sejtszámnak megfelelő QRSA DNS-t tartalmaztak 500 ng vér-DNSbe i. A vérben 106-10 QRSA-tartalmú sejtstandard ke nilumineszcencia-jelét a párhuzamosan vizsgált 10’-102 csírát tartalmazó tesztmintáéval hasonlítottuk össze, amelynek a csíraszámát a három primer szettteszttel határoztuk meg. A sejtszám DNS-standard (103 és 102) kemilumineszcencia-jelei jól megegyeznek a 103 és 102 csírát tartalmazó tesztminták kemilumineszcencia-jeleivel, és azt mutatják, hogy a kemilumineszcencia-teszt a QRSA szemikvantitatív mérésére alkalmazható néldául vér esetén.
SZEKVENCIALISTA (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:
(i) BEJELENTŐ:
(A) Bayer AG (B) Utca: Bayerwerk (C) Helység: Leverkusen
HU 218 266 Β (E) Ország: Németország (F) Postai irányítószám: D-51368 (G) Telefon: 0214/3061455 (H) Telefax: 0214/303482 (ii) A TALÁLMÁNY CÍME: DNS-gyorsteszt kinolonrezisztens Staphylococcus aureus-kórokozók kimutatására klinikai mintákban (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 13 (2) INFORMÁCIÓK AZ 1. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 19 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomi) (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDET:
(A) ORGANIZMUS: primer (B) INDIVIDUÁLIS IZOLÁTUM: szintetikus (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 1. szekvencia:
ATCACCCTCA TGGTGACTT 19 (2) INFORMÁCIÓK A 2. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomi) (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDET:
(A) ORGANIZMUS: primer (B) INDIVIDUÁLIS IZOLÁTUM: szintetikus (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 2. szekvencia:
ATCACCCTCA TGGTGACG 18 (2) INFORMÁCIÓK A 3. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomi) (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDET:
(A) ORGANIZMUS: primer (B) INDIVIDUÁLIS IZOLÁTUM: szintetikus (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 3. szekvencia:
ATGGTGACTC ATCTATTTAT A 21 (2) INFORMÁCIÓK A 4. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomi) (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDET:
(A) ORGANIZMUS: primer (B) INDIVIDUÁLIS IZOLÁTUM : szintetikus (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 4. szekvencia:
G1 CCGCCTCC ACGTTCTT 18 (2) INFORMÁCIÓK AZ 5. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 36bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomi) (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDET:
(A) ORGANIZMUS: primer (B) INDIVIDUÁLIS IZOLÁTUM: szintetikus (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 5. szekvencia:
G1ACGTATGG CTCAAGATTT CAGTTATCGT TATCCG 36 (2) INFORMÁCIÓK A 6. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 534 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomi) (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDET:
(A) ORGANIZMUS: szonda (B) INDIVIDUÁLIS IZOLÁTUM: szintetikus (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 6. szekvencia:
ATCACCCTCA TGGTGACTCA TCTATTTATG GTTATCGTTA TCCGCTTGTT GATGGCCAAG CAGCAGCAAT GCGTTATACT GAAGCGCGTA ATATTAATAA AGATACAATA GATTTTATCG CAGTCTTACC TGCTCGATTC CCTAACTTGT GTATGGCAAC GAATATTCCA CCACATAACT TAAGTAAGAA CCCTGATATT TCAATTGCTG TCCCAACTGC TGGACTTATT TTAGGTAAGA GTGGTTCAAT TCAAATGCGT TCTCGTGCAG
AAGCAATGGT ACGTATGGCT CAAGATTTCA 60 GTAACTTTGG TTCAATGGAT GGAGATGGCG 120 TGACTAvVAAT CACACTTGAA CTGTTACGTG 180 ATAACTATGA TGGTAATGAA AGAGAGCCGT 240 TAGCCAATGG TGCATCAGGT ATCGCGGTAG 300 TAACAGAATT AATCAATGGT GTACTTAGCT 360 AGTTAATGGA GGATATTGAA GGTCCTGATT 420 GTGGTATTAG ACGTGCATAT GAAACAGGTC 480 TTATTG.AAGA ACGTGGAGGC GGAC 5 34 (2) INFORMÁCIÓK A 7. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 22 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris
HU 218 266 Β (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomi) (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDET:
(A) ORGANIZMUS: Staphylococcus aureus (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 7. szekvencia: GGTGACTCAT CTATTTATGA AG 22 (2) INFORMÁCIÓK A 8. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 22 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomi) (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDET:
(A) ORGANIZMUS: Staphylococcus aureus (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 8. szekvencia: GGTGACTCAT CTATCTATGA AG 22 (2) INFORMÁCIÓK A 9. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 22 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomi) (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDET:
(A) ORGANIZMUS: Staphylococcus aureus (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 9. szekvencia: GGTGACTTAT CTATTTATGA AG 22 (2) INFORMÁCIÓK A 10. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 22 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL SZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomi) (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDET:
(A) ORGANIZMUS: Staphylococcus aureus (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 10. szekvencia:
GGTGACTTAT CTATCTATGA AG 22 (2) INFORMÁCIÓK All. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 22 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (Ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomi) (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDET:
(A) ORGANIZMUS: Staphylococcus aureus (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 11. szekvencia:
GGTGACTCAT CTATTTATAA AG 22 (2) INFORMÁCIÓK A 12. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 22 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomi) (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDET:
(A) ORGANIZMUS: Staphylococcus aureus (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 12. szekvencia:
GGTGATTCAT CTATTTATAA AG 22 (2) INFORMÁCIÓK A 13. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 22 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL SZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomi) (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDET:
(A) ORGANIZMUS: Staphylococcus aureus (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 13. szekvencia:
GGTGACGCAT CTATTTATGA AG 22

Claims (10)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Oligonukleotid-primerek giráz A nukleotidszekvenciájában levő pontmutációk specifikus kimutatására és amplifikálására.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid-primer a giráz A nukleotidszekvenciája 2533-helyzetében levő C/T pontmutáció specifikus kimutatására és amplifikálására, amely a szekvencialista szerinti 1. és 4. szekvenciával rendelkező nukleotidszekvenciát tartalmazza.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid-primer a giráz A nukleotidszekvenciája 2532-helyzetében levő T/G pontmutáció specifikus kimutatására és amplifikálására, amely a szekvencialista szerinti 2. és 4. szekvenciával rendelkező nukleotidszekvenciát tartalmazza.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid-primer a giráz A nukleotidszekvenciája 2544-helyzetében levő G A pontmutáció specifikus kimutatására és amplifikálására, amely a szekvencialista szerinti 3. és 4. szekvenciával rendelkező nukleotidszekvenciát tartalmazza.
  5. 5. Kinolonrezisztens Staphylococcus-ók. DNS-ével vegy RNS-ével hibiridizálni képes oligonukleotidszondák és polinukleotidszondák, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotidszondák a szekvencialista szerinti 5. szekvenciával rendelkező nukleotidszekvenciát tartalmazzák, amely adott esetben jelzéssel van ellátva, míg a polinukleotidszondák a szekvencialista szerinti
  6. 6. szekvenciával rendelkező nukleotidszekvenciát tartalmazzák, amely adott esetben jelzéssel van ellátva.
    6. Eljárás kinolonrezisztens Staphylococcus aureuscsírák kimutatására, azzal jellemezve, hogy
    HU 218 266 Β
    a) kinolonrezisztens Staphylococcus a«n?z«-csírák nukleinsavtartalmát az 1 -4. igénypontok szerinti mutációspecifikus primer szettekkel végzett amplifikálás után közvetlenül további hibridizálás nélkül vizsgáljuk vagy génszondákkal való reakcióban alkalmazzuk,
    b) kinolonrezisztens Staphylococcus aureus-cslrak. nukelinsavtartalmának specifikus hibridizálására és detektálására egy, az 5. igénypont szerinti oligonukleotidvagy polinukleotidszondát alkalmazunk,
    c) az oligo- és polinukleotidszondákat ismert módon riportermolekulákkal jelzéssel látjuk el,
    d) a hibridizációs komplex alapján, az amplifikált cél-DNS jelzése által közvetlenül meghatározzuk a kinolonrezisztens Staphylococcus-ok. mennyiségét.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a giráz A gén részeinek amplifikálására valamely az 1-4. igénypontok szerinti prímért alkalmazunk.
  8. 8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 5 hogy egy, az 5. igénypont szerinti oligonukleotidszondái alkalmazunk.
  9. 9. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy, az 5. igénypont szerinti polinukleotidszondát alkalmazunk.
  10. 10 10. Tesztkészlet kinolonrezisztencia meghatározásé ra klinikai mintákban, azzal jellemezve, hogy egy vagy több az 1-5. igénypontok szerinti oligonukleotidot, valamint puffért és más oldatokat tartalmaz.
HU9501875A 1994-06-23 1995-06-23 DNS gyorsteszt kinolonrezisztens Staphylococcus aureus kórokozók kimutatására klinikai mintákban HU218266B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4421901A DE4421901A1 (de) 1994-06-23 1994-06-23 Ein DNA-Schnelltest zum Nachweis von chinolonresistenten Staphylococcus aureus Erregern in klinischem Probenmaterial

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9501875D0 HU9501875D0 (en) 1995-08-28
HUT71861A HUT71861A (en) 1996-02-28
HU218266B true HU218266B (hu) 2000-06-28

Family

ID=6521270

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9501875A HU218266B (hu) 1994-06-23 1995-06-23 DNS gyorsteszt kinolonrezisztens Staphylococcus aureus kórokozók kimutatására klinikai mintákban

Country Status (6)

Country Link
US (1) US6015666A (hu)
EP (1) EP0688873A3 (hu)
JP (1) JPH08298A (hu)
CA (1) CA2152218A1 (hu)
DE (1) DE4421901A1 (hu)
HU (1) HU218266B (hu)

Families Citing this family (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6306348B1 (en) * 1993-11-01 2001-10-23 Nanogen, Inc. Inorganic permeation layer for micro-electric device
ATE366418T1 (de) 1996-04-25 2007-07-15 Bioarray Solutions Ltd Licht-regulierte, elektrokinetische zusammensetzung von partikeln an oberflächen
DE19717346C2 (de) * 1997-04-24 1999-05-20 Max Planck Gesellschaft DNA-Sonden, Verfahren und Kit zur Identifizierung Antibiotika-resistenter Bakterienstämme
AU762314B2 (en) * 1998-04-01 2003-06-19 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Oligonucleotide probes for detecting enterobacteriaceae and quinolone-resistant enterobacteriaceae
US6706475B1 (en) 1998-04-01 2004-03-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligonucleotide probes for detecting Enterobacteriaceae and quinolone-resistant Enterobacteriaceae
JP2002528094A (ja) * 1998-10-28 2002-09-03 ワーナー−ランバート・カンパニー 細菌のＤＮＡジャイレースおよびＦａｂＩ内の突然変異の同定および特徴解析方法
US7135283B1 (en) * 1998-11-17 2006-11-14 Nanogen, Inc. Topoisomerase type II gene polymorphisms and their use in identifying drug resistance and pathogenic strains of microorganisms
EP1077265A1 (de) * 1999-08-19 2001-02-21 Merlin Gesellschaft Für Mikrobiologische Diagnostika Mbh Verfahren zur genotypischen Klassifizierung von Bakterien
EP1169482A1 (de) * 1999-04-10 2002-01-09 Merlin Gesellschaft für mikrobiologische Diagnostika mbH Verfahren zur genotypischen klassifizierung
DE19916227A1 (de) * 1999-04-10 2000-11-02 Merlin Mikrobiolog Diag Gmbh Verfahren zur genotypischen Klassifizierung
JP5181157B2 (ja) * 1999-09-30 2013-04-10 ハミダ・フォー・ライフ・ベスローテン・フェンノートシャップ マイクロエレクトロニックアレイ上の生体分子付着部位
US6303082B1 (en) * 1999-12-15 2001-10-16 Nanogen, Inc. Permeation layer attachment chemistry and method
US7892854B2 (en) * 2000-06-21 2011-02-22 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
US9709559B2 (en) 2000-06-21 2017-07-18 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
US7226739B2 (en) 2001-03-02 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations
US20030027135A1 (en) * 2001-03-02 2003-02-06 Ecker David J. Method for rapid detection and identification of bioagents
US7718354B2 (en) 2001-03-02 2010-05-18 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals
US7666588B2 (en) * 2001-03-02 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy
US20040121335A1 (en) * 2002-12-06 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents associated with host versus graft and graft versus host rejections
US7262063B2 (en) 2001-06-21 2007-08-28 Bio Array Solutions, Ltd. Directed assembly of functional heterostructures
US7217510B2 (en) * 2001-06-26 2007-05-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for providing bacterial bioagent characterizing information
US8073627B2 (en) * 2001-06-26 2011-12-06 Ibis Biosciences, Inc. System for indentification of pathogens
JP2003070478A (ja) * 2001-09-04 2003-03-11 Nisshinbo Ind Inc 結核菌のキノロン耐性の判定方法
CA2497740C (en) 2001-10-15 2011-06-21 Bioarray Solutions, Ltd. Multiplexed analysis of polymorphic loci by probe elongation-mediated detection
US6960298B2 (en) * 2001-12-10 2005-11-01 Nanogen, Inc. Mesoporous permeation layers for use on active electronic matrix devices
US20040241723A1 (en) * 2002-03-18 2004-12-02 Marquess Foley Leigh Shaw Systems and methods for improving protein and milk production of dairy herds
EP1581650A4 (en) * 2002-10-11 2006-08-23 Univ Arizona State MOLECULAR SIGNATURES AND ASSAY FOR FLUOROQUINOLINE RESISTANCE IN BACILLUS OF CHARCOAL
AU2003298655A1 (en) 2002-11-15 2004-06-15 Bioarray Solutions, Ltd. Analysis, secure access to, and transmission of array images
EP1578399A4 (en) 2002-12-06 2007-11-28 Isis Pharmaceuticals Inc METHODS FOR RAPID IDENTIFICATION OF PATHOGENS IN HUMANS AND BEETS
EP1606419A1 (en) 2003-03-18 2005-12-21 Quantum Genetics Ireland Limited Systems and methods for improving protein and milk production of dairy herds
US20040185452A1 (en) * 2003-03-21 2004-09-23 Pei-Jer Chen Identification of single nucleotide polymorphisms
US8046171B2 (en) * 2003-04-18 2011-10-25 Ibis Biosciences, Inc. Methods and apparatus for genetic evaluation
US8057993B2 (en) 2003-04-26 2011-11-15 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of coronaviruses
US7964343B2 (en) * 2003-05-13 2011-06-21 Ibis Biosciences, Inc. Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US8158354B2 (en) * 2003-05-13 2012-04-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US20060240412A1 (en) * 2003-09-11 2006-10-26 Hall Thomas A Compositions for use in identification of adenoviruses
US8546082B2 (en) 2003-09-11 2013-10-01 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US8288523B2 (en) * 2003-09-11 2012-10-16 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of bacteria
US8097416B2 (en) 2003-09-11 2012-01-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US20100035239A1 (en) * 2003-09-11 2010-02-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for use in identification of bacteria
US20080138808A1 (en) * 2003-09-11 2008-06-12 Hall Thomas A Methods for identification of sepsis-causing bacteria
WO2005029705A2 (en) * 2003-09-18 2005-03-31 Bioarray Solutions, Ltd. Number coding for identification of subtypes of coded types of solid phase carriers
ATE532066T1 (de) * 2003-09-22 2011-11-15 Bioarray Solutions Ltd Oberflächenimmobilisierter polyelektrolyt mit mehreren, zur kovalenten bindung an biomoleküle fähigen funktionellen gruppen
US20050089916A1 (en) * 2003-10-28 2005-04-28 Xiongwu Xia Allele assignment and probe selection in multiplexed assays of polymorphic targets
NZ547492A (en) * 2003-10-28 2009-12-24 Bioarray Solutions Ltd Optimization of gene expression analysis using immobilized capture probes of different lengths and densities
JP2007509629A (ja) 2003-10-29 2007-04-19 バイオアレイ ソリューションズ リミテッド 二本鎖ｄｎａの切断による複合核酸分析
US7666592B2 (en) * 2004-02-18 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent
US20050202484A1 (en) 2004-02-19 2005-09-15 The Governors Of The University Of Alberta Leptin promoter polymorphisms and uses thereof
US8119336B2 (en) * 2004-03-03 2012-02-21 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of alphaviruses
WO2005117270A2 (en) 2004-05-24 2005-12-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Mass spectrometry with selective ion filtration by digital thresholding
US20050266411A1 (en) * 2004-05-25 2005-12-01 Hofstadler Steven A Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA
US7363170B2 (en) * 2004-07-09 2008-04-22 Bio Array Solutions Ltd. Transfusion registry network providing real-time interaction between users and providers of genetically characterized blood products
US7811753B2 (en) 2004-07-14 2010-10-12 Ibis Biosciences, Inc. Methods for repairing degraded DNA
US7848889B2 (en) 2004-08-02 2010-12-07 Bioarray Solutions, Ltd. Automated analysis of multiplexed probe-target interaction patterns: pattern matching and allele identification
WO2006135400A2 (en) 2004-08-24 2006-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapid identification of recombinant organisms
US8084207B2 (en) * 2005-03-03 2011-12-27 Ibis Bioscience, Inc. Compositions for use in identification of papillomavirus
EP1869180B1 (en) 2005-03-03 2013-02-20 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of polyoma viruses
US8486629B2 (en) 2005-06-01 2013-07-16 Bioarray Solutions, Ltd. Creation of functionalized microparticle libraries by oligonucleotide ligation or elongation
US8026084B2 (en) * 2005-07-21 2011-09-27 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid identification and quantitation of nucleic acid variants
US7687103B2 (en) * 2006-08-31 2010-03-30 Gamida For Life B.V. Compositions and methods for preserving permeation layers for use on active electronic matrix devices
US9149473B2 (en) * 2006-09-14 2015-10-06 Ibis Biosciences, Inc. Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens
WO2008104002A2 (en) * 2007-02-23 2008-08-28 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic dna analysis
US20100204266A1 (en) * 2007-03-23 2010-08-12 Ibis Biosciences, INC Compositions for use in identification of mixed populations of bioagents
EP2503008B1 (en) 2007-04-19 2015-04-01 Molecular Detection Inc. Methods, compositions and kits for detection and analysis of antibiotic-resistant bacteria
WO2008151023A2 (en) 2007-06-01 2008-12-11 Ibis Biosciences, Inc. Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids
US8550694B2 (en) 2008-09-16 2013-10-08 Ibis Biosciences, Inc. Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, systems, and methods
WO2010033627A2 (en) 2008-09-16 2010-03-25 Ibis Biosciences, Inc. Sample processing units, systems, and related methods
US8534447B2 (en) 2008-09-16 2013-09-17 Ibis Biosciences, Inc. Microplate handling systems and related computer program products and methods
WO2010093943A1 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Ibis Biosciences, Inc. Ionization probe assemblies
WO2011008971A1 (en) * 2009-07-17 2011-01-20 Ibis Biosciences, Inc. Lift and mount apparatus
US9194877B2 (en) 2009-07-17 2015-11-24 Ibis Biosciences, Inc. Systems for bioagent indentification
US20110091882A1 (en) * 2009-10-02 2011-04-21 Ibis Biosciences, Inc. Determination of methylation status of polynucleotides
EP2488656B1 (en) * 2009-10-15 2015-06-03 Ibis Biosciences, Inc. Multiple displacement amplification
FR3004728B1 (fr) 2013-04-19 2016-02-19 Univ Reims Champagne Ardenne Methode de caracterisation des mutations chromosomiques des genes codant les topoisomerases bacteriennes

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4957858A (en) * 1986-04-16 1990-09-18 The Salk Instute For Biological Studies Replicative RNA reporter systems
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4965188A (en) * 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
DK171161B1 (da) * 1985-03-28 1996-07-08 Hoffmann La Roche Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve
AU622104B2 (en) * 1987-03-11 1992-04-02 Sangtec Molecular Diagnostics Ab Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore
CA1323293C (en) * 1987-12-11 1993-10-19 Keith C. Backman Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization
CA1340807C (en) * 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
NO904633L (no) * 1989-11-09 1991-05-10 Molecular Diagnostics Inc Amplifikasjon av nukleinsyrer ved transkriberbar haarnaalsprobe.
DE4014845A1 (de) * 1990-05-09 1991-11-14 Bayer Ag Verfahren zur detektion und quantitativen bestimmung von nitrosomonas-staemmen in abwaessern oder boeden
WO1993018178A1 (en) * 1992-03-13 1993-09-16 The Children's Hospital Of Philadelphia DIAGNOSIS OF β-THALASSEMIA USING A MULTIPLEX AMPLIFICATION REFRACTORY MUTATION SYSTEM
EP0655090B1 (en) * 1992-04-27 2000-12-27 The Trustees Of Dartmouth College Detection of gene sequences in biological fluids
DE4338119A1 (de) * 1993-11-08 1995-05-11 Bayer Ag Spezifische Gensonden und Verfahren zum quantitativen Nachweis von methicillinresistenten Staphylococcen

Also Published As

Publication number Publication date
JPH08298A (ja) 1996-01-09
HU9501875D0 (en) 1995-08-28
HUT71861A (en) 1996-02-28
CA2152218A1 (en) 1995-12-24
EP0688873A3 (de) 1999-02-24
US6015666A (en) 2000-01-18
EP0688873A2 (de) 1995-12-27
DE4421901A1 (de) 1996-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU218266B (hu) DNS gyorsteszt kinolonrezisztens Staphylococcus aureus kórokozók kimutatására klinikai mintákban
JP4176146B2 (ja) 微生物検査室における日常的診断用の臨床検体からの通常の細菌病原体および抗生物質耐性遺伝子を迅速に検出および同定するための特異的および普遍的プローブおよび増幅プライマー
JP2719225B2 (ja) クラミジア・トラコーマチスの検出方法およびそのためのキット
US10233504B2 (en) Methods and compositions for isothermal amplification and detection of mycoplasma pneumoniae
US20020119475A1 (en) Methods and compositions for detection of specific nucleotide sequences
DE4338119A1 (de) Spezifische Gensonden und Verfahren zum quantitativen Nachweis von methicillinresistenten Staphylococcen
JP2001514483A (ja) 核酸増幅法：分枝―伸長増幅方法（ｒａｍ）
JP2001521373A (ja) 核酸増幅法：ハイブリダイゼーションシグナル増幅法（ｈｓａｍ）
JP2002509436A (ja) メチシリン耐性ブドウ球菌を迅速に検出するための方法
JP2005511030A (ja) 核酸の増幅方法
JPH0549477A (ja) スタフイロコツカス属細菌類の検出
JP2006518194A5 (hu)
JPH08510386A (ja) ポリメラーゼ鎖反応によるサルモネラ菌の同定
CA2862373C (en) Hev assay
JP2001103986A (ja) 鳥型結核菌複合種の増幅および検出
WO2013176992A2 (en) Methods and compositions for the diagnosis of sepsis using gamma peptide nucleic acids
JP2006525809A (ja) 抗生物質耐性微生物を同定するための方法およびキット
JPH06209797A (ja) カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）の診断的研究のための特異的遺伝子のプローブ
AU2018236842A1 (en) Compositions and methods for detecting gastrointestinal pathogen nucleic acid
JPS62266000A (ja) 微生物の急速ｄｎａ試験
JP2003510092A (ja) Ｅｈｅｃ感染を検出するための多重ｐｃｒ
US5814490A (en) Amplification and detection of chlamydia trachomatis nucleic acids
US20050058985A1 (en) Method and kit for identifying vancomycin-resistant enterococcus
JP2002017399A (ja) 塩基多型を検出する方法
JP2010536343A (ja) 薬剤耐性菌検出方法

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee