JP2024105718A - Ｈｃｖ検出 - Google Patents
Ｈｃｖ検出 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024105718A JP2024105718A JP2024085494A JP2024085494A JP2024105718A JP 2024105718 A JP2024105718 A JP 2024105718A JP 2024085494 A JP2024085494 A JP 2024085494A JP 2024085494 A JP2024085494 A JP 2024085494A JP 2024105718 A JP2024105718 A JP 2024105718A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- acid sequence
- hcv
- seq
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 32
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 304
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 162
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 136
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 136
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 98
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 abstract description 93
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 72
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 68
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 68
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 abstract description 63
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 abstract description 59
- 108700039791 Hepatitis C virus nucleocapsid Proteins 0.000 abstract description 39
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 36
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 11
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 abstract description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 35
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 34
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 30
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 29
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 27
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 23
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 19
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 18
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 15
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 15
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 13
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 12
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 12
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 11
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 10
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 10
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 10
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- -1 nucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 6
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 6
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 6
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 6
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 6
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 5
- 108091028733 RNTP Proteins 0.000 description 5
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 5
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 5
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 5
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 5
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 5
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 4
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 4
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 3
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 3
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 3
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical compound [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N rGTP Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000013179 statistical model Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 101710118188 DNA-binding protein HU-alpha Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 208000012266 Needlestick injury Diseases 0.000 description 1
- 101710144128 Non-structural protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101800001020 Non-structural protein 4A Proteins 0.000 description 1
- 101800001019 Non-structural protein 4B Proteins 0.000 description 1
- 101800001014 Non-structural protein 5A Proteins 0.000 description 1
- 101710199667 Nuclear export protein Proteins 0.000 description 1
- 101800001554 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700022715 Viral Proteases Proteins 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 244000309457 enveloped RNA virus Species 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 229910052809 inorganic oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 description 1
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000009518 sodium iodide Nutrition 0.000 description 1
- BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M sodium perchlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)(=O)=O BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910001488 sodium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000007501 viral attachment Effects 0.000 description 1
- 230000007502 viral entry Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
- C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】ＨＣＶ検出の提供。【解決手段】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸を検出するための方法が記載されている。本方法は、臨床現場即時（ＰＯＣ）検査に有用であり、いくつかの異なるＨＣＶ遺伝子型を検出することができる迅速な検査を提供する。キット、プライマー、プローブ、プライマーの組、オリゴヌクレオチドの組、およびオリゴヌクレオチド、ならびに本方法におけるそれらの使用も記載されている。本出願人は、ＨＣＶコア核酸配列（またはその相補物）の保存された領域に特異的にハイブリッド形成する核酸増幅プライマーを使用することによって、いくつかの異なるＨＣＶ遺伝子型を検出することができる迅速なＰＯＣ核酸検査を提供できることを十分に認識した。【選択図】なし
Description
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸を検出するための、特に臨床現場即時（ＰＯＣ（ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－ｃａｒｅ））検査のための方法、キット、プライマー、プローブ、プライマーの組、オリゴヌクレオチドの組およびオリゴヌクレオチドならびに前記方法におけるこれらの使用に関する。
Ｃ型肝炎は、主に肝臓に影響を及ぼすＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）によって引き起こされる感染性疾患である。初期感染の間には、多くの場合、軽度の症状が存在するにすぎず、または症状が全く存在しない。ウイルスは、最初に感染した者の約７５％～８５％において肝臓内に存続する。慢性感染の早期には、通例、症状がない。しかしながら、長年にわたって、慢性感染は、しばしば肝疾患、特には肝硬変に至る。場合によっては、肝硬変患者は、肝不全、肝臓がん、または食道および胃内の拡張した血管などの合併症を発症する。
ＨＣＶは、主に、静脈内薬物使用、滅菌が不十分な医療器具、健康管理における針刺し損傷および輸血に関連する血液と血液との接触によって拡散する。２０１５年現在、世界中で１億４３００万人（２％）がＣ型肝炎に感染していると推定された（ＧＢＤ ２０１５ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｉｎｊｕｒｙ Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ，Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｓ．（８ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１６）．Ｌａｎｃｅｔ，３８８（１００５３）：１５４５－１６０２）。Ｃ型肝炎は、アフリカならびに中央アジアおよび東アジアで最も一般的に発生する。２０１５年には、Ｃ型肝炎に起因して、約１６７，０００人が肝臓がんで死亡し、３２６，０００人が肝硬変で死亡した（ＧＢＤ ２０１５ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ａｎｄ Ｃａｕｓｅｓ ｏｆ Ｄｅａｔｈ，Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｓ．（８ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１６）．Ｌａｎｃｅｔ，３８８（１００５３）：１４５９－１５４４）。Ｃ型肝炎に対するワクチンは存在しない。しかしながら、強力で忍容性の高い直接作用する抗ウイルス薬の組み合わせの開発および承認によって、ＨＣＶ感染の処置は、革命的な変化を遂げている。これらの治療法は、ほとんどの患者集団において８～２４週間の投与後に９５％を超える治癒率をもたらす（Ｂｅｌｐｅｒｉｏら、２０１７，Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １６７，４９９－５０４５；Ｆａｌａｄｅ－Ｎｗｕｌｉａら、２０１７，Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ，１６６，６３７－６４８）。
ＨＣＶは、エンベロープに覆われたフラビウイルス科のＲＮＡウイルスである。ＨＣＶ粒子は、２つのウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ１およびＥ２がその中に埋め込まれている脂質膜エンベロープを含む。Ｅ１およびＥ２は、ウイルスの付着および細胞内への侵入に関与する。エンベロープ内には、ウイルスのＲＮＡ材料を含有する正二十面体のコアが存在する。ＨＣＶは、９，６００ヌクレオチド塩基長である単一のオープンリーディングフレームからなる一本鎖プラス鎖ＲＮＡゲノムを有する。この単一のオープンリーディングフレームは、翻訳されて約３，０００アミノ酸の単一のタンパク質産物を生成し、次いで、このタンパク質産物は、細胞のプロテアーゼおよびウイルスのプロテアーゼによって、宿主細胞内でのウイルス複製を可能にする１０個のより小さいタンパク質へとさらにプロセシングされるか、または成熟ウイルス粒子へと集合する。このＲＮＡの５’および３’末端には非翻訳領域（ＮＴＲ）があり、これらはタンパク質に翻訳されないが、ウイルスＲＮＡの翻訳および複製にとって重要である。
Ｃ型肝炎ウイルスによって作られる構造タンパク質には、コアタンパク質、Ｅ１およびＥ２が含まれる。非構造（ＮＳ）タンパク質には、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂが含まれる。タンパク質は、ゲノムに沿って以下の順序で配置されている。Ｎ末端－コア－エンベロープ（Ｅ１）－Ｅ２－ｐ７－ＮＳ２－ＮＳ３－ＮＳ４Ａ－ＮＳ４Ｂ－ＮＳ５Ａ－ＮＳ５Ｂ－Ｃ末端。コアタンパク質は１９１個のアミノ酸を有する。
ＨＣＶは、７つの主要な遺伝子型（１～７）および６７のサブタイプに分類されている（Ｓｍｉｔｈら、２０１４（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１４；５９；３１８－３２７）。遺伝子型は、完全なゲノムに対してヌクレオチド部位の３０～３５％が異なる（Ｏｈｎｏら（２００７）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５（１）：２０１－７）。遺伝子型のサブタイプのゲノム組成の差は、通常２０～２５％である。サブタイプ１ａおよび１ｂは世界中で見出されており、全症例の６０％を引き起こす。
ＨＣＶの診断は、ウイルスまたはそのＲＮＡに対する抗体を探すための血液検査による。ＨＣＶ検出のいくつかの方法が米国ＦＤＡによって承認されている。
・ Ｃ型肝炎ウイルスにコードされた抗原（抗ＨＣＶアッセイ）：ＡＢＢＯＴＴ ＨＣＶ ＥＩＡ ２．０（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；Ｃｈｉｒｏｎ ＲＩＢＡ ＨＣＶ ３．０ Ｓｔｒｉｐ Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ Ａｓｓａｙ（Ｃｈｉｒｏｎ
Ｃｏｒｐ）；ＡＢＢＯＴＴ ＰＲＩＳＭ ＨＣＶ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；
・ 核酸試験：ＵｌｔｒａＱｕａｌ ＨＣＶ ＲＴ－ＰＣＲ Ａｓｓａｙ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ＣＯＢＡＳ ＡｍｐｌｉＳｃｒｅｅｎ ＨＣＶ Ｔｅｓｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）；Ｐｒｏｃｌｅｉｘ ＨＩＶ－１／ＨＣＶ Ａｓｓａｙ（Ｇｅｎ－Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ）；Ｐｒｏｃｌｅｉｘ Ｕｌｔｒｉｏ Ａｓｓａｙ（Ｇｅｎ－Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ）；Ｐｒｏｃｌｅｉｘ Ｕｌｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ Ａｓｓａｙｓ（Ｇｅｎ－Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ）；Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ（ＨＣＶ）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＲＴ）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）Ａｓｓａｙ（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｐｌａｓｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｌ．Ｐ．）；
・ ＥＬＩＳＡ試験：Ｏｒｔｈｏ ＨＣＶ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０ ＥＬＩＳＡ Ｔｅｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｏｒｔｈｏ－Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ）。
・ Ｃ型肝炎ウイルスにコードされた抗原（抗ＨＣＶアッセイ）：ＡＢＢＯＴＴ ＨＣＶ ＥＩＡ ２．０（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；Ｃｈｉｒｏｎ ＲＩＢＡ ＨＣＶ ３．０ Ｓｔｒｉｐ Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ Ａｓｓａｙ（Ｃｈｉｒｏｎ
Ｃｏｒｐ）；ＡＢＢＯＴＴ ＰＲＩＳＭ ＨＣＶ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；
・ 核酸試験：ＵｌｔｒａＱｕａｌ ＨＣＶ ＲＴ－ＰＣＲ Ａｓｓａｙ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ＣＯＢＡＳ ＡｍｐｌｉＳｃｒｅｅｎ ＨＣＶ Ｔｅｓｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）；Ｐｒｏｃｌｅｉｘ ＨＩＶ－１／ＨＣＶ Ａｓｓａｙ（Ｇｅｎ－Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ）；Ｐｒｏｃｌｅｉｘ Ｕｌｔｒｉｏ Ａｓｓａｙ（Ｇｅｎ－Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ）；Ｐｒｏｃｌｅｉｘ Ｕｌｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ Ａｓｓａｙｓ（Ｇｅｎ－Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ）；Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ（ＨＣＶ）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＲＴ）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）Ａｓｓａｙ（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｐｌａｓｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｌ．Ｐ．）；
・ ＥＬＩＳＡ試験：Ｏｒｔｈｏ ＨＣＶ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０ ＥＬＩＳＡ Ｔｅｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｏｒｔｈｏ－Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ）。
これらの方法は、検査室において実施され、時間と費用がかかるので、ＨＣＶ感染が蔓延している支援が届きにくい集団および医療制度が十分でない環境での使用には適していない。また、抗体に基づく試験は、一般に感染の６～１２週後にＨＣＶ感染を検出することができるに過ぎない。したがって、支援が届きにくい集団および医療制度が十分でない環境での使用に適し、感染後できるだけ早くＨＣＶを検出することができる迅速な試験が必要とされている。
ＧＢＤ ２０１５ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｉｎｊｕｒｙ Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ，Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｓ．（８ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１６）．Ｌａｎｃｅｔ，３８８（１００５３）：１５４５－１６０２
ＧＢＤ ２０１５ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ａｎｄ Ｃａｕｓｅｓ ｏｆ Ｄｅａｔｈ，Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｓ．（８ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１６）．Ｌａｎｃｅｔ，３８８（１００５３）：１４５９－１５４４
Ｂｅｌｐｅｒｉｏら、２０１７，Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １６７，４９９－５０４５
Ｆａｌａｄｅ－Ｎｗｕｌｉａら、２０１７，Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ，１６６，６３７－６４８
Ｓｍｉｔｈら、２０１４（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１４；５９；３１８－３２７
Ｏｈｎｏら（２００７）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５（１）：２０１－７
本出願人は、ＨＣＶコア核酸配列（またはその相補物）の保存された領域に特異的にハイブリッド形成する核酸増幅プライマーを使用することによって、いくつかの異なるＨＣＶ遺伝子型を検出することができる迅速なＰＯＣ核酸検査を提供できることを十分に認識した。
本発明によれば、試料がＨＣＶ核酸を含むかどうかを決定する方法であって、順方向核酸増幅プライマーおよび逆方向核酸増幅プライマーを使用する等温増幅反応によって、前記試料の核酸を増幅すること、または前記試料の核酸に由来する核酸を増幅することを含み、各核酸増幅プライマーは、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に特異的にハイブリッド形成する、方法が提供される。
ＨＣＶコア核酸配列を図２に示す。
保存された配列は、ＢＬＡＳＴ、ＨＭＭＥＲおよびＩｎｆｅｒｎａｌなどのツールを使用して、相同性検索によって同定され得る。相同性検索ツールは、個々の核酸配列を入力として採用し得、または既知の関連配列の多重配列アラインメントから生成された統計モデルを使用し得る。プロファイル－ＨＭＭなどの統計モデル、および構造情報も取り込んだＲＮＡ共分散モデルは、より関連性が遠い配列を検索するときに役立つことができる。次いで、関連する個体または他の種からの配列のデータベースに対して、入力配列が整列される。次いで、マッチする塩基の数、およびアラインメントによって生じたギャップまたは欠失の数に基づいて、得られたアラインメントにスコアを与える。許容され得る保存的置換は、ＰＡＭおよびＢＬＯＳＵＭなどの置換行列を使用して同定され得る。高スコアのアラインメントは、相同配列に由来すると想定される。次いで、広範な系統学的範囲にわたって高度に類似する相同体を検出することによって、配列の保存が推測され得る。
必要に応じて、異なるＨＣＶ遺伝子型間での保存されたＨＣＶコア核酸配列は、各ＨＣＶ遺伝子型１～６に対して２０ヌクレオチドあたり最大２個のミスマッチを含む核酸配列である。
必要に応じて、異なるＨＣＶ遺伝子型間での保存されたＨＣＶコア核酸配列は、各ＨＣＶ遺伝子型１～６に対して同一である核酸配列である。
保存された配列を可視化するために、多重配列アラインメントを使用することができる。ＣＬＵＳＴＡＬフォーマットは、アラインメントの保存されたカラムに注釈を付すためのプレーンテキストキーを含んでおり、保存された配列（＊）、保存的変異（：）、半保存的変異（．）および非保存的変異（）を表す。多重配列アラインメントを行うために、ＭａｃＶｅｃｔｏｒなどのソフトウェアを使用することができる。
必要に応じて、核酸増幅プライマーが、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成すれば、核酸増幅プライマーはＨＣＶコア核酸配列に特異的にハイブリッド形成する。
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、塩濃度、イオン強度およびハイブリダイゼーション緩衝液組成などの条件によって影響される。一般的には、低ストリンジェンシー条件は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列に対する熱融解点（Ｔｍ）より約３０℃低いように選択される。中ストリンジェンシー条件は、温度がＴｍより２０℃低い場合であり、高ストリンジェンシー条件は、温度がＴｍより１０℃低い場合である。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全に一致したプライマーまたはプローブにハイブリッド形成する、所定のイオン強度およびｐＨ下での温度である。Ｔｍは、溶液条件および塩基組成およびプローブの長さに依存する。例えば、より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリッド形成する。ハイブリダイゼーションの最大速度は、Ｔｍを約１６℃～最大３２℃下回ると得られる。ハイブリダイゼーション溶液中の一価カチオンの存在は、２つの核酸鎖間の静電的反発を減少させ、それによってハイブリッド形成を促進する；この効果は、０．４Ｍまでのナトリウム濃度に対して見られる（より高い濃度では、この効果は無視され得る。）。ホルムアミドは、各パーセントのホルムアミドについて、ＤＮＡ－ＤＮＡおよびＤＮＡ－ＲＮＡ二本鎖の融解温度を０．６～０．７℃低下させ、５０％ホルムアミドの添加は、３０～４５℃でハイブリダイゼーションを実施することを可能にするが、ハイブリダイゼーションの速度は低下する。塩基対ミスマッチは、二本鎖のハイブリダイゼーション速度および熱安定性を低下させる。平均すると、大きなプローブでは、Ｔｍは％塩基ミスマッチ当たり約１℃減少する。Ｔｍは、ハイブリッドの種類に応じて、以下の式を使用して計算することができる。
１）ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッド（Ｍｅｉｎｋｏｔｈ ａｎｄ Ｗａｈｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：２６７－２８４，１９８４）：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６×ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］ａ＋０．４１×％［Ｇ／Ｃｂ］－５００×［Ｌｃ］－１－０．６１×％ホルムアミド；
２）ＤＮＡ－ＲＮＡまたはＲＮＡ－ＲＮＡハイブリッド：
Ｔｍ＝７９．８℃＋１８．５（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］ａ）＋０．５８（％Ｇ／Ｃｂ）＋１１．８（％Ｇ／Ｃｂ）２－８２０／Ｌｃ；
３）オリゴＤＮＡまたはオリゴＲＮＡハイブリッド：
２０ヌクレオチド未満の場合：Ｔｍ＝２（ｌｎ）；
２０～３５ヌクレオチドの場合：Ｔｍ＝２２＋１．４６（ｌｎ）；
ａまたは他の一価カチオンについては、０．０１～０．４Ｍの範囲でのみ正確。
ｂ３０％～７５％の範囲の％ＧＣに対してのみ正確。
ｃＬ＝塩基対中の二本鎖の長さ。
ｄオリゴ、オリゴヌクレオチド；１ｎ，＝プライマーの有効長＝２×（Ｇ／Ｃの数）＋（ＮＴの数）。
１）ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッド（Ｍｅｉｎｋｏｔｈ ａｎｄ Ｗａｈｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：２６７－２８４，１９８４）：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６×ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］ａ＋０．４１×％［Ｇ／Ｃｂ］－５００×［Ｌｃ］－１－０．６１×％ホルムアミド；
２）ＤＮＡ－ＲＮＡまたはＲＮＡ－ＲＮＡハイブリッド：
Ｔｍ＝７９．８℃＋１８．５（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］ａ）＋０．５８（％Ｇ／Ｃｂ）＋１１．８（％Ｇ／Ｃｂ）２－８２０／Ｌｃ；
３）オリゴＤＮＡまたはオリゴＲＮＡハイブリッド：
２０ヌクレオチド未満の場合：Ｔｍ＝２（ｌｎ）；
２０～３５ヌクレオチドの場合：Ｔｍ＝２２＋１．４６（ｌｎ）；
ａまたは他の一価カチオンについては、０．０１～０．４Ｍの範囲でのみ正確。
ｂ３０％～７５％の範囲の％ＧＣに対してのみ正確。
ｃＬ＝塩基対中の二本鎖の長さ。
ｄオリゴ、オリゴヌクレオチド；１ｎ，＝プライマーの有効長＝２×（Ｇ／Ｃの数）＋（ＮＴの数）。
ハイブリダイゼーション条件に加えて、ハイブリダイゼーションの特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後洗浄の機能にも依存する。非特異的ハイブリダイゼーションから生じるバックグラウンドを除去するために、試料は希塩溶液で洗浄される。このような洗浄の重要な要素には、最終的な洗浄溶液のイオン強度および温度が含まれる：塩濃度が低く、かつ洗浄温度が高いほど、洗浄のストリンジェンシーは高くなる。洗浄条件は、典型的には、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーでまたはそれを下回るストリンジェンシーで行われる。陽性のハイブリダイゼーションは、バックグラウンドのシグナルの少なくとも２倍のシグナルを与える。一般に、核酸ハイブリダイゼーションアッセイまたは遺伝子増幅検出手順に適したストリンジェントな条件は、上記の通りである。より高いまたはより低いストリンジェントな条件も選択され得る。当業者は、洗浄中に変更され得、ストリンジェンシー条件を維持または変更する様々なパラメータを承知している。
例えば、５０ヌクレオチドより長いＤＮＡハイブリッドに対する典型的なストリンジェントな条件（高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件とも呼ばれる）は、１×ＳＳＣ中６５℃でのまたは１×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミド中４２℃でのハイブリダイゼーション、その後０．３×ＳＳＣ中６５℃での洗浄を包含する。ハイブリッドの長さは、ハイブリッド形成する核酸に対する予想される長さである。公知の配列の核酸がハイブリッドを形成する場合、配列のアラインメントを行い、本明細書に記載されている保存された領域を同定することによって、ハイブリッド長が決定され得る。１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである；ハイブリダイゼーション溶液および洗浄溶液は、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔの試薬、０．５～１．０％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性断片化サケ精子ＤＮＡ、０．５％ピロリン酸ナトリウムをさらに含み得る。
ストリンジェンシーの水準を定義する目的で、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＣＳＨ，Ｎｅｗ ＹｏｒｋまたはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９年および毎年の更新版）を参照することができる。
必要に応じて、順方向核酸プライマーは、ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、を含む。
必要に応じて、逆方向核酸プライマーは、ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、を含む。
配列番号１の配列に対応する配列（プライマーＦ２、順方向プライマー）および配列番号２の配列の逆相補物に対応する配列（プライマーＲ１．２、逆方向プライマー）のＨＣＶコア領域中での位置を図２に示す。ＨＣＶ遺伝子型１～６に対するＨＣＶコア核酸配列の配列アラインメントが、配列番号１に対応する配列（プライマーＦ２）および配列番号２の逆相補物に対応する配列（プライマーＲ１．２）の位置とともに図３に示されている。
例えば、試料のＨＣＶコア核酸を逆転写し、順方向および逆方向核酸増幅プライマーを用いる等温核酸増幅反応によって逆転写の産物を増幅することによって、核酸は試料の核酸から誘導され得る。
必要に応じて、本発明の方法は、試料のＨＣＶ ＲＮＡを逆転写すること、ならびに順方向および逆方向核酸増幅プライマーを使用して等温増幅反応によって逆転写の産物を増幅することをさらに含む。
等温核酸増幅の任意の適切な方法が本発明の方法において使用され得る。等温核酸増幅のいくつかの適切な方法が当業者に公知である。必要に応じて、等温核酸増幅は、転写に基づく増幅である。そのような方法は、逆転写酵素（ＲＴ）、ＲＮアーゼＨおよびＲＮＡポリメラーゼ活性を使用したＲＮＡ鋳型の増幅を含み、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）および自家持続配列複製（３ＳＲ）を含む（ＣｈａｎおよびＦｏｘ，Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：１８５－１９６（１９９９）；Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：１８７４－１８７８（１９９０）；Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３５０：９１－９２（１９９１））。ＮＡＳＢＡおよび３ＳＲは、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）由来のＲＴ（ＲＮアーゼＨ活性も有する）、大腸菌由来のＲＮアーゼＨおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用する。ＴＭＡは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）ＲＴ（ＲＮアーゼＨ活性も有する）およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用する。
転写に基づく増幅法などの等温増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する増幅よりもいくつかの利点を有する。反応は単一の管内で同時に起こり、等温条件下で行われるため、サーモサイクラーは必要とされない。増幅反応はＰＣＲより速い（ＰＣＲでの、２０サイクル後における１×１０６倍の増幅と比較して、５サイクル後に１×１０９倍の増幅を認めることができる。）。ＤＮＡバックグラウンドは転写に基づく増幅を妨害しないので、これらの方法は二本鎖ＤＮＡ夾雑によって影響を受けない。増幅産物は一本鎖であり、鎖分離を必要とせずに検出することができる。
必要に応じて、逆方向核酸プライマーは、その５’末端に、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列をさらに含む。このようなプライマーは、逆転写のためにおよび転写に基づく等温増幅反応のために使用することができ、それによって逆転写および等温核酸増幅を実行するために必要とされるプライマーの数を最小限に抑えることができる。
例えば、プロモーター配列は、Ｔ７プロモーター配列：５’ ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ ３’（配列番号：６）、であり得る。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、このプロモーター配列中の下線が付されたＧにおいて転写を開始する。次いで、このポリメラーゼは、反対鎖を鋳型として使用して、５’→３’へ転写する。転写物中の第１の塩基はＧである。
例えば、Ｔ７プロモーター配列をその５’末端に有する逆方向核酸プライマーは、ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ（配列番号７）の核酸配列を含み得る。
本発明の方法における使用に適した転写に基づく等温増幅反応を、図４を参照しながら以下に記載する。
アンチセンスプライマー１は、プライマーが標的ＲＮＡに特異的にハイブリッド形成することができるように、標的ＲＮＡの一部に相補的な核酸配列（例えば、配列番号２、プライマーＲ１．２、逆方向プライマー）を含み、およびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列の一本鎖バージョン（例えば、配列番号７、Ｔ７プロモーター配列）をその５’末端に含む。プライマー１をＲＮＡ標的にアニーリングする。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ標的の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）コピーを合成するためにプライマー１を伸長する。ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖特異的リボヌクレアーゼは、ＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを消化する。センスプライマー２は、ｃＤＮＡの一部に相補的な核酸配列を含む。プライマー２は、プライマー１によって形成されたｃＤＮＡの部分の下流のｃＤＮＡにアニーリングする。プライマー２は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、一方の末端のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を通じて伸長する第２のＤＮＡ鎖を生成する（それによって二本鎖プロモーターを形成する）。このプロモーターは、元の標的配列に相補的な多数のＲＮＡを合成するためにＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって使用される。次いで、これらのＲＮＡ産物は、反応の循環相のための鋳型として機能するが、プライマーアニーリング工程は逆転している、すなわちプライマー２の後にプライマー１が続く。
この方法の変形例において、プライマー２は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列の一本鎖バージョンも含み得る。これは、元の標的配列と同じセンスを有するＲＮＡ（および元の標的配列に相補的なＲＮＡ）の産生をもたらす。
いくつかの従来の転写に基づく等温増幅反応では、ｃＤＮＡ合成のための鋳型として機能する前に５’末端で標的ＲＮＡを切断することが知られている。標的ＲＮＡの５’末端と重複し、隣接する領域に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（切断オリゴヌクレオチド）を付加することによって形成されたＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を切断するために、ＲＮアーゼＨ活性を有する酵素が用いられる。切断オリゴヌクレオチドは、伸長反応を防止するために、その３’末端ＯＨが適切に修飾されてもよい。本発明のいくつかの実施形態では、切断オリゴヌクレオチドを使用することができるが、本発明の方法は、切断オリゴヌクレオチドの非存在下で実施され、それによって増幅反応および必要とされる成分を単純化することが好ましい。
等温核酸増幅は、物資が限られた環境で容易に使用できるので有利である。このような方法は、物資が限られた環境では利用できないことがあり得るサーマルサイクラーの使用を必要としない。適切な方法の例は、国際公開第２００８／０９０３４０号およびＬｅｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０１０；２０１（Ｓ１）：Ｓ６５－Ｓ７１に記載されている。
ＲＮＡの逆転写を実施するための、および逆転写の生成物の等温増幅のための適切な試薬の例は、国際公開第２００８／０９０３４０号に示されており、例えば、以下の酵素活性が挙げられる：ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖特異的リボヌクレアーゼおよびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ。
必要とされる酵素活性に加えて、適切なヌクレオチド三リン酸（転写ベースの増幅のために、リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ、すなわちｒＡＴＰ、ｒＧＴＰ、ｒＣＴＰおよびｒＵＴＰ）およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ、すなわちｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）が必要である）、標的核酸の特異的増幅のための適切なプライマー、増幅反応を実施するための適切な緩衝液、および酵素活性によって必要とされる任意の必要な補因子（例えば、マグネシウムイオン）を提供することも必要であることが理解されよう。適切な緩衝液の例としては、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳまたは酢酸緩衝液が挙げられる。塩化カリウムまたは塩化ナトリウムなどの適切な塩が与えられ得る。これらの成分の適切な濃度は、当業者によって容易に決定され得る。適切なｒＮＴＰ濃度は、典型的には、０．２５～５ｍＭ、または０．５～２．５ｍＭの範囲である。適切なｄＮＴＰ濃度は、典型的には、０．２５～５ｍＭのｄＮＴＰまたは０．５～２．５ｍＭの範囲である。適切なマグネシウムイオン濃度は、典型的には５～１５ｍＭの範囲である。
いくつかの従来の転写に基づく増幅方法は、非常に大量のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、１４２またはそれを超える単位、ここで、１単位は、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ｒＮＴＰ、４００μＭ ［３Ｈ］－ＵＴＰ（３０ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅｓ）、２０μｇ／ｍｌ Ｔ７ ＤＮＡ、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１００μｌ反応体積、３７℃、１０分などの標準的アッセイ条件下において、３７℃で１時間に、１ｎｍｏｌｅの標識されたヌクレオチドを酸不溶性材料中に組み込む）を使用する。本発明の方法は、そのような従来の方法よりも有意に少ないＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して実施することができ、それによってコストを削減する。例えば、本発明の方法は、１４２単位未満、適切には１００単位未満または５０単位未満、例えば３０～４０単位のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）を使用して実施することができる。
必要に応じて、試料の核酸は、単離された核酸中に存在する試料のＨＣＶ ＲＮＡを逆転写する前に単離される。
核酸を単離するための多くの好適な方法が当業者に公知である。いくつかの方法は、細胞を溶解し、タンパク質を変性させるために、チオシアン酸グアニジニウムなどのカオトロピック剤および有機溶媒を使用する。例えば、Ｂｏｏｍら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９０，Ｖｏｌ．２８（３）：４９５－５０３）は、チオシアン酸グアニジニウムを含有する溶解／結合緩衝液の存在下で試料をシリカ粒子と接触させる方法を記載している。放出された核酸はシリカ粒子に結合し、次いで、シリカ粒子は、チオシアン酸グアニジニウムを含有する洗浄緩衝液で、次いでエタノール、次いでアセトンで洗浄される。続いて、結合した核酸は、水性低塩緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０）で溶出される。
いくつかの方法は、カオトロピック塩および有機溶媒の必要性を回避する。例えば、Ｈｏｕｒｆａｒら（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，５１（７）：１２１７－１２２２）は、プロテイナーゼＫの添加前に、コスモトロピック塩（硫酸アンモニウム）を含有する溶解／結合緩衝液の存在下で試料を磁性シリカ粒子と混合する方法を記載している。分離後に、プロテイナーゼＫを含む洗浄緩衝液で磁性粒子を洗浄し、８０℃の溶出緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８．５）で溶出する。他の適切な方法は、国際公開第２０１０／０１５８３５号に記載されている。
核酸の単離は、第１のｐＨで結合緩衝液の存在下で核酸を結合することができ、第２のｐＨで核酸をそこから溶出することができる固相とともに使用するための従来の結合緩衝液および／または溶出緩衝液を使用して実施され得る。
必要に応じて、固相は、周囲条件に従って電荷を変化させるイオン化可能な基を含む。イオン化可能な基のｐＫａは、固相に核酸を結合し、固相から核酸を放出することが望まれる条件に適している。一般に、核酸は、ｐＫａより低いまたは概ね等しいｐＨで固相に結合し、より高いｐＨ（通常、ｐＫａより上）で放出される。第１のｐＨで核酸を結合させ、第１のｐＨよりも高い第２のｐＨで結合した核酸を溶出するための適切な固相は、当業者に周知である。例えば、第１のｐＨでは、固相は正電荷を含み得、第２のｐＨでは、固相は、より少ない正電荷、中性電荷または負電荷を含み得る。これに代えてまたはこれに加えて、第１のｐＨでは、固相は中性電荷またはより少ない負電荷を含み得、第２のｐＨでは、固相は負電荷またはより多い負電荷を有し得る。このような電荷の変化は、核酸が第１のｐＨで固相に吸着され、第２のｐＨで放出されることを可能にする。
例えば、固相は、第１のｐＨと第２のｐＨの間にｐＫａを有する負にイオン化可能な基を含み得る。核酸は、固相が中性にまたはより少なく負に帯電されると固相に結合し、固相が負にまたはより多く負に帯電されると放出される。これに代えてまたはこれに加えて、固相は、第１のｐＨと第２のｐＨの間にｐＫａを有する正にイオン化可能な基を含み得る。核酸は、固相が正に帯電しているときに固相に結合し、固相が中性にまたはより少なく正に帯電していないときに放出される。
核酸の抽出のために使用され得る固相の例としては、無機酸化物、例えばシリカもしくはガラス（例えば、Ｂｏｏｍら、またはＨｏｕｒｆａｒらに記載されている）、または酸化アルミニウム、糖ポリマー、または電荷スイッチ材料（例えば、国際公開第０２／４８１６４号に記載されている）を含む固相が挙げられる。
固相は、例えば膜、ゲルまたは粒子、例えば磁性粒子を含む任意の適切な形態であり得る。シリカ膜またはゲル、および磁性シリカ粒子が好ましい例である。シリカ膜が特に好ましい。これは、（例えば、Ｈｏｕｒｆａｒらによって使用されている）磁性シリカ粒子より安価であり、磁性シリカ粒子とは異なり、冷蔵貯蔵を必要としない。
固相は、コスモトロピック剤の存在によって核酸の結合が増強される固相であり得る。必要に応じて、固相への核酸の結合は、コスモトロピック剤の存在下で行われてもよい。そのような剤は、シリカをベースとする固相などの固相への核酸の結合を増強することが知られている。
「カオトロピック」および「コスモトロピック」剤という用語は、高分子および水の構造への影響に応じてこれらの剤を分けるホフマイスター系列（Ｃａｃａｃｅら、Ｑ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ １９９７；３０：２４１－７７）に由来する。カオトロープは、溶媒構造を破壊する物質として定義され得、コスモトロープは、溶媒構造を増強する物質として定義され得る。Ｃａｃａｃｅらの図１は、ホフマイスター系列およびタンパク質の構造／機能に影響を及ぼす一般的に存在する有機溶質を示す。カオトロピック剤の例は当業者に公知であり、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジニウムおよびグアニジニウム塩酸塩が挙げられる。コスモトロピック剤の例は当業者に公知であり、硫酸アンモニウムおよび塩化リチウムが挙げられる。
必要に応じて、溶解は、結合緩衝液を用いて行われる。細胞溶解のために使用され得る結合緩衝液は、当業者に公知である。Ｂｏｏｍらによって使用された溶解緩衝液は、チオシアン酸グアニジニウム、Ｔｒｉｓ塩酸、ｐＨ ６．４、ＥＤＴＡ（ｐＨ ８に調整される）およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む。必要に応じて、溶解緩衝液はカオトロピック剤を含まない。例えば、コスモトロピック剤を含む溶解／結合緩衝液が使用され得る。必要に応じて、緩衝液は酸性緩衝液、適切には３～５の範囲のｐＫａ（２５℃）を有する強酸性緩衝液である。
必要に応じて、本発明の方法は、等温増幅反応の生成物の核酸を核酸捕捉プローブにハイブリッド形成させることによって前記等温増幅反応の生成物を捕捉することをさらに含み、前記捕捉プローブは、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に特異的にハイブリッド形成する。
必要に応じて、捕捉プローブが、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成すれば、捕捉プローブはＨＣＶコア核酸配列に特異的にハイブリッド形成する。
必要に応じて、捕捉プローブは、ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む。
必要に応じて、本発明の方法は、等温増幅反応の生成物を核酸検出プローブにハイブリッド形成させることによって前記等温増幅反応の生成物を検出することをさらに含み、前記検出プローブが、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に特異的にハイブリッド形成する。
必要に応じて、検出プローブが、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成すれば、検出プローブはＨＣＶコア核酸配列に特異的にハイブリッド形成する。
必要に応じて、検出プローブは、ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む。
配列番号３（プローブＣＰ２、捕捉プローブ）および配列番号４（プローブＤＰ２、検出プローブ）の配列に対応する配列のＨＣＶコア領域内の位置が図２に示されている。ＨＣＶ遺伝子型１～６に対するＨＣＶコア核酸配列の配列アラインメントが、配列番号３（捕捉プローブ２）および配列番号４（検出プローブ）に対応する配列の位置とともに図３に示されている。
例えば、捕捉プローブおよび検出プローブが、等温増幅反応中に存在する他の核酸（すなわち、コア領域外のＨＣＶ核酸を含む非ＨＣＶコア核酸）に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド形成しなければ、捕捉プローブおよび検出プローブはＨＣＶコア核酸配列に特異的にハイブリッド形成する。
核酸配列間の配列同一性は、配列のアラインメントを比較することによって決定することができる。比較される配列中の等価な位置が同じヌクレオチドによって占められている場合に、分子はその位置において同一である。同一性のパーセンテージとしてアラインメントをスコア化することは、比較される配列によって共有される位置における同一のヌクレオチドの数の関数である。配列を比較する場合、最適なアラインメントでは、配列への挿入および欠失の可能性を考慮に入れて、配列の１つまたはそれより多くへとギャップを導入することが必要な場合がある。比較されている配列中の同一分子の同じ数について、２つの比較された配列間のより高い関連性を反映する可能な限り少ないギャップを有する配列アラインメントが、多くのギャップを有する配列アラインメントより高いスコアを達成するように、配列比較方法は、ギャップペナルティを使用し得る。最大パーセント同一性の計算は、ギャップペナルティを考慮に入れた、最適なアライメントの生成を含む。
配列比較を実行するための適切なコンピュータプログラムは、商業および公共部門で広く利用可能である。例としては、ＭａｔＧａｔ（Ｃａｍｐａｎｅｌｌａら、２００３、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ４：２９；ｈｔｔｐ：／／ｂｉｔｉｎｃｋａ．ｃｏｍ／ｌｅｄｉｏｎ／ｍａｔｇａｔから入手可能なプログラム）、Ｇａｐ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｆａｓｔａから入手可能なプログラム）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ ２．０およびＸ ２．０（Ｌａｒｋｉｎら、２００７，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３：２９４７－２９４８；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２から入手可能なプログラム）ならびにＥＭＢＯＳＳ Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，上掲；Ｋｒｕｓｋａｌ，１９８３，Ｉｎ：Ｔｉｍｅ ｗａｒｐｓ，ｓｔｒｉｎｇ ｅｄｉｔｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，Ｓａｎｋｏｆｆ＆Ｋｒｕｓｋａｌ（ｅｄｓ），ｐｐ １－４４，Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎから入手可能なプログラム）が挙げられる。すべてのプログラムは、デフォルトパラメータを使用して実行され得る。
例えば、配列比較は、ＥＭＢＯＳＳ Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓの「ｎｅｅｄｌｅ」法を使用して行うことができ、この方法では、２つの配列の全長にわたって検討する場合に、２つの配列の最適なアラインメント（ギャップを含む）を決定し、パーセント同一性スコアを提供する。
必要に応じて、検出プローブは、視覚的に検出され得る標識（すなわち、計測手段を使用せずに視覚的に検出され得る標識）で標識される。適切な視覚的に検出され得る標識の例としては、コロイド状金属ゾル粒子、ラテックス粒子または織物染料（ｔｅｘｔｉｌｅ
ｄｙｅ）粒子が挙げられる。コロイド状金属ゾル粒子の例は、コロイド状金粒子である。
ｄｙｅ）粒子が挙げられる。コロイド状金属ゾル粒子の例は、コロイド状金粒子である。
等温核酸増幅の生成物は、視覚的に検出され得る標識で標識され、例えば国際公開第２００８／０９０３４０号およびＬｅｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ
Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０１０；２０１（Ｓ１）：Ｓ６５－Ｓ７１に記載されているように、クロマトグラフィー試験片を使用して捕捉および検出され得る。
Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０１０；２０１（Ｓ１）：Ｓ６５－Ｓ７１に記載されているように、クロマトグラフィー試験片を使用して捕捉および検出され得る。
必要に応じて、試料は液体試料である。必要に応じて、試料は、ＨＣＶに感染している疑いのある対象から得られた生物学的試料、例えば液体生物学的試料である。必要に応じて、試料は、ＨＣＶに感染している疑いのある対象から得られた血液または血漿試料である。
必要に応じて、本発明の方法はインビトロ方法である。
本発明の方法は、ＨＣＶ感染に関してスクリーニングするためのＰＯＣ検査として特に有用である。特に、本発明の方法は、検査室設備やサーマルサイクラーを使用せずに迅速に実施することができる。ＨＣＶ感染は、感染の１～２週間以内に検出することができる。対象がＨＣＶに感染していると同定されたら、対象に適切な処置を施すことができ、感染を監視することができる。適切であれば、どのＨＣＶ遺伝子型が感染の原因であるかを決定するために、対象を再度検査し、次いで、その遺伝子型に適した処置を施すことができる。
本発明によれば、試料がＨＣＶ核酸を含むかどうかを決定するためのキットであって、
等温増幅反応によって鋳型核酸を増幅するための順方向核酸増幅プライマーおよび逆方向核酸増幅プライマーであって、各核酸増幅プライマーは、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する、順方向核酸増幅プライマーおよび逆方向核酸増幅プライマーと；
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸捕捉プローブと；ならびに／または
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸検出プローブであって、必要に応じて、等温核酸増幅の生成物を標識するための視覚的に検出され得る標識を含む、核酸検出プローブと；
を含む、キットも提供される。
等温増幅反応によって鋳型核酸を増幅するための順方向核酸増幅プライマーおよび逆方向核酸増幅プライマーであって、各核酸増幅プライマーは、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する、順方向核酸増幅プライマーおよび逆方向核酸増幅プライマーと；
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸捕捉プローブと；ならびに／または
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸検出プローブであって、必要に応じて、等温核酸増幅の生成物を標識するための視覚的に検出され得る標識を含む、核酸検出プローブと；
を含む、キットも提供される。
必要に応じて、順方向核酸プライマーは、ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、を含む。
必要に応じて、逆方向核酸プライマーは、ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、を含む。
必要に応じて、捕捉プローブは、ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む。
必要に応じて、検出プローブは、ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む。
必要に応じて、本発明のキットは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖特異的リボヌクレアーゼおよびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをさらに含む。
必要に応じて、本発明のキットは、適切なヌクレオチド三リン酸（転写ベースの増幅のために、リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ、すなわちｒＡＴＰ、ｒＧＴＰ、ｒＣＴＰおよびｒＵＴＰ）およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ、すなわちｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）が必要とされる）、増幅反応を実施するための適切な緩衝液、および酵素活性によって必要とされる任意の必要な補因子（例えばマグネシウムイオン）をさらに含む。適切な緩衝液の例としては、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳまたは酢酸緩衝液が挙げられる。塩化カリウムまたは塩化ナトリウムなどの適切な塩が与えられ得る。これらの成分の適切な濃度は、当業者によって容易に決定され得る。適切なｒＮＴＰ濃度は、典型的には、０．２５～５ｍＭ、または０．５～２．５ｍＭの範囲である。適切なｄＮＴＰ濃度は、典型的には、０．２５～５ｍＭのｄＮＴＰまたは０．５～２．５ｍＭの範囲である。適切なマグネシウムイオン濃度は、典型的には５～１５ｍＭの範囲である。
本発明のキットは、等温核酸増幅の生成物を標識するための視覚的に検出され得る標識および／またはクロマトグラフィー試験片、ならびに等温核酸増幅の生成物を捕捉および検出するための試薬をさらに含み得る。適切な標識、試験片および試薬、ならびに単純な増幅ベースのアッセイ（ＳＡＭＢＡ）による等温核酸増幅の生成物を捕捉および検出するための方法は、国際公開第２００８／０９０３４０号およびＬｅｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０１０；２０１（Ｓ１）：Ｓ６５－Ｓ７１に記載されている。
本発明のキットは、例えば上記の核酸抽出の方法を使用して、試料から核酸を単離するための試薬をさらに含み得る。核酸を抽出するための適切な試薬は、試料中に存在する細胞を溶解するための溶解緩衝液と、核酸を結合するための固相と、核酸を固相に結合させるための結合緩衝液（必要に応じて、溶解緩衝液は結合緩衝液と同一である）とを含み得、固相に結合された核酸を洗浄するための洗浄緩衝液と、固相から核酸を溶出するための溶出緩衝液とを必要に応じて含み得る。適切な溶解、洗浄および溶出緩衝液、ならびにこれらの緩衝液とともに使用するための適切な固相が上記されている。
本発明のキットは、以下の追加の構成要素のいずれをもさらに含み得る：指穿刺または踵穿刺によって対象から全血の試料を得るためのランセット；対象から血液の試料を採取するための血液採取器；陽性および／または陰性対照；キットを使用して本発明の試験方法を実施するための指示。
本発明によれば、等温核酸増幅反応によってＨＣＶ核酸を増幅するためのプライマーの組であって、順方向核酸増幅プライマーと逆方向核酸増幅プライマーとを含み、各核酸増幅プライマーは、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に特異的にハイブリッド形成する、プライマーの組も提供される。
必要に応じて、プライマーの組は、ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、を含む。
必要に応じて、プライマーの組は、ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、を含む。
必要に応じて、順方向核酸プライマーおよび／または逆方向核酸プライマーは最大５０ヌクレオチド長である。
本発明によれば、等温増幅反応によってＨＣＶ核酸を増幅するための、ならびに増幅反応の生成物を捕捉および／または検出するためのオリゴヌクレオチドの組であって、
本発明のプライマーの組と；
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸捕捉プローブと；ならびに／または
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸検出プローブと；
を含む、オリゴヌクレオチドの組も提供される。
本発明のプライマーの組と；
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸捕捉プローブと；ならびに／または
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸検出プローブと；
を含む、オリゴヌクレオチドの組も提供される。
必要に応じて、オリゴヌクレオチドの組は、ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、を含む。
必要に応じて、オリゴヌクレオチドの組は、ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、を含む。
必要に応じて、オリゴヌクレオチドの組は、ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む。
必要に応じて、オリゴヌクレオチドの組は、ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む。
必要に応じて、捕捉および／または検出プローブは最大５０ヌクレオチド長である。
本発明によれば、
核酸配列：ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）、もしくはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物を含むもしくはそれからなる核酸配列；
核酸配列：ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）、もしくはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物を含むもしくはそれからなる核酸配列；
核酸配列ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）、もしくはその全長に沿って配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物を含むもしくはそれからなる核酸配列；または
核酸配列ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）、もしくはその全長に沿って配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物を含むもしくはそれからなる核酸配列；
を含むオリゴヌクレオチドも提供される。
核酸配列：ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）、もしくはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物を含むもしくはそれからなる核酸配列；
核酸配列：ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）、もしくはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物を含むもしくはそれからなる核酸配列；
核酸配列ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）、もしくはその全長に沿って配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物を含むもしくはそれからなる核酸配列；または
核酸配列ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）、もしくはその全長に沿って配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物を含むもしくはそれからなる核酸配列；
を含むオリゴヌクレオチドも提供される。
本発明のプライマーの組、オリゴヌクレオチドの組またはオリゴヌクレオチドは、本発明のキットにおいてまたは本発明の方法において使用され得る。
本発明の、または本発明のプライマーもしくはオリゴヌクレオチドの組の、または本発明のキットの、または本発明の方法において使用するための、プライマー、プローブまたはオリゴヌクレオチドは、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチドの長さ、または５０ヌクレオチドを超える長さであり得る。
本発明の、または本発明のプライマーもしくはオリゴヌクレオチドの組の、または本発明のキットの、または本発明の方法において使用するための、プライマー、プローブまたはオリゴヌクレオチドは、最大２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、または１００ヌクレオチドの長さであり得る。
核酸配列：ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）を含む、本発明の、または本発明のプライマーもしくはオリゴヌクレオチドの組の、または本発明のキットの、または本発明の方法において使用するための、プライマーまたはオリゴヌクレオチドは、最大１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さであり得る。
核酸配列：ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の相補物を含む、本発明の、または本発明のプライマーもしくはオリゴヌクレオチドの組の、または本発明のキットの、または本発明の方法において使用するためのオリゴヌクレオチドは、最大１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さであり得る。
核酸配列：GCTCATGATGCACGGTCTACGAGA（配列番号２）を含む、本発明の、または本発明のプライマーもしくはオリゴヌクレオチドの組の、または本発明のキットの、または本発明の方法において使用するための、プライマーまたはオリゴヌクレオチドは、最大２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さであり得る。
核酸配列：GCTCATGATGCACGGTCTACGAGA（配列番号２）の相補物を含む、本発明の、または本発明のプライマーもしくはオリゴヌクレオチドの組の、または本発明のキットの、または本発明の方法において使用するためのオリゴヌクレオチドは、最大２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さであり得る。
核酸配列：ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）を含む、本発明の、または本発明のプライマーもしくはオリゴヌクレオチドの組の、または本発明のキットの、または本発明の方法において使用するための、プローブまたはオリゴヌクレオチドは、最大２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さであり得る。
核酸配列：ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）の相補物を含む、本発明の、または本発明のプライマーもしくはオリゴヌクレオチドの組の、または本発明のキットの、または本発明の方法において使用するための、プローブまたはオリゴヌクレオチドは、最大２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さであり得る。
核酸配列：TGATAGGGTGCTTGCGAGTG（配列番号４）を含む、本発明の、または本発明のプライマーもしくはオリゴヌクレオチドの組の、または本発明のキットの、または本発明の方法において使用するための、プローブまたはオリゴヌクレオチドは、最大２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さであり得る。
核酸配列：TGATAGGGTGCTTGCGAGTG（配列番号４）の相補物を含む、本発明の、または本発明のプライマーもしくはオリゴヌクレオチドの組の、または本発明のキットの、または本発明の方法において使用するための、プローブまたはオリゴヌクレオチドは、最大２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さであり得る。
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１～４もしくは７のいずれかのヌクレオチド配列と、その全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であり、もしくは１００％同一である配列またはその相補物を含むまたはそれからなるヌクレオチド配列を含み得る。
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号７のヌクレオチド配列と、その全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であり、もしくは１００％同一である配列またはその相補物を含むまたはそれからなるヌクレオチド配列を含み得る。
オリゴヌクレオチドは、例えば、視覚的に検出され得る標識で標識され得る。特に、ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含むまたはそれからなるオリゴヌクレオチドは、視覚的に検出され得る標識で標識され得る。視覚的に検出され得る標識の例としては、コロイド状金属ゾル粒子、ラテックス粒子または織物染料粒子が挙げられる。コロイド状金属ゾル粒子の例は、コロイド状金粒子である。
本発明のプライマーまたはオリゴヌクレオチドの組は、本発明のオリゴヌクレオチドを含み得る。
本発明のキットは、本発明の、プライマーの組、オリゴヌクレオチドの組またはオリゴヌクレオチドを含み得る。
本発明によれば、本発明の方法における、本発明の、プライマーの組、オリゴヌクレオチドの組またはオリゴヌクレオチドの使用も提供される。
本発明の実施形態は、添付の図面を参照しながら、単なる例として以下に説明される。
ＨＣＶ遺伝子型１～６を検出するための臨床現場即時（ＰＯＣ）核酸検査
ＨＣＶウイルスＲＮＡを抽出し、逆転写し、等温核酸増幅によって増幅し、Ｌｅｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０１０；２０１（Ｓ１）：Ｓ６５－Ｓ７１に記載されている方法と同様の単純な増幅ベースのアッセイ（ＳＡＭＢＡ）法を用いて、ディップスティックを用いた迅速な目視検出によって増幅生成物を検出した。
ＨＣＶウイルスＲＮＡを抽出し、逆転写し、等温核酸増幅によって増幅し、Ｌｅｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０１０；２０１（Ｓ１）：Ｓ６５－Ｓ７１に記載されている方法と同様の単純な増幅ベースのアッセイ（ＳＡＭＢＡ）法を用いて、ディップスティックを用いた迅速な目視検出によって増幅生成物を検出した。
簡潔には、逆方向核酸増幅プライマーは、プライマーが標的ＲＮＡに特異的にハイブリッド形成することができるように、ＨＣＶ標的ＲＮＡの一部に相補的な核酸配列を含み、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列の一本鎖バージョンをその５’末端に含む。逆方向プライマーはＲＮＡ標的にハイブリッド形成する。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、逆方向プライマーを伸長してＲＮＡ標的の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）コピーを合成する。ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖特異的リボヌクレアーゼは、ＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを消化する。順方向核酸増幅プライマーは、ｃＤＮＡの一部に相補的な核酸配列を含む。順方向プライマーは、逆方向プライマーによって形成されたｃＤＮＡの部分の下流のｃＤＮＡにハイブリッド形成する。順方向プライマーは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、一方の末端のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を通じて伸長する第２のＤＮＡ鎖を生成する（それによって二本鎖プロモーターを形成する）。このプロモーターは、元の標的配列に相補的な多数のＲＮＡを合成するためにＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって使用される。次いで、これらのＲＮＡ産物は、反応の循環相のための鋳型として機能するが、プライマーハイブリッド形成工程は逆転している、すなわち順方向プライマーの後に逆方向プライマーが続く。
遺伝子型１～６のＨＣＶ核酸の等温増幅のために、以下のプライマー配列を使用した：
ＨＣＶプライマーＦ２（順方向プライマー）：
ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）；
ＨＣＶプライマーＲＥＶ１．２（逆方向プライマー）／Ｔ７プロモーター：
ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ（配列番号：７）。
ＨＣＶプライマーＦ２（順方向プライマー）：
ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）；
ＨＣＶプライマーＲＥＶ１．２（逆方向プライマー）／Ｔ７プロモーター：
ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ（配列番号：７）。
以下の捕捉および検出プローブを使用して増幅産物を捕捉および検出した：
ＨＣＶプローブＣＰ２（捕捉プローブ）：
ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）；
ＨＣＶプローブＤＰ２（検出プローブ）：
ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）。
ＨＣＶプローブＣＰ２（捕捉プローブ）：
ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）；
ＨＣＶプローブＤＰ２（検出プローブ）：
ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）。
６つのＨＣＶ遺伝子型のそれぞれについて少なくとも３つの異なる試料に対してＨＣＶプライマー／プローブを試験した。結果を図５に記録する。ＨＣＶ遺伝子型１～６が効率的に検出された。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
試料がＨＣＶ核酸を含むかどうかを決定する方法であって、順方向核酸増幅プライマーおよび逆方向核酸増幅プライマーを使用する等温増幅反応によって、前記試料の核酸を増幅すること、または前記試料の核酸に由来する核酸を増幅することを含み、各核酸増幅プライマーは、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に特異的にハイブリッド形成する、方法。
（項目２）
前記順方向核酸プライマーが、ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記逆方向核酸プライマーが、ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記試料のＨＣＶ ＲＮＡを逆転写することと、前記順方向および逆方向核酸増幅プライマーを使用する等温増幅反応によって前記逆転写の産物を増幅することと、をさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記逆方向核酸プライマーが、その５’末端にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列をさらに含み、逆転写が前記逆方向核酸プライマーを用いて行われる、項目５に記載の方法。
（項目６）
単離された前記核酸中に存在する前記試料のＨＣＶ ＲＮＡを逆転写する前に、前記試料の核酸を単離することをさらに含む、項目４または５に記載の方法。
（項目７）
前記等温増幅反応の生成物の核酸を核酸捕捉プローブにハイブリッド形成させることによって前記等温増幅反応の生成物を捕捉することをさらに含み、前記捕捉プローブは、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に特異的にハイブリッド形成する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記捕捉プローブが、ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記等温増幅反応の生成物を核酸検出プローブとハイブリッド形成させることによって前記等温増幅反応の生成物を検出することをさらに含み、前記検出プローブが、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に特異的にハイブリッド形成する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記検出プローブが、ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記検出プローブが、視覚的に検出され得る標識で標識されている、項目９または１０に記載の方法。
（項目１２）
前記等温増幅反応の前記生成物の捕捉および／または検出がクロマトグラフィーディップスティックアッセイによって行われる、項目７～１１のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記試料が、ＨＣＶに感染している疑いのある対象から得られた生物学的試料である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
前記試料が、ＨＣＶに感染している疑いのある対象から得られた血液または血漿試料である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
インビトロ法である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
試料がＨＣＶ核酸を含むかどうかを決定するためのキットであって、
等温増幅反応によって鋳型核酸を増幅するための、順方向核酸増幅プライマーおよび逆方向核酸増幅プライマーであって、各核酸増幅プライマーは、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する、順方向核酸増幅プライマーおよび逆方向核酸増幅プライマーと；
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸捕捉プローブと；ならびに／または
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸検出プローブであって、前記等温核酸増幅の生成物を標識するための視覚的に検出され得る標識を必要に応じて含む、核酸検出プローブと；
を含む、キット。
（項目１７）
前記順方向核酸プライマーが、ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、項目１６に記載のキット。
（項目１８）
前記逆方向核酸プライマーが、ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、項目１６または１７に記載のキット。
（項目１９）
前記捕捉プローブが、ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む、項目１６～１８のいずれかに記載のキット。
（項目２０）
前記検出プローブが、ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む、項目１６～１９のいずれかに記載のキット。
（項目２１）
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖特異的リボヌクレアーゼおよびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをさらに含む、項目１６～２０のいずれかに記載のキット。
（項目２２）
指穿刺または踵穿刺によって対象から全血の試料を得るためのランセットをさらに含む、項目１６～２１のいずれかに記載のキット。
（項目２３）
対象から血液の試料を採取するための血液採取器をさらに含む、項目１６～２２のいずれかに記載のキット。
（項目２４）
前記等温核酸増幅の生成物を捕捉および検出するためのクロマトグラフィー試験片をさらに含む、項目１６～２３のいずれかに記載のキット。
（項目２５）
血液または血漿試料から核酸を抽出するための、溶解／結合緩衝液と、溶出緩衝液と、および必要に応じて洗浄緩衝液とをさらに含む、項目１６～２４のいずれかに記載のキット。
（項目２６）
等温核酸増幅反応によってＨＣＶ核酸を増幅するためのプライマーの組であって、順方向核酸増幅プライマーと逆方向核酸増幅プライマーとを含み、各核酸増幅プライマーは、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に特異的にハイブリッド形成する、プライマーの組。
（項目２７）
前記順方向核酸プライマーが、ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、項目２６に記載のプライマーの組。
（項目２８）
前記逆方向核酸プライマーが、ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、項目２６または２７に記載のプライマーの組。
（項目２９）
前記順方向および／または前記逆方向核酸プライマーが最大５０ヌクレオチド長である、項目２６～２８のいずれかに記載のプライマーの組。
（項目３０）
等温核酸増幅反応によってＨＣＶ核酸を増幅するための、ならびに前記増幅反応の生成物を捕捉および／または検出するためのオリゴヌクレオチドの組であって、
項目２６～２９のいずれかに記載のプライマーの組と；
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸捕捉プローブと；および／または
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸検出プローブと；
を含む、オリゴヌクレオチドの組。
（項目３１）
前記順方向核酸プライマーが、ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、項目３０に記載のオリゴヌクレオチドの組。
（項目３２）
前記逆方向核酸プライマーが、ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、項目３０または３１に記載のオリゴヌクレオチドの組。
（項目３３）
前記捕捉プローブが、ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む、項目３０～３２のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組。
（項目３４）
前記検出プローブが、ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む、項目３０～３３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組。
（項目３５）
前記捕捉および／または検出プローブが最大５０ヌクレオチド長である、項目３０～３４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組。
（項目３６）
オリゴヌクレオチドであって、
ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物；
ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物；
ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物；または
ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物；
を含む、オリゴヌクレオチド。
（項目３７）
最大２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチド長である、項目３６に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３８）
項目２６～２９のいずれかに記載のプライマーの組、項目３０～３５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組、または項目３６もしくは３７に記載のオリゴヌクレオチドを含む、項目１６～２５のいずれかに記載のキット。
（項目３９）
項目１～１５のいずれかに記載の方法における、項目２６～２９のいずれかに記載のプライマーの組、項目３０～３５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組、または項目３６もしくは３７に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
試料がＨＣＶ核酸を含むかどうかを決定する方法であって、順方向核酸増幅プライマーおよび逆方向核酸増幅プライマーを使用する等温増幅反応によって、前記試料の核酸を増幅すること、または前記試料の核酸に由来する核酸を増幅することを含み、各核酸増幅プライマーは、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に特異的にハイブリッド形成する、方法。
（項目２）
前記順方向核酸プライマーが、ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記逆方向核酸プライマーが、ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記試料のＨＣＶ ＲＮＡを逆転写することと、前記順方向および逆方向核酸増幅プライマーを使用する等温増幅反応によって前記逆転写の産物を増幅することと、をさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記逆方向核酸プライマーが、その５’末端にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列をさらに含み、逆転写が前記逆方向核酸プライマーを用いて行われる、項目５に記載の方法。
（項目６）
単離された前記核酸中に存在する前記試料のＨＣＶ ＲＮＡを逆転写する前に、前記試料の核酸を単離することをさらに含む、項目４または５に記載の方法。
（項目７）
前記等温増幅反応の生成物の核酸を核酸捕捉プローブにハイブリッド形成させることによって前記等温増幅反応の生成物を捕捉することをさらに含み、前記捕捉プローブは、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に特異的にハイブリッド形成する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記捕捉プローブが、ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記等温増幅反応の生成物を核酸検出プローブとハイブリッド形成させることによって前記等温増幅反応の生成物を検出することをさらに含み、前記検出プローブが、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に特異的にハイブリッド形成する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記検出プローブが、ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記検出プローブが、視覚的に検出され得る標識で標識されている、項目９または１０に記載の方法。
（項目１２）
前記等温増幅反応の前記生成物の捕捉および／または検出がクロマトグラフィーディップスティックアッセイによって行われる、項目７～１１のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記試料が、ＨＣＶに感染している疑いのある対象から得られた生物学的試料である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
前記試料が、ＨＣＶに感染している疑いのある対象から得られた血液または血漿試料である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
インビトロ法である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
試料がＨＣＶ核酸を含むかどうかを決定するためのキットであって、
等温増幅反応によって鋳型核酸を増幅するための、順方向核酸増幅プライマーおよび逆方向核酸増幅プライマーであって、各核酸増幅プライマーは、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する、順方向核酸増幅プライマーおよび逆方向核酸増幅プライマーと；
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸捕捉プローブと；ならびに／または
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸検出プローブであって、前記等温核酸増幅の生成物を標識するための視覚的に検出され得る標識を必要に応じて含む、核酸検出プローブと；
を含む、キット。
（項目１７）
前記順方向核酸プライマーが、ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、項目１６に記載のキット。
（項目１８）
前記逆方向核酸プライマーが、ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、項目１６または１７に記載のキット。
（項目１９）
前記捕捉プローブが、ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む、項目１６～１８のいずれかに記載のキット。
（項目２０）
前記検出プローブが、ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む、項目１６～１９のいずれかに記載のキット。
（項目２１）
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖特異的リボヌクレアーゼおよびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをさらに含む、項目１６～２０のいずれかに記載のキット。
（項目２２）
指穿刺または踵穿刺によって対象から全血の試料を得るためのランセットをさらに含む、項目１６～２１のいずれかに記載のキット。
（項目２３）
対象から血液の試料を採取するための血液採取器をさらに含む、項目１６～２２のいずれかに記載のキット。
（項目２４）
前記等温核酸増幅の生成物を捕捉および検出するためのクロマトグラフィー試験片をさらに含む、項目１６～２３のいずれかに記載のキット。
（項目２５）
血液または血漿試料から核酸を抽出するための、溶解／結合緩衝液と、溶出緩衝液と、および必要に応じて洗浄緩衝液とをさらに含む、項目１６～２４のいずれかに記載のキット。
（項目２６）
等温核酸増幅反応によってＨＣＶ核酸を増幅するためのプライマーの組であって、順方向核酸増幅プライマーと逆方向核酸増幅プライマーとを含み、各核酸増幅プライマーは、少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列またはその相補物に特異的にハイブリッド形成する、プライマーの組。
（項目２７）
前記順方向核酸プライマーが、ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、項目２６に記載のプライマーの組。
（項目２８）
前記逆方向核酸プライマーが、ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、項目２６または２７に記載のプライマーの組。
（項目２９）
前記順方向および／または前記逆方向核酸プライマーが最大５０ヌクレオチド長である、項目２６～２８のいずれかに記載のプライマーの組。
（項目３０）
等温核酸増幅反応によってＨＣＶ核酸を増幅するための、ならびに前記増幅反応の生成物を捕捉および／または検出するためのオリゴヌクレオチドの組であって、
項目２６～２９のいずれかに記載のプライマーの組と；
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸捕捉プローブと；および／または
少なくともＨＣＶ遺伝子型１～６の間で保存されているＨＣＶコア核酸配列もしくはその相補物に特異的にハイブリッド形成する核酸検出プローブと；
を含む、オリゴヌクレオチドの組。
（項目３１）
前記順方向核酸プライマーが、ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、項目３０に記載のオリゴヌクレオチドの組。
（項目３２）
前記逆方向核酸プライマーが、ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）の核酸配列、またはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、項目３０または３１に記載のオリゴヌクレオチドの組。
（項目３３）
前記捕捉プローブが、ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む、項目３０～３２のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組。
（項目３４）
前記検出プローブが、ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、またはこれらの相補物を含む、項目３０～３３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組。
（項目３５）
前記捕捉および／または検出プローブが最大５０ヌクレオチド長である、項目３０～３４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組。
（項目３６）
オリゴヌクレオチドであって、
ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号１）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物；
ＧＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ（配列番号２）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物；
ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴ（配列番号３）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号３の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物；または
ＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧ（配列番号４）の核酸配列、もしくはその全長に沿って配列番号４の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、もしくはこれらの相補物；
を含む、オリゴヌクレオチド。
（項目３７）
最大２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチド長である、項目３６に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３８）
項目２６～２９のいずれかに記載のプライマーの組、項目３０～３５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組、または項目３６もしくは３７に記載のオリゴヌクレオチドを含む、項目１６～２５のいずれかに記載のキット。
（項目３９）
項目１～１５のいずれかに記載の方法における、項目２６～２９のいずれかに記載のプライマーの組、項目３０～３５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの組、または項目３６もしくは３７に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
Claims (1)
- 明細書に記載の発明。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB1819726.9A GB201819726D0 (en) | 2018-12-03 | 2018-12-03 | HCV detection |
| GB1819726.9 | 2018-12-03 | ||
| PCT/US2019/064182 WO2020117769A1 (en) | 2018-12-03 | 2019-12-03 | Hcv detection |
| JP2021531551A JP2022513704A (ja) | 2018-12-03 | 2019-12-03 | Ｈｃｖ検出 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021531551A Division JP2022513704A (ja) | 2018-12-03 | 2019-12-03 | Ｈｃｖ検出 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2024105718A true JP2024105718A (ja) | 2024-08-06 |
Family
ID=65024723
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021531551A Pending JP2022513704A (ja) | 2018-12-03 | 2019-12-03 | Ｈｃｖ検出 |
| JP2024085494A Pending JP2024105718A (ja) | 2018-12-03 | 2024-05-27 | Ｈｃｖ検出 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021531551A Pending JP2022513704A (ja) | 2018-12-03 | 2019-12-03 | Ｈｃｖ検出 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220074004A1 (ja) |
| EP (1) | EP3891308A1 (ja) |
| JP (2) | JP2022513704A (ja) |
| CN (1) | CN113614251A (ja) |
| AU (1) | AU2019392450A1 (ja) |
| GB (1) | GB201819726D0 (ja) |
| WO (1) | WO2020117769A1 (ja) |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2198514T3 (es) * | 1991-08-27 | 2004-02-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Cebadores y sondas para la deteccion de la hepatitis c. |
| US6201166B1 (en) * | 1996-07-24 | 2001-03-13 | Tokyo Metropolitan Institute Of Medical Science | Transgenic mouse hepatitis C virus model comprising a hepatitis C viral fragment |
| US6914137B2 (en) | 1997-12-06 | 2005-07-05 | Dna Research Innovations Limited | Isolation of nucleic acids |
| GB0016813D0 (en) * | 2000-07-07 | 2000-08-30 | Lee Helen | Improved dipstick assays (4) |
| GB0130947D0 (en) * | 2001-12-24 | 2002-02-13 | Lee Helen | Improved sample preparation for the detection of infectious agents |
| CA2457528C (en) * | 2002-02-20 | 2011-07-12 | Sirna Therapeutics, Inc. | Rna interference mediated inhibition of hepatitis c virus (hcv) gene expression using short interfering nucleic acid (sina) |
| JP4474198B2 (ja) * | 2004-05-19 | 2010-06-02 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | Ｃ型肝炎ウイルス恒温増幅用プライマー |
| US20090311770A1 (en) * | 2005-05-20 | 2009-12-17 | Arkray, Inc. | Method of collecting microorganisms using fine particles, method of collecting nucleic acids using fine particles, and kits for use in the these methods |
| GB0701253D0 (en) * | 2007-01-23 | 2007-02-28 | Diagnostics For The Real World | Nucleic acid amplification and testing |
| GB0814570D0 (en) * | 2008-08-08 | 2008-09-17 | Diagnostics For The Real World | Isolation of nucleic acid |
| JP2012515534A (ja) * | 2009-01-21 | 2012-07-12 | バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | Ｃ型肝炎ウイルス核酸を増幅する方法 |
| CN105483283B (zh) * | 2014-10-11 | 2019-01-18 | 上海仁度生物科技有限公司 | 丙型肝炎病毒hcv实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒 |
| CN106282404A (zh) * | 2015-05-28 | 2017-01-04 | 达雅高生物科技有限公司 | 丙型肝炎病毒的快速及灵敏检测及基因型鉴定 |
| WO2018075633A2 (en) * | 2016-10-19 | 2018-04-26 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods for detecting or quantifying hepatitis c virus |
| CN115094161A (zh) * | 2022-03-31 | 2022-09-23 | 杭州丹威生物科技有限公司 | 一种丙肝病毒的富集实时荧光rt-pcr检测方法 |
-
2018
- 2018-12-03 GB GBGB1819726.9A patent/GB201819726D0/en not_active Ceased
-
2019
- 2019-12-03 CN CN201980090832.8A patent/CN113614251A/zh active Pending
- 2019-12-03 US US17/299,107 patent/US20220074004A1/en active Pending
- 2019-12-03 WO PCT/US2019/064182 patent/WO2020117769A1/en unknown
- 2019-12-03 AU AU2019392450A patent/AU2019392450A1/en active Pending
- 2019-12-03 JP JP2021531551A patent/JP2022513704A/ja active Pending
- 2019-12-03 EP EP19828034.9A patent/EP3891308A1/en active Pending
-
2024
- 2024-05-27 JP JP2024085494A patent/JP2024105718A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2020117769A1 (en) | 2020-06-11 |
| JP2022513704A (ja) | 2022-02-09 |
| EP3891308A1 (en) | 2021-10-13 |
| AU2019392450A1 (en) | 2021-07-01 |
| CN113614251A (zh) | 2021-11-05 |
| US20220074004A1 (en) | 2022-03-10 |
| GB201819726D0 (en) | 2019-01-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ölschläger et al. | Improved detection of Lassa virus by reverse transcription-PCR targeting the 5′ region of S RNA | |
| Hoffmann et al. | A universal heterologous internal control system for duplex real-time RT-PCR assays used in a detection system for pestiviruses | |
| US8679740B2 (en) | Methods for amplifying hepatitis C virus nucleic acids | |
| CN108330210B (zh) | 寨卡病毒、登革热病毒和基孔肯雅病毒核酸检测试剂盒及其用途 | |
| JP2024032815A (ja) | シングルプレックス又はマルチプレックスアッセイにおいてヒトパルボウイルス核酸を検出及びａ型肝炎ウイルス核酸を検出するための組成物及び方法 | |
| Wang et al. | Quantitative competitive reverse transcription-PCR for quantification of dengue virus RNA | |
| Hui et al. | Reverse transcriptase PCR diagnostic assay for the coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome | |
| CN116134157A (zh) | 用于扩增和检测sars-cov-2的基于pcr的诊断试剂盒、组合物和方法 | |
| Medici et al. | Broadly reactive nested reverse transcription-PCR using an internal RNA standard control for detection of noroviruses in stool samples | |
| Nordbø et al. | Prevalence of GB virus C (also called hepatitis G virus) markers in Norwegian blood donors | |
| Mizutani et al. | Rapid genome sequencing of RNA viruses | |
| JP2022191442A (ja) | 非特異的な核酸増幅を抑制する方法 | |
| CN103173568B (zh) | 一种快速鉴定1型登革热病毒的引物组、试剂盒及方法 | |
| Mohammadi-Yeganeh et al. | Molecular beacon probes–base multiplex NASBA Real-time for detection of HIV-1 and HCV | |
| Liu et al. | Accurate representation of the hepatitis C virus quasispecies in 5.2-kilobase amplicons | |
| Davarpanah et al. | Hepatitis C virus genotype distribution in Shiraz, southern Iran | |
| Casanova et al. | A complete molecular biology assay for hepatitis C virus detection, quantification and genotyping | |
| JP2024105718A (ja) | Ｈｃｖ検出 | |
| Bokharaei-Salim et al. | The first detection of co-infection of double-stranded RNA virus 1, 2 and 3 in Iranian isolates of Trichomonas vaginalis | |
| JP2008517594A (ja) | 遺伝子型ｈｃｖの同定方法 | |
| JP2007518425A (ja) | Ｈｃｖ３’非翻訳領域を効率的に増幅および検出するためのプライマーおよびプローブの設計 | |
| EP1466019A2 (en) | Detection of human papillomavirus e6 mrna | |
| Nadarajah et al. | Evaluation of a new-generation line-probe assay that detects 5'untranslated and core regions to genotype and subtype hepatitis C virus | |
| CN107385116B (zh) | 一种检测1型人类免疫缺陷病毒的方法及其专用成套试剂 | |
| US20240209460A1 (en) | Coronavirus detection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20240527 |