CN102654502B - 慢性乙型肝炎肝纤维化的蛋白标记物及其检测方法 - Google Patents

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本发明属生物医药领域，涉及一类非创伤性诊断慢性乙型肝炎肝纤维化的血清蛋白分子标记物。本发明的蛋白标记物是下列蛋白中的一种或者几种：人血清糖基化脱铁-转铁蛋白A链，糖蛋白HC复合结构C链，人补体成份C3c，免疫球蛋白M？Fc段，人血红蛋白β链变异型Hb？S尾迹，或者Ig？G1？Fc段A链（Herceptin）的蛋白A模拟肽树状配体。本发明还提供了上述血清蛋白标记物的检测方法和应用，以及根据上述血清蛋白标记物制成的试剂盒。本发明中血清蛋白分子标记物及相关mRNA、MircoRNA等指标可预测慢性乙型肝炎肝纤维化的程度，预测慢性乙型肝炎肝纤维化的程度，对预后判断、治疗选择及疗效评估中的用途。

Description

慢性乙型肝炎肝纤维化的蛋白标记物及其检测方法
技术领域
本发明属生物医药领域，涉及生物医学中诊断肝纤维化血清分子标记物，具体涉及一类非创伤性诊断慢性乙型肝炎肝纤维化的血清蛋白分子标记物。
背景技术
长期以来，肝穿刺活检一直是明确肝病病因、评价肝脏炎症坏死及纤维化程度的金标准，对预后判断、治疗选择及疗效评估等具有重要临床意义，但创伤性、取样误差、观察者自身及观察者间偏倚等不足给临床应用造成许多不便，目前临床诊疗中迫切需要寻找便捷的非创伤性替代指标。近年来，以血清指标组合建立肝纤维化诊断模型成为世界性的研究热点。在一系列肝纤维化非创伤性诊断模型中，较具代表性的包括采用慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染患者建模的Fibrotest、Forns指数、APRI指数和HepascoreL等。而针对慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染的肝纤维化诊断模型仍研究较少，主要有上海市肝纤维化课题协作组(SLFG)所提出的Zeng模型M和我国香港的Hui模型。不过这些研究成果在我国慢性HBV感染患者中尚未得到有效验证和临床应用。
肝纤维化分期诊断的金标准目前国内外采用肝活组织检查+病理学诊断，属于有创伤性的诊断方法，因此临床应用受局限。血清学检测是临床非创伤性肝纤维化诊断的有效方法，具有很好的应用前景。目前创新性的血清肝纤维化诊断分子标记物研究方法包括：蛋白和多肽组学、糖组学、microRNA芯片等技术；而以蛋白组学研究最为成熟。蛋白组学研究的优点包括：技术成熟和稳定，筛选出的差异蛋白验证简便，血清蛋白检测价廉，易与其他血清蛋白结合建立诊断模型提高诊断效力。
然而，目前尚未有报道以本发明的血清蛋白作为慢性乙型肝炎肝纤维化程度的标记物。
发明内容
本发明的目的是提供一类非创伤性诊断慢性乙型肝炎肝纤维化的血清蛋白分子标记物。
本发明的血清蛋白分子标记物，作为一种非创伤性替代指标，能高效预测慢性乙型肝炎肝纤维化的程度，对预后判断、治疗选择及疗效评估等具有现实的临床意义。
本发明提供了一组慢性乙型肝炎肝纤维化的血清蛋白标记物，所述的蛋白标记物是下列蛋白中的一种或者几种：人血清糖基化脱铁-转铁蛋白A链，糖蛋白HC复合结构C链，人补体成份C3c，免疫球蛋白MFc段，人血红蛋白β链变异型HbS尾迹，或者IgG1Fc段A链（Herceptin）的蛋白A模拟肽树状配体。
所述的血清蛋白标记物可以包括人血清糖基化脱铁-转铁蛋白A链、糖蛋白HC复合结构C链、人补体成份C3c、免疫球蛋白MFc段、人血红蛋白β链变异型HbS尾迹和IgG1Fc段A链（Herceptin）的蛋白A模拟肽树状配体。甚至于，所述的蛋白标记物就是由人血清糖基化脱铁-转铁蛋白A链、糖蛋白HC复合结构C链、人补体成份C3c、免疫球蛋白MFc段、人血红蛋白β链变异型HbS尾迹和IgG1Fc段A链（Herceptin）的蛋白A模拟肽树状配体组成。
本发明的血清蛋白分子标记物，它含以下6种表达差异标志物：
ChainA,Apo-HumanSerumTransferrin(Glycosylated)，人血清糖基化脱铁-转铁蛋白A链；
complex-formingglycoproteinHC;ChainC，糖蛋白HC复合结构C链；
HumanComplementComponentC3c，人补体成份C3c；
IgMFc，免疫球蛋白MFc段；
hemoglobinbetachainvariantHbS-Wake[Homosapiens]，人血红蛋白β链变异型HbS尾迹；
ChainA,FcFragmentofIgg1(Herceptin)WithProtein-AMimeticPeptideDendrimerLigand，IgG1Fc段A链（Herceptin）的蛋白A模拟肽树状配体。
上述6种蛋白具体介绍参考genbank数据库（如从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/登录查询）。如，ChainA,Apo-HumanSerumTransferrin(Glycosylated)可参考PDB:2HAV_A，GI:110590599。complex-formingglycoproteinHC;ChainC可以参考Swiss-Prot:P02760.1，GI:122801，UniProtKB:locusAMBP_HUMAN,accessionP02760。HumanComplementComponentC3c可以参考Swiss-Prot:P01024.2，GI:119370332，UniProtKB:locusCO3_HUMAN,accessionP01024；也可以由上海博升生物技术有限公司购得，产品编号:PRO-555。IgMFc可以参考PRF:222978，genbankACCESSION0308221A，GI:222978。hemoglobinbetachainvariantHbS-Wake[Homosapiens]可以参考GenBank:AAN11320.1，GI:23268449。ChainA,FcFragmentofIgg1(Herceptin)WithProtein-AMimeticPeptideDendrimerLigand可以参考PDB:3D6G_A，GI:240104304。
本发明还提供了上述血清蛋白标记物的检测方法，即抽取血清样本，分离提纯其中的蛋白，检测上述的血清蛋白标记物的含量。检测蛋白含量时，可以采用现有的常规操作方法，例如使用质谱、ELISA或者双向电泳，等。其中，ELISA即酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay）。
根据检测获得的上述血清蛋白标记物的含量可以判断慢性乙型肝炎肝纤维化程度。
例如，血清样本中，人血清糖基化脱铁-转铁蛋白A链、人补体成份C3c、免疫球蛋白MFc段、人血红蛋白β链变异型HbS尾迹或者IgG1Fc段A链（Herceptin）的蛋白A模拟肽树状配体的含量为早期纤维化样品中相应蛋白的含量的2倍及以上的，相应蛋白的表达量异常。又如，血清样本中糖蛋白HC复合结构C链的蛋白含量为早期纤维化样品中糖蛋白HC复合结构C链含量的50%及以下的，慢性乙型肝炎肝纤维化程度恶化，按照Scheuer分期为晚期纤维化组。
相应的，本发明还提供了含有上述血清蛋白标记物的慢性乙型肝炎肝纤维化的诊断试剂盒。该诊断试剂盒中含有上述的血清蛋白标记物。除此以外，该诊断试剂盒还通常含有标准样品或者早期纤维化样本，使用说明，等等。
为了检验本发明的血清蛋白标记物，于本发明的血清蛋白分子标记物收集45例不同肝纤维化分期（Scheuer分期S0-S4期，每组平均10例病例）慢性乙型肝炎肝纤维化病例，均以肝活检病理学诊断明确纤维化程度，将S0、S1期列为早期纤维化组，S3、S4期列为晚期纤维化组，留取血清样本。所有血清样本采用蛋白组学检测技术（2DE-MS/MALDI-ToFMS）检测，电泳图谱利用ImageMaster软件分析得出早期纤维化组与晚期纤维化组表达差异2倍以上的血清蛋白，进而与本发明的血清蛋白分子标记物作比较。
上述血清蛋白分子标记物：与早期纤维化组相比，人血清糖基化脱铁-转铁蛋白A链、人补体成份C3c、免疫球蛋白MFc段、人血红蛋白β链变异型HbS尾迹、IgG1Fc段A链（Herceptin）的蛋白A模拟肽树状配体升高2倍以上；糖蛋白HC复合结构C链降低2倍以上。
本发明中，根据所涉及血清蛋白分子标记物、相关mRNA、MircoRNA等指标，预测慢性乙型肝炎肝纤维化的程度，对预后判断、治疗选择及疗效评估中的用途。
本发明中，根据所涉及血清蛋白分子标记物、相关mRNA、MircoRNA等指标，制备成不同的检验检测用品，如制成诊断试剂盒、诊断试纸、诊断试剂；治疗及预后评估相关试剂盒、试纸、试剂等。
本发明所述的血清蛋白分子标记物可以采用动静脉、外周采血、体液采集，漏出液或渗出液采集方式使用。
本发明实验证实所述的血清蛋白分子标记物，通过我们的实验验证可显著提高慢性乙型肝炎肝纤维化非创伤性诊断的特异性及敏感性（特异性89%、敏感性87%）。作为一种非创伤性替代指标，能高效预测慢性乙型肝炎肝纤维化的程度，对预后判断、治疗选择及疗效评估等具有现实的临床意义。
具体实施方式
实施例1：血清蛋白分子标记物诊断慢性乙型肝炎肝纤维化程度的验证。
本发明的血清蛋白分子标记物收集45例不同肝纤维化分期（Scheuer分期S0-S4期，每组平均10例病例）慢性乙型肝炎肝纤维化病例，均以肝活检病理学诊断明确纤维化程度，将S0、S1期列为早期纤维化组，S3、S4期列为晚期纤维化组，留取血清样本。所有血清样本采用蛋白组学检测技术（2DE-MS/MALDI-ToFMS）检测，电泳图谱利用ImageMaster软件分析。结果表明，本发明的血清蛋白标记物，在早期纤维化组与晚期纤维化组表达差异2倍以上。
本发明的血清蛋白分子标记物，它含以下6种表达差异标志物：
表1
实施例2:血清蛋白分子标记物诊断慢性乙型肝炎肝纤维化的程度应用
1、研究对象：2010年收集100例不同肝纤维化分期（Scheuer分期S0-S4期，每组平均20例病例）。
2.研究方法：收集100例不同肝纤维化分期（Scheuer分期S0-S4期，每组平均20例病例）慢性乙型肝炎肝纤维化病例，均以肝活检病理学诊断明确纤维化程度，将S0-S2期列为早期纤维化组，S3-S4期列为晚期纤维化组，留取血清样本。所有血清样本采用血清ELISA检测得出早期纤维化组与晚期纤维化组血清蛋白检测值并组间统计学分析具统计学差异（p<0.05），与上述诊断标记物一致为阳性，否则为阴性。
3.实验结果：研究发现，以上述诊断标记物评价验证组敏感性特异性均达到85%以上。

Claims (2)

1.一组慢性乙型肝炎肝纤维化的血清蛋白标记物，所述的蛋白标记物是人血清糖基化脱铁-转铁蛋白A链、糖蛋白HC复合结构C链、人补体成份C3c、免疫球蛋白MFc段、人血红蛋白β链变异型HbS尾迹和IgG1Fc段A链的蛋白A模拟肽树状配体。
2.慢性乙型肝炎肝纤维化的诊断试剂盒，其特征在于，该诊断试剂盒中含有权利要求1所述的血清蛋白标记物。
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