CN102175839B - IgG核心岩藻糖基化水平检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于蛋白质技术领域，涉及糖蛋白的检测，具体涉及IgG核心岩藻糖基化水平检测方法及其应用，包括计算核心岩藻糖基化的IgG量/核心岩藻糖基化的糖蛋白总量。该方法尽管不能区分健康和乙肝感染患者，但是可用于区分经诊断是乙肝患者中的慢性肝炎患者和肝硬化患者。

Description

IgG核心岩藻糖基化水平检测方法及其应用

技术领域

本发明属于蛋白质技术领域，涉及糖蛋白的检测，具体涉及免疫球蛋白IgG核心岩藻糖基化水平检测方法及其应用。该方法尽管不能区分健康和乙型肝炎病毒(HBV)感染患者，但是可用于区分经诊断是HBV感染者中的慢性肝炎患者和肝硬化患者。

背景技术

近年来人们逐渐清楚地认识到蛋白糖基化修饰在很多疾病的发生发展中扮演着重要角色。肝脏是重要的蛋白质合成、加工场所，与血清蛋白的糖基化状态密切相关。我们在前期研究中已分别发现了HBV感染后、肝硬化及肝癌患者血液中的特征性N-糖结构标志物。但有关这种糖标志物的来源尚存在争议。

IgG是血清中含量最多的免疫球蛋白类型(占人血清Ig的80％)，其结晶段(Fc)含有唯一的N-糖基化修饰保守位点，即Asn-297。Asn-297糖链由于核心七糖上连接的末端糖基不同，存在着种属、组织、年龄和性别特异性。研究提示IgG的Fc段糖基化修饰状态与多种疾病密切相关，例如随类风湿性关节炎的发生、发展，IgG低半乳糖基化修饰的程度增加；晚期卵巢癌病人拥有高水平不对称寡糖结构的Con A结合(高甘露糖)的IgG，该异常糖链存在于IgG的恒定区。IgG糖基化与功能密切相关。连接在Asn-297的糖链可维持抗体的四级结构以及Fc段的热稳定性，并通过影响IgG分子与FcRs、C1q以及FcRn的结合而分别调节IgG分子的抗体依赖细胞毒作用(ADCC)、补体依赖的细胞毒作用(CDC)以及半衰期。

肝硬化是多种慢性肝病特别是病毒性肝炎发展到晚期的主要不良结果；其诊断金标准仍为肝穿刺病理诊断，但众所周知肝穿刺为创伤性检查，难以动态观察，其临床应用受到限制。肝硬化的形成是一个多因素、多细胞参与的复杂过程，这进一步增加了其诊断标志物研究的难度。

临床研究已证实，肝病患者常出现免疫球蛋白水平上升，但其结构特征及其在肝病发生发展中的意义尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种IgG核心岩藻糖基化水平检测方法，并将该方法用于慢性乙肝(CHB)、肝硬化(LC)IgG核心岩藻糖基化水平的检测，可作为无创性肝纤维化监测、诊断中所需的中间结果，也为可能的免疫调控干预提供了潜在的治疗靶点。

具体而言，在第一方面，本发明提供了一种检测血清核心岩藻糖基化水平比值的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(A)血清样品通过凝集素亲和层析，收集核心岩藻糖基化的糖蛋白；

(B)分别检测收集的核心岩藻糖基化的糖蛋白总量(简称为LCA-TP)和其中核心岩藻糖基化的IgG量(简称为LCA-IgG)；

(C)计算核心岩藻糖基化的IgG量/核心岩藻糖基化的糖蛋白总量。

其中，血清样品是离体样品，优选是人血清样品。本发明的方法不包括从生物体取样的步骤。

优选其中，所述的凝集素是小扁豆凝集素(简称为LCA)。

优选其中，该方法不包括检测血清样品的HBV感染性。由于本发明的方法不能区分健康人群和慢性乙肝患者，而对于其他疾病患者(如，HIV感染者)也不具有诊断依据，只能用于判断HBV感染的患者中肝纤维化的倾向。因此，当不清楚血清样品是否是来自HBV感染的患者中的时候，即使是有经验的医师，也无法根据核心岩藻糖基化的IgG量/核心岩藻糖基化的糖蛋白总量这一比值直接诊断出是否患有肝纤维化或其倾向。因此，本发明的方法是可以用于诊断肝纤维化的诊断过程中得出非充分中间结果的过程。

优选其中，核心岩藻糖基化的糖蛋白总量通过双缩脲法来检测，和/或核心岩藻糖基化的IgG量通过免疫比浊法来检测。更优选其中，核心岩藻糖基化的糖蛋白总量通过双缩脲法来检测，而且核心岩藻糖基化的IgG量通过免疫比浊法来检测。在本发明的具体实施方式中，就是通过优选的方式进行检测。

优选其中，该方法进一步包括核心岩藻糖基化的IgG量/核心岩藻糖基化的糖蛋白总量的比值与51.12％相比较的步骤。这样，如果进一步检测出血清样品是来自HBV感染患者的血清(尽管这一检测不包括在本发明的方法中)，这可以直接判断该患者是否有肝纤维化的倾向。

另外其中，该方法也可以不包括核心岩藻糖基化的IgG量/核心岩藻糖基化的糖蛋白总量的比值与51.12％相比较的步骤。

在第二方面，本发明提供了用于本发明第一方面的方法的检测系统，其特征在于该系统包括预装凝集素亲和层析柱、生化分析仪、输入设备、计算设备和输出设备，其中输入设备能将核心岩藻糖基化的IgG量和核心岩藻糖基化的糖蛋白总量输入计算设备，计算设备能计算LCA-IgG/LCA-TP值。这些仪器本身是常规设备，但是它们组合在一起的系统是本发明人对本发明第一方面的方法进行研究后的结果。计算设备可以是个人电脑、服务器，也可以是只能做除法的计算设备，后者已经能够满足本发明的系统对计算设备的要求。

优选其中，凝集素亲和层析柱是扁豆凝集素亲和层析柱。

在另一个方面，本发明提供了本发明第二方面的检测系统在制造用于本发明第一方面的方法的装置中的应用。

在第三方面，本发明提供了本发明第一方面的检测血清核心岩藻糖基化水平比值的方法在诊断肝硬化中的应用，其中还进一步包括检测血清样品是否是HBV感染者的血清样品的步骤。优选其中，包括诊断个体是HBV感染者并采集血清样品供本发明第一方面的检测血清核心岩藻糖基化水平比值的方法中使用。

附图说明

图1三组患者总蛋白、白蛋白和IgG测定结果(x±s，g/L)。

**表示与其它两组均有统计学差异(P＜0.05)

图2三组患者LCA-TP和LCA-IgG测定结果(x±s，g/L)。

**表示与其它两组均有统计学差异(P＜0.05)

图3：从CHB中辨别诊断LC时，LCA-IgG/LCA-TP、LCA-IgG和LCA-TP/TP的ROC曲线。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述。

实施例1：正常对照组(Control)、慢性乙肝组(CHB)和HBV肝硬化(LC)组IgG核心岩藻糖基化水平的检测分析。

收集2006年9月～2009年9月来我院接受治疗并明确诊断的CHB、LC患者的血清各20例，其中每组男16例，女4例；平均年龄51.6±13.2岁。所有入选患者还必须满足以下标准：(1)均为乙型肝炎病毒(HBV)感染的乙肝患者；(2)由于经研究发现，其他病毒的感染者与正常对照组的(岩藻糖化)的TP，ALB和IgG均不具有以下规律，因此排除人类免疫缺陷病毒，肝炎病毒丙型、丁型、戊型和梅毒等除HBV感染之外的病原体感染；(3)排除自身免疫性肝病、酒精性肝病、药物性肝病和Wilson病。另外选择健康体检者20例作为对照组，平均年龄51.2±10.3岁。肝硬化组、肝炎组及对照组之间性别、年龄等一般资料比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。

试剂或仪器：特异性结合核心岩藻糖的LCA凝集素亲和柱、清洗液和洗脱液，免疫球蛋白G测定试剂盒(免疫比浊法)购自德赛诊断系统(上海)有限公司，仪器采用日本日立(Hitachi)7170生化分析仪，应用spss软件分析结果。

1)以上人员均抽提空腹全血，静置30分钟，3000rpm，10min.吸取上层血清，-80℃冰箱保存备用。

2)分离纯化核心岩藻糖基化总蛋白

a.200ul血清加入300ul清洗液中，混匀待用；

b.将预装LCA凝集素亲和柱装入离心柱外管，室温以3000rpm/min离心20秒；

c.将稀释血清加入预装LCA凝集素柱，静置10min，以3000rpm/min离心20秒；

d.加入1ml清洗液，以3000rpm/min离心20秒；

e.将预装LCA凝集素柱装入新离心柱外管，加500ul洗脱液，室温以3000rpm/min离心20秒；

f.收集离心柱外管内液体。

3)检测分析

采用日立(Hitachi)7170生化分析仪检测血清及离心柱外管内收集液体的TP，ALB和IgG。血清中的TP、白蛋白和IgG分别采用双缩脲法、溴甲酚绿法和免疫比浊法进行检测[依次分别参见参考文献1，2，3]。离心柱外管内收集液体的岩藻糖化的TP和IgG检测方法与与血清中相同成分的检测相同。

将LC检测结果与慢性乙肝对照组(CHB)和阴性对照组(健康正常组)比较分析。本发明检测结果为：

①肝硬化组TP、ALB、IgG与CHB和正常对照组相比显著升高，且差异均具有统计学意义(P＜0.05)；CHB和正常对照组间各测试指标虽存在差异，但无统计学意义(P＞0.05)(见图1)。

②LC和CHB的岩藻糖化-总蛋白(LCA-TP)均高于正常对照组，但不具有统计学差异(P＞0.05)，CHB组和正常对照组间的差异无统计学意义(P＞0.05)(见图2)。

③正常对照组的LCA-IgG/LCA-TP平均值是46.92％，而CHB组的LCA-IgG/LCA-TP平均值是45.68％，非常接近，表明该值无法用于直接诊断出健康人群和乙型肝炎患者。然而对于已经确诊为HBV感染的患者来说，在鉴别肝硬化和慢性乙肝(CHB)组时，发现LCA-IgG/LCA-TP的临界值为51.12％，大于51.12％被判断为肝硬化，而小于51.12％被判断为慢性乙肝，这一判断规律正确率为87.5％。LCA-IgG、LCA-TP/TP也具有一定的参考检测特异性和灵敏度(见表1)。

表1从HBV中辨别诊断肝硬化的诊断结果评估

实施例2：检测患者血清TP、IgG、LCA-TP和LCA-IgG

具体实验步骤：

1)患者1、2、3和4抽血，留取血清。

2)分离纯化核心岩藻糖基化总蛋白

a.200ul血清加入300ul清洗液中，混匀待用；

b.将预装LCA凝集素亲和柱装入离心柱外管，室温3000rpm/min，20秒；

c.将稀释血清加入预装LCA凝集素柱，静置10min，3000rpm/min，20秒；

d.加入1ml清洗液，3000rpm/min，20秒；

e.将预装LCA凝集素柱装入新离心柱外管，加500ul洗脱液，室温3000rpm/min，20秒；

f.收集管内液体。

3)检测分析

采用日立(Hitachi)7170生化分析仪检测血清及管内收集液体的TP，ALB和IgG。

根据LCA-IgG/LCA-TP)对患者进行分组，即LCA-IgG/LCA-TP≥51.12％的为肝硬化，LCA-IgG/LCA-TP＜51.12％的非肝硬化慢性乙肝。

表2：4位患者的各测试指标和LCA-IgG/LCA-TP值

7)根据cut off值51.12％，我们可以推断患者3(LCA-IgG/LCA-TP≥51.12％)，为肝硬化患者，而患者1、2和4(LCA-IgG/LCA-TP＜51.12％)，为非肝硬化慢性乙肝。

8)随后对患者进行超声，肝穿刺等体格检查，结果证实患者3为肝硬化患者，而患者1、2和4为非肝硬化慢性乙肝。

可见在临床运用上，对于已经确诊为乙肝患者的，本发明检测方法在四例乙肝患者中均正确。

参考文献

[1]Weichselbaum T.E.，An accurate and rapid method for the determination of proteins in smallamounts of blood serum and plasma.American Journal of Clinical Pathology，1946，10：40-49.

[2]B.T.Doumas，W.Ard Watson，and H.G.Biggs，Albumin standards and the measurement ofserum albumin with bromcresol green.Clinica Chimica Acta，1971，31：87-96.

[3]检验医学诊断技术(第三版)，ISBNT-117-04424-1/R.4425.

Claims (7)

1.一种检测血清核心岩藻糖基化水平比值的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(A)血清样品通过凝集素亲和层析，收集核心岩藻糖基化的糖蛋白；

(B)分别检测收集的核心岩藻糖基化的糖蛋白总量和其中核心岩藻糖基化的IgG量；

(C)计算核心岩藻糖基化的IgG量/核心岩藻糖基化的糖蛋白总量；

而且，该方法不包括检测血清样品的HBV感染性。

2.根据权利要求1所述的核心岩藻糖基化水平比值的方法，其特征在于，所述的凝集素是扁豆凝集素(LCA)。

3.根据权利要求1所述的核心岩藻糖基化水平比值的方法，其特征在于，核心岩藻糖基化的糖蛋白总量通过双缩脲法来检测，和/或核心岩藻糖基化的IgG量通过免疫透射比浊法来检测。

4.根据权利要求1所述的核心岩藻糖基化水平比值的方法，其特征在于，该方法进一步包括核心岩藻糖基化的IgG量/核心岩藻糖基化的糖蛋白总量的比值与51.12％相比较的步骤。

5.根据权利要求1所述的核心岩藻糖基化水平比值的方法，其特征在于，该方法不包括核心岩藻糖基化的IgG量/核心岩藻糖基化的糖蛋白总量的比值与51.12％相比较的步骤。

6.一种检测系统在检测血清核心岩藻糖基化水平比值的方法中的应用，其中，

所述检测系统由预装凝集素亲和层析柱、生化分析仪、输入设备、计算设备和输出设备组成，其中输入设备能将核心岩藻糖基化的IgG量和核心岩藻糖基化的糖蛋白总量输入计算设备，计算设备能计算LCA-IgG/LCA-TP值；和，

所述检测血清核心岩藻糖基化水平比值的方法，其特征在于，该方法由以下步骤组成：

(A)血清样品通过凝集素亲和层析，收集核心岩藻糖基化的糖蛋白；

(B)分别检测收集的核心岩藻糖基化的糖蛋白总量和其中核心岩藻糖基化的IgG量；

(C)计算核心岩藻糖基化的IgG量/核心岩藻糖基化的糖蛋白总量；而且，该方法不包括检测血清样品的HBV感染性。

7.根据权利要求6所述的应用，其中凝集素亲和层析柱是扁豆凝集素亲和层析柱。

Images