WO2006123781A1 - 微粒子を用いた微生物及び核酸の回収方法ならびにそれらに用いるキット - Google Patents

微粒子を用いた微生物及び核酸の回収方法ならびにそれらに用いるキット Download PDF

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WO2006123781A1
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microorganism
nucleic acid
fine particles
recovery
solution
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PCT/JP2006/310043
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Satoshi Hashiguchi
Mitsuharu Hirai
Toshiya Hosomi
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Arkray, Inc.
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    • C12N2770/24251—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to a method for recovering microorganisms and nucleic acids using fine particles, and a kit used for them.
  • Nucleic acid analysis plays an important role in diagnosing infectious diseases and genetic diseases at the genetic level in the medical field.
  • the analysis is not limited to the medical field, such as agriculture or food. It is applied and used in various fields.
  • nucleic acid For analysis of nucleic acid, it is necessary to recover the nucleic acid from a sample (eg, bacterial cell culture medium, urine, blood, etc.).
  • a sample eg, bacterial cell culture medium, urine, blood, etc.
  • the method of this document is based on the knowledge that the bacterial cells can be magnetically separated together with the magnetic particles because the bacterial cells bind nonspecifically to the magnetic particles under acidic conditions. More specifically, first, magnetic particles and a bacterial cell culture solution are mixed under acidic conditions to immobilize the bacterial cells on the magnetic particles, and then a magnetic field is applied to recover the magnetic particles by liquid force. Next, the magnetic particles are suspended to separate the magnetic particle force cells, and then the cells are dissolved to elute DNA. Then, the target DNA is obtained by fixing the eluted DNA to magnetic particles.
  • cells are immobilized on a solid support such as magnetic silica particles, then the nucleic acid of the cells is eluted, and the nucleic acid is bound to the solid support to form a nucleic acid.
  • a method of recovering see, for example, Patent Document 2.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Publication No. 2003-521228
  • Patent Document 2 Japanese Translation of Special Publication 2002-507116
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object thereof is to provide a method for recovering microorganisms and nucleic acids that is simple and has a high recovery rate.
  • the microorganism recovery method of the present invention is a microorganism recovery method using microparticles, and includes a microorganism adsorption step of bringing microparticles into contact with a sample and adsorbing the microbes in the sample to the microparticles,
  • the fine particles have a particle size of 6 ⁇ m or less and a specific surface area of 50 m 2 Zg or less.
  • the nucleic acid recovery method of the present invention includes a microorganism adsorption step for adsorbing microorganisms in a sample to microparticles, and a nucleic acid elution step for eluting nucleic acids from the microorganisms adsorbed to the microparticles, and the microorganism adsorption
  • the process is characterized in that it is the microorganism recovery method of the present invention.
  • the inventors of the present invention have made extensive studies to improve the recovery rate of microorganisms and nucleic acids from a sample.
  • the knowledge that the particle size and specific surface area of the fine particles used have a great influence on the recovery rate of microorganisms was obtained, and as a result of further research, the present invention It came. That is, in order to increase the recovery rate of microorganisms, it is usually considered to use fine particles having a large specific surface area to increase the total surface area of the fine particles.
  • fine particles with a large specific surface area were used, it was found that even though the total surface area was large, microorganisms could not be sufficiently adsorbed. This is probably due to the following reasons.
  • the fine particles having a large specific surface area for example, those having many pores on the surface are conceivable, but in this case, since the contact area between the microorganisms and the fine particles is small, it is considered that the microorganisms cannot be sufficiently adsorbed. It is done.
  • the microparticles having a particle diameter of 6 ⁇ m or less and a specific surface area of 5 Om 2 Zg or less used in the microorganism recovery method of the present invention are used, for example, the contact area between the microorganisms and the microparticles is increased. It is thought that the amount of microorganisms adsorbed per particle could be increased.
  • the recovery rate of microorganisms can be improved, and a complicated process such as centrifugation is not required, so that simple recovery is possible. Further, since the recovery rate is improved by using the fine particles as described above, for example, it is possible to recover the microorganisms with a high recovery rate even if the amount of fine particles is smaller than that of the conventional one.
  • the nucleic acid recovery method of the present invention recovers microorganisms by the microorganism recovery method of the present invention, so that microorganisms can be recovered at a high recovery rate, and nucleic acids are extracted from microorganisms recovered at such a high recovery rate. Nucleic acids can be efficiently recovered.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of real-time PCR measurement in Example 7 of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of real-time PCR measurement in Example 8-1 and Comparative Example 6-1 of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of real-time PCR measurement in Example 8-1 and Comparative Example 6-2 of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing measurement results of real-time PCR in Example 9 and Comparative Example 7 of the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing measurement results of real-time PCR in Example 10 and Comparative Example 8 of the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing the recovery rates in Examples 13-1 and 13-2 and Comparative Example 11 of the present invention.
  • FIG. 7 is a graph showing the recovery rates in Example 13-3 and Comparative Example 12 of the present invention.
  • FIG. 8 is a graph showing the recovery rates in Examples 14-1 and 14-2 and Comparative Example 13 of the present invention.
  • FIG. 9 shows the recoveries in Examples 14-3 and 14-4 of the present invention and Comparative Example 14. It is a graph which shows.
  • the upper limit of the particle diameter of the fine particles is 6 ⁇ m or less, preferably 4 ⁇ m or less, more preferably 2 ⁇ m or less, and even more preferably. Is 1 ⁇ m or less, particularly preferably 0 or less.
  • the lower limit value is not particularly limited, but is preferably, for example, 0 or more. Microparticles having such a particle size can recover microorganisms at a high recovery rate as described above. In addition, even with a smaller amount of fine particles than in the past, microorganisms can be recovered at a high recovery rate, which is extremely advantageous in terms of cost.
  • the particle diameter is a line connecting a certain point on the outer periphery of the fine particle and other points, and is the length of the longest line.
  • the particle diameter is measured using a scanning electron microscope (SEM). It can be obtained by directly observing fine particles.
  • SEM scanning electron microscope
  • the particle diameter of 50% or more of the fine particles is within the above range, and preferably 70% or more.
  • the upper limit of the specific surface area of the particle diameter is 50 m 2 Zg or less, preferably
  • the lower limit of the specific surface area is not particularly limited, but is preferably lm 2 / g or more.
  • the specific surface area can be calculated by, for example, the BET (nitrogen adsorption) method standardized by JISK1150 “Silica gel test method”.
  • the specific surface area of 50% or more of the fine particles is within the above range, and preferably 70% or more.
  • the particle diameter and specific surface area of the fine particles may be determined according to, for example, the type of microorganisms to be collected, which will be described later.
  • the collection target is bacterial cells
  • a particle diameter of 0.1 to 6 / ⁇ ⁇ a specific surface area of 1 to 50 m 2 Zg is more preferable, and a particle diameter of 0.1 to 2 m, a specific surface area is preferable.
  • the collection target is a virus
  • a particle diameter of 0.1 to 6 / ⁇ ⁇ a specific surface area of 1 to 50 m 2 / g is preferred, and a particle diameter of 0.1 to 2 m, a specific surface area of l ⁇ 30m is a 2 / g.
  • the fine particles include, for example, fine particles having a hydroxyl group or the like on the surface thereof, but the surface has a silica compound, or a resin having a hydroxyl group such as poly (ethlene, alkyl-OH, acrylate) or polyethylene glycol. Fine particles containing etc. are preferred. With such fine particles, for example, it becomes easier to adsorb microorganisms, so that the recovery rate can be further improved.
  • the fine particles may be fine particles having magnetism! /, And may be fine particles having no magnetism. For example, it is easier to separate the fine particles from the liquid. Therefore, magnetic particles are preferable.
  • the magnetic particles do not have to be magnetic as a whole as long as some of the fine particles have magnetism. That is, examples of the magnetic particles include magnetic particles obtained by coating at least part of the surface of particles made of a magnetic material with a nonmagnetic material, and magnetic particles obtained by kneading and granulating a magnetic material and a nonmagnetic material. Particles and the like. As the fine particles, commercially available fine particles may be used.
  • the magnetic material is not particularly limited as long as it has magnetism, and examples thereof include metals such as iron, chromium and nickel, metal oxides such as iron oxide and chromium oxide, and magnetic alloys. It is done.
  • the acid pig iron include Fe 2 O (magnetite), Fe 2 O (maghemite), r
  • Fe 2 O (r-type 322 iron) and the like can be mentioned.
  • the nonmagnetic material include silica compounds.
  • silica compound examples include glass, celite diatomaceous earth, silica polymer, magnesium silicate, silicone nitrogen compound (eg, SiN), aluminum silicate, silicon dioxide and silicon dioxide.
  • silica compound examples include glass, celite diatomaceous earth, silica polymer, magnesium silicate, silicone nitrogen compound (eg, SiN), aluminum silicate, silicon dioxide and silicon dioxide.
  • silica compound examples include glass, celite diatomaceous earth, silica polymer, magnesium silicate, silicone nitrogen compound (eg, SiN), aluminum silicate, silicon dioxide and silicon dioxide.
  • silicone nitrogen compound eg, SiN
  • Examples of the coconut resin having a hydroxyl group include poly (ethlene, alkyl-OH, acrylate), polyethylene glycol, and the like.
  • the fine particles are preferably magnetic silica particles containing a magnetic material such as a magnetic metal or a magnetic metal oxide, and more preferably magnetic silica particles obtained by coating the magnetic material with a silica compound.
  • examples of the non-magnetic! / Fine particles include particles made of a non-magnetic material, and the non-magnetic material is the same as described above.
  • microparticles in the present invention are excellent in the recovery rate as described above, even if the amount of microparticles is smaller than that in the past, microorganisms can be recovered with excellent efficiency. In this way, if the amount of fine particles used can be reduced, for example, it is possible to sufficiently separate liquid force fine particles from which microorganisms have been collected. In other words, as described above, in the past, it was necessary to increase the amount of fine particles used to improve the recovery rate. Liquid force from which nucleic acid was recovered It was difficult to sufficiently separate the fine particles. On the other hand, in the present invention, since the amount of use can be reduced by using the above-mentioned fine particles, it is possible to sufficiently separate the recovered fine particles of liquid force.
  • the particles may remain in the recovery solution. If fine particles remain in this way, for example, in nucleic acid amplification by a PCR (Polymerase chain reaction) method, the remaining fine particles may become an inhibitor of the reaction, and the nucleic acid may not be sufficiently amplified.
  • a label attached to a nucleic acid is measured and detected by an optical method, measurement errors may occur due to residual fine particles in the recovered solution.
  • the microorganisms and the fine particles are sufficiently separated as described above, for example, the above-described problem due to the remaining fine particles can be avoided. For this reason, for example, a decrease in PCR amplification efficiency and a decrease in analysis accuracy can be suppressed.
  • fine particles smaller than conventional particles are used. Can be recovered. Further, since the particle size is small in this way, it is possible to add more fine particles to the sample than before, and this can further improve the recovery rate.
  • the microorganism includes, for example, microbial cells, viruses and cells.
  • the cells include, but are not limited to, bacteria and fungi. Examples include staphylococci, streptococci, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, and plague.
  • the virus include ⁇ phage, immunodeficiency virus, leukocyte virus, Japanese encephalitis virus, hepatitis C virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), adult T cell leukemia virus (ATLV), human immunity Infectious virus (HIV) and Ebola virus.
  • the cells include leukocytes, epithelial cells, mucosal cells, somatic cells, and other animal and plant cells.
  • the microorganism recovery method of the present invention is a method for recovering microorganisms using fine particles.
  • the microorganism adsorption step of bringing microparticles into contact with a sample and adsorbing the microorganisms in the sample to the microparticles.
  • the fine particles have a particle size of 6 m or less and a specific surface area of 50 m 2 / g or less.
  • a microorganism recovery liquid containing fine particles is prepared in advance, and in the microorganism adsorption step, the microorganism recovery liquid and the sample are brought into contact with each other to adsorb the microorganisms in the sample to the microparticles.
  • the content of the fine particles in the microorganism collection liquid is not particularly limited, and can be determined based on, for example, the type and amount of microorganisms to be collected, the particle diameter of the fine particles to be used, the specific surface area, and the like.
  • the sample is urine, blood, or the like, for example, it is preferable to use 0.1 to LOmg fine particles with respect to 100 L of the sample, and more preferably 1 to 5 mg.
  • the microorganism recovery solution refers to a reagent used for adsorbing microorganisms to fine particles.
  • the microorganism recovery liquid is preferably an acidic liquid or a neutral liquid, for example.
  • the acidic solution preferably has a pH of, for example, 2 to 3, and examples thereof include a formate buffer solution, an acetate buffer solution, a citrate buffer solution, and a glycine hydrochloride buffer solution.
  • the neutral solution is a buffer solution, for example, Tris-HC1 and the like can be mentioned.
  • the neutral solution preferably contains a salt such as Mg salt, Na salt, Ca salt and K salt, more preferably Mg salt. These salts may be used alone or in combination of two or more. By using a neutral solution containing such a salt, a high recovery rate can be realized even with a smaller amount of fine particles.
  • Specific examples of the salt include MgCl, NaCl, Ca
  • the microorganism recovery solution contains, for example, a protein denaturant.
  • a protein denaturant for example, a non-surfactant denaturant is preferable.
  • the non-surfactant-based modifier include heavy metal salts, organic solvents, urea, and the like, and specific examples include guam salt, ethanol and vinegar. Acid is preferred.
  • microparticles adsorbed with microorganisms can be collected using, for example, a magnet, as described later.
  • the microbe adsorbed on the microparticles can be separated from the microparticles, for example, by suspending the microparticles in physiological saline or a surfactant having an appropriate concentration.
  • the nucleic acid recovery method of the present invention includes a microorganism adsorption step in which microorganisms in a sample are adsorbed to fine particles by the microorganism recovery method of the present invention, and a microorganism cartridge adsorbed on the fine particles. And a nucleic acid elution step for eluting the nucleic acid.
  • the fine particles are brought into contact with a nucleic acid extraction reagent to elute the nucleic acids from the microorganisms adsorbed on the fine particles.
  • the nucleic acid extraction reagent can be determined according to the type of microorganism to be collected, and is not particularly limited.
  • polyoxyethylene-p-tert-butyl ether Triton-based surfactant, etc.
  • polyoxy Examples thereof include surfactants such as ethylene sorbitan alkyl esters (Tween surfactants, etc.) and sodium dodecyl sulfate (SDS), ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), and the like.
  • Triton surfactant examples include trade name TritonX-100, and specific examples of the Tween surfactant include trade name Tween20.
  • the solvent for the nucleic acid extraction reagent is not particularly limited, and examples thereof include a buffer solution such as Tris-HCl.
  • the nucleic acid recovery method of the present invention may further include a liquid separation step.
  • the microorganism adsorption step the microorganism collection liquid containing fine particles is contacted with a sample containing microorganisms to adsorb the microorganisms to the fine particles, and then in the liquid separation step, the fine particles and liquid (for example, And the nucleic acid elution step.
  • the microorganism recovery liquid is as described above.
  • nucleic acid recovery method of the present invention a method for recovering nucleic acid from microorganisms adsorbed on fine particles will be described.
  • the fine particles are magnetic particles
  • it can be performed as follows. First, in the liquid separation process, magnetic force is applied by an external force magnet or the like of the container to attach magnetic particles to the inner surface of the container, and in this state, the container force liquid is removed and the microorganisms are adsorbed. Collect the magnetic particles. According to this method, the sample force which does not need to be centrifuged to separate unnecessary components (for example, liquid components) and necessary components (for example, solid components such as magnetic particles) can be recovered. Can be simplified.
  • the magnetic particles are dispersed in a nucleic acid extraction reagent and heated during the nucleic acid elution step.
  • the heating temperature and heating time are not particularly limited, and can be set according to, for example, the type and amount of microorganisms and nucleic acid extraction reagents to be collected.
  • the heating temperature is 80 to 100 ° C.
  • the heating time is Is preferably 1 to 10 minutes.
  • nucleic acid extraction reagent containing nucleic acid is collected from the container. Nucleic acids can be recovered. According to this method, it is possible to simplify the operation of recovering the nucleic acid that does not need to be centrifuged to separate unnecessary components (for example, magnetic particles) and necessary components (nucleic acid extraction reagent containing nucleic acids).
  • the fine particles are not magnetic particles, for example, the following can be carried out.
  • the liquid separation step for example, the fine particles are naturally allowed to settle by their own weight to separate the fine particles from the liquid.
  • the nucleic acid elution step is performed in the same manner as in the case of the magnetic particles, and after elution of the nucleic acid, for example, after the natural precipitation of the microparticles by the dead weight of the microparticles, The nucleic acid can be recovered by recovering the supernatant.
  • the microorganism collection kit of the present invention is a microorganism collection kit used in the microorganism collection method of the present invention, and has a particle diameter of 6 ⁇ m or less and a specific surface area thereof.
  • microorganisms can be recovered at a high recovery rate by using such fine particles.
  • a high recovery rate can be realized, which is extremely advantageous in terms of cost.
  • the fine particles those similar to the method for recovering microorganisms of the present invention can be used, and among them, magnetic silica particles are preferable.
  • the method for determining the particle diameter and specific surface area is as described above.
  • the microorganism collection kit of the present invention further includes a microorganism collection solution containing the fine particles.
  • the microorganism recovery solution is used for the microorganism recovery method of the present invention. can give.
  • the nucleic acid recovery kit of the present invention is a nucleic acid recovery kit used in the nucleic acid recovery method of the present invention, and has a particle size of 6 ⁇ m or less and a specific surface area of 50 m 2.
  • nucleic acids can be recovered at a high recovery rate by using such fine particles.
  • a high recovery rate can be realized, which is extremely advantageous in terms of cost.
  • the fine particles can be the same as those used in the method for recovering microorganisms of the present invention.
  • magnetic silica particles coated with a silica compound are preferable.
  • the nucleic acid extraction reagent used in the nucleic acid recovery method of the present invention can be used, and the method for determining the particle size and specific surface area is as described above.
  • the nucleic acid recovery kit of the present invention preferably further includes a microorganism recovery solution containing the fine particles.
  • a microorganism recovery solution containing the fine particles examples include those used in the microorganism collection method of the present invention.
  • the particle diameter is a line connecting a point with the outer periphery and the other point, and is the length of the longest line, determined using an electron microscope, and the ratio The surface area was determined based on the BET (nitrogen adsorption) method standardized by JISK1150 “Silica gel test method”.
  • This example is an example in which bacterial cells (gonococci) were collected using acidic silica particles under acidic conditions and the bacterial cell strength nucleic acid was collected.
  • a magnetic silica particle-containing liquid 200 mgZ mL was prepared using each magnetic silica particle shown in Table 1 below.
  • Example 11 and 12 the surface modification of the fine particles of Examples 11 and 12 and Comparative Example 1 is SiO.
  • the fine particles of Example 1-3 are trade name MagExtmctor (R) — Genome
  • Magnetic silica particles included in the gene extraction kit included in the gene extraction kit.
  • Neisseria gonorrhoeae colonies cultured on chocolate agar medium are collected and suspended in physiological saline so that the absorbance (OD) at a wavelength of 530 nm is 0.18.
  • a bacterial cell solution was prepared.
  • the bacterial cell solution is diluted 100-fold with physiological saline, 100 ⁇ L of the diluted bacterial cell solution and 120 L of the microorganism recovery solution are mixed, and pipetting 10 times to dispose the bacterial cells on the magnetic silica particles.
  • the magnetic silica particles were collected with a magnet and the supernatant was removed.
  • 200 L of 10 mM glycine-HCl (pH 3) was added and pipetted 10 times, and the magnetic silica particles were washed by removing the supernatant in the same manner as described above. This washing operation was repeated three times. Thus, impurities were removed, and the bacterial cells in the bacterial cell liquid were recovered while adsorbed on the magnetic silica particles.
  • Nucleic acid was extracted from the collected magnetic silica particles by pipetting 10 times with 100 ⁇ L of the nucleic acid extraction reagent, heating at 95 ° C. for 5 minutes, and further pipetting 10 times.
  • a nucleic acid extract was collected with magnetic silica particles collected by a magnet.
  • the nucleic acid extraction reagent a mixed solution of 10 mM Tris-HCl (pH 8), 0. ImM ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) (pH 8) and 1 wt% Triton X-100 (trade name) was used.
  • Reagents and product names shown in Table 2 below using i-Cycler TM (Bio-Rad Laboratories), heat at 50 ° C for 2 minutes, 95 ° C for 2 minutes, 95 ° C for 10 seconds and 56 ° C Measure the fluorescence intensity in real time while amplifying the extracted nucleic acid by PCR. Set. The number of cycles when the fluorescence intensity reached 100 was measured, and the Ct value (Ctl) of the nucleic acid was determined. The measurement was performed 6 times for each.
  • the amounts of reagents shown in Table 2 below are the amounts for the nucleic acid extract 1.
  • F-D-NG-Rl-32 (FAM) -ac 11 agagacg 11 acggaaaa t at c aacgag- (DABCYL) (SEQ ID NO: 1) * XG-F3405-20: 5 '-gcggttattttctgctcgct-3' (SEQ ID NO: 2)
  • N'G-3526-20R 5 '-accttcgagcagacatcacg-3' (SEQ ID NO: 3)
  • the AUGC includes ATP, GTP and CTP (all manufactured by Takara) and UTP (manufactured by Roche).
  • the recovery rate of the nucleic acid was calculated from the following equation using the Ct value (Ctl) of the example or comparative example and the Ct value (Ct 2) of the control.
  • Ctl Ct value of the example or comparative example
  • Ct value (Ct 2) of the control Ct value of the control.
  • the obtained Ct values and nucleic acid recovery rates (both average values) are shown in Table 3 below.
  • Example 1 2 2 2. 7 25. 7 66
  • nucleic acids As shown in Table 4 above, examples using fine particles having a particle diameter of 6 ⁇ m or less and a specific surface area of 50 m 2 / g or less even though the amount of magnetic silica particles is small (1Z10 of Example 1). In (2-1, 2-2 and 2-3), nucleic acids could be recovered with a high recovery rate. On the other hand, in Comparative Example 2 in which fine particles whose particle diameter did not satisfy the above range were used, the recovery of nucleic acid with a very low recovery rate was insufficient. Therefore, it can be said that nucleic acids (bacteria) can be efficiently recovered even with a small amount of magnetic silica particles by using fine particles having a particle size of less than or equal to 50 m 2 / g.
  • Example 3 [0059] In this example, cells (gonococci) were collected using a neutral solution containing magnetic silica particles and a salt, and collected cell strength nucleic acids were collected.
  • a bacterial cell solution and a microorganism recovery solution were prepared. That is, a total of 6 buffer solutions, 0.5M Tris-HCl buffer solution (pH 7.1) containing 5 kinds of salts (concentration 0.5M) shown in Table 6 below and the above-mentioned buffer solution containing no salt, were used. Got ready. Subsequently, 100 ⁇ L of each buffer solution and 10 L of a magnetic silica-containing solution (400 mgZmL) containing each magnetic silica particle shown in Table 5 below were mixed to prepare the microorganism recovery solution. On the other hand, the bacterial cell solution was prepared by diluting a koji mold suspension (OD: 0.18) prepared in the same manner as in Example 1 100 times with physiological saline.
  • OD koji mold suspension
  • Example 6 Nucleic acid extraction and PCR were performed in the same manner as in Example 1, Ct value was determined, and nucleic acid recovery rate (%) was calculated. The obtained Ct values and nucleic acid recovery rates are shown in Table 6 below. The values in Table 6 below are average values of 6 measurements, and the values in parentheses are Ct values. The Ct value (Ct2) of the control used to calculate the recovery rate is 24.0 in Example 3-1, and 22.2 in Example 3-2 and Comparative Example 3.
  • This example is an example in which a virus solution (HBV) in plasma is collected using a buffer solution containing magnetic silica particles and a protein denaturant, and nucleic acid is collected from the virus cartridge.
  • HBV virus solution
  • magnetic silica particles having a particle diameter of 0.1 0.4 0.4 111 and a specific surface area of 2 10111 2 78 (manufactured by Band Chemical Co., Ltd .; trade name S—M—03) were used. mL) was prepared. HBV Plasma (ProMedDx “Numberl 0222136”) 1. After adding O / z L to 100 ⁇ L of healthy human plasma, any of the buffer solutions shown in Table 8 below and the magnetic silica particle-containing solution 16 L was added. Then, the virus was adsorbed to the magnetic silica particles by pipetting 30 times, and the supernatant was removed in the same manner as described above.
  • nucleic acid extraction reagent 100 L of nucleic acid extraction reagent was added to the washed magnetic silica particles, pipetted 10 times, then heated at 95 ° C for 5 minutes, and further pipetted 10 times to extract the virus power and nucleic acid. In the same manner as described above, the nucleic acid extract was collected to recover the nucleic acid.
  • a mixed reagent of 10 mM Tris-HCl (pH 8), 0.1 ImM EDTA (pH 8), and 0.1 weight 0 / oSDS was used as the nucleic acid extraction reagent.
  • nucleic acid extract 1.0 / zL
  • reagents shown in Table 7 below and brand name i Cycler TM (Bio-Rad Laboratories)
  • 50 cycles were performed for 30 seconds at 95 ° C and 60 seconds at 56 ° C, and the number of cycles when the fluorescence intensity was 250 was measured to obtain the Ct value. The measurement was performed three times for each.
  • Taqman-BFl-32 (FAM) -caacaaccgacc t tgaggcat ac 11 caaagac- (TAMRA) (Major 4) * IIBV F50-74: 5 '-gaggac tc 11 ggac tctc age aa t g-3' ( (SEQ ID NO: 5)
  • Example 4-1 0.5M glycine-HCl (pH 3) 100 57
  • Example 4-2 0.5 M glycine-HCl (pH 3) 100 87
  • nucleic acid could be recovered at a high recovery rate in any of the Examples.
  • the recovery rate was extremely high.
  • virus (HBV) in plasma is collected using magnetic silica particles, and nucleic acid is collected from the virus.
  • Virus was recovered and nucleic acid was extracted and nucleic acid recovery was calculated in the same manner as in Example 4 except that HC1 buffer (pH 3) was used and fine particles shown in Table 9 below were used. The recovery rate of the resulting nuclear acid is shown in Table 9 below together with the control.
  • virus (HBV) in plasma is collected using magnetic silica particles, and nucleic acid is collected from the virus.
  • Virus was recovered and nucleic acid was extracted in the same manner as in Example 5 except that 0.5 M glycine-HC1 buffer (PH3) containing 40% ethanol was used as a buffer for microorganism recovery. The nucleic acid recovery rate was calculated. The recovery rate of the obtained nucleic acid is shown in Table 10 below together with the control.
  • Example 6-1 0.1 to 0.4 4 to 10 71
  • cells (leukocytes) were collected using magnetic silica particles, and nucleic acids were collected from the cells.
  • the magnetic silica particles are trade names S— ⁇ -03 (manufactured by Bandichi Kagaku Co., Ltd .: particle diameter 0.1 to 0.4 m, specific surface area 2 to: LOm 2 / g, surface-modified SiO 2). used.
  • nucleic acid extraction reagent (Recovery of nucleic acid) Add 50 L of nucleic acid extraction reagent to magnetic silica particles adsorbed with leukocytes, stir with vortex for 5 seconds, heat at 95 ° C for 5 minutes, and further vortex for 5 seconds to remove leukocyte strength. Extracted. A nucleic acid extract was collected in the same manner as described above.
  • nucleic acid extraction reagent a mixed reagent of 10 mM Tris-HCl (pH 8), 0. ImM EDTA (pH 8) and 1% Triton X-100 (trade name) was used.
  • FIG. 1 is a graph showing changes in fluorescence intensity with increasing PCR cycles. As shown in FIG. 1, in both Examples 7-1 and 7-2, the fluorescence intensity decreased after a certain number of cycles, and thus it was confirmed that nucleic acid was present in the sample. That is, using magnetic silica particles having a particle diameter of 6 m or less and a specific surface area of 50 m 2 Zg or less, leukocytes in blood can be collected and nucleic acids can be collected from the leukocytes.
  • Example 2-2 since the fluorescence intensity of Example 2-2 is lower than that of Example 7-1, it can be said that more nucleic acid was detected (recovered) in Example 2-2. That is, collect leukocytes in the blood When using a neutral solution containing MgCl, etc. as a microorganism recovery solution,
  • This example is another example in which cells (leukocytes) are collected using magnetic silica particles, and nucleic acids are collected from the cells.
  • Example 8-1 is a magnetic silica particle having a particle size of 0.1 to 0.4 ⁇ m and a specific surface area of 2 to 10 m 2 Zg (trade name S—M-05, manufactured by Bandichi Kagaku Co., Ltd.), buffer Contains 1M MgCl as liquid 0
  • Example 7 The same procedure as in Example 7 was performed except that heating was performed at 5 ° C for 2 minutes, and 50 cycles were performed at 95 ° C for 15 seconds and 56 ° C for 45 seconds.
  • Example 8-2 is a magnetic silica particle having a particle diameter of 2 m and a specific surface area of 2.7 m 2 Zg (trade name)
  • Example 8-1 The same procedure as in Example 8-1, except that Micromer (R) — M, manufactured by Micromod Co., Ltd.) was used.
  • the particle diameter was 12 / zm and the specific surface area was 0.4.
  • FIG. 2 shows the measurement results of real-time PCR in Example 8-1 and Comparative Example 6-1.
  • Fig. 3 shows the measurement results of real-time PCR in Example 8-1 and Comparative Example 6-2.
  • the particle size is larger than that of Comparative Example 61 using fine particles whose diameter does not satisfy the above range. Was successfully recovered. Further, as shown in FIG.
  • Example 8-2 using fine particles having a particle diameter of 6 m or less and a specific surface area of 50 m 2 / g or less, Comparative Example 6 using fine particles having a particle diameter not satisfying the above range was used. More than 2 nucleic acids could be recovered.
  • virus was recovered using magnetic silica particles, and the recovered virus force nucleic acid was recovered.
  • HCV Plasma (ProMedDx Number9990964) 50 [This buffer solution (0.50 glycine citrate ( ⁇ 3), 40% ethanol) 50 ⁇ L and any one of the above magnetic silica particles] (500 mg / mL) 8 ⁇ L was added and pipetting 30 times to adsorb HCV to the magnetic silica particles. After removing the supernatant in the same manner as described above, 200 ⁇ L of distilled water (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) was removed, and the magnetic silica particles adsorbed with HCV were washed by pipetting 10 times. After repeating this washing operation three times, magnetic silica particles were recovered in the same manner as described above.
  • a nucleic acid extraction reagent (10 mM Tris-HCl (pH 8), 0.1 ImM EDTA (pH 8) and 0.1 wt. 0 / oSDS) 70 L, RNAsequreagent (Ambion) 5 L and The HCV nucleic acid was extracted by pipetting 10 times, heating at 95 ° C for 5 minutes, and pipetting 10 times.
  • 25 ⁇ L of 20% Nodet ⁇ -40 manufactured by Nacalai Testa Co., Ltd. was added, pipetted 10 times, and heated at 60 ° C. for 10 minutes.
  • HCV RNA was detected by performing real-time PCR using a target sequence-specific quenching probe, using the reagents shown in Table 15 below, on 5 ⁇ L of the heated nucleic acid extract.
  • a target sequence-specific quenching probe using the reagents shown in Table 15 below, on 5 ⁇ L of the heated nucleic acid extract.
  • Table 15 the product name i—Cycler TM (Bio—Rad Laboratories) and heating at 60 ° C. for 30 minutes, then 94. Heat at C for 2 minutes, 94. 15 seconds and 60 for C. 60 cycles of 30 seconds at C were performed and heated at 60 ° C for 7 minutes. The results are shown in Fig. 4.
  • the reagent marked with ** is a reagent included in the trade name RT—PCR hi h 1 Pl us— “Reverse 1 shot” (TOYOBO CO., LTD).
  • Fig. 4 is a graph showing changes in fluorescence intensity with the number of PCR cycles.
  • Fig. 4 in the examples (9-1 and 9-2) using fine particles having a particle diameter of 6 ⁇ m or less and a specific surface area of 50 m 2 Zg or less, quenching was observed in an early cycle. It can be said that there is a large amount of collected waste.
  • Comparative Example 7 using fine particles whose particle diameter does not satisfy the above range almost no quenching was observed and the recovery rate was low. Therefore, it can be said that viruses can be efficiently recovered by using fine particles with a particle size of 6 m or less and a specific surface area of 50 m 2 Zg or less.
  • virus was recovered using magnetic silica particles, and the virus was recovered from the virus. It is the other example which collect
  • HCV Plasma (ProMedDx Number9990964) 50 L [This, buffer solution (0.5M glycine—HC1 ( ⁇ 3) and 40% ethanol) 50 ⁇ L, and magnetic silica particles (trade name S— ⁇ —04; band one chemical Co., Ltd., particle size 0.1 to 0.4 111, specific surface area 2-10111 2/8) containing liquid (376MgZmL) 10. added and 64 / z L, magnetic and 30 times pipetting HCV was adsorbed on silica particles. In the same manner as described above, the supernatant was removed, and 100 ⁇ L of distilled water (Otsuka Pharmaceutical) was added, and the magnetic silica particles adsorbed with HCV were washed by pipetting 10 times.
  • buffer solution 0.5M glycine—HC1 ( ⁇ 3) and 40% ethanol
  • magnetic silica particles (trade name S— ⁇ —04; band one chemical Co., Ltd., particle size 0.1 to 0.4 111, specific surface area 2-10111 2/8) containing liquid (376
  • HCV Plasma ProMedDx Number9990964 50 L force HCV RNA was purified, and real-time PCR was performed using a target sequence-specific quenching probe. HCV RNA was detected. The results are shown in FIG. 5 together with Example 10.
  • FIG. 5 is a graph showing changes in fluorescence intensity with the number of PCR cycles.
  • Example 10 using magnetic silica particles having a particle diameter of 6 ⁇ m or less and a specific surface area of 50 m 2 / g or less is faster than the conventional method using no fine particles (Comparative Example 8).
  • the fluorescence was low and the fluorescence intensity was low. Therefore, according to the method of the present invention, it is possible to recover viruses more efficiently than the method without using conventional fine particles.
  • This example is still another example in which virus (HIV) is collected using magnetic silica particles, and nucleic acid is collected from the virus.
  • virus HIV
  • fine particles shown in Table 16 below were prepared.
  • HIV Plasma ProMedDx Numberl0439039
  • buffer solution 0.5M glycine-chenic acid (pH3), 40% ethanol
  • magnetic silica particles listed in Table 16 below Liquid (500mgZ mDS / zL was pipetted and pipetted 30 times to adsorb HIV to the magnetic silica particles.
  • the supernatant was removed and distilled water (Otsuka Pharmaceutical) 200
  • the magnetic silica particles adsorbed with HIV were washed by pipetting 10 times, and this operation was repeated 3 times, and the supernatant was removed in the same manner as described above, and the nucleic acid extraction reagent (10 mM Tris — Add HCl (pH8), 0.1 ImM EDTA (pH8), 0.1% SDS) 70 L and RNAsequrereagent5 L, pipette 10 times, heat at 95 ° C for 5 minutes, and pipette 10 times HIV nucleic acid was extracted, and 25 ⁇ L of 20% Nodette P-40 ( R ) (manufactured by National Power Tester Co., Ltd.) was added to 75 ⁇ L of the nucleic acid extract. Pipetted 10 times and heated for 10 minutes at 60 ° C. Amplified detection was performed using Amplicor HIV-1 Monitor vl.5 (Roche Diagnostics). 450 nm) is shown
  • This example is still another example in which virus (HIV) is collected using magnetic silica particles, and nucleic acid is collected from the virus.
  • Nucleic acids were recovered and amplified in the same manner as in Example 11-2. Subsequently, the same procedure as in Example 11-2 was performed, except that dilution series of X1, X1Z5 and X1Z25 were prepared and nucleic acids were detected. The obtained absorbance (450 nm) is shown in Table 17 below.
  • HIV recovery ability of Example 11 using the following magnetic silica force particle diameter 6 / zm or less and a specific surface area of 50 m 2 Zg is by Amplicor HIV- 1 Monitor vl. 5 Same or better than pretreatment. Therefore, it can be said that the method for recovering microorganisms of the present invention can recover viruses extremely efficiently.
  • This example is an example showing the influence of the specific surface area and particle diameter of fine particles on the recovery rate of microorganisms (cells).
  • Example 13-1 Product name s-raQ-oi 1 17. 8 0. 40 12
  • Example 13-2 Product name S-FSQ-01 4 14. 7 0. 48 9 Comparative Example 11
  • the total surface area is the same, the embodiments using the following and specific surface area of 50 m 2 / g or less of magnetic silica particles having a particle diameter of 6 m (13 1 and 13 In 2), the nucleic acid could be recovered at a higher recovery rate than Comparative Example 11 using magnetic silica particles having a particle diameter exceeding 6 ⁇ m.
  • Example 13 3 using the following magnetic silica particles The specific surface area 50 m Zg, than Comparative Example 12 having a specific surface area using magnetic silica particles of more than 50 m 2 / g Nucleic acids could be recovered with a high recovery rate.
  • viruses (HBV) and nucleic acids were collected using magnetic silica particles having a constant total surface area of fine particles and different particle sizes. Specifically, virus (HBV) was recovered and nucleic acid was extracted in the same manner as in Example 6 except that the magnetic silica particles shown in Table 20 below were used, and the nucleic acid recovery rate was calculated by PCR. The amount of each fine particle used was adjusted so that its specific surface area (m 2 / g) force was 710 cm 2 in total surface area. The recovery rates obtained are shown in Fig. 8 and Table 20 below.
  • virus (HBV) and nucleic acid were collected using magnetic silica particles having a constant fine particle size (1 ⁇ m) and different specific surface areas. Specifically, except that the magnetic silica particles shown in Table 21 below were used and the amount used was 4. Omg, virus (HBV) was recovered and nucleic acid was extracted and PCR was performed in the same manner as in Example 6. The recovery rate of nucleic acid was calculated by The recovery rates obtained are shown in Fig. 9 and Table 21 below.
  • microparticles having a particle diameter of 6 ⁇ m or less and a specific surface area of 50 m 2 Zg or less can be efficiently recovered.
  • the nucleic acid recovery method of the present invention recovers microorganisms by the microorganism recovery method of the present invention, microorganisms can be efficiently recovered, and as a result, nucleic acids can be efficiently recovered. Therefore, the present invention can be applied to all fields in which microorganisms, nucleic acids, and the like need to be recovered.
  • the present invention can be preferably applied to the extraction of components of biological sample strength, but the application is not limited and wide.
  • SEQ ID NO: 2 NG-F3405 20 Oligonucleotide probe designed for forward primer
  • SEQ ID NO: 3 NG— 3526— 20R oligonucleotide probe designed for reverse primer
  • SEQ ID NO: 5 HBV F50—74 oligonucleotide probe designed for the forward primer
  • SEQ ID NO: 8 27F1 2 Oligonucleotide probe designed for forward primer
  • SEQ ID NO: 9 27R1 2 Oligonucleotide probe designed for reverse primer SEQ ID NO: 10 F— T IAPP— Fl it— 34: Probe
  • SEQ ID NO: 14 HC-F303 25— 3a oligonucleotide probe designed for forward primer
  • SEQ ID NO: 15 HCV—R402—28 Oligonucleotide probe designed for reverse primer

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Abstract

　簡便かつ、回収率に優れる微生物及び核酸の回収方法を提供する。 　本発明の微生物の回収方法は、微粒子と試料とを接触させ、前記試料中の微生物を微粒子に吸着させる微生物吸着工程を含み、前記微粒子の粒子径が６μｍ以下であり、かつ、その比表面積が５０ｍ2／ｇ以下であることを特徴とする。また、本発明の核酸の回収方法は、試料中の微生物を微粒子に吸着させる微生物吸着工程と、前記微粒子に吸着させた微生物から核酸を溶出させる核酸溶出工程とを含み、前記微生物吸着工程が、本発明の微生物回収方法であることを特徴とする。本発明の回収方法によれば、微生物及び核酸を簡便かつ効率よく回収できる。前記微粒子は、磁性シリカ粒子が好ましい。

Description

明 細 書
微粒子を用レ、た微生物及び核酸の回収方法ならびにそれらに用レ、るキッ 卜
技術分野
[0001] 本発明は、微粒子を用いた微生物及び核酸の回収方法ならびにそれらに用いるキ ットに関する。
背景技術
[0002] 核酸の分析は、医療分野において感染症や遺伝子疾患を遺伝子レベルで診断す るために重要な役割を果たしており、現在においては、医療分野に限らず、農業ある いは食品分野などの様々な分野にぉ 、て応用され、使用されて 、る。
[0003] 核酸の分析には、試料 (例えば、菌体培養液、尿、血液等)から核酸を回収する必 要がある。その方法としては、例えば、磁性粒子等の微粒子を用いる方法がある（例 えば、特許文献 1参照)。この文献の方法は、酸性条件下において磁性粒子に対し て菌体が非特異的に結合することから、菌体を磁性粒子とともに磁気的に分離可能 であるという知見に基づいている。より具体的には、まず、酸性条件下で磁性粒子と 菌体培養液を混合して菌体を磁性粒子に固定化させた後、磁場を作用させて磁性 粒子を液体力 回収する。ついで、前記磁性粒子を懸濁して磁性粒子力 菌体を分 離させた後、菌体を溶解して DNAを溶出させる。そして、溶出した DNAを磁性粒子 に固定ィ匕させることにより目的とする DNAを得る。
[0004] その他の微粒子を用いた方法としては、細胞を磁性シリカ粒子等の固体支持体に 固定化させた後、前記細胞の核酸を溶出させ、前記核酸を前記固体支持体に結合 させて核酸を回収する方法がある（例えば、特許文献 2参照)。
[0005] これらの方法は、試料中から菌体を分離するための遠心分離操作が不要であるた め、機械による自動化に適するという利点がある。その反面、試料からの菌体ゃ核酸 の回収率が十分とは言えず、未だ改善の余地がある。また、菌体ゃ核酸の回収率を 向上させるためには、磁性粒子の使用量を増加させる必要があり、コスト的に不利で ある。 [0006] このため、簡便、かつ、回収率が高い微生物及び核酸の回収方法が広く求められ ている。
[0007] 特許文献 1 :特表 2003— 521228号公報
特許文献 2：特表 2002— 507116号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、簡便かつ回収率が高い微生物及 び核酸の回収方法の提供を、その目的としている。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明の微生物回収方法は、微粒子を用いた微生物の回収方法であって、微粒 子と試料とを接触させ、前記試料中の微生物を微粒子に吸着させる微生物吸着工 程を含み、前記微粒子の粒子径が 6 μ m以下であり、かつ、その比表面積が 50m2Z g以下であることを特徴とする。
[0010] また、本発明の核酸回収方法は、試料中の微生物を微粒子に吸着させる微生物吸 着工程と、前記微粒子に吸着させた微生物から核酸を溶出させる核酸溶出工程とを 含み、前記微生物吸着工程が、本発明の微生物回収方法であることを特徴とする。 発明の効果
[0011] 本発明者等は、試料からの微生物及び核酸の回収率を向上すベぐ鋭意研究を重 ねた。その過程で、微粒子を用いて微生物を回収するにあたって、使用する微粒子 の粒子径及び比表面積が、微生物の回収率に大きな影響を与えるという知見を得て 、さらに研究を重ねた結果、本発明に至った。すなわち、通常、微生物の回収率を向 上させるためには、比表面積が大きな微粒子を使用して微粒子の総表面積を大きく することが考えられる。ところが、比表面積が大きな微粒子を使用した場合、総表面 積が大きいにも関わらず、微生物を十分に吸着できないことが分力つた。これは、お そらぐ以下の理由によると推測される。すなわち、比表面積が大きな微粒子としては 、例えば、その表面に多くの細孔を有するものが考えられるが、この場合、微生物と 微粒子との接触面積が小さくなるため、十分に微生物を吸着できないと考えられる。 これに対し、本発明の微生物回収方法に使用する粒子径 6 μ m以下かつ比表面積 5 Om2Zg以下の微粒子であれば、例えば、微生物と微粒子との接触面積が大きくなる ため、微生物を十分に吸着でき、微粒子あたりの微生物の吸着量を増加できたと考 えられる。このため、本発明の微生物回収方法によれば、微生物の回収率が向上で き、遠心分離等の煩雑な工程を必要としないことから、簡便な回収が可能である。ま た、このように前記微粒子の使用により回収率が向上するため、例えば、従来より少 量の微粒子であっても高い回収率で微生物を回収することも可能である。
[0012] 本発明の核酸回収方法は、本発明の微生物回収方法によって微生物を回収する ため、高い回収率で微生物を回収でき、このように高い回収率で回収した微生物か ら核酸を抽出するため、核酸を効率よく回収できる。
図面の簡単な説明
[0013] [図 1]図 1は、本発明の実施例 7におけるリアルタイム PCRの測定結果を示すグラフで ある。
[図 2]図 2は、本発明の実施例 8— 1及び比較例 6— 1におけるリアルタイム PCRの測 定結果を示すグラフである。
[図 3]図 3は、本発明の実施例 8— 2及び比較例 6— 2におけるリアルタイム PCRの測 定結果を示すグラフである。
[図 4]図 4は、本発明の実施例 9及び比較例 7におけるリアルタイム PCRの測定結果 を示すグラフである。
[図 5]図 5は、本発明の実施例 10及び比較例 8におけるリアルタイム PCRの測定結果 を示すグラフである。
[図 6]図 6は、本発明の実施例 13— 1及び 13— 2ならびに比較例 11における回収率 を示すグラフである。
[図 7]図 7は、本発明の実施例 13— 3及び比較例 12における回収率を示すグラフで ある。
[図 8]図 8は、本発明の実施例 14— 1及び 14— 2ならびに比較例 13における回収率 を示すグラフである。
[図 9]図 9は、本発明の実施例 14— 3及び 14— 4ならびに比較例 14における回収率 を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0014] 本発明にお 、て、前記微粒子の粒子径の上限値は、前述のように、 6 μ m以下であ り、好ましくは 4 μ m以下、より好ましくは 2 μ m以下、さらに好ましくは 1 μ m以下、特 に好ましくは 0. 以下である。また、下限値は特に制限されないが、例えば、 0. 以上が好ましい。このような粒子径の微粒子であれば、前述のように高い回収 率で微生物を回収できる。また、従来より少量の微粒子であっても、高い回収率で微 生物を回収できるため、コスト的に極めて有利である。前記粒子径は、微粒子の外周 におけるある点と、その他の点とを結ぶ線であって、かつ、最も長い線の長さのことを いい、例えば、走査型電子顕微鏡 (SEM)を用いて前記微粒子を直接観察すること 等により求めることができる。使用する微粒子のうち、例えば、 50%以上の微粒子の 粒子径が、前記範囲であればよぐ好ましくは 70%以上である。
[0015] 前記粒子径の比表面積の上限値は、前述の通り、 50m2Zg以下であり、好ましくは
30m2Zg以下、より好ましくは 20m2Zg以下である。前記比表面積の下限値は、特 に制限されないが、 lm2/g以上が好ましい。前記比表面積は、例えば、 JISK1150 「シリカゲル試験方法」で規格化された BET (窒素吸着)法によって算出できる。使用 する微粒子のうち、例えば、 50%以上の微粒子の比表面積が、前記範囲であればよ ぐ好ましくは 70%以上である。
[0016] 前記微粒子の粒子径及び比表面積は、例えば、後述する回収対象である微生物 の種類等に応じて決定してもよい。回収対象が菌体ゃ細胞である場合、例えば、粒 子径 0. 1〜6 /ζ πι、比表面積 l〜50m2Zgが好ましぐより好ましくは粒子径 0. 1〜2 m、比表面積 l〜20m2/gである。一方、回収対象がウィルスである場合、例えば 、粒子径 0. 1〜6 /ζ πι、比表面積 l〜50m2/gが好ましぐより好ましくは粒子径 0. 1 〜2 m、比表面積 l〜30m2/gである。
[0017] 前記微粒子は、例えば、その表面に水酸基等を有する微粒子が好ましぐ中でも、 表面に、シリカ化合物や、 poly(ethlene、 alkyl—OH、 acrylate)及びポリエチレン グリコール等の水酸基を有する榭脂等を含む微粒子が好まし 、。このような微粒子で あれば、例えば、微生物をさらに吸着させ易くなるため、回収率をより一層向上できる [0018] また、前記微粒子は、磁性を有する微粒子であってもよ!/、し、磁性を有さな 、微粒 子であってもよいが、例えば、微粒子と液体との分離がさらに容易となるため、磁性粒 子が好ましい。前記磁性粒子は、微粒子の一部が磁性を有していればよぐ微粒子 全体が磁性を有している必要はない。すなわち、前記磁性粒子としては、例えば、磁 性材料により構成された粒子の表面の少なくとも一部を非磁性材料で被覆した磁性 粒子や、磁性材料と非磁性材料とを混練して造粒した磁性粒子等があげられる。な お、前記微粒子は、市販の微粒子を使用してもよい。
[0019] 前記磁性材料としては、磁性を有するものであれば特に制限されな 、が、例えば、 鉄、クロム、ニッケル等の金属、酸化鉄や酸化クロム等の金属酸化物、磁性合金等が あげられる。前記酸ィ匕鉄としては、例えば、 Fe O (磁鉄鉱）、 Fe O (マグへマイト）、 r
3 4 2 3
Fe O (r型三二鉄)等があげられる。前記非磁性材料としては、例えば、シリカ化合
2 3
物、水酸基を有する榭脂等があげられる。前記シリカ化合物としては、例えば、ガラス 、ゼライト珪藻土、シリカポリマー、珪酸マグネシウム、シリコーン窒素化合物（例えば 、 SiN )、珪酸アルミニウム、二酸ィ匕珪素等があげられる。中でも、ガラス、ゼライト珪
4
藻土、シリカポリマー、 SiN、二酸化珪素が好ましぐガラス、ゼライト珪藻土、 SiN、
4 4 二酸ィ匕珪素がより好ましい。前記水酸基を有する榭脂としては、例えば、 poly (ethle ne、 alkyl-OH, acrylate)、ポリエチレングリコール等があげられる。
[0020] これらの中でも、前記微粒子は、磁性金属や磁性金属酸化物等の磁性材料を含む 磁性シリカ粒子が好ましぐより好ましくは前記磁性材料をシリカ化合物で被覆した磁 性シリカ粒子が好ましい。
[0021] また、前記磁性を有さな!/、微粒子としては、例えば、非磁性材料により構成された 粒子等があげられ、前記非磁性材料としては前述と同様である。
[0022] また、本発明における微粒子は、前述のように回収率に優れることから、従来より少 量の微粒子であっても、優れた効率で微生物を回収できる。このように、微粒子の使 用量を低減できれば、例えば、微生物を回収した液体力 微粒子を十分に分離する ことも可能である。すなわち、前述のように、従来では、回収率向上のため、微粒子の 使用量を増加させる必要があつたが、使用量が増加すると、これに伴って微生物や 核酸を回収した液体力 微粒子を十分に分離することが困難であった。これに対して 、本発明においては、前述の微粒子を使用することにより、使用量を低減できるため 、回収した液体力もの微粒子の分離を十分に行うことも可能となる。さらに、従来のよ うに微粒子が十分に分離できな 、場合、微生物の回収液から後述するようにして核 酸を回収すると、その回収液に微粒子が残存するおそれがある。このように微粒子が 残存すると、例えば、 PCR (Polymerase chain reaction)法による核酸増幅にお いて、残存微粒子が反応の阻害剤となり、十分に核酸を増幅できないおそれがある。 また、光学的手法により核酸に付した標識を測定して検出する場合、回収液の残存 微粒子によって測定誤差が生じるおそれもある。し力しながら、本発明であれば、前 述のように微生物と微粒子とが十分に分離されるため、例えば、残存微粒子による前 記問題を回避することも可能となる。このため、例えば、 PCRの増幅効率の低下や分 析精度の低下を抑制することもできる。
[0023] さらに、本発明の微生物回収方法によれば、従来より小さい微粒子 (粒子径 6 m 以下）を使用するため、例えば、不純物を多く含む試料であっても、高い回収率で微 生物を回収できる。また、このように粒子径が小さいため、従来より多くの微粒子を試 料に添加することも可能であり、これによつても回収率をさらに向上できる。
[0024] 本発明にお 、て、微生物とは、例えば、菌体、ウィルス及び細胞を含む。前記菌体 は、特に制限されないが、バクテリア及び菌類を含み、例えば、淋菌、クラミジァ、抗 酸菌、非定型抗酸菌、レジオネラ、マイコプラズマ、スピロヘータ、梅毒スピロヘータ、 リケッチア、らい菌、鼠咬症スピリルム、ブドウ球菌、連鎖球菌、大腸菌、緑膿菌及び ペスト菌等があげられる。前記ウィルスとしては、例えば、 λファージ、免疫不全ウイ ルス、白血球ウィルス、日本脳炎ウィルス、 Β型肝炎ウィルス (HBV)、C型肝炎ウイ ルス (HCV)、成人 T細胞白血病ウィルス (ATLV)、ヒト免疫不全ウィルス (HIV)及 びエボラ出血熱ウィルス等があげられる。前記細胞としては、例えば、白血球、上皮 細胞、粘膜細胞、体細胞、その他動植物の細胞等があげられる。前記試料は、特に 制限されず、例えば、生体由来試料、生活排水や工場排水等カゝら採取された環境 試料、化学分析で使用される化学試料等がある。前記生体由来試料としては、例え ば、全血、リンパ液、尿、唾液、痰、鼻汁等がある。 [0025] 本発明の微生物回収方法は、前述のように、微粒子を用いた微生物の回収方法で あって、微粒子と試料とを接触させ、前記試料中の微生物を微粒子に吸着させる微 生物吸着工程を含み、前記微粒子の粒子径が 6 m以下であり、かつ、その比表面 積が 50m2/g以下であることを特徴とする。
[0026] 本発明の微生物回収方法において、予め微粒子を含む微生物回収液を準備し、 前記微生物吸着工程において、前記微生物回収液と試料とを接触させ、試料中の 微生物を微粒子に吸着させることが好ましい。前記微生物回収液における微粒子の 含有量は、特に制限されないが、例えば、回収対象となる微生物の種類や量、使用 する微粒子の粒子径ゃ比表面積等に基づき決定できる。試料が尿や血液等である 場合、例えば、試料 100 Lに対して 0. 1〜： LOmgの微粒子を使用することが好まし ぐより好ましくは l〜5mgである。なお、本発明において、前記微生物回収液は、微 粒子に微生物を吸着させるために使用する試薬のことを 、う。
[0027] 前記微生物回収液は、例えば、酸性液や中性液等が好ま 、。このような液の使 用によって、さらに少量の微粒子であっても、より高い回収率を実現でき、コスト的に 極めて有利である。前記酸性液は、その pHが、例えば、 2〜3であることが好ましぐ 緩衝液の場合、例えば、ギ酸緩衝液、酢酸緩衝液、クェン酸緩衝液及びグリシン 塩酸緩衝液等があげられる。一方、前記中性液が緩衝液の場合、例えば、 Tris-H C1等があげられる。前記中性液は、例えば、 Mg塩、 Na塩、 Ca塩及び K塩等の塩を 含むことが好ましぐより好ましくは Mg塩である。これらの塩は、 1種類のみでもよいし 、 2種類以上でもよい。このような塩を含む中性液の使用により、さらに少量の微粒子 であっても、高い回収率を実現できる。前記塩の具体例としては、 MgCl、 NaCl、 Ca
2
CI及び KC1等があげられ、好ましくは MgClである。前記中性液における塩の濃度
2
は、例えば、 0. 25〜2. OMであり、好ましくは 0. 5〜1. OMである。
[0028] 前記微生物回収液は、例えば、タンパク質変性剤を含むことが好ま 、。微生物の 回収率をより一層向上させ、さらに少量の微粒子であっても、極めて高い回収率で微 生物を回収できるからである。前記タンパク質変性剤としては、例えば、非界面活性 剤系変性剤が好ましい。前記非界面活性剤系変性剤としては、例えば、重金属塩、 有機溶媒及び尿素等があげられ、具体例としてはグァ-ジゥム塩、エタノール及び酢 酸が好ましい。
[0029] 微生物を吸着させた微粒子の回収は、後述するように、例えば、磁石等を用いて行 うことができる。また、微粒子に吸着させた微生物と微粒子との分離は、例えば、前記 微粒子を生理食塩水や適当な濃度の界面活性剤等に懸濁することによって行うこと ができる。
[0030] 次に、本発明の核酸回収方法は、前述のように、本発明の微生物回収方法により、 試料中の微生物を微粒子に吸着させる微生物吸着工程と、前記微粒子に吸着させ た微生物カゝら核酸を溶出させる核酸溶出工程とを含む。
[0031] 前記核酸溶出工程において、前記微粒子を核酸抽出試薬に接触させ、微粒子に 吸着させた微生物から核酸を溶出させることが好ましい。前記核酸抽出試薬は、回 収対象となる微生物の種類等に応じて決定でき、特に制限されないが、例えば、ポリ ォキシエチレン—p— tーォクチルフエ-ル エーテル (Triton系界面活性剤等）、ポ リオキシエチレン ソルビタン アルキル エステル (Tween系界面活性剤等）及びド デシル硫酸ナトリウム（SDS)等の界面活性剤や、エチレンジァミン四酢酸 (EDTA) 等があげられる。前記 Triton系界面活性剤の具体例としては、商品名 TritonX— 1 00があげられ、前記 Tween系界面活性剤の具体例としては、商品名 Tween20があ げられる。また、前記核酸抽出試薬の溶媒としては、特に制限されないが、例えば、 Tris—HCl等の緩衝液があげられる。
[0032] 本発明の核酸回収方法は、さらに、液体分離工程を含んでもよい。この場合、前記 微生物吸着工程において、微粒子を含む微生物回収液と微生物を含む試料とを接 触させて前記微粒子に前記微生物を吸着させ、ついで、前記液体分離工程におい て、前記微粒子と液体 (例えば、微生物回収液)とを分離し、前記核酸溶出工程を行 うことが好ましい。前記微生物回収液は、前述のとおりである。
[0033] 本発明の核酸回収方法の一例として、微粒子に吸着させた微生物からの核酸の回 収方法について説明する。
[0034] 前記微粒子が磁性粒子である場合、例えば、以下のようにして行うことができる。ま ず、液体分離工程において、容器の外部力 磁石等により磁力を作用させて容器の 内面に磁性粒子を付着させ、この状態で容器力 液体を除去し、前記微生物を吸着 させた磁性粒子を回収する。この方法によれば、不要成分 (例えば、液体成分）と必 要成分 (例えば、磁性粒子等の固体成分)とを分離するための遠心分離操作を行う 必要がなぐ試料力 微生物を回収する作業を簡略ィ匕できる。
[0035] っ 、で、前記核酸溶出工程にぉ ヽて、例えば、前記磁性粒子を核酸抽出試薬中 に分散させ、加熱する。前記加熱温度及び加熱時間は、特に制限されず、例えば、 回収対象である微生物や核酸抽出試薬の種類及び量などによって設定できるが、例 えば、加熱温度が 80〜100°Cであり、加熱時間が 1〜10分であることが好ましい。
[0036] そして、前記液体分離工程と同様に、容器の外部から磁力を作用させて容器の内 面に磁性粒子を付着させ、この状態で容器から核酸を含む核酸抽出試薬を採取す ることによって核酸を回収できる。この方法によれば、不要成分 (例えば、磁性粒子） と必要成分 (核酸を含む核酸抽出試薬)とを分離するための遠心分離操作を行う必 要がなぐ核酸を回収する作業を簡略化できる。
[0037] 一方、前記微粒子が磁性粒子でない場合は、例えば、以下のようにして行うことが できる。前記液体分離工程において、例えば、微粒子の自重により微粒子を自然沈 降させて、微粒子と液体とを分離させる。ついで、前記核酸溶出工程は、前記磁性 粒子の場合と同様にして行い、核酸を溶出した後、前記液体分離工程と同様に、例 えば、微粒子の自重により微粒子を自然沈降させた後、核酸を含む上清を回収する ことによって核酸を回収できる。
[0038] 次に、本発明の微生物回収用キットは、本発明の微生物回収方法に使用する微生 物回収用キットであって、粒子径が 6 μ m以下であり、かつ、その比表面積が 50m2Z g以下である微粒子を含む微生物回収用キットである。本発明のキットによれば、この ような微粒子の使用により、高い回収率で微生物を回収できる。また、従来より少量 の微粒子であっても、高い回収率を実現できるため、コスト的に極めて有利である。 前記微粒子は、本発明の微生物の回収方法と同様のものが使用でき、中でも、磁性 シリカ粒子が好ましい。なお、前記粒子径及び比表面積の決定方法は、前述の通り である。
[0039] 本発明の微生物回収用キットは、さらに、前記微粒子を含む微生物回収液を含む ことが好ましい。前記微生物回収液は、本発明の微生物回収方法に使用するものが あげられる。
[0040] 次に、本発明の核酸回収用キットは、本発明の核酸回収方法に使用する核酸回収 用キットであって、粒子径が 6 μ m以下であり、かつ、その比表面積が 50m2Zg以下 である微粒子、及び核酸抽出試薬を含む核酸回収用キットである。本発明のキットに よれば、このような微粒子の使用により、高い回収率で核酸を回収できる。また、従来 より少量の微粒子であっても、高い回収率を実現できるため、コスト的に極めて有利 である。前記微粒子は、本発明の微生物の回収方法と同様のものが使用でき、中で も、シリカ化合物で被覆された磁性シリカ粒子が好ましい。前記核酸抽出試薬は、例 えば、本発明の核酸回収方法に使用するものが使用でき、前記粒子径及び比表面 積の決定方法は、前述の通りである。
[0041] 本発明の核酸回収用キットは、さらに、前記微粒子を含む微生物回収液を含むこと が好ましい。前記微生物回収液は、例えば、本発明の微生物回収方法に使用するも のがあげられる。
[0042] 次に、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。ただし、本発明は下 記実施例及び比較例により制限されな 、。なお、下記実施例及び比較例にお 、て、 粒子径は、外周のある点とその他の点とを結ぶ線であって、最も長い線の長さとし、 電子顕微鏡を用いて決定し、前記比表面積は、 JISK1150「シリカゲル試験方法」で 規格化された BET (窒素吸着)法に基づき決定した。
実施例 1
[0043] 本実施例は、酸性条件下にお!/、て磁性シリカ粒子を用いて菌体 (淋菌）を回収し、 前記菌体力 核酸を回収した例である。
[0044] (酸性条件下での菌体の回収）
まず、下記表 1に示す各磁性シリカ粒子を用い、磁性シリカ粒子含有液（200mgZ mL)をそれぞれ調製した。ついで、前記磁性シリカ粒子含有液 20 Lと 0. 5Mダリ シン—HCl(pH3) 100 Lとを混合し、微生物回収液を調製した。
[0045] [表 1] 粒子径 比表面積
( u m) (mVg) 実施例 1 -1 商品名 MT03v2- r l (バンド一化学 （株） 製） 0. 1〜 4 2〜10 実施例 1 - 2 商品名 Micromer 00- M (Mi cromod (株） 製） 2 2. 7 実施例 1-3 商品名 MagExtrac tor00- Genome (T0Y0B0 CO. , LTD.製) 2〜6 7. 06 比較例 1 商品名 Micromer 08- M (Mi cromod (株） 製） 12 0. 45
[0046] 前記表 1にお!/、て、実施例 1 1及び 1 2ならびに比較例 1の微粒子の表面修飾 は、 SiOである。実施例 1—3の微粒子は、商品名 MagExtmctor(R)— Genomeの
2
遺伝子抽出キットに含まれる磁性シリカ粒子である。
[0047] 次に、チョコレート寒天培地（日水製薬製）において培養した淋菌コロニーを採取し て生理食塩水に懸濁させ、波長 530nmにおける吸光度（OD )が 0. 18となるよう
530
に、菌体液を調製した。
[0048] 生理食塩水で前記菌体液を 100倍希釈し、この希釈した菌体液 100 μ Lと前記微 生物回収液 120 Lとを混合し、 10回ピペッティングして磁性シリカ粒子に菌体を吸 着させ、磁石で磁性シリカ粒子を集めて上清を除去した。ついで、 10mMグリシン— HCl (pH3) 200 Lを添カ卩して 10回ピペッティングした後、前述と同様にして上清を 除去することによって前記磁性シリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を 3回繰り返した 。このようにして不純物を除去し、前記菌体液中の菌体を磁性シリカ粒子に吸着させ た状態で回収した。
[0049] (菌体からの核酸の回収）
回収した磁性シリカ粒子に核酸抽出試薬 100 μ Lをカ卩えて 10回ピペッティングし、 95°Cで 5分間加熱し、さらに 10回ピペッティングすることによって前記菌体力も核酸 を抽出した。磁石で磁性シリカ粒子を集めた状態で核酸の抽出液を採取した。前記 核酸抽出試薬は、 10mM Tris— HCl (pH8)、 0. ImMエチレンジァミン四酢酸（E DTA) (pH8)及び 1重量％TritonX— 100 (商品名 )の混合液を使用した。
[0050] (核酸の回収率の算出）
下記表 2に示す試薬及び商品名 i— Cycler™(Bio—Rad Laboratories製）を用 い、 50°Cで 2分間、 95°Cで 2分間加熱し、 95°Cで 10秒間及び 56°Cで 60秒間を 50 サイクル行 、、抽出した核酸を PCRにより増幅させつつリアルタイムで蛍光強度を測 定した。蛍光強度が 100となるときのサイクル数を測定し、核酸の Ct値 (Ctl)を求め た。前記測定は、それぞれについて 6回行った。なお、下記表 2に示す試薬の量は、 核酸の抽出液 1. に対する量である。
[0051] [表 2]
H20 18 . 65 し
1 OXGeneTaq Bu f f e r (商品名、 二ツボンジーン製） 2 ■ 5 y L
1 OmM AUGC 0. . 5 μ L
10 OmM MgC 12 0 . 375iiL
5 M *F-D-NG-R 1 - 32 1 L
l O OwM *NG-F3405-20 0 . 125wL
10 O M *NG- 3526 -2 O R 0 . 125 i L
2U//iL UNG (TREV I GEN, I nc製） 0. • 1 ML
5U/ L Ge neTaq NT (商品名、 二ツボンジーン製） 0. . 125 /iL
23. , 5 L
*F-D-NG-Rl-32： (FAM) -ac 11 agagacg 11 acggaaaaa t a t c aacgag- (DABCYL) (配列番号 1) *XG-F3405-20： 5' -gcggttattttctgctcgct-3' (配列番号 2)
*N'G-3526-20R： 5' - accttcgagcagacatcacg-3' (配列番号 3)
なお、 前記 AUGCは、 ATP、 GTP及び CTP (いずれも T a k a r a製） ならびに UTP (ロシュ製） を含む。
[0052] 一方、コントロールとして、 OD が 0.18である前記菌体液 1 μ Lを前記核酸抽出
530
試薬 100 L〖こカロえ、 95°Cで 5分間加熱することによって菌体を溶菌させて核酸を抽 出した。ついで、 PCRにより核酸を増幅させつつリアルタイムで蛍光強度を測定し、 蛍光強度が 100となるときのサイクル数を測定することにより、 Ct値 (Ct2)を求めた。 この測定は 6回行った。
[0053] 核酸の回収率は、実施例又は比較例の Ct値（Ctl)と前記コントロールの Ct値（Ct 2)とを用いて、以下の式より算出した。得られた Ct値及び核酸の回収率 (いずれも平 均値)を下記表 3に示す。
回収率(％)=10072((¾2— etl)
[0054] [表 3] 粒子径（ m) 比表面積 (mソ g) Ct値 核酸の回収率 (¾) 実施例 1 - 1 0. 1〜0. 4 2~10 25. 9 57
実施例 1 2 2 2. 7 25. 7 66
実施例卜 3 2〜6 7. 06 25. 8 62
比較例 1 12 0.45 27. 6 18
コントロール ― ― 25. 1 100
[0055] 前記表 3に示すように、粒子径 6 /z m以下かつ比表面積 50m2Zg以下の微粒子を 使用した実施例（1 1、 1 2及び 1 3)では、高い回収率で核酸を回収できた。一 方、粒子径が前記範囲を満たさない微粒子を使用した比較例 1では、回収率が極め て低ぐ核酸の回収が不十分であった。したがって、粒子径 6 m以下かつ比表面積 50m2Zg以下の微粒子により、核酸 (菌体)を効率良く回収できると 、える。
実施例 2
[0056] 磁性シリカ粒子含有液 (40mgZmL)の添力卩量を Lとし、シリカ粒子の使用量 を実施例 1の 1Z10とした以外は、実施例 1と同様にして核酸を回収した。この結果 を下記表 4に示す。
[0057] [表 4]
Figure imgf000015_0001
[0058] 前記表 4に示すように、磁性シリカ粒子が少量 (実施例 1の 1Z10)であっても、粒 子径 6 μ m以下かつ比表面積 50m2/g以下の微粒子を使用した実施例（2— 1、 2— 2及び 2— 3)では、高い回収率で核酸を回収できた。一方、粒子径が前記範囲を満 たさない微粒子を使用した比較例 2では、回収率が極めて低ぐ核酸の回収が不十 分であった。したがって、粒子径 以下かつ比表面積 50m2/g以下の微粒子に より、少量の磁性シリカ粒子であっても、核酸 (菌体)を効率良く回収できるといえる。 実施例 3 [0059] 本実施例は、磁性シリカ粒子と塩とを含む中性液を用いて菌体 (淋菌）を回収し、回 収菌体力 核酸を回収した例である。
[0060] (中性条件下での菌体の回収）
まず、菌体液及び微生物回収液をそれぞれ調製した。すなわち、下記表 6に示す 5 種類の塩 (濃度 0. 5M)を含む 0. 5M Tris—HCl緩衝液 (pH7. 1)と、塩を含まな い前記緩衝液の計 6種類の緩衝液を準備した。ついで、前記それぞれの緩衝液 100 μ Lと下記表 5の各磁性シリカ粒子を含む磁性シリカ含有液 (400mgZmL) 10 L とを混合し、前記微生物回収液を調製した。一方、菌体液は、実施例 1と同様にして 調製した淋菌懸濁液 (OD : 0. 18)を、生理食塩水で 100倍希釈して調製した。
530
[0061] [表 5]
Figure imgf000016_0001
[0062] 次に、前記微生物回収液 110 Lと希釈した菌体液 100 Lとを混合し、 1分間ピ ペッティングして磁性シリカ粒子に菌体を吸着させた後、前述と同様にして上清を除 去した。ついで、蒸留水 200 /z Lを添加して 10回ピペッティングした後、前述と同様 にして蒸留水を除去することによって前記磁性シリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作 を 3回繰り返した。このようにして不純物を除去し、前記菌体液中の菌体を磁性シリカ 粒子に吸着させた状態で回収した。
[0063] (核酸の回収率の算出）
実施例 1と同様にして核酸の抽出及び PCRを行い、 Ct値を求め、核酸の回収率（ %)を算出した。得られた Ct値及び核酸の回収率を下記表 6に示す。なお、下記表 6 の値は 6回の測定の平均値であり、括弧内の値が Ct値である。また、回収率の算出 に使用したコントロールの Ct値 (Ct2)は、実施例 3—1は 24. 0、実施例 3— 2及び比 較例 3は 22. 2である。
[0064] [表 6] なし L iCl KC1 NaCl MgC CaC lj
実施例 3-1
実施例 3-2
比較例 3
[0065] 前記表 6に示すように、 V、ずれの緩衝液を用いた場合であっても、粒子径 6 μ m以 下かつ比表面積 50m2/g以下の微粒子を使用した実施例（3— 1及び 3— 2)は、粒 子径が前記範囲を満たさない微粒子を使用した比較例 3よりも高い回収率で微生物 を回収できた。
実施例 4
[0066] 本実施例は、磁性シリカ粒子及びタンパク質変性剤を含む緩衝液を用い、血漿中 のウィルス (HBV)を回収し、前記ウィルスカゝら核酸を回収した例である。
[0067] (ウィルスの回収）
まず、粒子径 0. 1 0. 4 111かっ比表面積2 10111278の磁性シリカ粒子（バンド 化学 (株)製;商品名 S— M— 03)を使用し、磁性シリカ粒子含有液 (500mg/mL )を調製した。健常人血漿 100 μ Lに、 HBV Plasma (ProMedDx社製「Numberl 0222136」） 1. O /z Lを添カ卩した後、下記表 8に示すいずれかの緩衝液と前記磁性 シリカ粒子含有液 16 Lを添加した。ついで、 30回ピペッティングして前記磁性シリ 力粒子にウィルスを吸着させ、前述と同様にして上清を除去した。前記ウィルスを吸 着させた磁性シリカ粒子に 10mMグリシン— HCl (pH3) 100 μ Lを添カ卩し、 10回ピ ぺティングした後、前述と同様にして上清を除去することによって前記磁性シリカ粒 子を洗浄した。この洗浄操作を 3回繰り返した。
[0068] (核酸の回収）
洗浄した磁性シリカ粒子に核酸抽出試薬を 100 L加え、 10回ピペッティングした 後、 95°Cで 5分間加熱し、さらに 10回ピペッティングすることによってウィルス力も核 酸を抽出した。前述と同様にして核酸の抽出液を採取して核酸を回収した。前記核 酸抽出試薬としては、 10mM Tris—HCl (pH8)、 0. ImM EDTA (pH8)及び 0 . 1重量0 /oSDSの混合試薬を使用した。 [0069] なお、コントロールとして、前記 HBV Plasma (ProMedDx社製「Number 10222 136」 /zLに前記核酸抽出試薬 100 /zLをカ卩え、 10回ピペッティングし、 95°Cで 5 分間加熱した後、さらに 10回ピペッティングすることによって HBV核酸を抽出した。
[0070] (核酸の回収率の算出）
核酸の抽出液（1.0/zL)、下記表 7に示す試薬及び商品名 i Cycler™(Bio—R ad Laboratories製）を使用して、 50°Cで 2分間、 95°Cで 2分間加熱した後、 95°C で 30秒間及び 56°Cで 60秒間を 50サイクル行!、、蛍光強度が 250となるときのサイク ル数を測定して Ct値を求めた。なお、前記測定は、それぞれについて 3回行った。
[0071] [表 7]
H20 1 9. 86 5 L
1 OXGeneTaq Bu f f e r (商品名、 二ツボンジーン製） 2. 5 L
1 OmM AUGC 0. 5 L
7 ιιΜ *Ta aman-B-F- 1 - 32 0. 71 zL
100 *HBV F50-74 0. 125
1 0 0 M *HB V R 1 36 - 1 0 9 0. 1 25 L
2U/ L UNG (TREV I GEN, I nc製） 0. 0 5 L
5U/wL Ge n eTaq NT (商品名、 二ツボンジーン製） 0. 125 wL
24 iL
*Taqman-B-F-l-32： (FAM) -caacaaccgacc t tgaggcat ac 11 caaagac- (TAMRA) (配歹幡号 4) *IIBV F50-74： 5' -gaggac t c 11 ggac t c t c age aa t g-3 ' (配列番号 5)
*HBV R136-109 5' -cccaactcctcccagtctttaaacaaac-3' (配列番号 6)
[0072] 実施例 1と同様にして、前記 Ct値から回収率を算出した。この結果を、下記表 8に 示す。なお、下記表 8における核酸の回収率は、 3回の測定の平均値である。
[0073] [表 8] 緩衝液 核酸の
種類 添加量（iL) 回収率 (%)
実施例 4-1 0.5Mグリシン- HCl(pH3) 100 57
2.5Mグァニジン塩酸
実施例 4 - 2 0.5Mグリシン- HCl(pH3) 100 87
40%エタノール
実施例 4-3 酢酸 25 81
コントロール 一 ― 100 [0074] 前記表 8に示すように、いずれの実施例においても、高い回収率で核酸を回収でき た。中でも、エタノールを含むグリシン一 HC1緩衝液を使用した場合 (実施例 4— 2)、 回収率が極めて高力つた。
実施例 5
[0075] 本実施例は、磁性シリカ粒子を用いて血漿中のウィルス (HBV)を回収し、前記ウイ ルスから核酸を回収したその他の例である。
[0076] 微生物回収のための緩衝液として 2. 5Mグァ-ジン塩酸を含む 0. 5Mグリシン
HC1緩衝液 (pH3)を使用し、下記表 9に示す微粒子を使用した以外は、実施例 4と 同様にしてウィルスを回収して核酸を抽出し、核酸の回収率を算出した。得られた核 酸の回収率を、コントロールとあわせて下記表 9に示す。
[0077] [表 9]
Figure imgf000019_0001
[0078] 前記表 9に示すように、粒子径 6 /z m以下かつ比表面積 50m2Zg以下の微粒子を 使用した実施例（5— 1及び 5— 2)では、高い回収率で核酸を回収できた。一方、粒 子径が前記範囲を満たさない微粒子を使用した比較例 4では回収率が低ぐ核酸の 回収が不十分であった。
実施例 6
[0079] 本実施例は、磁性シリカ粒子を用いて血漿中のウィルス (HBV)を回収し、前記ウイ ルスから核酸を回収したさらにその他の例である。
[0080] 微生物回収のための緩衝液として、 40%エタノールを含む 0. 5Mグリシン一 HC1 緩衝液 (PH3)を使用した以外は、実施例 5と同様にして、ウィルスを回収して核酸を 抽出し、核酸の回収率を算出した。得られた核酸の回収率を、コントロールとあわせ て下記表 10に示す。
[0081] [表 10] 粒子径（/im) 比表面積 (m½) 核酸の回収率 «)
実施例 6-1 0. 1〜0. 4 2~10 71
実施例 6 2 2 2. 7 81
比較例 5 12 0. 45 31
コントロール ― ― 100
[0082] 前記表 10に示すように、粒子径 6 μ m以下かつ比表面積 50m2/g以下の微粒子 を使用した実施例（6— 1及び 6— 2)では、核酸の回収率が高力つた。一方、粒子径 が前記範囲を満たさない微粒子を使用した比較例 5では回収率が低ぐ核酸の回収 が不十分であった。
実施例 7
[0083] 本実施例は、磁性シリカ粒子を用いて細胞（白血球)を回収し、前記細胞から核酸 を回収した例である。
[0084] (白血球の回収）
生理食塩水 500 μ Lにぺパリン血 50 μ Lを添カ卩した後、下記表 11のいずれかの緩 衝液 100 μ Lと 500mg/mLの磁性シリカ粒子含有液 5 μ Lとを添カ卩した。つ!、で、 ボルテックスで 1分間攪拌して前記磁性シリカ粒子に細胞（白血球)を吸着させた。前 述と同様にして上清を除去し、細胞（白血球)を吸着させた磁性シリカ粒子を回収し た。なお、前記磁性シリカ粒子は、商品名 S— Μ— 03 (バンド一化学 (株)製:粒子径 0. 1〜0. 4 m、比表面積 2〜： LOm2/g、表面修飾 SiO )を使用した。
2
[0085] 前記緩衝液に対応する下記表 11の洗浄液 500 μ Lを前記磁性シリカ粒子に添カロ し、ボルテックスを用いて 5秒間、前記洗浄液を攪拌した後、前述と同様にして洗浄 液を除去することによって前記磁性シリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を 3回繰り した ο
[0086] [表 11]
Figure imgf000020_0001
[0087] (核酸の回収) 白血球を吸着させた磁性シリカ粒子に核酸抽出試薬を 50 L加え、 5秒間ボルテ ッタスで攪拌し、 95°Cで 5分間加熱し、さらに 5秒間ボルテックスで攪拌することによつ て白血球力も核酸を抽出した。前述と同様にして核酸の抽出液を採取した。前記核 酸抽出試薬としては、 10mM Tris—HCl(pH8)、 0. ImM EDTA(pH8)及び 1 %TritonX- 100 (商品名 )の混合試薬を使用した。
[0088] (核酸の回収能）
核酸の抽出液（1.0 L)、下記表 12に示す試薬及び商品名 i Cycler™ (Bio— Rad Laboratories製）を使用して、 95°Cで 1分間加熱し、 90°Cで 1秒間及び 56°C で 15秒間を 50サイクルした。 PCRによる増幅に伴う蛍光強度の変化を経時的に測 定した。得られた結果を図 1に示す。
[0089] [表 12]
H20 40. 75
1 OXGeneTaq Bu f f e r (商品名、 二ツボンジーン製） 2. 5 w L
2. 5mM dNTPs (二ツボンジーン製） 4. 0 ill.
10 OmM MgC 1 0. 5 M L
5uM '3FL-27-wt -F3-27 0. 25
100 M *27 F 1 -2 0. 25/iL
1 00 M '2 7 R 1 - 2 0. 2 5 iL
5U/iL GeneTaa NT (商品名、 二ソポンジーン製） 0. 25 iiL
49 L
*3FL-27-wt-F3-27:5' -gtttattcccCgtatgcaacccttgcc-(BODIPY FL) (配列番号 7) '27Fl-2:5' -agaactttctgtgcgacg (配列番号 8)
'27Rl-2:5' -cagatgcagagctcaatagg (配列番号 9)
[0090] 図 1は、 PCRのサイクルの増加に伴う蛍光強度の変化を示すグラフである。図 1に 示すように、実施例 7—1及び 7— 2ともに、一定のサイクル数が経過すると蛍光強度 が低下したことから、サンプル中に核酸が存在することが確認された。すなわち、粒 子径 6 m以下かつ比表面積 50m2Zg以下の磁性シリカ粒子を用いて、血液中の 白血球が回収でき、前記白血球から核酸が回収できたと!/、える。
[0091] また、実施例 7—1よりも実施例 7— 2の蛍光強度が低いことから、実施例 7— 2にお いてより多くの核酸が検出（回収）されたといえる。すなわち、血液中の白血球を回収 する場合、微生物回収液として MgCl等を含む中性液を使用することにより、さらに
2
効率よく核酸を回収できると 、える。
実施例 8
[0092] 本実施例は、磁性シリカ粒子を用いて細胞（白血球)を回収し、前記細胞から核酸 を回収したその他の例である。
[0093] 実施例 8— 1は、粒子径 0. 1〜0.4 μ mかつ比表面積 2〜10m2Zgの磁性シリカ 粒子（商品名 S— M— 05、バンド一化学 (株)製）、緩衝液として 1M MgClを含む 0
2
.5M Tris-HCl(pH7.2)、洗浄液として 0. ImM EDTA(pH8)を含む 10mM Tris— HCl(pH8)を使用し、下記表 13に示す試薬を使用し、 2分間加熱した後、 9
5°Cで 2分間加熱し、 95°Cで 15秒間及び 56°Cで 45秒間を 50サイクルした以外は、 前記実施例 7と同様に行った。
[0094] 実施例 8— 2は、粒子径 2 mかつ比表面積 2.7m2Zgの磁性シリカ粒子（商品名
Micromer(R)— M、 Micromod (株)製)を使用した以外は、前記実施例 8— 1と同様 に行った。また、比較例 6—1及び 6— 2として、粒子径が 12/zmで、比表面積が 0.4
5m2Zgの磁性シリカ粒子（Micromer(R)— M、 Micromod (株）製）を用いた以外は、 前記実施例 8— 1及び 8— 2のそれぞれと同様にして行った。
[0095] [表 13]
H20 1 9. 2 L
1 OXGeneTaq Bu f f e r (商品名、 二ツボンジーン製) 2. 5 L 1 OmM AUGC 0. 5 L 100 mM MgC 12 0. 37 /I h
5 MM F-T-IAPP-Fl-wt-34* 1 L
1 00 I APP F 2 5 0 -2 6 7* 0. 125 L
100//M I APP R354-331 * 0. 125 L
5U/ii L GeneTaq NT (商品名、 二ツボンジーン製） 0. 1 5
2U/ L _UNG (TREV I GEN, I nc製） 0. 05 L
24 wL
*F - T-IAPP- F卜 wt-34： (FAM) -t teal tccagcaacaac U tgglgccattc Ixlc- (TAMRA) (配列番号 1 0) *IAPP F250-267： 5' -cacatgtgcaacgcagcg-3' (配列番号 1 1)
*IAPP R354-331： 5' -ctcttgccatatgtaltggatccc-3' (配列番号 12) [0096] 図 2に、実施例 8— 1及び比較例 6— 1におけるリアルタイム PCRの測定結果を示し 、図 3に、実施例 8— 2及び比較例 6— 2におけるリアルタイム PCRの測定結果を示す 。図 2に示すように、粒子径 6 m以下かつ比表面積 50m2Zg以下の微粒子を使用 した実施例 8— 1では、粒子径が前記範囲を満たさない微粒子を使用した比較例 6 1よりも多くの核酸が回収できた。また、図 3に示すように、粒子径 6 m以下かつ 比表面積 50m2/g以下の微粒子を使用した実施例 8— 2では、粒子径が前記範囲 を満たさない微粒子を使用した比較例 6— 2よりも多くの核酸を回収できた。
実施例 9
[0097] 本実施例は、磁性シリカ粒子を用いてウィルス (HCV)を回収し、回収したウィルス 力 核酸を回収した例である。
[0098] まず、下記表 14に示す磁性シリカ粒子を準備した。
[0099] [表 14]
Figure imgf000023_0001
[0100] 次【こ、 HCV Plasma (ProMedDx社 Number9990964) 50 【こ、緩衝液（0 . 5Μグリシン クェン酸（ρΗ3)、 40%エタノール） 50 μ Lと前記いずれかの磁性シリ 力粒子の含有液 (500mg/mL) 8 μ Lとを加え、 30回ピペッティングして磁性シリカ 粒子に HCVを吸着させた。前述と同様にして上清を除去した後、蒸留水 (大塚製薬 ) 200 μ Lをカロえ、 10回ピペッティングすることによって HCVを吸着させた磁性シリカ 粒子を洗浄した。この洗浄操作を 3回繰り返した後、前述と同様にして磁性シリカ粒 子を回収した。回収した磁性シリカ粒子に、核酸抽出試薬（10mM Tris-HCl(pH 8)、0. ImM EDTA (pH8)及び 0. 1重量0 /oSDS) 70 Lと RNAsequre Reage nt (Ambion社製） 5 Lとをカ卩え、 10回ピペッティングし、 95°Cで 5分間加熱し、 10 回ピペッティングすることによって HCVの核酸を抽出した。得られた核酸抽出液 75 μ Lに 20%ノ-デット Ρ— 40 (ナカライテスタ（株）製） 25 μ Lを加え、 10回ピベッティ ングし、 60°Cで 10分間加熱した。 [0101] 加熱した核酸抽出液 5 μ Lに対し、下記表 15に示す試薬を使用し、標的配列特異 的消光プローブを用いたリアルタイム PCRを行って HCV RNAを検出した。すなわ ち、商品名 i— Cycler™ (Bio— Rad Laboratories製）を用い、 60°Cで 30分加熱し た後、 94。Cで 2分加熱し、 94。Cで 15秒及び 60。Cで 30秒を 60サイクル行い、 60°C で 7分加熱した。この結果を図 4に示す。
[0102] [表 15]
H20 6. 7 5 y L
5X""* e ac t i on Bu f r e r 5 L
1 OmM AUGC 0. 75 L
100 MM *HC-F 303 -25-3 a 0. 25 w L
I O O M *HCV-R402 -28 0. 125
25mM "Mn (OAc) 2 1 L
1 OU/wL **RNa s e I nh i b i t o r 1
2. 5U//xL ** r T t h DNA po l yme r as e 1 i L
5 M *3 FL-HCV-347-27 1 L
40% グリセロール 3.— 125iiL
20 Mし
* 3FL-HCV-347-27： gc agt acc caaggcc 111 cgcgac cc- (BOD IPY FL) (配列番号 13) *HC-F303-25-3a:5' -ccccgcgagatcactagccgagtag-3' (配列番号 14)
*HCV-R402-28:5' -gc t c a t a t gcacggt c t acgagacc t c-3 ' (配列番号 15)
なお、 前記表 1 5において、 **を付した試薬は、 商品名 RT—PCR h i h 一 P l u s—《逆転一発》 (TOYOBO CO. , LTD) に含まれる試薬である。
[0103] 図 4は、 PCRのサイクル数に伴う蛍光強度の変化を示すグラフである。図 4に示す ように、粒子径 6 μ m以下かつ比表面積 50m2Zg以下の微粒子を使用した実施例（ 9—1及び 9— 2)では、早いサイクルで消光が見られたことから、核酸の回収量が多 いといえる。一方、粒子径が前記範囲を満たさない微粒子を使用した比較例 7では、 ほとんど消光が見られず、回収率が低いといえる。したがって、粒子径 6 m以下か つ比表面積 50m2Zg以下の微粒子の使用により、ウィルスを効率良く回収できるとい える。
実施例 10
[0104] 本実施例は、磁性シリカ粒子を用いてウィルス (HCV)を回収し、前記ウィルスから 核酸を回収したその他の例である。
[0105] HCV Plasma (ProMedDx社 Number9990964) 50 L【こ、緩衝液（0. 5Mグ リシン— HC1 (ρΗ3)及び 40%エタノール） 50 μ Lと、磁性シリカ粒子（商品名 S— Μ — 04 ;バンド一化学 (株)製、粒子径 0. 1〜0. 4 111、比表面積2〜101112/8)含有 液（376mgZmL) 10. 64 /z Lとを加え、 30回ピペッティングして磁性シリカ粒子に H CVを吸着させた。前述と同様にして上清を除去し、蒸留水 (大塚製薬） 100 μ Lをカロ え、 10回ピペッティングすることによって HCVを吸着させた磁性シリカ粒子を洗浄し た。この操作を 3回繰り返した。前述と同様にして上清を除去し、核酸抽出試薬（10 mM Tris—HCl (pH8)、 0. ImM EDTA(pH8)、 0. 1%SDS) 70 Lと RNAse qure Reagent (Ambion社製） 5 Lとをカ卩え、 10回ピペッティングを行い、 95°Cで 5分間加熱し、 10回ピペッティングすることによって HCVの核酸を抽出した。前記核 酸抽出液 75 μ Lに 20%ノ-デット P— 40(R) (ナカライテスタ (株)製） 25 μ Lを加えて 1 0回ピペッティングし、 60°Cで 10分間加熱した。前記実施例 9と同様にして、標的配 列特異的消光プローブを用いたリアルタイム PCRを行って HCV RNAを検出した。 この結果を図 5に示す。
[0106] (比較例 8)
比較例 8として、商品名 QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN)を用い、 HCV Plasma (ProMedDx社 Number9990964) 50 L力ら HCV RNAを精 製し、標的配列特異的消光プローブを用いたリアルタイム PCRを行って HCV RNA を検出した。この結果を、前記実施例 10とあわせて図 5に示す。
[0107] 図 5は、 PCRのサイクル数に伴う蛍光強度の変化を示すグラフである。図 5に示す ように、粒子径 6 μ m以下かつ比表面積 50m2/g以下の磁性シリカ粒子を使用した 実施例 10は、従来の微粒子を使用しない方法 (比較例 8)よりも、早いサイクルで消 光が見られ、また、蛍光強度も低かった。したがって、本発明の方法によれば、従来 の微粒子を使用しな 、方法よりもウィルスを効率よく回収できると 、える。
実施例 11
[0108] 本実施例は、磁性シリカ粒子を用いてウィルス (HIV)を回収し、前記ウィルスから 核酸を回収したさらにその他の例である。 [0109] まず、下記表 16に示す微粒子を準備した。次に、 HIV Plasma (ProMedDx社 Numberl0439039) 50 μ Lに、緩衝液（0. 5Mグリシン—クェン酸（pH3)、 40% エタノール） 50 μ Lと、下記表 16のいずれかの磁性シリカ粒子の含有液（500mgZ mD S /z Lとをカ卩え、 30回ピペッティングして磁性シリカ粒子に HIVを吸着させた。前 述と同様にして上清を除去し、蒸留水（大塚製薬)を 200 L加え、 10回ピぺッティン グすることによって HIVを吸着させた磁性シリカ粒子を洗浄した。この操作を 3回繰り 返した。前述と同様にして上清を除去し、核酸抽出試薬（10mM Tris— HCl (pH8 )、0. ImM EDTA (pH8)、0. 1%SDS) 70 Lと RNAsequre Reagent5 Lと を加え、 10回ピペッティングし、 95°Cで 5分間加熱し、 10回ピペッティングすることに よって HIV核酸を抽出した。前記核酸抽出液 75 μ Lに 20% ノ-デット P— 40(R) (ナ 力ライテスタ (株)製）25 Lをカ卩え、 10回ピペッティングし、 60°Cで 10分間加熱した 。アンプリコア HIV— 1 モニター vl. 5 (ロシュ'ダイァグノスティックス株式会社） を用いて増幅 '検出を行つた。得られた吸光度 (450nm)を下記表 16に示す。
[0110] [表 16]
Figure imgf000026_0001
[0111] 前記表 16に示すように、粒子径 以下かつ比表面積 50m2Zg以下の微粒子 を使用した実施例（ 11— 1、 11— 2及び 11― 3)では、粒子径が前記範囲を満たさな い微粒子を使用した比較例 9と比較して、得られた吸光度 (450nm)が大きぐこれは 、より多くの核酸が回収できたことを示す。したがって、粒子径 6 m以下かつ比表面 積 50m2/g以下の微粒子を使用することによって、高い回収率でウィルス (HIV)を 回収できるといえる。
実施例 12
[0112] 本実施例は、磁性シリカ粒子を用いてウィルス (HIV)を回収し、前記ウィルスから 核酸を回収したさらにその他の例である。 [0113] 実施例 11— 2と同様にして核酸を回収し、増幅した。ついで、 X 1、 X 1Z5及び X 1Z25の希釈系列を作成し、核酸を検出した以外は、実施例 11— 2と同様に行った 。得られた吸光度 (450nm)を下記表 17に示す。
[0114] (比較例 10)
HIV Plasma (ProMedDx社 Number 10439039)を 200 L使用し、商品名 アンプリコア HIV— 1 モニター vl. 5 (ロシュ'ダイァグノスティックス株式会社製） を用いて前処理及び増幅した以外は、前記実施例 12と同様にして検出を行った。得 られた吸光度 (450nm)を下記表 17に示す。
[0115] [表 17]
Figure imgf000027_0001
[0116] 前記表 17に示すように、粒子径 6 /z m以下かつ比表面積 50m2Zg以下の磁性シリ 力粒子を用いた実施例 11の HIV回収能は、アンプリコア HIV— 1 モニター vl. 5による前処理と同等若しくはそれ以上であった。したがって、本発明の微生物回収 方法は、極めて効率よくウィルスを回収できるといえる。
実施例 13
[0117] 本実施例は、微粒子の比表面積及び粒子径が、微生物 (菌体)の回収率に与える 影響を示す例である。
[0118] まず、微粒子の総表面積を一定とし、異なる粒子径を有する磁性シリカ粒子を使用 して菌体 (淋菌）の回収及び核酸の回収を行った。具体的には、下記表 18の磁性シ リカ粒子を使用した以外は、実施例 1と同様に、菌体 (淋菌）を回収して核酸を抽出し 、 PCRにより核酸の回収率を算出した。なお、各微粒子の使用量は、その比表面積 ( m2/g)力も総表面積が 71cm2となるように調整した。得られた回収率を図 6及び下 記表 18に示す。
[0119] [表 18] 粒子径 比表面積 使用量 核酸の回収率
(/xm) (mVg) (mg) ( )
実施例 13-1 商品名 s-raQ-oi 1 17. 8 0. 40 12 実施例 13- 2 商品名 S-FSQ - 01 4 14. 7 0. 48 9 比較例 11 商品名 S-FLQ - 01 10 6. 19 1. 1 6 全てバンド一化学製であり、 表面修飾は、 S i 02である。
[0120] 前記表 18に示すように、総表面積が同一であっても、粒子径 6 m以下かつ比表 面積 50m2/g以下の磁性シリカ粒子を用いた実施例（13— 1及び 13— 2)は、粒子 径が 6 μ mを超える磁性シリカ粒子を使用した比較例 11よりも高い回収率で核酸を 回収できた。
[0121] 次に、微粒子の粒子径を一定（1 μ m)とし、異なる比表面積を有する磁性シリカ粒 子を使用して菌体 (淋菌）の回収及び核酸の回収を行った。具体的には、下記表 19 の磁性シリカ粒子を使用し、その使用量を 0. 4mgとした以外は、実施例 1と同様に、 菌体 (淋菌）を回収して核酸を抽出し、 PCRにより核酸の回収率を算出した。得られ た回収率を図 7及び表 19に示す。
[0122] [表 19]
Figure imgf000028_0001
全てバンド一化学製であり、 表面修飾は、 S i 02である。
[0123] 前記表 19に示すように、比表面積 50m Zg以下の磁性シリカ粒子を使用した実施 例 13— 3は、比表面積が 50m2/gを超える磁性シリカ粒子を使用した比較例 12より も高い回収率で核酸を回収できた。
[0124] これらの結果から、微粒子の粒子径及び比表面積の双方が、微生物の回収におい て重要であることが分かる。
実施例 14
[0125] 本実施例は、微粒子の比表面積及び粒子径が、微生物（ウィルス）の回収率に与 える影響を示す例である。 [0126] まず、微粒子の総表面積を一定とし、異なる粒子径を有する磁性シリカ粒子を使用 してウィルス (HBV)及び核酸の回収を行った。具体的には、下記表 20の磁性シリカ 粒子を使用した以外は、実施例 6と同様に、ウィルス (HBV)を回収して核酸を抽出 し、 PCRにより核酸の回収率を算出した。なお、各微粒子の使用量は、その比表面 積 (m2/g)力も総表面積が 710cm2となるように調整した。得られた回収率を図 8及 び下記表 20に示す。
[0127] [表 20]
Figure imgf000029_0001
全てバンド一化学製であり、 表面修飾は、 S i 02である。
[0128] 前記表 20に示すように、総表面積が同一であっても、粒子径 6 m以下かつ比表 面積 50m2/g以下の磁性シリカ粒子使用した実施例（14— 1及び 14— 2)では、粒 子径が 6 μ mを超える磁性シリカ粒子を使用した比較例 13よりも高い回収率で核酸 を回収できた。
[0129] 次に、微粒子の粒子径を一定（1 μ m)とし、異なる比表面積を有する磁性シリカ粒 子を使用してウィルス (HBV)及び核酸の回収を行った。具体的には、下記表 21の 磁性シリカ粒子を使用し、その使用量を 4. Omgとした以外は、実施例 6と同様に、ゥ ィルス (HBV)を回収して核酸を抽出し、 PCRにより核酸の回収率を算出した。得ら れた回収率を図 9及び下記表 21に示す。
[0130] [表 21]
Figure imgf000029_0002
全てバンド一化学製であり、 表面修飾は、 S i 02である。
[0131] 前記表 21に示すように、比表面積 50m Zg以下の磁性シリカ粒子を用いた実施例 (14— 3及び 14— 4)は、比表面積が 50m2/gを超える磁性シリカ粒子を使用した比 較例 14よりも高い回収率で核酸を回収できた。
[0132] これらの結果から、微粒子の粒子径及び比表面積の双方が、微生物の回収におい て重要であることが分かる。
産業上の利用可能性
[0133] 以上のように、本発明の微生物回収方法によれば、粒子径 6 μ m以下かつ比表面 積 50m2Zg以下の微粒子を使用するため、微生物を効率よく回収できる。また、本発 明の核酸回収方法は、本発明の微生物回収方法により微生物を回収するため、微 生物を効率よく回収でき、その結果、効率よく核酸を回収できる。したがって、本発明 は、微生物及び核酸等を回収する必要がある全ての分野に適用可能であり、例えば 、生体由来試料力 の成分抽出に好ましく適用可能であるが、その用途は制限され ず広い。
配列表フリーテキスト
[0134] 配列番号 1 F— D— NG—Rl— 32 :TaqManプローブ
配列番号 2 NG-F3405 20：フォワードプライマーのために設計したオリゴヌタレ ォチドプローブ
配列番号 3 NG— 3526— 20R：リバースプライマーのために設計したオリゴヌクレオ チドプローブ
配列番号 4 Taqman— B— F—l— 32 : TaqManプローブ
配列番号 5 HBV F50— 74 :フォワードプライマーのために設計したオリゴヌクレオ チドプローブ
配列番号 6 HBV R136— 109 :リバースプライマーのために設計したオリゴヌタレ ォチドプローブ
配列番号 7 3FL— 27—wt—F3— 27 :プローブ
配列番号 8 27F1 2：フォワードプライマーのために設計したオリゴヌクレオチドプ ローブ
配列番号 9 27R1 2：リバースプライマーのために設計したオリゴヌクレオチドプロ ーブ 配列番号 10 F— T IAPP— Fl it— 34 :プローブ
配列番号 11 IAPP F250— 267 :フォワードプライマーのために設計したオリゴヌ クレオチドプローブ
配列番号 12 IAPP R354— 331 :リバースプライマーのために設計したオリゴヌク レオチドプローブ
配列番号 13 3FL— HCV— 347— 27 :プローブ
配列番号 14 HC-F303 25— 3a：フォワードプライマーのために設計したオリゴ ヌクレオチドプローブ
配列番号 15 HCV—R402— 28 :リバースプライマーのために設計したオリゴヌタレ ォチドプローブ

Claims

請求の範囲
[I] 微粒子を用いた微生物の回収方法であって、微粒子と試料とを接触させ、前記試 料中の微生物を微粒子に吸着させる微生物吸着工程を含み、前記微粒子の粒子径 力 /z m以下であり、かつ、その比表面積が 50m2/g以下であることを特徴とする微 生物回収方法。
[2] 前記微粒子が、その表面に、水酸基を有する微粒子である請求の範囲 1記載の微 生物回収方法。
[3] 前記微粒子が、シリカ粒子である請求の範囲 1記載の微生物回収方法。
[4] 前記微粒子が、磁性粒子である請求の範囲 1記載の微生物回収方法。
[5] 前記微粒子が、磁性シリカ粒子である請求の範囲 1記載の微生物回収方法。
[6] 前記微粒子が、磁性金属及び磁性金属酸ィ匕物の少なくとも一方を含む磁性シリカ 粒子である請求の範囲 5記載の微生物回収方法。
[7] 前記微粒子を含む微生物回収液を準備し、前記微生物吸着工程において、前記 微生物回収液と試料とを接触させる請求の範囲 1記載の微生物回収方法。
[8] 前記微生物回収液が、酸性液又は中性液であって、前記酸性液が、 pH2〜3であ り、前記中性液が、 Mg塩、 Na塩、 Ca塩及び K塩力 なる群力 選択される少なくとも
1つの塩を含む中性液である請求の範囲 7記載の微生物回収方法。
[9] 前記微生物回収液が、 Mg塩を含む中性液である請求の範囲 7記載の微生物回収 方法。
[10] 前記微生物回収液が、タンパク質変性剤を含む液である請求の範囲 7記載の微生 物回収方法。
[II] 前記タンパク質変性剤が、グァ-ジゥム塩、エタノール及び酢酸力 なる群力 選 択される少なくとも 1つである請求の範囲 10記載の微生物回収方法。
[12] 前記微生物が、菌体、ウィルス及び細胞力 なる群力 選択される少なくとも 1つで ある請求の範囲 1記載の微生物回収方法。
[13] 前記微生物が、菌体又は細胞であって、前記微粒子の粒子径が 6 μ m以下であり
、かつ、その比表面積が 20m2Zg以下である請求の範囲 1記載の微生物回収方法。
[14] 前記微生物が、ウィルスであって、前記微粒子の粒子径が 2 μ m以下であり、かつ 、その比表面積が 30m2Zg以下である請求の範囲 1記載の微生物回収方法。
[15] 核酸の回収方法であって、試料中の微生物を微粒子に吸着させる微生物吸着工 程と、前記微粒子に吸着させた微生物から核酸を溶出させる核酸溶出工程とを含み 、前記微生物吸着工程が、請求の範囲 1記載の微生物回収方法である核酸回収方 法。
[16] 前記核酸溶出工程において、微生物を吸着させた微粒子を核酸抽出試薬に接触 させることにより、前記微生物から核酸を溶出させる請求の範囲 15記載の核酸回収 方法。
[17] さらに、液体分離工程を含み、前記微生物吸着工程において、微粒子を含む微生 物回収液と、微生物を含む試料とを接触させ、前記液体分離工程において、微生物 を吸着させた微粒子と液体とを分離する請求の範囲 15記載の核酸回収方法。
[18] 請求の範囲 1記載の微生物回収方法に使用する微生物回収用キットであって、粒 子径が 6 μ m以下であり、かつ、その比表面積が 50m2/g以下である微粒子を含む 微生物回収用キット。
[19] 前記微粒子が、磁性シリカ粒子である請求の範囲 18記載の微生物回収用キット。
[20] さらに、微生物回収液を含み、前記微生物回収液が、前記微粒子を含む液である 請求の範囲 18記載の微生物回収用キット。
[21] 前記微生物回収液が、酸性液又は中性液であって、前記酸性液が、 pH2〜3であ り、前記中性液が、 Mg塩、 Na塩、 Ca塩及び K塩力 なる群力 選択される少なくとも
1つの塩を含む中性液である請求の範囲 20記載の微生物回収用キット。
[22] 請求の範囲 15記載の核酸回収方法に使用する核酸回収用キットであって、粒子 径が 6 m以下であり、かつ、その比表面積が 50m2/g以下である微粒子、及び核 酸抽出試薬を含む核酸回収用キット。
[23] 前記微粒子が、磁性シリカ粒子である請求の範囲 22記載の核酸回収用キット。
[24] さらに、微生物回収液を含み、前記微生物回収液が、前記微粒子を含む液である 請求の範囲 22記載の核酸回収用キット。
[25] 前記微生物回収液が、酸性液又は中性液であって、前記酸性液が、 pH2〜3であ り、前記中性液が、 Mg塩、 Na塩、 Ca塩及び K塩力 なる群力 選択される少なくとも つの塩を含む中性液である請求の範囲 24記載の核酸回収用キット。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010034846A1 (es) 2008-09-26 2010-04-01 Biótica, Bioquímica Analítica, S.L. Procedimiento rápido de detección de microorganismos con partículas magnéticas
JP2011155919A (ja) * 2010-02-02 2011-08-18 Fisheries Research Agency ノロウイルス検出用材料および該材料を用いるノロウイルスの検出方法
KR101349713B1 (ko) 2012-06-25 2014-01-14 한국에너지기술연구원 아민-자성 나노응집제를 이용한 미세조류의 회수방법
KR101443147B1 (ko) 2013-10-07 2014-09-24 한국에너지기술연구원 아미노클레이가 코팅된 자성물질, 그의 제조방법 및 아미노클레이가 코팅된 자성물질을 이용한 미세조류의 수확방법
WO2015098959A1 (ja) * 2013-12-26 2015-07-02 国立大学法人名古屋大学 サンプルの破砕方法、生体分子の抽出方法、及びナノワイヤを含む破砕液
JP2017205085A (ja) * 2016-05-20 2017-11-24 Jnc株式会社 磁性粒子を用いた水溶液中の微生物の回収方法および回収装置
WO2018062573A1 (ja) * 2016-09-29 2018-04-05 栄研化学株式会社 細胞の回収方法
WO2020117769A1 (en) * 2018-12-03 2020-06-11 Diagnostics For The Real World, Ltd Hcv detection

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010145754A1 (en) * 2009-06-18 2010-12-23 Merck Patent Gmbh Method for isolating cells
WO2016030357A1 (de) 2014-08-26 2016-03-03 3M Innovative Properties Company System zur entfernung von proinflammatorischen mediatoren sowie von granulozyten und monozyten aus blut

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62269691A (ja) * 1986-04-28 1987-11-24 ロ−ム・アンド・ハ−ス・カンパニ− 細胞培養用又は細胞生産物製造用の微細担体系、及びその製造方法
JPS6328392A (ja) * 1986-07-21 1988-02-06 Fuji Debuison Kagaku Kk 生体物質固定化担体及びこれを用いる酵母あるいは微生物の固定化法
JP2002165591A (ja) * 2000-09-25 2002-06-11 Jsr Corp 磁性粒子およびその使用方法
JP2003265164A (ja) * 2001-05-24 2003-09-24 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 力学的刺激負荷が可能な細胞培養装置

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1517758A1 (de) * 1966-11-02 1970-01-29 Intermag Ag Verfahren zur mengenbestimmten Fixierung und Dosierung von Mikroorganismen
JP2965131B2 (ja) * 1995-07-07 1999-10-18 東洋紡績株式会社 核酸結合用磁性担体およびそれを用いる核酸単離方法
DE19851156C1 (de) * 1998-11-06 2000-04-27 Merck Patent Gmbh Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA
EP1179058B1 (en) * 1999-05-14 2011-08-24 Promega Corporation Cell concentration and lysate clearance using paramagnetic particles
DE10157624A1 (de) * 2001-11-26 2003-06-05 Merck Patent Gmbh Verfahren zur Anreicherung und zum Nachweis von HIV

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62269691A (ja) * 1986-04-28 1987-11-24 ロ−ム・アンド・ハ−ス・カンパニ− 細胞培養用又は細胞生産物製造用の微細担体系、及びその製造方法
JPS6328392A (ja) * 1986-07-21 1988-02-06 Fuji Debuison Kagaku Kk 生体物質固定化担体及びこれを用いる酵母あるいは微生物の固定化法
JP2002165591A (ja) * 2000-09-25 2002-06-11 Jsr Corp 磁性粒子およびその使用方法
JP2003265164A (ja) * 2001-05-24 2003-09-24 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 力学的刺激負荷が可能な細胞培養装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1882738A4 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010034846A1 (es) 2008-09-26 2010-04-01 Biótica, Bioquímica Analítica, S.L. Procedimiento rápido de detección de microorganismos con partículas magnéticas
JP2011155919A (ja) * 2010-02-02 2011-08-18 Fisheries Research Agency ノロウイルス検出用材料および該材料を用いるノロウイルスの検出方法
KR101349713B1 (ko) 2012-06-25 2014-01-14 한국에너지기술연구원 아민-자성 나노응집제를 이용한 미세조류의 회수방법
KR101443147B1 (ko) 2013-10-07 2014-09-24 한국에너지기술연구원 아미노클레이가 코팅된 자성물질, 그의 제조방법 및 아미노클레이가 코팅된 자성물질을 이용한 미세조류의 수확방법
WO2015098959A1 (ja) * 2013-12-26 2015-07-02 国立大学法人名古屋大学 サンプルの破砕方法、生体分子の抽出方法、及びナノワイヤを含む破砕液
JP2017205085A (ja) * 2016-05-20 2017-11-24 Jnc株式会社 磁性粒子を用いた水溶液中の微生物の回収方法および回収装置
WO2018062573A1 (ja) * 2016-09-29 2018-04-05 栄研化学株式会社 細胞の回収方法
WO2020117769A1 (en) * 2018-12-03 2020-06-11 Diagnostics For The Real World, Ltd Hcv detection

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