JP6356227B2 - メタロβラクタマーゼの阻害剤 - Google Patents

Description

関連出願
本願は、２０１３年５月７日に出願の係属中の米国特許仮出願番号第６１／８２０，２７７号の優先権の利益を主張するものであり、この内容は本明細書中参照として全体に援用される。

本願は、細菌感染症のための併用処置に関する。たとえば本願は、メタロβラクタマーゼを発現する細菌の感染症、またはメタロβラクタマーゼを発現する細菌の感染症から生じる疾患、障害、もしくは状態の処置のための、１つまたは複数の抗生剤および本明細書中に定義されるような式Ｉの１つまたは複数の化合物の使用に関する。

βラクタム系抗生物質（β−ｌａｃｔａｍ）（ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム、およびモノバクタム）は、医学において、特に重篤なグラム陰性細菌感染症の処置において最も重要であり、頻繁に使用される抗生剤のクラスの１つである。過去６０年にわたるペニシリンおよびセファロスポリンの臨床的な導入から、これら化合物の細胞殺傷の活性に関与する、β−ラクタム環を加水分解する酵素であるβラクタマーゼの出現により継続する臨床的な問題が起こっている^１。抗生剤の耐性により、βラクタマーゼが触媒する加水分解からコアのβ‐ラクタム骨格を保護しつつ抗菌スペクトラムを広くするために医学上化学的な努力が強化されてきた。この結果、現存するβラクタマーゼに対する効果および耐性が改善した何世代ものβラクタム系抗生物質がある。しかしながら、病原菌も同様に、主に新規のまたは変化したβラクタマーゼを得ることによりさらなる耐性機構を発展させている。これは、多くの最新の世代のセファロスポリンおよびペニシリンを不活性化させる基質特異性拡張型βラクタマーゼの出現がその典型である（しかしカルバペネムはこれに当てはまらない）^２。結果として、ここ２０年間で、イミペネムおよびメロペネムなどのカルバペネムの利用が顕著に増加している。予想通り、このカルバペネムの消費の増大によってカルバペネム耐性グラム陰性細菌が出現している^３。特に、カルバペネム耐性腸内細菌（ＣＲＥ）は、シカゴ^５およびブリティッシュコロンビア^６での近年の大流行により証明されるように、世界中で高まっている問題である^４。

カルバペネムを不活性化させる、カルバペネマーゼのβラクタマーゼは、β‐ラクタム環の加水分解の機構に基づき２つのカテゴリに分けることができる。第１のカテゴリは、たとえばＫＰＣ型およびＯＸＡ−４８型など、β‐ラクタム環を共有結合的に攻撃するセリン残基を活性部位に配置する^７。第２のカテゴリは、たとえばヴェローナ・インテグロンコード型メタロβラクタマーゼ（Ｖｅｒｏｎａ ｉｎｔｅｇｒｏｎ−ｅｎｃｏｄｅｄ ｍｅｔａｌｌｏ−β−ｌａｃｔａｍａｓｅ；ＶＩＭ）およびニューデリー・メタロβラクタマーゼ（ＮＤＭ）型など、環を開裂する求核性水分子を活性化するためにＺｎ^２＋原子を使用するメタロβラクタマーゼ（ＭＢＬ）である^８。Ｓｅｒ βラクタマーゼのいくつかの阻害剤は、耐性を克服するためにβラクタム系抗生剤と共に阻害剤が処方される共薬剤として臨床的に利用可能である（たとえば、クラブラン酸‐アモキシシリン、タゾバクタム‐ピペラシリン、スルバクタム‐アンピシリン、およびより最近の、様々なセファロスポリンと対でフェーズＩＩＩの臨床試験段階にある、Ｓｅｒ βラクタマーゼ阻害剤アビバクタム）^９。継続的な努力にも関わらず^{１０、１１}、実務的および技術的な理由のため、診療において同等のＭＢＬの阻害剤は存在しない。第１に、近年まで、ＭＢＬ由来のＣＲＥは主な臨床問題として考えられておらず、この急速な増加は、ＭＢＬ阻害剤の開発の速度をしのいでいる。第２に、ＶＩＭおよびＮＤＭなどの臨床的に鍵となる重要なＭＢＬを中和する単一の阻害剤の開発は、技術的に非常に難しいと考えられており、ヒトの金属酵素との交差反応性に関連するｉｎ ｖｉｖｏでの毒性を克服することも懸念されている。重大な臨床的脅威としてのＭＢＬの近年の出現に伴い、ＭＢＬの強力かつ安全な阻害剤、特にＶＩＭおよびＮＤＭに対する阻害剤が、感染性疾患の管理に非常に有益となるであろう。

アスペルギロマラスミンＡおよびＢは、１９６０年代初期に発見、報告された真菌由来の分子である^{１２、１３}。これらの分子は、１９８０年代にアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害剤として^１４、および１９９０年代初期に、血管の筋肉収縮を調節するペプチドである、ヒトのエンドセリンの活性化の阻害のための前臨床の候補物質として^{１５、１６}評価された。この以前の研究から、ＡＭ‐Ａは、マウスでの耐容性が良好で毒性が低く（ＬＤ_５０：ＥＤＴＡの２８．５ｍｇ／ｋｇと比較して１５９．８ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．））、平均心房血圧に影響しないことが実証された^１７。別の試験では、ラットにおいて、ＡＭ‐ＡではＬＤ_５０が２５０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）であり、ＡＭ−ＢではＬＤ_５０が６６０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）であることが報告されている^１４。

リコマラスミンもまた、１９４７年に最初に報告された真菌由来の分子である^１８。

本願では、化合物アスペルギロマラスミンＡ（ＡＭ−Ａ）ならびに特定の類似体および誘導体を、βラクタム系抗生剤の増強剤として開示する。

よって、一実施形態では、本願は、
１つまたは複数のβラクタム系抗生剤と、
１つまたは複数の式Ｉ

の化合物であって、式中、
Ｒ^１が、Ｃ（Ｏ）ＯＲ^５、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ^５、およびＣＨ（ＮＨ_２）Ｃ（Ｏ）ＯＲ^５から選択され；
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５が、独立して、Ｈ、Ｃ_１−２４アルキル、Ｃ_１−６アルキレンＣ_６−１０アリール、Ｃ_１−６アルキレンＣ_３−１０シクロアルキル、Ｃ_１−６アルキレンＣ_３−１０ヘテロシクロアルキル、およびＣ_１−６アルキレン−ＯＣ（Ｏ）Ｃ_１−６アルキルから選択され；
ｎ、ｍ、およびｐが、１および２から独立して選択される；
化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物と
を含む医薬組成物であって、
１つまたは複数のβラクタム系化合物および１つまたは複数の式Ｉの化合物は、細菌感染症、または細菌感染症から生じる疾患、障害、もしくは状態を処置するために有効な量で存在する、
医薬組成物を含む。

別の実施形態では、本願は、細菌感染症を処置する方法であって、１つまたは複数の式Ｉ

の化合物であって、式中、
Ｒ^１が、Ｃ（Ｏ）ＯＲ^５、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ^５、およびＣＨ（ＮＨ_２）Ｃ（Ｏ）ＯＲ^５から選択され；
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５が、独立して、Ｈ、Ｃ_１−２４アルキル、Ｃ_１−６アルキレンＣ_６−１０アリール、Ｃ_１−６アルキレンＣ_３−１０シクロアルキル、Ｃ_１−６アルキレンＣ_３−１０ヘテロシクロアルキル、およびＣ_１−６アルキレン−ＯＣ（Ｏ）Ｃ_１−６アルキルから選択され；
ｎ、ｍ、およびｐが、独立して１および２から選択される；
化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物の有効量と併用して１つまたは複数のβラクタム系抗生剤の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を含む。

別の実施形態では、本願は、対象において細菌感染症から生じる疾患、障害または状態を処置または予防する方法であって、１つまたは複数の上記に定義される式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物の有効量と併用して１つまたは複数のβラクタム系抗生剤の有効量を、対象に投与することを含む、方法を含む。

別の実施形態では、本願は、細菌感染症を処置するβラクタム系抗生剤の効力を改善する方法であって、抗生剤と併用して、１つまたは複数の上記に定義される式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法、ならびに細菌感染症から生じる疾患、障害または状態を処置するβラクタム系抗生剤の効力を改善する方法であって、抗生剤と併用して、１つまたは複数の上記に定義される式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を含む。

本願はまた、動物またはヒトにおいて細菌感染症を処置する方法であって、細菌感染症を処置するために有効である量の薬学的に許容可能なβラクタム系抗生剤と併用して所定のβラクタマーゼ阻害剤を投与することを含む、方法を含む。本願はまた、動物およびヒトの対象において、メタロβラクタマーゼを発現する腸内細菌、特に肺炎桿菌に関連する疾患を処置する方法であって、βラクタム系抗生剤、特にカルバペネム系抗生剤の有効量と併用して、ＡＭ‐Ａ、または任意の活性ＡＭ‐Ａ類似体もしくは誘導体のいずれかの有効量を対象に投与することを含む、方法を含む。

また本願は、有効量の真菌の天然産物、アスペルギロマラスミンＡまたはその任意の活性類似体、およびβラクタム系抗生剤を含む、抗菌配合剤を含む。一実施形態では、真菌の天然産物はアスペルギロマラスミンＡまたはその任意の活性類似体であり、βラクタム系抗生剤はペニシリン、セファロスポリン、モノバクタムおよびカルバペネム系抗生剤からなる群から選択される。さらなる実施形態では、真菌の天然産物はアスペルギロマラスミンＡまたはその任意の活性類似体であり、βラクタム系抗生剤はカルバペネムである。さらなる実施形態では、βラクタム系抗生剤はメロペネムである。

本願の実施形態では、抗菌配合剤は医薬的な剤形に製剤化される。本願のさらなる実施形態では、抗菌配合剤は個体での細菌感染症を処置かつ／または予防する方法で使用されるためのものであって、上記感染症は１つまたは複数のβラクタマーゼを産生する細菌により引き起こされ、上記方法はヒトまたは動物の対象に配合剤を投与することを含む。

一実施形態では、細菌感染症は少なくとも１つのメタロβラクタマーゼ（ＭＢＬ）を発現する細菌の感染症であり、細菌感染症から生じる疾患、障害または状態は少なくとも１つのＭＢＬを発現する細菌の感染症から生じる疾患、障害または状態である。

一実施形態では、感染症を引き起こす細菌は、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌および他のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌、肺炎球菌、ストレプトコッカス・アガラクチア、エンテロコッカス属、コリネバクテリウム・ジフテリエ、リステリア・モノサイトゲネス、バチルス・アントラシス、ナイセリア・メニンギティディス、ナイセリア・ゴノレー、モラクセラ・カタラーリス、ビブリオ・コレラエ、およびカンピロバクター・ジェジュニから選択される。

一実施形態では、感染症を引き起こす細菌は、腸内細菌（大腸菌類、サルモネラ属、クレブシエラ属、エンテロバクター属を含む）、緑膿菌、アシネトバクター属、インフルエンザ菌、破傷風菌、ボツリヌス菌、バクテロイデス属、プレボテラ属、ポルフィロモナス属、フソバクテリウム属、結核菌、およびらい菌から選択される。

一実施形態では、感染症を引き起こす細菌は腸内細菌科由来である。

一実施形態では、感染症を引き起こす細菌は肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）である。

本願はまた、細菌耐性遺伝子を発現する細菌細胞を含む細胞ベースのスクリーニングアッセイであって、上記細胞が（ｉ）細胞内への分子の侵入を遮断するタンパク質をコードする遺伝子および（ｉｉ）細胞からの分子の排出を促進するタンパク質をコードする遺伝子のうちの１つまたは複数が欠失するように改変されている、アッセイを含む。

また本願は、抗生剤耐性を処置する化合物を同定する方法であって、
（ａ）細菌耐性遺伝子を発現する細菌細胞と１つまたは複数の化合物を接触させることであって、上記細胞が（ｉ）細胞内への分子の侵入を遮断するタンパク質をコードする遺伝子および（ｉｉ）細胞からの分子の排出を促進するタンパク質をコードする遺伝子のうちの１つまたは複数が欠失するように改変されており、上記１つまたは複数の化合物が、細菌耐性遺伝子によりコードされるタンパク質に感受性のある抗生剤の存在下で細胞と接触される、ことと、
（ｂ）抗生剤耐性を処置する化合物として細菌細胞の増殖を阻害する化合物を同定することと
を含む、方法を含む。

本願の他の特性および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、本願の実施例を表すものではあるが、単なる例示として与えられるものであり、これらの実施形態により特許請求の範囲が限定されるものではなく、全体として本明細書と矛盾することのない最も広い解釈がなされる。

本願の実施形態を、以下の添付図面を参照してより詳細に説明する。

ＡＭ−Ａ（（ａ）で表される）は、（ｂ）ＮＤＭ‐１（●）（ＩＣ_５０：４．０±１．０μＭ）およびＶＩＭ‐２（○）（ＩＣ_５０：９．６±２．４μＭ）を阻害するが、ＯＸＡ４８の活性（■）はＡＭ‐Ａに影響されなかった。（ｃ）ＰＤ１０カラムを介したＡＭ‐Ａの除去はＮＤＭ−１の活性を回復させず、不可逆的な不活性化が確認される。（ｄ）過度のＺｎＳＯ_４を添加することにより不活性化後の活性が回復する。（ｅ）ＮＤＭ‐１およびＶＩＭ−２の不活性化の比率は［ＡＭ−Ａ］で飽和可能である。（ｆ）ＩＣＰ−ＭＳによりＮＤＭ−１からのＺｎの欠失が確認される。エラーバーは、３回反復の標準偏差を表す。 （ａ、ｂ）カルバペネム感受性株（ｂ，Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ ＭＩＣ＝０．００８−０．０１６μｇ／ｍｌ）に対してではなく、ＣＲＥ（ａ，肺炎桿菌 Ｎ１１−２２１８ ＭＩＣメロペネム＝３２μｇ／ｍｌ）に対し選択的なＡＭ−Ａおよびメロペネムの併用作用を示す微量希釈チェッカーボード解析。（ｃ）ＶＩＭおよびＮＤＭを発現するグラム陰性病原菌は、メロペネム／ＡＭ−Ａの併用（それぞれ２μｇ／ｍｌおよび８μｇ／ｍｌ）に感受性が高く、ＡＩＭ、ＩＭＰ、およびＳＰＭ‐１を発現する単離物は、抵抗性があるままであった。 腹腔内注射により肺炎桿菌 Ｎ１１−２２１８（メロペネム、ＭＩＣ：３２μｇ／ｍＬ）の致死用量を与えたＣＤ‐１マウスの処置の結果を示す。（ａ、ｂ）マウスのグループを、皮下注射により、単一用量のメロペネム（１０ｍｇ／ｋｇ）、メロペネム（１０ｍｇ／ｋｇ）＋ＡＭ−Ａ（１０ｍｇ／ｋｇ）の併用、またはＰＢＳで処置した。脾臓（ａ）および肝臓（ｂ）での注射および細菌量を、選択的なプレーティングにより決定した。データは、２つの別の実験からの標準誤差を伴う平均値である。（ｃ）マウスを、皮下注射により、単一用量のメロペネム（１０ｍｇ／ｋｇ）、メロペネム（１０ｍｇ／ｋｇ）＋ＡＭ−Ａ（３０ｍｇ／ｋｇ）の併用、またはＰＢＳで処置した。

Ｉ．定義
特段記載がない限り、このセクションおよび他のセクションに記載される定義および実施形態は、当業者が適切に理解するために説明される本明細書中の本願の全ての実施形態および態様に使用可能であるように意図される。

本願の範囲を理解する際に、本明細書中で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその派生語は、記載される特性、要素、構成要素、群、整数、および／またはステップの存在を特定するが、記載されていない他の特性、要素、構成要素、群、整数、および／またはステップの存在を除外するものではない、オープンエンドの用語であると意図される。また前述の定義は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびそれらの派生語といった用語などの類似の意味を有する用語にも適用される。本明細書中で使用される用語「からなる」およびその派生語は、記載される特性、要素、構成要素、群、整数、および／またはステップの存在を特定するが、記載されない特性、要素、構成要素、群、整数、および／またはステップの存在を排除するクローズドの用語であると意図される。本明細書中に使用される、用語「本質的に〜からなる」は、記載される特性、要素、構成要素、群、整数、および／またはステップの存在を特定し、かつ特性、要素、構成要素、群、整数、および／またはステップの基本的かつ新規な特徴に著しく影響を与えるものではないと意図される。

本明細書中に使用される「実質的に」、「約（ａｂｏｕｔ）」、および「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」などの用語の度合いは、最終的な結果が顕著に変化しないように修正された用語の合理的な量の偏差を意味する。これらの用語の度合いは、この偏差が、これら用語が修飾される用語の意味を無効にしない場合、修飾される用語のうち少なくとも±５％の偏差を含むものとして構築される。

本願で使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、特段明確に記載がない限り複数の基準を含む。たとえば、「βラクタム系抗生剤」を含む実施形態は、１つのβラクタム系抗生剤、または２つ以上のさらなるβラクタム系抗生剤を有する特定の実施形態を呈するものと理解される。

追加的なまたは第２のβラクタム系抗生剤などの「追加的な」または「第２」の構成要素を含む実施形態では、本明細書中で使用される第２の構成要素は、他の構成要素または第１の構成要素と化学的に異なる。「第３の」構成要素は、他の構成要素、第１の構成要素、および第２の構成要素と異なっており、さらに列挙される構成要素または「追加的な」構成要素も同様に異なる。

本明細書中で使用される用語「および／または」は、列挙された項目が、個々にまたは併用して、提示されるかまたは使用されることを意味する。実際に、この用語は、「少なくとも１つの」または「１つまたは複数の」列挙される項目が使用または提示されることを意味する。

本明細書中で使用される用語「細菌感染症」は、外来性の望ましくない細菌による細胞または体内組織の侵襲を指す。一実施形態では、細菌感染症は、メタロβラクタマーゼを発現する感染症である。

本明細書中で使用される用語「メタロβラクタマーゼを発現する感染症」は、メタロβラクタマーゼを発現する細菌による細胞または体内組織の侵襲を指す。

本明細書中で使用される用語「βラクタム系抗生剤」は、分子構造中にβ‐ラクタム環を有する抗生剤のクラスを指す。たとえば、ペニシリン誘導体（ペネム系）、セファロスポリン（セフェム系）、モノバクタムおよびカルバペネムが挙げられる。大部分のβラクタム系抗生剤は、細菌の細胞壁の生合成を阻害することにより作用し、最も広く使用されるグループの抗生剤である。

本明細書中で使用される用語「アルキル」は、単独または別の基の一部として使用されているかに関わらず、直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｙｌ）基を意味する。たとえば、用語Ｃ_１〜２４アルキルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４の炭素分子を有するアルキル基を意味する。

本明細書中で使用される用語「アルキレン」は、直鎖または分枝鎖の飽和型炭化水素基を意味し、端部の２つに置換基を含む飽和炭素鎖である。たとえば、用語Ｃ_１〜６アルキレンは、１、２、３、４、５、または６の炭素原子を有するアルキレン基を意味する。

本明細書中で使用される用語「シクロアルキル」は、単独で使用されるかまたは別の基の一部として使用されるかに関わらず、少なくとも１つの環を有する飽和アルキル基を意味する。たとえば、用語Ｃ_３〜１０シクロアルキルは、３、４、５、６、７、８、９、または１０の炭素原子を有するシクロアルキル基を意味する。

本明細書中で使用される用語「アリール」または「芳香族」は、単独または別の基の一部として使用されるかに関わらず、少なくとも１つの芳香環を含む環を指す。本願の一実施形態では、アリール基は、フェニル、ナフチル、またはインダニルなどの６または１０の（炭素原子）を含む。

本明細書中で使用される用語「ヘテロシクロアルキル」は、単独または別の基の一部として使用されるかに関わらず、５、６、７、８、９、または１０の原子を含む、非芳香族の単環系または多環系を指し、この原子のうちの１つ以上、たとえば１〜６個、１〜５個、１〜４個、または１〜３個が、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、およびＮＣ_１〜６アルキルから選択されるヘテロ部位であり、残りの原子が、Ｃ、ＣＨ、またはＣＨ_２である。ヘテロシクロアルキル基は、飽和型または不飽和型（すなわち１つ以上の２重結合を含む）のいずれかであり、１超の環を含んでもよい。ヘテロシクロアルキル基が１超の環を含む場合、この環は縮合、架橋、スピロ結合または単結合により結合してもよい。

第２の環状基と「縮合した」第１の環状基とは、第１の環および第２の環が、その間で少なくとも２つの隣接する原子を共有することを意味する。

第２の環状基と「架橋した」第１の環状基とは、第１の環および第２の環が、その間で少なくとも２つの隣接していない原子を共有することを意味する。

第２の環状基と「スピロ結合した」第１の環状基とは、第１の環および第２の環が、その間で１つの原子を共有することを意味する。

本明細書中で使用される用語「アスペルギロマラスミンＡ（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｍａｒａｓｉｍｅ Ａ）または「ＡＭ‐Ａ」は、式

の化合物を指す。

本明細書中で使用される用語「アスペルギロマラスミンＢ（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｍａｒａｓｉｍｅ Ｂ）」または「ＡＭ‐Ｂ」は、式

の化合物を指す。

本明細書中で使用される用語「リコマラスミン」は、式

の化合物を指す。

用語「薬学的に許容可能な塩」は、対象の処置に適した、または対象の処置に適合する酸付加塩または塩基付加塩を意味する。

用語「薬学的に許容可能な塩」は、遊離酸または遊離塩基の付加塩を形成するために一般に使用される塩を包有する。塩の性質は、薬学的に許容可能である限り重要ではない。適切な薬学的に許容可能な酸付加塩は、無機酸または有機酸から調製される。このような無機酸の例として、限定するものではないが、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸、およびリン酸が挙げられる。適切な有機酸の例として、たとえば、脂肪族の酸、脂環式の酸、芳香族の酸、アリール脂肪酸、複素環の酸、カルボン酸、およびスルホン酸の分類の有機酸が含まれ、たとえば、限定するものではないが、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、マレイン酸、エンボン酸（パモ酸）メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、パントテン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルファニル酸、メシル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルギン（ａｌｇｅｎｉｃ）酸、β−ヒドロキシ酪酸、マロン酸、催乳性（ｇａｌａｃｔｉｃ）酸、およびガラクツロン酸が挙げられる。適切な薬学的に許容可能な塩基付加塩として、限定するものではないが、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛から作製される金属塩、またはＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、リジンおよびプロカインから作製される有機塩が挙げられる。

望ましい化合物の塩の形成は、標準的な技術を使用して達せられる。たとえば、中性化合物を適切な溶媒中で、酸または塩基で処置し、形成される塩を濾過、抽出または他の任意の適切な方法により単離する。

本明細書中で使用される用語「溶媒和物」は、化合物と、この化合物がそこから沈殿するか、またはこの化合物がその中で作製される溶媒との間で形成される複合体を指す。よって、本明細書中で使用される用語「溶媒和物」は、適切な溶媒の分子が結晶格子に組み込まれる化合物、または塩化合物を意味する。適切な溶媒の例として、エタノール、水などがある。水が溶媒の場合、分子は「水和物」と呼ばれる。溶媒和物の形成は、化合物および溶媒和物に応じて変動する。一般的に溶媒和物は、適切な溶媒に化合物を溶解し、冷却または逆溶剤を使用することによって溶媒和物を単離することにより形成される。概して溶媒和物は、大気条件下で乾燥され、共沸混合物となる。特定の溶媒和物を形成するための適切な条件の選択は当業者によって行うことができる。

用語「薬学的に許容可能な溶媒和物」は、対象の処置に適切であるか、または対象の処置に適合した溶媒和物を意味する。薬学的に許容可能な溶媒和物では、適切な溶媒は、使用または投与する用量で生理学的に耐容性がある。

本明細書で使用される「細菌感染症から生じる疾患、障害、または状態」との表現は、対象において細菌感染症の存在により直接的または間接的に起こるいずれかの疾患、障害、または状態を指す。

本明細書で使用される用語「対象」は、哺乳類を含む動物界のすべての動物を含む。

本明細書で使用される用語「医薬組成物」は、薬学的に使用するための対象となる組成物を指す。

用語「薬学的に許容可能な」は、ウマおよびヒトなどの哺乳類といった対象の処置に適合可能であることを意味する。

本明細書で使用される用語「非経口」は、消化管を介する投与以外の方法で体内に取り込まれるか、または投与されることを意味する。

本明細書中で使用される用語「投与される」は、抗生剤、ならびに式Ｉの化合物またはその塩および／もしくは溶媒和物を含む化合物の有効量を、細胞培養物または対象中のいずれかの細胞に投与することを意味する。

本明細書で使用される用語「有効量」または「治療有効量」は、所望の結果を達成するために必要な用量および時間の間で有効な量を意味する。たとえば、細菌感染症、または細菌感染症から生じる疾患、障害、もしくは状態を処置する観点から、抗生剤ならびに／または式Ｉの化合物もしくはその塩および／もしくは溶媒和物の有効量は、たとえば、抗生剤ならびに／または式Ｉの化合物もしくはその塩および／もしくは溶媒和物を投与していない細菌感染症と比較して、細菌感染症を低減する量である。さらに、細菌感染症または細菌感染症から生じる疾患、障害、もしくは状態の処置のための抗生剤の効力を改善する観点から、式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物の有効量は、たとえば、抗生剤単独の投与での細菌感染症の低減と比較して、細菌感染症を低減する量である。「感染症を低減する」との文言は、たとえば、対象中の感染症病原体の量を減少させること、かつ／または感染症の症状を低減することを意味する。有効量は、対象の疾患状態、年齢、性別、および／または重量などの要因に応じて変動してもよい。このような量に対応する所定の化合物または組成物の量は、所定の化合物または組成物、医薬製剤、投与経路、状態、疾患、または障害の種類、処置される対象の固有性などの要因に応じて変動するが、これは当業者にとって通常の手順により決定できる。

本明細書中で使用される用語「処置するため」、「処置する」、および「処置」は、臨床上の結果を含む有益または望ましい結果を得る手法を意味する。有益または望ましい臨床上の結果として、限定するものではないが、部分的であるかまたは総合的であるか、検出可能か検出できないかに関わらず、細菌感染症の範囲の縮小、細菌感染症の状態の安定（すなわち悪化していない状態）、細菌感染症の拡大の予防、感染症の進行の遅延または減速、細菌感染症の状態の回復または寛解、細菌感染症の再発の減少、細菌感染症から生じる１つまたは複数の疾患、障害または状態の縮小、安定、軽減または回復、細菌感染症から生じる１つまたは複数の疾患、障害または状態の再発の減少、ならびに細菌感染症および／または細菌感染症から生じる１つまたは複数の症状または状態の緩解が挙げられる。「処置するため」、「処置する」および「処置」はまた、処置を受けていない場合の予測される生存時間と比較して延長した生存時間を意味する。本明細書中で使用される「処置するため」、「処置する」、および「処置」はまた、予防上の処置をも意味する。たとえば、初期の細菌感染症を罹患する患者は、進行を予防するために処置され、またあるいは緩解した対象は再発を予防するために処置される。

感染症、疾患、障害、および／または状態の「緩和」は、感染症、疾患、障害、および／または状態の範囲および／または望ましくない臨床症状が、これら感染症、疾患、障害、および／または状態を処置していない場合と比較して少なく、かつ／または進行の経時変化が遅延または延長していることを意味する。

本明細書中で使用される用語「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎまたはｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」などは、対象が細菌感染症および／または細菌感染症から生じる疾患、障害および／もしくは状態を罹患するか、または細菌感染症およびまたは細菌感染症から生じる疾患、障害および／もしくは状態に関連する症状を呈するリスクまたは可能性を低下させることを意味する。

たとえば本願の処置、使用、組成物およびキットに関して使用する場合、たとえば「その必要のある」対象などの対象とは、細菌感染症または細菌感染症から生じる疾患、障害、もしくは状態と診断された対象、これらに罹患した疑いのある、これらに接触した可能性のある、および／または以前これらの治療を受けたことのある対象である。

ＩＩ．方法および用途
環境微生物由来の天然産物抽出物の収集物を使用してＮＤＭ−１メタロβラクタマーゼの阻害剤の細胞ベースのスクリーニングを実施した。ＭＢＬ阻害剤の発見に対するスクリーニングの感受性を増大させるために、ｂａｍＢおよびｔｏｌＣの遺伝子が、独立して欠失している大腸菌 ＢＷ２５１１３の試験株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔｂａｍＢΔｔｏｌＣ）を作製した。ＢａｍＢは、外膜のポリンアセンブリに関与しており、破壊されると小分子に対する透過性が増大し^１９、ＴｏｌＣは、細胞から小分子を能動的に排除するＡｃｒＡ−ＡｃｒＢ−ＴｏｌＣなどの３分子の小分子排出システムの一部である^２０。よって、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔｂａｍＢΔｔｏｌＣは、「ヒット」の発見のためのスクリーニングの感受性を増大させる。この株を、ｐＬａｃプロモーターの制御下でｂｌａ_{ＮＤＭ−１}βラクタマーゼ遺伝子を染色体［Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔｂａｍＢΔｔｏｌＣΔａｒａＤＡＢ：：ｐＬａｃ（ｂｌａ_{ＮＤＭ−１}）］に統合することによりさらに改変した。この株を、〜５００の天然産物の抽出物と組み合わせたメロペネムの亜致死濃度（０．１２５μｇ／ｍｌの最小阻止濃度の１／４）の存在下でスクリーニングした。

本願の例示的な実施形態では、このスクリーニングで、アスペルギルス・ベルシコロル株（１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列により同定）の抽出物から、Ｅ．ｃｏｌｉスクリーニング株に対するメロペネム抗生剤の活性を回復させる優れた特質を有する再現性のあるヒットを得た。Ｉｎ ｖｉｖｏでＮＤＭ‐１の活性を中和するための抽出物の選択性を、精製した酵素および発色性βラクタマーゼ基質のニトロセフィンを使用し、カルバペネム系薬剤のメロペネムを用いて確認した。活性を指標にしたＡ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒの発酵ブロス由来の活性化合物の精製およびその後の詳細な化学的特性評価から、ＭＢＬ阻害剤をアスペルギロマラスミンＡ（ＡＭ−Ａ）として同定した。

したがって、一実施形態では、本願は、細菌感染症を処置する方法であって、１つまたは複数の式Ｉ

の化合物であって、式中
Ｒ^１が、Ｃ（Ｏ）ＯＲ^５、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ^５、およびＣＨ（ＮＨ_２）Ｃ（Ｏ）ＯＲ^５から選択され；
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５が、独立して、Ｈ、Ｃ_１−２４アルキル、Ｃ_１−６アルキレンＣ_６−１０アリール、Ｃ_１−６アルキレンＣ_３−１０シクロアルキル、Ｃ_１−６アルキレンＣ_３−１０ヘテロシクロアルキル、およびＣ_１−６アルキレン−ＯＣ（Ｏ）Ｃ_１−６アルキルから選択され；
ｎ、ｍ、およびｐが、独立して１および２から選択される；
式Ｉの化合物またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物の有効量と併用して１つまたは複数のβラクタム系抗生剤の有効量を、その必要のある対象に投与することを含む、方法を含む。

また本願は、対象において細菌感染症を処置するための、１つまたは複数の上記に定義される式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物と併用したβラクタム系抗生剤の使用、対象において細菌感染症を処置するために薬物を調製するための、１つまたは複数の上記に定義される式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物と併用したβラクタム系抗生剤の使用、ならびに、対象において細菌感染症を処置するために使用するための、βラクタム系抗生剤ならびに１つまたは複数の上記に定義される式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物を含む。

別の実施形態では、本願は、対象において細菌感染症から生じる疾患、障害、または状態を処置または予防する方法であって、１つまたは複数の上記に定義される式Ｉの化合物またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物の有効量と併用して１つまたは複数のβラクタム系抗生剤の有効量を、対象に投与することを含む、方法を含む。

また本願は、対象において細菌感染症から生じる疾患、障害、または状態を処置するための、１つまたは複数の上記に定義される式Ｉの化合物またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物と併用したβラクタム系抗生剤の使用、対象において細菌感染症から生じる疾患、障害、または状態を処置するための薬物を調製するための、１つまたは複数の上記に定義される式Ｉの化合物またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物と併用したβラクタム系抗生剤の使用、ならびに、対象において細菌感染症から生じる疾患、障害、または状態を処置するために使用するための、βラクタム系抗生剤ならびに１つまたは複数の上記に定義される式Ｉの化合物またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物を含む。

別の実施形態では、本願は、細菌感染症を処置するためのβラクタム系抗生剤の効力を改善する方法であって、上記抗生剤と併用して１つまたは複数の上記に定義される式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を含む。

また本願は、対象において細菌感染症を処置するためのβラクタム系抗生剤の効力を改善するための、１つまたは複数の上記に定義される式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物の使用、対象において細菌感染症を処置するためのβラクタム系抗生剤の効力を改善する薬物を調製するための、１つまたは複数の上記に定義される式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物の使用、ならびに対象において細菌感染症を処置するためにβラクタム系抗生剤の効力を改善するために使用する、１つまたは複数の上記に定義される式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物を含む。

また本願は、細菌感染症から生じる疾患、障害、または状態を処置するβラクタム系抗生剤の効力を改善する方法であって、１つまたは複数の上記に定義される式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物の有効量を、その必要のある対象に投与することを含む、方法を含む。

また本願は、対象の細菌感染症から生じる疾患、障害、または状態を処置するβラクタム系抗生剤の効力を改善するための、１つまたは複数の上記に定義される式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物の使用、対象において細菌感染症から生じる疾患、障害または状態を処置するためのβラクタム系抗生剤の効力を改善する薬物を調製するための、１つまたは複数の上記に定義される式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物の使用、ならびに、対象において細菌感染症から生じる疾患、障害または状態を処置するβラクタム系抗生剤の効力を改善するために使用する、１つまたは複数の上記に定義される式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物の使用を含む。

一実施形態では、細菌感染症は、少なくとも１つのメタロβラクタマーゼ（ＭＢＬ）を発現する細菌の感染症であり、細菌感染症から生じる疾患、障害、または状態は、少なくとも１つのＭＢＬを発現する細菌の感染症から生じる疾患、障害、または状態である。一実施形態では、ＭＢＬは、ＩＭＰ−型、ヴェローナ・インテグロンコード型メタロβラクタマーゼ（ＶＩＭ）、またはニューデリー・メタロβラクタマーゼ（ＮＤＭ）である。さらなる実施形態では、ＭＢＬはＶＩＭまたはＮＤＭである。

一実施形態では、細菌感染症は、少なくとも１つのカルバペネム抵抗性グラム陰性細菌の感染症である。

一実施形態では、細菌感染症は、腸内細菌科のアシネトバクター属、シュードモナス属に属する少なくとも１つの細菌の感染症である。

一実施形態では、腸内細菌は、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）などのクレブシエラ属または大腸菌である。別の実施形態では、シュードモナス属の細菌は緑膿菌である。

一実施形態では、感染症を引き起こす細菌は、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌および他のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌、肺炎球菌、ストレプトコッカス・アガラクチア、エンテロコッカス属、コリネバクテリウム・ジフテリエ、リステリア・モノサイトゲネス、バチルス・アントラシス、ナイセリア・メニンギティディス、ナイセリア・ゴノレー、モラクセラ・カタラーリス、ビブリオ・コレラエ、およびカンピロバクター・ジェジュニから選択される。

一実施形態では、感染症を引き起こす細菌は、腸内細菌科（大腸菌類、サルモネラ属、クレブシエラ属、エンテロバクター属を含む）、緑膿菌、アシネトバクター属、インフルエンザ菌、破傷風菌、ボツリヌス菌、バクテロイデス属、プレボテラ属、ポルフィロモナス属、フソバクテリウム属、結核菌、およびらい菌から選択される。

一実施形態では、感染症を引き起こす細菌は腸内細菌科由来である。

一実施形態では、感染症を引き起こす細菌は肺炎桿菌である。

細菌感染症から生じる疾患、障害、または状態は、ＭＢＬを発現する細菌の感染症に共通する全ての病因を含む。これらは、当業者に良く知られている。より一般的な例の一部は、より良く知られているＭＢＬ発現細菌に関して以下に列挙されるが、これらの列挙は完全に網羅されているものではなく、１つのＭＢＬ発現の細菌に関して列挙される疾患、障害、および状態の多くは他のＭＢＬ発現の細菌にも共通することは当業者にとって明らかである。

一実施形態では、肺炎桿菌の感染症などの細菌感染症から生じる疾患、障害、または状態は、たとえば限定するものではないが、肺炎（たとえば気管支肺炎または気管支炎）、血栓性静脈炎、尿路感染症（ＵＴＩ）、胆嚢炎（ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｉｔｕｓ）、下痢、上気道感染症、下胆道感染症、創傷感染症、外科的創傷感染症、骨髄炎、髄膜炎、菌血症、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ、ｓｅｐｓｉｓ）、敗血症性ショック、鼻硬腫、臭鼻症、強直性脊椎炎、細胞死（ネクローシス）を伴う炎症および出血を介するヒトの肺の破壊性変化、肺膿瘍、キャビテーション、蓄膿症もしくはウラル接着（ｕｒａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎｓ）、またはそれらの組み合わせである。

一実施形態では、緑膿菌の感染症などの細菌感染症から生じる疾患、障害、または状態は、限定するものではないが、嚢胞性線維症、肺炎、菌血症、心内膜炎、髄膜炎、脳腫瘍、敗血症性ショック、ＵＴＩ、胃腸感染症（たとえば下痢、腸炎、もしくは全腸炎）、皮膚感染症（たとえば壊疽性膿瘡）、軟部組織感染症、熱傷の感染症、外耳の感染症、細菌性角膜炎、眼内炎、医療機器の存在による感染症、入院による感染症、低品質の水により引き起こされる感染症、術後感染、もしくは骨髄炎、またはそれらの組み合わせである。

一実施形態では、大腸菌の感染症などの細菌感染症から生じる疾患、障害、または状態は、限定するものではないが、腸管感染症（たとえば下痢）、腹腔内感染症、胆嚢炎（ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｉｔｕｓ）、菌血症、胆管炎、ＵＴＩ、髄膜炎、肺炎、化膿性関節炎、眼内炎、化膿性甲状腺炎、骨髄炎、心内膜炎、皮膚感染症もしくは軟部組織感染症、またはそれらの組み合わせである。

一実施形態では、対象はヒトである。さらなる実施形態では、対象はコンパニオンアニマルまたは家畜などの動物である。

１つまたは複数の抗生剤は、βラクタマーゼを発現する細菌の感染症を処置する任意の抗生剤から選択される。一実施形態では、１つまたは複数の抗生剤はβラクタム系抗生剤である。一実施形態ではβラクタム系抗生剤は、ペニシリン誘導体（ペネム系）、セファロスポリン（セフェム系）、モノバクタム、およびカルバペネムから選択される。一実施形態では、βラクタム系抗生剤は、イミペネム、エルタペネム、メロペネム、ドリペネム、ビアペネム、パニペネム、チカルシリン、アンピシリン、アモキシシリン、カルベニシリン、ピペラシリン、アズロシリン、メズロシリン、チカルシリン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフトリアキソン、およびセフタジジムから選択される。

別の実施形態では、１つまたは複数の抗生剤は、カルバペネム系抗生剤である。一実施形態では、カルバペネム系抗生剤は、メロペネム、ビアペネム（ｂｉａｐｅｎｍ）、ドリペネム、エルタペネム、パニペネム、およびイミペネムから選択される。

一実施形態では、式Ｉの化合物は以下の

相対立体化学を有する。

一実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５はそれぞれＨである。一実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、独立して、Ｃ_１−１８アルキル、Ｃ_１−４アルキレンＣ_５−６ヘテロシクロアルキル、およびＣ_１−４アルキレン−ＯＣ（Ｏ）Ｃ_１−６アルキルから選択される。一実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、同一であり、Ｃ_１−１８アルキル、Ｃ_１−４アルキレンＣ_５−６ヘテロシクロアルキル、およびＣ_１−４アルキレン−ＯＣ（Ｏ）Ｃ_１−６アルキルから選択される。

一実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５の少なくとも１つがＨ以外である場合、式Ｉの化合物は、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５がそれぞれＨである活性化合物のプロドラッグである。

一実施形態では、Ｒ^１はＣＨ（ＮＨ_２）Ｃ（Ｏ）ＯＲ^５であり、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、独立して、Ｈ、Ｃ_１−１８アルキル、Ｃ_１−４アルキレンＣ_５−６ヘテロシクロアルキル、およびＣ_１−４アルキレン−ＯＣ（Ｏ）Ｃ_１−６アルキルから選択される。一実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は同一である。一実施形態では、Ｒ^１がＣＨ（ＮＨ_２）Ｃ（Ｏ）ＯＲ^５である場合、式Ｉの化合物は以下の

相対立体化学を有する。

一実施形態では、Ｒ^１はＣ（Ｏ）ＯＲ^５であり、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は独立して、Ｈ、Ｃ_１−１８アルキル、Ｃ_１−４アルキレンＣ_５−６ヘテロシクロアルキル、およびＣ_１−４アルキレン−ＯＣ（Ｏ）Ｃ_１−６アルキルから選択される。一実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は同一である。

一実施形態では、Ｒ^１はＣ（Ｏ）ＮＨＲ^５であり、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、独立して、Ｈ、Ｃ_１−１８アルキル、Ｃ_１−４アルキレンＣ_５−６ヘテロシクロアルキル、およびＣ_１−４アルキレン−ＯＣ（Ｏ）Ｃ_１−６アルキルから選択される。一実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は同一である。

一実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、

である。

一実施形態では、ｎ、ｍ、およびｐはそれぞれ１である。

一実施形態では、式Ｉの化合物は、ＡＭ−Ａ、ＡＭ−Ｂ、およびリコマラスミンまたはそれらの薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物から選択される。さらなる実施形態では、式Ｉの化合物は、ＡＭ−Ａ、ＡＭ−Ｂ、およびリコマラスミンまたはそれらの薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物のプロドラッグである。

式Ｉの化合物は、知られている天然産物の単離方法を使用する真菌供給源からの単離を介して入手可能であるか、または当業者に知られている方法を使用する化学合成により調製される。たとえば、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、および／またはＲ^５がＨ以外である式Ｉの化合物は、標準的なエステル化またはアミド化の方法を使用して、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、および／またはＲ^５がＨである式Ｉの化合物から入手可能である。

抗生剤は、当業者に理解されるように、選択した投与経路に応じた様々な形態で対象に投与されるか、または使用される。一実施形態では、抗生剤は、経口（舌下、および頬側を含む）投与、または非経口（静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経上皮、経鼻、肺内、髄腔内、直腸、局所、パッチ、ポンプ、および経皮）投与より対象に投与されるか、または使用され、これに沿うように抗生剤が製剤化される。適切な組成物の選択および調製のための従来の手法および成分が、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０００−２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）および１９９９年に公開されたＴｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ： Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（ＵＳＰ ２４ ＮＦ１９）に記載される。一般的に、抗生剤は、入手可能である形態で使用されて対象に投与される。このような形態として、たとえば、これらの薬学的に許容可能な塩の形態、双性イオンの形態の微粒子形態および注射可能または吸入可能（ｉｎｆｕｓａｂｌｅ）な懸濁物の形態が挙げられる。

式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物はまた、当業者が理解するように、選択した投与経路に応じて様々な形態で対象に投与され、または使用される。一実施形態では、式Ｉの化合物は、経口（舌下および頬側を含む）投与、または非経口（静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経上皮、経鼻、肺内、髄腔内、直腸、パッチ、ポンプ、および経皮を含む）投与により対象に投与されるか、または使用され、これに沿うように化合物、塩および／または溶媒和物が製剤化される。再度、適切な組成物の選択および調製のための従来の手法および成分は、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０００−２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）、および１９９９年に公開されたＴｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ： Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（ＵＳＰ ２４ ＮＦ１９）に記載される。

注射可能な用途に適した薬学的な形態は、滅菌性の水溶液または分散剤、および滅菌性の注射可能な溶液または分散剤の即時調製のための滅菌性粉末が挙げられる。すべての場合で、この形態は滅菌されており、容易に注射投与可能である程度に流動性がある。

一実施形態では、非経口投与は、選択された時間にわたる持続投与によるものである。非経口投与に適した溶液は、当業者により知られた方法により調製される。たとえば、抗生剤または式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と任意に混合した水で調製される。分散物もまた、グリセロール、液体のポリエチレングリコール、ＤＭＳＯおよびこれらの混合物中でアルコールを含んでまたは含まないで調製され、ならびに油中で調製される。保存および使用の一般的な条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を予防するために保存剤を含む。

経鼻投与用の組成物は、エアロゾル、点滴剤、ゲル、または粉剤として都合よく製剤化される。エアロゾル製剤は、概して、生理学的に許容可能な水性または非水性溶媒中に活性物質の溶液または微細懸濁物を含み、通常、密封したコンテナ内に滅菌形態で単一用量または複数の用量で存在しており、これは噴霧装置と共に使用するためのカートリッジまたはレフィルの形態をとる。あるいは、密封したコンテナは、使用後に処分するよう意図される計量バルブを取り付けた単一用量の経鼻吸入器またはエアロゾルディスペンサなどの、単一の投与デバイスである。剤形がエアロゾルディスペンサを含む場合、これは、たとえば圧縮空気などの圧縮ガスまたはフルオロクロロ炭化水素などの有機噴射剤である、噴射剤を含む。一実施形態では、エアロゾル剤形は、ポンプアトマイザの形態をとる。

頬側投与または舌下投与に適した組成物は、錠剤、トローチ剤、およびトローチを含み、この活性成分は、糖、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、および／またはグリセリンなどのキャリアーと共に製剤化される。直腸投与用の組成物は、ココアバターなどの従来の座薬の基剤を含む都合のよい座薬の形態である。

別の実施形態では、抗生剤、または式Ｉの化合物、もしくはその塩および／もしくは溶媒和物は、たとえば不活性希釈剤または吸収可能な食用キャリアーと共に経口投与され、またはハードシェルまたはソフトシェルのゼラチンカプセルの中に包有され、または錠剤の中に圧縮され、または食品に直接組み込まれる。経口投与では、抗生剤、または式Ｉの化合物、もしくはその塩および／もしくは溶媒和物は、賦形剤に組み込まれ、たとえば、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ、オブラートなどの形態で使用される。経口剤形はまた、たとえば、即時放出型および持続放出型（ｔｉｍｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ）の製剤など放出調節型製剤を含む。放出調節型製剤の例として、たとえば徐放（ＳＲ）型、持続放出（ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ）（ＥＲ、ＸＲ、またはＸＬ）型、持続放出（ｔｉｍｅ−ｒｅｌｅａｓｅまたはｔｉｍｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ、ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ）（ＣＲ）型、または連続放出（ＣＲまたはＣｏｎｔｉｎ）型が挙げられ、コーティングされた錠剤、浸透送達装置、コーティングされたカプセル、マイクロカプセル化マイクロスフェア、凝集した粒子、たとえばモレキュラーシーブ型粒子、もしくは微小中空浸透ファイバー束、または線維状パケットに凝集もしくは保持された切断型中空浸透ファイバーの形態で使用される。一実施形態では、徐放型組成物は、リポソームとして製剤化され、またはこの活性化合物がマイクロカプセル化、複数のコーティングなどにより、異なって分解されるコーティングで保護されるものとして製剤化される。リポソーム送達系として、たとえば、小さな単層リポソーム、大きな単層リポソーム、および複層リポソームが挙げられる。一実施形態では、リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンなどの、様々な脂質から形成される。

また、抗生剤または式Ｉの化合物、もしくはその塩および／もしくは溶媒和物を凍結乾燥し、たとえば注射用の生成物の調製のために、得られた凍結乾燥物を使用することも可能である。

一実施形態では、抗生剤、または式Ｉの化合物、もしくはその塩および／もしくは溶媒和物を、錠剤化可能な薬剤キャリアーとしての可溶性ポリマーと結合させる。このようなポリマーとして、たとえば、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシ−エチルアスパルトアミド−フェノール、またはパルミトイル残基と置換したポリエチレンオキシド−ポリリシンが挙げられる。さらなる実施形態では、抗生剤または式Ｉの化合物、もしくはその塩および／もしくは溶媒和物を、たとえばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマー、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシブタン酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、およびハイドロゲルの架橋型コポリマーまたは両親媒性ブロックコポリマーといった、薬剤の徐放を達成する際に有用な生分解性のクラスのポリマーと結合させる。

抗生剤ならびに式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物は、互いに組み合わせて使用される。抗生剤ならびに式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物は、別々の時間でおよび／もしくは投与形式（すなわち異なる投与経路）で使用、もしくは投与され、または同一の医薬調製物中で共に投与される。

一実施形態では、抗生剤ならびに式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物は、別々の時間でおよび／または投与経路で使用または投与される。たとえば、抗生剤が注射により投与され、式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物が経口投与される。別の例では、抗生剤が経口投与され、式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物が注射により投与される。さらなる例では、抗生剤ならびに式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物の両方が、注射により投与される。抗生剤ならびに式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物は、別々の時間でおよび／または投与経路で投与される場合、抗生剤は、式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物の投与、または使用の前後のいずれかで投与、または使用される。

別の実施形態では、抗生剤ならびに式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物は、同時に投与される。本明細書中で使用されるように、対象への２つの物質の「同時投与」は、抗生剤ならびに式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物を、これらの両方が同時に対象の中で生物学的に活性となるように、提供することを意味する。投与の正確な詳細は、抗生剤、ならびに式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物が互いに存在する中でのこれらの薬物動態に依存し、抗生剤ならびに式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物を、互いに数時間以内に投与すること、またさらには薬物動態が適切である場合には、抗生剤ならびに式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物を、一方の投与から２４時間以上の範囲内に投与することを含んでよい。適切な投与レジメンの設計は、当業者の業務の範囲である。

一実施形態では、抗生剤、ならびに式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物は、単一の組成物または製剤で対象に投与される。

本願の別の実施形態では、抗生剤、ならびに式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物は、同時ではない形式で対象に投与される。

本願のさらなる実施形態では、抗生剤、ならびに式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物は、同時の形式で対象に投与され次いで同時ではない形式で対象に投与されるか、または同時形式と同時ではない形式で交互に投与される。

処置方法は、抗生剤、ならびに式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物を対象に投与することを含み、任意に、単一の投与からなるか、またあるいは、一連の投与を含む。処置期間の長さは、疾患、障害、または状態の重症度、対象の年齢、抗生剤、および式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物の用量、抗生剤、および式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物の活性、ならびに／またはそれらの組み合わせなどの様々な要因に依存する。

抗生剤が、細菌感染症を処置する際の抗生剤について知られている処置プロトコルにしたがって投与または処置される実施形態がある。

一実施形態では、抗生剤、ならびに式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物は、細菌に曝露した後、可能な限り早く投与または使用される。一実施形態では、抗生剤、ならびに式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物は、細菌感染症の処置が達成されるまで、たとえば、細菌の完全な根絶が達成されるまで、または対象の生体防御がもはや圧倒されず残りの細菌を殺傷できる時点まで細菌数が減少するまで、投与または使用される。

抗生剤、ならびに式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは塩の用量は、それらの薬力学的特性、投与形式、対象の年齢、健康状態、および重量、症状の性質および度合い、処置の頻度およびもしあれば、併用療法の種類、ならびに処置される対象中のクリアランス比率に応じて変動する。当業者のうち一人は、上記の要因に基づき適切な用量を決定できる。抗生剤、ならびに式Ｉの化合物、またはその塩および／もしくは溶媒和物は、臨床応答に応じて必要な量に調節し得る適切な用量で最初は投与してもよい。

一実施形態では、抗生剤の用量は、単独で使用する場合のこの薬剤の用量以下である。このような用量は当業者に知られ得ているか、当業者により容易に決定される。

ＩＩＩ．本願の組成物およびキット
本願はまた、
１つまたは複数のβラクタム系抗生剤と、
１つまたは複数の式Ｉ

の化合物であって、式中、
Ｒ^１が、Ｃ（Ｏ）ＯＲ^５、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ^５、およびＣＨ（ＮＨ_２）Ｃ（Ｏ）ＯＲ^５から選択され；
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５が、独立して、Ｈ、Ｃ_１−２４アルキル、Ｃ_１−６アルキレンＣ_６−１０アリール、Ｃ_１−６アルキレンＣ_３−１０シクロアルキル、Ｃ_１−６アルキレンＣ_３−１０ヘテロシクロアルキル、およびＣ_１−６アルキレン−ＯＣ（Ｏ）Ｃ_１−６アルキルから選択され；
ｎ、ｍ、およびｐが、独立して１および２から選択される；
式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／または溶媒和物と
を含む医薬組成物であって、
１つまたは複数のβラクタム系抗生剤および１つまたは複数の式１の化合物が、細菌感染症、または細菌感染症から生じる疾患、障害、もしくは状態を処置するために有効な量で存在する、
医薬組成物を含む。

本願はまた、
１つまたは複数のβラクタム系抗生剤と、
１つまたは複数の上記に定義した式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物と
を含む医薬組成物であって、
１つまたは複数のβラクタム系抗生剤および１つまたは複数の式Ｉの化合物が、細菌感染症、または細菌感染症から生じる疾患、障害、もしくは状態の処置のためのβラクタム系抗生剤の効力を改善するために有効な量で存在する、
医薬組成物を含む。

本願はまた、細菌感染症、または細菌感染症から生じる疾患、障害、もしくは状態の処置のためのキットであって、
１つまたは複数のβラクタム系抗生剤と、
１つまたは複数の式Ｉ

の化合物であって、式中、
Ｒ^１が、Ｃ（Ｏ）ＯＲ^５、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ^５、およびＣＨ（ＮＨ_２）Ｃ（Ｏ）ＯＲ^５から選択され；
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５が、独立して、Ｈ、Ｃ_１−２４アルキル、Ｃ_１−６アルキレンＣ_６−１０アリール、Ｃ_１−６アルキレンＣ_３−１０シクロアルキル、Ｃ_１−６アルキレンＣ_３−１０ヘテロシクロアルキル、およびＣ_１−６アルキレン−ＯＣ（Ｏ）Ｃ_１−６アルキルから選択され；
ｎ、ｍ、およびｐが、独立して１および２から選択される；
式Ｉの化合物またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物と、
任意に、１つまたは複数のβラクタム系抗生剤ならびに１つまたは複数の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物を、それを必要とする対象に投与するための説明書と
を含む、キットを含む。

本願はまた、細菌感染症、または細菌感染症から生じる疾患、障害、もしくは状態を処置するためのキットであって、
１つまたは複数の上記に定義した式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物と、
１つまたは複数の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物を、細菌感染症、または細菌感染症から生じる疾患、障害、もしくは状態のための抗生剤を投与されている対象に投与するための説明書と
を含む、キットを含む。

本願はまた、細菌感染症、または細菌感染症から生じる疾患、障害もしくは状態の処置のためのβラクタム系抗生剤の効力を改善するキットであって、
１つまたは複数のβラクタム系抗生剤と、
１つまたは複数の上記に定義した式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物と、
任意に、１つまたは複数のβラクタム系抗生剤ならびに１つまたは複数の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物を、それを必要とする対象に投与するための説明書と
を含む、キットを含む。

本願はまた、細菌感染症、または細菌感染症から生じる疾患、障害、もしくは状態の処置のためのβラクタム系抗生剤の効力を改善するキットであって、
１つまたは複数の上記に定義した式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物と、
１つまたは複数の上記に定義した式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物を、細菌感染症、または細菌感染症から生じる疾患、障害、もしくは状態を処置するためのβラクタム系抗生剤を投与されている対象に投与するための説明書と
を含む、キットを含む。

１つまたは複数の抗生剤は、メタロβラクタマーゼを発現する細菌の感染症を処置するいずれかの抗生剤から選択される。一実施形態では、１つまたは複数の抗生剤はβラクタム系抗生剤である。一実施形態ではβラクタム系抗生剤は、ペニシリン誘導体（ペネム系）、セファロスポリン（セフェム系）、モノバクタム、およびカルバペネムから選択される。一実施形態ではβラクタム系抗生剤は、イミペネム、エルタペネム、メロペネム、ドリペネム、ビアペネム、パニペネム、チカルシリン、アンピシリン、アモキシシリン、カルベニシリン、ピペラシリン、アズロシリン、メズロシリン、チカルシリン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフトリアキソン、およびセフタジジムから選択される。

別の実施形態では、１つまたは複数の抗生剤は、カルバペネム系抗生剤である。一実施形態では、カルバペネム系抗生剤は、メロペネム、ビアペネム、ドリペネム、パニペネム、およびイミペネムから選択される。

一実施形態では、式Ｉの化合物は、以下の

相対立体化学を有する。

一実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれＨである。一実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、独立して、Ｃ_１−１８アルキル、Ｃ_１−４アルキレンＣ_５−６ヘテロシクロアルキル、およびＣ_１−４アルキレン−ＯＣ（Ｏ）Ｃ_１−６アルキルから選択される。一実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、同一であり、Ｃ_１−１８アルキル、Ｃ_１−４アルキレンＣ_５−６ヘテロシクロアルキル、およびＣ_１−４アルキレン−ＯＣ（Ｏ）Ｃ_１−６アルキルから選択される。

一実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５のうちの少なくとも１つがＨ以外である場合、式Ｉの化合物は、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５がそれぞれＨである活性化合物のプロドラッグである。

一実施形態では、Ｒ^１は、ＣＨ（ＮＨ_２）Ｃ（Ｏ）ＯＲ^５であり、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、独立して、Ｈ、Ｃ_１−１８アルキル、Ｃ_１−４アルキレンＣ_５−６ヘテロシクロアルキル、およびＣ_１−４アルキレン−ＯＣ（Ｏ）Ｃ_１−６アルキルから選択される。一実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は同一である。一実施形態では、Ｒ^１がＣＨ（ＮＨ_２）Ｃ（Ｏ）ＯＲ^５である場合、式Ｉの化合物は、以下の

相対立体化学を有する。

一実施形態では、Ｒ^１はＣ（Ｏ）ＯＲ^５であり、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、独立して、Ｈ、Ｃ_１−１８アルキル、Ｃ_１−４アルキレンＣ_５−６ヘテロシクロアルキル、およびＣ_１−４アルキレン−ＯＣ（Ｏ）Ｃ_１−６アルキルから選択される。一実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は同一である。

一実施形態では、Ｒ^１はＣ（Ｏ）ＮＨＲ^５であり、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、独立して、Ｈ、Ｃ_１−１８アルキル、Ｃ_１−４アルキレンＣ_５−６ヘテロシクロアルキル、およびＣ_１−４アルキレン−ＯＣ（Ｏ）Ｃ_１−６アルキルから選択される。一実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は同一である。

一実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、

である。

一実施形態では、ｎ、ｍ、およびｐはそれぞれ１である。

一実施形態では、式Ｉの化合物は、ＡＭ−Ａ、ＡＭ−Ｂ、およびリコマラスミン、またはそれらの薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物から選択される。さらなる実施形態では、式Ｉの化合物は、ＡＭ−Ａ、ＡＭ−Ｂ、またはリコマラスミン、またはそれらの薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物のプロドラッグである。

一実施形態では、本願の組成物ならびにキットにおける１つまたは複数の上記に定義される式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物、ならびに１つまたは複数のβラクタム系抗生剤は、対象に別々に投与または使用するため、別々の医薬組成物として製剤化される。この実施形態では、別々の医薬組成物は、互いに独立して、かつ、それぞれが有効である望ましい投与形式に従って製剤化される。一実施形態では、１つまたは複数のβラクタム系抗生剤は、経口送達による投与または使用のため、または注入による送達のために製剤化される。別の実施形態では、１つまたは複数の上記に定義した式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物は、経口送達による投与または使用のため、または注入による送達のために製剤化される。

一実施形態では、本願の組成物ならびにキットにおける１つまたは複数の上記に定義される式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物、ならびに１つまたは複数のβラクタム系抗生剤は、対象への組み合わせた同時の投与、または使用のために、単一の医薬組成物として製剤化される。一実施形態では、単一の医薬組成物は、経口送達または注入による投与または使用のために製剤化される。

ＩＶ．細胞ベースの抗生剤の耐性アッセイ
本願はまた、細菌耐性遺伝子を発現する細菌細胞を含む細胞ベースのスクリーニングアッセイであって、上記細胞が（ｉ）細胞中への分子の侵入を遮断するタンパク質をコードする遺伝子および（ｉｉ）細胞からの分子の排出を促進するタンパク質をコードする遺伝子の内の１つまたは複数が欠失するように改変されている、アッセイを含む。

一実施形態では、この細菌細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞である。さらなる実施形態では、細胞中への分子の侵入を遮断するタンパク質をコードする遺伝子はｂａｍＢである。別の実施形態では、細胞からの分子の排出を促進するタンパク質をコードする遺伝子はｔｏｌＣである。さらなる実施形態では、細菌耐性遺伝子はｂｌａ_{ＮＤＭ−１}遺伝子などのメタロβラクタマーゼをコードする遺伝子である。

一実施形態では、本願はまた、抗生剤の耐性を処置する化合物を同定する方法であって、
（ａ）細菌耐性遺伝子を発現する細菌細胞と１つまたは複数の化合物を接触させることであって、上記細胞が（ｉ）細胞中への分子の侵入を遮断するタンパク質をコードする遺伝子および（ｉｉ）細胞からの分子の排出を促進するタンパク質をコードする遺伝子のうちの１つまたは複数が欠失するように改変されており、１つまたは複数の化合物が、細菌耐性遺伝子によりコードされるタンパク質に感受性のある抗生剤の存在下で細胞と接触していることと、
（ｂ）抗生剤の耐性を処置する化合物として、上記細菌細胞の増殖を阻害する化合物を同定することと
を含む、方法を含む。

一実施形態では、化合物による細菌細胞の増殖の細胞を対照と比較する。

細菌耐性遺伝子によりコードされるタンパク質に感受性のある抗生剤は、その効力が耐性遺伝子によるコードされるタンパク質の存在下で低減する抗生剤である。

以下の非限定的な実施例は、本願を表すものである。

実施例
実施例１：ＡＭ‐Ａの単離および活性
材料および方法
（ａ）試薬
全ての酵素および分析グレードの化学物質は、特段記載のない限りシグマアルドリッチ社より購入した。プロトンおよびカーボンＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ ７００ＭＨｚ分光計で記録した。ニトロセフィンを、従来報告されるようにに合成した。

（ｂ）ＤＮＡ操作およびプラスミド構築
プラスミドＤＮＡの精製およびゲル抽出を、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｑｕｉｃｋ ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉｐｒｅｐおよびＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（インビトロジェン）をそれぞれ使用して実施した。制限酵素を、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓから購入した。ＰＣＲ ＤＮＡ増幅のプライマーを、ＩＤＴ（アイオワ州コーラルビル）から購入した、ＰＣＲを、製造元が特定した反応条件を使用し、Ｐｈｕｓｉｏｎ ハイフィデリティーＤＮＡポリメラーゼ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）を使用して行った。全てのライゲーション反応を、製造元の指示にしたがって、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）を使用して行った。全てのβラクタマーゼの過剰発現構築物を、Ｎ末端Ｈｉｓタグを含むｐＥＴ−２８ｂプラスミドでリーダーペプチドなしで生成した。リーダーペプチド配列は、ＳｉｇｎａｌＰ ４．０ ２５を使用して決定した。すべてのベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０ ケミカルコンピテントセルにおいて形質転換した。

（ｃ）タンパク質の精製
ＶＩＭ−２、ＩＭＰ−７、ＣＴＸ−Ｍ−１５、ＴＥＭ−１、およびＯＸＡ−４８：それぞれのβラクタマーゼ構築物で形質転換したＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）のコロニーを、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地でイノキュレートし、３７℃で増殖させた。タンパク質の発現を、ＯＤ６００ ０．７で１ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導し、培養物を一晩１６℃でインキュベートした。細胞を遠心により収集し、βラクタマーゼを発現する１Ｌの培養物由来の細胞ペーストを、８ｍｌの０．８５％のＮａＣｌで洗浄し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾールおよび２０μＭのＺｎＳＯ_４（金属酵素のため）を含むバッファーに再懸濁し、次いで超音波処理により溶解させた。溶解物を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＪＡ ２５．５０ローターを使用して、２０，０００ＲＰＭ（４８２５４×ｇ）、４℃で４５分間遠心した。この上清を、５ｍＬのＨｉＴｒａｐ Ｎｉ−ＮＴＡカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、一定の流速３ｍｌ／分で適用した。カラムを５カラム容量の同一のバッファーで洗浄し、増大するイミダゾールのステップグラジエントを、洗浄および溶出ステップに使用した。精製されたβラクタマーゼを含む画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づき集め、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０％のグリセロールおよび金属酵素のための２０μＭのＺｎＳＯ_４を含むバッファー中で、４℃で一晩透析した。ＮＤＭ−１は、８４μｇのＳＵＭＯプロテアーゼを添加して、上述のように精製した。プロテアーゼおよび非切断のＮＤＭ‐１を、５ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｎｉ−ＮＴＡカラムに透析した溶液を適用し流出画分を収集することにより除去した。全ての精製した酵素を、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによる評価で＞９５％の純度であると検証し、−２０℃で保存した。

（ｄ）細胞ベースのスクリーニング
〜５００の天然産物抽出物を、０．１２５μｇ／ｍｌのメロペネムと組み合わせてＥ． ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ΔｂａｍＢΔｔｏｌＣΔａｒａＤＡＢ：：ｐＬａｃ（ｂｌａＮＤＭ−１）に対してスクリーニングした。このスクリーニングを、カチオンを調節したミューラーヒントンブロス（ＣＡＭＨＢ）を使用して、９６ウェルプレート中で２重に行った。低度増殖の対照は２×ＭＩＣメロペネム（１μｇ／ｍｌ）であり、増殖の対照は１／４ＭＩＣメロペネム（０．１２５μｇ／ｍｌ）であった。Ｚ’は０．７７と決定されており、これは良好なスクリーニングウィンドウを示した。

（ｅ）ＡＭ‐Ａの精製
ＷＡＣ−１３８（アスペルギルス・ベルシコロル）（４Ｌ）を、２％（Ｗ／Ｖ）ＨＰ−２０樹脂（ダイヤイオン）と共に減圧下で蒸発させ、残渣のＷＡＣ１３８−Ｅを得た。粗製混合物を、Ｈ_２Ｏ（１Ｌ）、１０％のＭｅＯＨ（１Ｌ）、２５％のＭｅＯＨ（１Ｌ）、６０％のＭｅＯＨ（１Ｌ）、および１００％のＭｅＯＨ（１Ｌ）で溶出するＨＰ−２０（１００ｇ）カラム上に適用して、５つの画分、ＷＡＣ１３８−Ｅ−１〜５を得た。活性画分ＷＡＣ１３８−Ｅ−１を、逆相ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ ＩＳＣＯ（ＲｅｄｉＳｅｐ Ｒｆ Ｃ１８、テレダイン）に適用し、水−アセトニトリルリニアグラジエントシステム（ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ）（０−１００％のアセトニトリル）で溶出して６５の画分、ＷＡＣ１３８−Ｅ−１−１〜６５を得た。活性細画分ＷＡＣ１３８−Ｅ−１−５を、２５％のＭｅＯＨで溶出するＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム（１００ｍｌ）に通し、１２の細画分を得た。活性細画分ＷＡＣ１３８−Ｅ−１−５−６〜８を組み合わせ、１％の酢酸（Ｖ／Ｖ）５ｍｌ中で再結晶化させて、白色結晶としてＡＭ‐Ａを得た。１Ｌの培養物から、〜２００ｍｇのＡＭ−Ａを得た。

旋光度は、パーキンエルマー ２４１旋光計で決定した。質量を、Ｍａｘｉｓ ４Ｇ Ｑ／ＴＯＦ、陽イオンモードでのＥＳＩ ＭＳ直接注入（３μＬ／分）を使用して決定した。

（ｆ）ＩＣ_５０酵素阻害アッセイ
酵素（ＮＤＭ−１、５ｎＭ；ＶＩＭ−２，５００ｐＭ；ＣＴＸ−Ｍ−１５、５００ｐＭ；ＫＰＣ−２、５ｎＭ；ＯＸＡ−４８、１ｎＭ；ＴＥＭ−１、１００ｐＭ；ＡＣＥ、５０ｎＭ）を、ＡＭ‐Ａと５〜１０分間プレインキュベートした後に、３０μＭのニトロセフィン（ＴＥＭ１に対しては１００μＭのニトロセフィン、ＡＣＥ２４に対しては２５０μＭのフランアクリロイル−Ｌ−フェニルアラニルグリシルグリシン［ＦＡＰＧＧ］）と混合した。金属酵素に、１０μＭのＺｎＳＯ_４を補充した。アッセイを、３０〜３７℃で、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘリーダー（モレキュラーデバイス）を使用して、４９０ｎｍにて９６ウェルマイクロプレートの形式で読み取った。

（ｇ）金属酵素とＡＭ‐Ａのインキュベーション
酵素（５００ｎＭ）を、ＡＭ‐Ａ（５００μＭ）と１０分間インキュベートした。上記の２０μｌを、以下の最終的な濃度：酵素（５０ｎＭ）、ＦＡＰＧＧ（５０μＭ）／ニトロセフィン（２０μＭ）、ＡＭ−Ａ（５０μＭ）とするために、１８０μｌのニトロセフィンまたはＦＡＰＧＧ基質で希釈した。バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭのＮａＣｌ）を、２ｇ／１００ｍＬのキレックス−１００（バイオ・ラッド；カリフォルニア州リッチモンド）と一晩撹拌した。アッセイを、３７℃で、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘリーダー（モレキュラーデバイス）を使用して、４９０ｎｍにて９６ウェルマイクロプレートの形式で読み取った。

（ｈ）可逆性アッセイ
５ｍＬのＮＤＭ−１（５００ｎＭ）を、ＡＭ−Ａ（１００μＭ）と共に、またはＡＭ−Ａを用いることなく、氷上で１時間インキュベートした。酵素のない対照は、バッファー単独（キレックス処置した５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５））であった。２．５ｍｌを、バッファーでカラムを平衡化した後ＰＤ−１０スピンカラム（ＧＥヘルスケア）に通し、２，０００×ｇで２分間遠心した。ＰＤ−１０前（＋ＡＭ−Ａ、−ＡＭ−Ａ、−ＮＤＭ−１）、ＰＤ−１０後（（＋ＡＭ−Ａ、−ＡＭ−Ａ、−ＮＤＭ−１）、およびニトロセフィンを、３０℃に平衡化した。酵素溶液の２０μｌを１８０μｌのニトロセフィンに添加して、５０ｍＭの最終酵素濃度、ならびに１００μＭのニトロセフィンおよび１０μＭのＡＭ‐Ａとした。アッセイを、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘリーダー（モレキュラーデバイス）を使用して３０℃で１時間、４９０ｎｍにて９６ウェルマイクロプレートの形式で読み取った。

（ｉ）Ｚｎ^２＋回復アッセイ
１０μＭのＺｎＳＯ_４を補充したＮＤＭ−１（５ｎＭ）を、２０μＭのＡＭ−Ａと３０℃で１５分間インキュベートした。ニトロセフィン（３０μＭ）および５００ｎＭ〜４０μＭのＺｎＳＯ_４を添加して最終容量１００μｌとし、４９０ｎｍでの吸光度を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘリーダー（モレキュラーデバイス）を使用して３０℃で３０分間モニタリングした。％残存活性を、ＡＭ‐Ａのない対照から計算した。わずかに負の％残存活性は０として報告した。

（ｊ）不活性化反応速度
ＮＤＭ−１（５０ｎＭ）を、８μＭから１／２の段階希釈でＡＭ‐Ａを含む２０μＭのニトロセフィンに添加した。このアッセイを、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２００μＬの最終容量で実施した。アッセイを、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘリーダー（モレキュラーデバイス）を使用して、３７℃で１０分間、４９０ｎｍにて９６ウェルマイクロプレートの形式で読み取った。ＶＩＭ−２（１０ｎＭ）を、１６μＭからの１／２の段階希釈でＡＭ−Ａを含む２０μＭのニトロセフィンに添加した。アッセイを、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２００μＬの最終容量で実施した。アッセイを、以前に報告されたように、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘリーダー（モレキュラーデバイス）を使用して、３７℃で１０分間４９０ｎｍにて９６ウェルマイクロプレートの形式で読み取った。全てのアッセイ実験で、反応開始と第１の読み取りとの間のオフセットは〜６ｓであった。

酵素の不活性化を特徴付ける速度定数を、以下のモデル

であって、式中、
Ｅ・Ｚｎ、Ａ、Ｅ・Ｚｎ・Ａ、およびＺｎ・Ａは、それぞれ、活性金属酵素、ＡＭ‐Ａ、三元の金属酵素‐ＡＭ‐Ａ複合体、およびＡＭ‐Ａ−金属複合体である、
モデルにしたがい、ＡＭ‐Ａ濃度に関する擬一次速度定数ｋｉの依存性に基づき計算した。Ｋｉは三元複合体の解離定数を表し、ｋ_＋２は、三元複合体の不活化酵素（Ｅ_{ｉｎａｃｔ}）およびＡＭ‐Ａ−Ｚｎ複合体への解離の速度定数である。定常状態の進行曲線は、以下の積分方程式

であって、式中、ｖ_０はレポーター基質の代謝回転の初期速度であり、ｋ_ｉは偽一次不活性化速度定数である、
式に適合した。Ｋ_ｉおよびｋ_＋２の個々の値は、以前に報告されたように^２５式２

であって、式中、［Ａ］はＡＭ‐Ａの濃度であり、［Ｓ］およびＫ_Ｍはそれぞれレポーター基質の濃度およびＫ_Ｍである、
式２にｋ_ｉの値を適合することにより決定した。

（ｋ）ＩＣＰ質量分析
誘導結合質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）を使用して、精製したＮＤＭ−１（２７−２７０）からＺｎ^６６をキレートするＡＭ‐Ａの特質を解析した。ＮＤＭ−１タンパク質を、以前に報告されたように^２６精製し、１５ｋＤａのカットオフ透析チューブを使用して、ＩＣＰ−ＭＳバッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）へと新たに４℃で一晩交換して、混入している金属を除去した。タンパク質を、〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、さまざまな濃度のＡＭ−Ａをタンパク質試料と、３重で、ゆっくりと撹拌しながら室温で３時間インキュベートした。タンパク質‐ＡＭ‐Ａの試料を、１２−１４ｋＤａカットオフ Ｄ−ｔｕｂｅ ｄｉａｌｙｚｅｒ ｍｉｎｉ（ＥＭＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）マイクロ透析カセットを使用して、ＩＣＰ−ＭＳバッファーへと、４℃で一晩再度透析した。最終的なタンパク質を、ＩＣＰ−ＭＳバッファー中で１ｍｇ／ｍｌに希釈し、次いで、内部標準物質（１０ｕｇ／Ｌ Ｓｃ４５、１％の硝酸、Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｖｅｎｔｕｒｅｓ）中で１／４０に希釈した。試料の解析の前に、ＩＣＰ ＭＳを、対象となる金属の同位体を含む標準溶液（Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｖｅｎｔｕｒｅｓ）を使用して較正した。次いで、タンパク質の試料を、ＮｅｘＩＯＮ ３０００ ＩＣＰ質量分光計（パーキンエルマー）へ噴霧により移した。定量解析を、各要素に関して５０ｍｓ／ＡＭＵの取り込み時間でのピークホッピングモードを使用して、読みとり当たり６０スイープで、各試料について３重に実施した。器機の設定は、ｒｆパワー（１６００Ｗ）、積分時間（３５ｓ）、衝突気体（Ａｒ４０）、ＲＰＱ電圧（２５Ｖ）および試料の流速（４ｒｐｍ）であった。同位体存在比を、ＮｅｘＩＯＮソフトウェアプログラムを使用して、ピーク面積を積分することにより決定し、データを、マイクロソフト社のエクセルを使用して図表として表した。

（ｌ）ＦＩＣインデックスの決定
ＦＩＣ値を、１／２で段階希釈した各メロペネムおよびＡＭ‐Ａの８つの濃度でチェッカーボードを設定する標準的な方法^２７により決定した。実験を二重に行い、平均値を計算に使用した。各化合物のＭＩＣは、増殖を示さない最も低い化合物濃度とした。各化合物のＦＩＣは、増殖を示さないウェルについて共化合物存在下での化合物濃度として計算し、その化合物のＭＩＣにより除算された。ＦＩＣインデックスは、２つのＦＩＣの合計である。

（ｍ）臨床単離物のスクリーニング
ＡＭ‐Ａの様々な濃度を、抵抗性についてのＥＵＣＡＳＴの限界点である２ｍｇ／ｌのメロペネムと組み合わせて選択した^２８。２つの化合物の相乗的な特性は、増殖培地としてＢＨＩ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ、英国）および０．５マックファーランドの接種菌液を使用してマイクロタイタートレイで試験した。すべてのプレートは、対照株の大腸菌ＡＴＣＣ ２５９２２および緑膿菌ＡＴＣＣ ２７８５３を含んだ。全体として、２２６の非クローン性の臨床単離物（腸内細菌科、緑膿菌およびアシネトバクター属）を、以下のＭＢＬ：ＳＰＭ−１（ｎ＝１７）、ＡＩＭ−１（ｎ＝８）、ＮＤＭ−１（ｎ＝６７）、ＶＩＭ−型（ｎ＝１１４）またはＩＭＰ−型（ｎ＝２０）のうちの１つを含めて試験した。ＶＩＭ−１を保有する３つのＥ．ｃｏｌｉおよび５つの肺炎桿菌が、セリンカルバぺネマーゼＫＰＣも有しており、ＮＤＭ−１を保有する４つのＥ．Ｃｏｌｉおよび１つの肺炎桿菌が、カルバぺネマーゼＯＸＡ−１８１も有していた。プレートを３７℃でインキュベートし、１８時間後に読み取った。サブセットの株（♯４８）を反復して再現性を試験し、元のデータから偏差がないことを示した。

（ｎ）動物実験
すべての動物を、マックマスター大学の中央動物施設での特定の病原体フリーユニットに収容した。全ての実験プロトコルは、マックマスター動物研究倫理審査会（ＭｃＭａｓｔｅｒ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｂｏａｒｄ）により認可されており、これにしたがって実施された。雌性ＣＤ１マウスを、チャールズリバーより購入した。

（ｏ）細菌感染
マウスに肺炎桿菌Ｎ１１−２２１８を、すべての臓器細菌負荷実験では２×１０^６のコロニー形成単位（ｃｆｕ）で、またはすべての生存実験では５×１０^７のｃｆｕの用量で、腹腔内（ｉｐ）を介して感染させた。すべての臓器細菌負荷実験では、マウスを感染から４８時間後に安楽死させ、脾臓および肝臓を回収した。臓器を氷上で１ｍｌの滅菌性ＰＢＳの中に置き、次いでホモジナイズした（ミキサーミル４００；レッチェ）。臓器のホモジネートをＰＢＳで段階希釈し、ｃｆｕ計測のためブリリアントグリーン寒天（Ｏｘｏｉｄ）上にプレーティングした。生存曲線のため、マウスをエンドポイントまでモニタリングした。すべての実験で、マウスを、特定の皮下用量のＰＢＳ、メロペネム、ＡＭ‐Ａ阻害剤、または抗生剤および阻害剤の組み合わせのいずれかで、感染から３０分後に処置した。

結果および考察
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＷ２５１１３を、浸透性を増大させ、かつ小分子の排出を低減させるためにｂａｍＢおよびｔｏｌＣの遺伝子の欠失により改変性した。次いで、この株を、ｐＬａｃプロモーター制御下のｂｌａ_{ＮＤＭ−１}遺伝子の単一コピー染色体挿入によりさらに改変性した。微生物の天然産物抽出物を、致死量以下の１／４ＭＩＣメロペネムの存在下で、この株に対してスクリーニングした。ＡＭ‐Ａをヒット抽出物から精製して、その構造をＮＭＲ、質量分析および旋光分析により明らかにした。ＡＭ‐ＡのＩＣ_５０値を、以下の精製した酵素：ＭＢＬ ＩＭＰ−７、ＶＩＭ−２、およびＮＤＭ−１；ＳＢＬ ＣＴＸ−Ｍ−１５、ＫＰＣ−２、ＯＸＡ−４８、およびＴＥＭ−１、ならびにウサギの肺由来のＡＣＥに対し、レポーター基質としてニトロセフィン（ＭＢＬおよびＳｅｒ ＢＬに関して）およびフランアクリロイル−Ｌ−フェニルアラニルグリシルグリシン（ＡＣＥに関して）^２１を使用して、決定した。ＩＣ_５０、可逆性、Ｚｎ^２＋回復、および不活性化酵素アッセイを、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中で実施し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘリーダー（モレキュラーデバイス）を使用して測定した。ＩＣＰ−ＭＳの実験を、５ｍｇ／ｍｌの精製したＮＤＭ−１およびさまざまな濃度のＡＭ‐Ａを用い、続いての希釈および噴霧によるＮｅｘＩＯＮ ３０００ ＩＣＰ質量分光計（パーキンエルマー）内への移行により行った。ＦＩＣ値を、標準的な方法^２７を使用して決定した。ＡＭ‐Ａの様々な濃度を、シュードモナス属、アシネトバクター属、および腸内細菌科を含む２００＋のＭＢＬ−発現の臨床単離物に対して、２ｍｇ／ｌのメロペネムと組み合わせて試験した。２×１０^６の形成単位（ｃｆｕ）用量の肺炎桿菌のＮ１１−２２１８を全ての臓器細菌量の実験で使用し、５×１０^７ｃｆｕの用量をすべての生存実験で使用した。全ての実験で、マウスを感染から３０分後に化合物で処置した。

ＡＭ−Ａは、ＮＤＭ−１および関連するＭＢＬ ＶＩＭ−２（図１ｂ）の強力な用量依存性阻害をｉｎ ｖｉｔｒｏで示し、ＩＭＰ−７ ＭＢＬに対してより弱い活性を有することを示した。ＡＭ‐Ａは、セリンβラクタマーゼ ＴＥＭ−１およびＣＴＸ−Ｍ−１５、ならびにセリンカルバペネマーゼＫＰＣ−２およびＯＸＡ−４８に対して効力がなかった（図１ｂ）。ＮＤＭ−１の阻害は、ゲル濾過によるＡＭ‐Ａの除去の後不可逆的であると示された（図１ｃ）が、酵素活性は、金属欠乏機構と一致して過度のＺｎＳＯ_４の添加により回復可能であった（図１ｄ）。哺乳類の金属酵素（ｍｅｔａｌｌｏｅｎｙｚｍｅ）の阻害が潜在的な副作用として観察され得るが、ＡＭ‐Ａは、濃度応答アッセイでウサギの肺のＡＣＥの活性を〜３５％低減させ得ただけであった。金属酵素ＮＤＭ−１、ＶＩＭ−２、ＩＭＰ−７、およびＡＣＥを、以前に報告されたように調製した^２９Ｚｎ^２＋欠乏バッファー中で高濃度のＡＭ‐Ａ（０．５ｍＭ）で延長してインキュベーションすることにより、ＮＤＭ−１およびＶＩＭ−２の完全な不活性化、ならびにＩＭＰ−７およびＡＣＥの活性のそれぞれ〜７０％および〜５０％の阻害がもたらされ、ＮＤＭおよびＶＩＭ ＭＢＬに対する選択性を例証した。時間依存的な不活性化は、ＮＤＭ−１（Ｋ_ｉ＝１１ｎＭ、ｋ_＋２＝０．００６２ｓ^−１）およびＶＩＭ−２（Ｋ_ｉ＝７ｎＭ、ｋ_＋２＝０．００６５ｓ^−１）に関して飽和性であることが示され、ＡＭ‐ＡがＺｎ^２＋を除去する不活性化機構と一致していた。この作用機構は、ＡＭ‐Ａにより不活性化したＮＤＭ−１での〜１．８Ｚｎ等価物の喪失を示した誘導結合質量分析により確認された。

遺伝子操作したＥ．ｃｏｌｉおよび臨床ＣＲＥ株に対するＡＭ‐Ａおよびメロペネム濃度の系統的な滴定から、ＡＭ‐Ａが、ＮＤＭ阻害と一致してメロペネム活性を回復させたことが示された。チェックボードＭＩＣ試験は、ＮＤＭ−１を発現するＣＲＥでのみメロペネムとＡＭ‐Ａとの間で予測された相乗作用を認め、カルバペネム感受性株では認めなかった（図２ａ、ｂ）。分別阻害濃度（Ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＩＣ）インデックス値を、メロペネムおよびＡＭ‐Ａの組み合わせに対して試験した１６の臨床ＣＲＥ単離物で＜０．１であると決定した（≦０．５のＦＩＣ値は、相乗的であると定義される^２７）。メロペネムとのＡＭ‐Ａ（８μｇ／ｍｌ）の相乗作用を、２２９のＭＢＬ陽性（ＳＰＭ−１、ＩＭＰ、ＮＤＭ、ＡＩＭおよびＶＩＭ）非クローン性臨床単離物（腸内細菌科、アシネトバクター属、およびシュードモナス属）を使用してさらに調査した（図２ｃ）。セリンカルバマーゼ、またはＭＢＬおよびセリンカルバぺネマーゼを有した７６の単離物もまた試験した。株は１０年間にわたり、ロシア、インド、パキスタン、オーストラリア、北アフリカ、および南アメリカ由来の単離物を含む世界的なＭＢＬ収集物の一部として集めた。ＡＭ‐Ａは、ＮＤＭ陽性単離物の８８％およびＶＩＭ陽性単離物の９０％でメロメネム感受性（２μｇ／ｍｌ）を回復させた。重要なことに、ＡＭ‐Ａは、新規抗生剤に関して非常に困難なモデルとみなされているシュードモナス属（主に緑膿菌）で活性であった。ＡＭ‐Ａは、ＳＰＭ−１、ＩＭＰおよびＡＩＭとはほとんど相乗作用を示さなかったが、これらのＭＢＬは、「世界的な」ＶＩＭおよびＮＤＭ ＭＢＬよりも少なく、よって臨床的にはそれほど適切でないとみなされる。ＩＭＰ発現株との相乗作用の欠如は、ＮＤＭ−１またはＶＩＭ−２と比較して精製ＩＭＰ−８の不活性化が弱いことを示す生化学的データと良好に相関する。

ＮＤＭ−１陽性臨床ＣＲＥの抵抗性プロファイルおよびＡＭ‐ＡがＮＤＭ−１陽性臨床ＣＲＥに対するメロペネム活性を増強させる効力から、ＡＭ‐Ａが、ｉｎ ｖｉｖｏでメロペネムへのＮＤＭ−１媒介型の抵抗性を反転させ、この抗生剤の臨床効力を回復させることが示唆される。これを試験するために、ＣＤ１マウスに、致死用量のＮＤＭ−１陽性肺炎桿菌 Ｎ１１−２２１８を腹腔内から感染させ、致死性全身感染症を引き起こさせ、メロペネムまたはＡＭ‐Ａ単一療法、または抗生剤−阻害剤の併用療法の効力を評価した。予備的な用量実験から、組織中のＮＤＭ−１陽性肺炎桿菌の細菌負荷は、ＡＭ‐Ａ単独での処置の影響を受けず、この株は、５０ｍｇ／ｋｇ未満の用量でのメロペネム単一療法に抵抗性があり、致死性の感染症を引き起こすことが経験的に判定されていた。しかしながら、ＡＭ−Ａおよびメロペネムを含む併用療法は、単一の腹腔内投与の後、脾臓における細菌負荷を顕著に減少させ（図３ａ）、より少ない度合いではあるが肝臓でも減少させた（図３ｂ）。注目すべきことに、メロペネムまたはＡＭ‐Ａ単独ではＮＤＭ−１陽性肺炎桿菌による致死性感染症を予防できなかったが、単一用量の併用療法は感染後５日目に＞９５％の生存をもたらした（図３ｃ）。

ＡＭ‐Ａは、ＮＤＭおよびＶＩＭ ＭＢＬにより媒介される抵抗性を克服し、かつカルバペネムに対するカルバペネム抵抗性グラム陰性病原体を再感作できる抗生剤アジュバントに関する非毒性の候補物である。活性薬剤／阻害剤の組み合わせは、Ｓｅｒ−βラクタマーゼを標的とした阻害剤で臨床において非常に成功し続けている^３０。ＡＭ‐Ａは、急速に世界に広がり特に開発途上国で著しいヒトの罹患率をもたらしている重要なＭＢＬに対して、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで相補的な活性を初めて示す。本明細書中で示されるようにメロペネムなどのβラクタム系抗生剤と併用すると、抵抗性を克服でき、抗生剤の活性は完全に回復された。ＡＭ‐Ａ、または半合成誘導体はそれゆえ診療所での近年のＭＢＬの出現に対応するための抗生剤アジュバント共療法の優れた手がかりである。

実施例２ ＡＭ‐Ａのプロドラッグ
この実施例では、様々なＡＭ‐Ａのプロドラッグを調製する。
（ａ）一般化学
ＡＭ−Ａのプロドラッグを、ＡＭ‐Ａ中のカルボン酸基を活性化し、次いで塩基の存在下で適切な求核剤を添加することにより調製する。反応混合物を中和後単離して、以下のＡＭ‐Ａのプロドラッグ

であって、式中、
Ｒ＝−ＣＨ_３、−（ＣＨ_２）_ｘＣＨ_３（ｘ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１５、１６、１７または１８）、−ＣＨ_２ＯＣ（Ｏ）ｔ−Ｂおよび

である、
ＡＭ‐Ａのプロドラッグを得る。

本願は、実施例を参照して記載されているが、特許請求の範囲は、実施例に記載される実施形態により限定されるべきものではなく、全体としての記載と一致した最も広い解釈を取るべきであることを理解すべきである。

すべての公報、特許、および特許出願は、それぞれ個々の公報、特許、または特許出願が、参照として全体に援用されると意図された場合と同一の程度として、本明細書中参照として全体に援用される。本願の用語は、本明細書中参照として援用される文書と異なって定義されていることが発見された場合は、本明細書中で提供された定義が、用語の定義として扱われるものである。

本明細書に関連する文書の引用

Claims (34)

1. １つまたは複数のβラクタム系抗生剤と、
   １つまたは複数の式Ｉ：
   

   

   の化合物であって、式中、
   Ｒ^１ がＣＨ（ＮＨ_２）Ｃ（Ｏ）ＯＲ^５ であり；
   Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５が、独立して、Ｈ、Ｃ_１−２４アルキル、Ｃ_１−６アルキレンＣ_６−１０アリール、Ｃ_１−６アルキレンＣ_３−１０シクロアルキル、Ｃ_１−６アルキレンＣ_３−１０ヘテロシクロアルキル、およびＣ_１−６アルキレン−ＯＣ（Ｏ）Ｃ_１−６アルキルから選択される、
   化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物と、
   を含む、細菌感染症または細菌感染症から生じる疾患、障害もしくは状態を処置するための医薬組成物。
2. 前記１つまたは複数のβラクタム系抗生剤が、ペニシリン誘導体（ペネム系）、セファロスポリン（セフェム系）、モノバクタム、およびカルバペネムから選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記１つまたは複数のβラクタム系抗生剤が、イミペネム、エルタペネム、メロペネム、ドリペネム、ビアペネム、パニペネム、チカルシリン、アンピシリン、アモキシシリン、カルベニシリン、ピペラシリン、アズロシリン、メズロシリン、チカルシリン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフトリアキソン、およびセフタジジムから選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
4. 前記１つまたは複数の抗生剤が、カルバペネム系抗生剤である、請求項２に記載の医薬組成物。
5. 前記カルバペネム系抗生剤が、メロペネム、ビアペネム、ドリペネム、パニペネム、およびイミペネムから選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
6. Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５が、それぞれＨである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
7. Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５が、独立して、Ｃ_１−１８アルキル、Ｃ_１−４アルキレンＣ_５−６ヘテロシクロアルキル、およびＣ_１−４アルキレン−ＯＣ（Ｏ）Ｃ_１−６アルキルから選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
8. Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５が同一であり、Ｃ_１−１８アルキル、Ｃ_１−４アルキレンＣ_５−６ヘテロシクロアルキル、およびＣ_１−４アルキレン−ＯＣ（Ｏ）Ｃ_１−６アルキルから選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
9. Ｒ ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５が、独立して、Ｈ、Ｃ_１−１８アルキル、Ｃ_１−４アルキレンＣ_５−６ヘテロシクロアルキル、およびＣ_１−４アルキレン−ＯＣ（Ｏ）Ｃ_１−６アルキルから選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
10. Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５が同一である、請求項９に記載の医薬組成物。
11. 式Ｉの化合物が、ＡＭ−Ａまたはそれらの薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
12. １つまたは複数のβラクタム系抗生剤と、
    請求項１および請求項６〜１１のいずれか１項に記載の１つまたは複数の式Ｉの化合物、またはそれらの薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物と、
    を含む医薬組成物であって、
    前記１つまたは複数のβラクタム系抗生剤および１つまたは複数の式Ｉの化合物が、細菌感染症、または細菌感染症から生じる疾患、障害、もしくは状態の処置に関するβラクタム系抗生剤の効力を改善するために有効な量で存在する、
    医薬組成物。
13. 前記１つまたは複数のβラクタム系抗生剤および前記１つまたは複数の式Ｉの化合物が、別々の剤形で製剤化される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
14. 前記１つまたは複数のβラクタム系抗生剤および前記１つまたは複数の式Ｉの化合物が、単一の剤形で製剤化される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
15. 前記細菌感染症が、少なくとも１つのメタロβラクタマーゼ（ＭＢＬ）を発現する細菌の感染症である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
16. 前記ＭＢＬが、ＩＭＰ型、ヴェローナ・インテグロンコード型メタロβラクタマーゼ（Ｖｅｒｏｎａ ｉｎｔｅｇｒｏｎ−ｅｎｃｏｄｅｄ ｍｅｔａｌｌｏ−β−ｌａｃｔａｍａｓｅ；ＶＩＭ）、またはニューデリー・メタロベータラクタマーゼ（ＮＤＭ）である、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. 前記細菌感染症が、少なくとも１つのカルバペネム抵抗性グラム陰性細菌の感染症である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
18. 前記細菌感染症が、腸内細菌科、アシネトバクター、またはシュードモナスに属する少なくとも１つの細菌の感染症である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
19. 前記腸内細菌科の細菌が、クレブシエラ属である、請求項１８に記載の医薬組成物。
20. 前記腸内細菌科の細菌が、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項１８に記載の医薬組成物。
21. 前記シュードモナス属の細菌が、緑膿菌である、請求項１８に記載の医薬組成物。
22. 対象において細菌感染症から生じる疾患、障害または状態を処置または予防する方法において使用するための医薬組成物であって、
    前記組成物は、請求項１および請求項６〜１１のいずれか１項に記載の１つまたは複数の式Ｉの化合物、またはそれらの薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物を含み、
    前記方法は、１つまたは複数のβラクタム系抗生剤の有効量を前記組成物と併用して、前記対象に投与することを含む、
    医薬組成物。
23. 細菌感染症を処置するためのβラクタム系抗生剤の効力を改善する方法において使用するための医薬組成物であって、
    前記組成物は、請求項１および請求項６〜１１のいずれか１項に定義される１つまたは複数の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物を含み、
    前記方法は、前記組成物を前記抗生剤と併用して、それを必要とする対象に投与することを含む、
    医薬組成物。
24. 細菌感染症から生じる疾患、障害または状態を処置するためのβラクタム系抗生剤の効力を改善する方法において使用するための医薬組成物であって、
    前記組成物は、請求項１および請求項６〜１１のいずれか１項に定義される１つまたは複数の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物を含み、
    前記方法は、それを必要とする対象に前記組成物を投与することを含む、
    医薬組成物。
25. 細菌感染症、または細菌感染症から生じる疾患、障害もしくは状態を処置するためのキットであって、
    １つまたは複数のβラクタム系抗生剤と、
    請求項１および請求項６〜１１のいずれか１項に定義される１つまたは複数の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物と、
    任意に、前記１つまたは複数のβラクタム系抗生剤ならびに前記１つまたは複数の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物を、それを必要とする対象に投与するための説明書と
    を含む、キット。
26. 細菌感染症、または細菌感染症から生じる疾患、障害もしくは状態を処置するためのキットであって、
    請求項１および請求項６〜１１のいずれか１項に定義される１つまたは複数の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物と、
    前記１つまたは複数の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物を、細菌感染症、または細菌感染症から生じる疾患、障害もしくは状態のための抗生剤を投与されている対象に投与するための説明書と
    を含む、キット。
27. 細菌感染症、または細菌感染症から生じる疾患、障害もしくは状態を処置するためのβラクタム系抗生剤の効力を改善するためのキットであって、
    １つまたは複数のβラクタム系抗生剤と、
    請求項１および請求項６〜１１のいずれか１項に定義される１つまたは複数の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物と、
    任意に、前記１つまたは複数のβラクタム系抗生剤ならびに前記１つまたは複数の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物を、それを必要とする対象に投与するための説明書と
    を含む、キット。
28. 細菌感染症、または細菌感染症から生じる疾患、障害もしくは状態の処置のためのβラクタム系抗生剤の効力を改善するためのキットであって、
    請求項１および請求項６〜１１のいずれか１項に定義される１つまたは複数の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物と、
    １つまたは複数の上記に定義される式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩および／もしくは溶媒和物を、細菌感染症、または細菌感染症から生じる疾患、障害もしくは状態を処置するために前記βラクタム系抗生剤を投与されている対象に投与するための説明書と
    を含む、キット。
29. 前記１つまたは複数のβラクタム系抗生剤が、ペニシリン誘導体（ペネム系）、セファロスポリン（セフェム系）、モノバクタムおよびカルバペネムから選択される、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載のキット。
30. １つまたは複数のβラクタム系抗生剤が、イミペネム、エルタペネム、メロペネム、ドリペネム、ビアペネム、パニペネム、チカルシリン、アンピシリン、アモキシシリン、カルベニシリン、ピペラシリン、アズロシリン、メズロシリン、チカルシリン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフトリアキソンおよびセフタジジムから選択される、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載のキット。
31. 前記１つまたは複数のβラクタム系抗生剤および前記１つまたは複数の式Ｉの化合物が、別々の剤形で製剤化される、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載のキット。
32. 前記１つまたは複数のβラクタム系抗生剤および前記１つまたは複数の式Ｉの化合物が、単一の剤形で製剤化される、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載のキット。
33. 式Ｉの化合物が、真菌から抽出された天然産物である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
34. 前記真菌がアスペルギルス・ベルシコロル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）である、請求項３３に記載の医薬組成物。

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