JP2022530351A - 疾患および障害の検出のために細胞外小胞を使用する方法および組成物 - Google Patents

Abstract

本明細書に開示されるのは、試料中の生物学的実体または化学物質を検出するための方法であり、生物学的実体または化学物質は細胞外小胞に関連している。開示される方法は、ａ）試料の処理、（ｂ）細胞外小胞の存在を検出し、細胞外小胞を単離するための検出アッセイの使用、（ｃ）生物学的実体または化学物質を露出または放出するための細胞外小胞の処理、および（ｅ）細胞外小胞から放出された生物学的実体または化学物質の検出の工程を含む。特定の実施形態では、細胞外小胞は、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、脂質、核酸または他の細胞成分と関連している。検出方法は、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アスペルギルス種、フサリウム種、コクシジオイデス種、クリプトコッカス種、およびヒストプラズマ種に関連する微生物抗原の存在を識別するのに役立つ。

Description

本明細書では、感染性微生物を検出し、関連する疾患および障害を診断するのに有用な改善された方法および組成物が提供される。

病原菌（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍ）および疾患および障害を示すバイオマーカーを検出するために現在利用可能な診断試験は、様々な問題にさらされている。多くの場合、このような試験では、取得が困難な試料の使用、多段階の試料処理、およびそれに続く分析の必要がある。これらは、弱い信号の検出に依存し、人為的エラーが発生しやすい場合がある。現在利用可能な診断試験に関連するさらなる複雑化させる要因は、それらを検出するために従来使用されてきた抗原マーカーをもはや容易に呈しないまたは呈しない（ｎｏ ｌｏｎｇｅｒ ｒｅａｄｉｌｙ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｒ ｐｒｅｓｅｎｔ）薬剤耐性微生物の進化に起因する。他の例では、病原体およびマーカーはタンパク質によって隠されているかマスクされているか、または簡単な検出を妨げる他の生物学的成分によって妨げられている。

容易に入手可能な試料に容易に適用することができる、病原菌およびバイオマーカーを検出するための改善された方法が必要とされている。また、そのような病原菌やバイオマーカーの正確な検出を妨げる可能性のある要素が除去されるか、または最終的な検出手順に干渉するのを防ぐための、試料の処理を含む方法も必要である。

現在利用可能な非培養ベースの診断試験の例は、血液中を循環している真菌抗原の検出を含む。分泌された細胞多糖類ベータ－１，３グルカン（ＧＬ）およびガラクトマンナン（ＧＭ）を検出する２つの利用可能な試験は、一貫性のないパフォーマンス特性を有し、行うためには高度かつ高価な実験リソースが必要である。臨床検査に必要な高度な機能、および採血および／または気管支肺胞洗浄液の侵襲的サンプリングの必要性により、現在利用可能なアッセイの適用が制限され、スクリーニングの実行頻度が低くなり、静脈切開術、気管支鏡検査、および試料処理のための医療施設が必要になる。

試料の最小限の処理を含む使いやすい診断試験の開発が非常に望ましい。さらに、尿等の入手が容易な試料で使用できる試験の開発により、早期発見が改善され、それによって症状の重症度を軽減するための早期介入の可能性が高まる。

さらに、使いやすい「ポイントオブケア」（ＰＯＣ）アッセイの開発は、特に医療施設からの退院後、患者が感染のリスクが最も高い期間中の頻繁なスクリーニングを可能にするであろう。イムノクロマトグラフィーストリップテスト（ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｒｉｐ ｔｅｓｔ）としても知られるラテラルフローデバイス（ＬＦＤ）は、一般的なＰＯＣ試験方法である。ＬＦＤは、試験結果の待機にかかる時間を（数時間から数分に）短縮し、オペレーターのトレーニングを少なくして（これにより、ユーザーによる解釈を可能にする）、製造および使用の両方にかかる費用を削減する。

特定の生物は、検出するのが難しいことで悪名高い。真菌は、群として、多糖類が豊富な生物であり、このことが真菌の抗原ベースのアッセイの開発におけるいくつかの限られた成功を説明している。しかし、特定の真菌抗原は尿中に濃縮されている。しかしながら、この特性は、比較的まれな風土病性真菌症（ヒストプラズマ症等）およびクリプトコッカス症の診断法を開発するためにのみ利用されている。

ガラクトースは哺乳動物において一般的であるが、ガラクトピラノース（ｇａｌＰ）と呼ばれる６員環ヘキソピラノシル形態でのみ見出される。一部の細菌、真菌、原生動物、地衣類、緑藻、ヒトデ、および海綿を含む他の生物は、ガラクトースの５員環型であるガラクトフラノース（ｇａｌＦ）を生成する。生物がｇａｌＦの維持を触媒する特定の酵素を含まない限り、平衡はｇａｌＰ形態を強く支持する。これらの生物では、ｇａｌＦは複合糖質抗原の重要な残基であり、分泌された細胞の多糖類、糖タンパク質、スフィンゴ糖脂質に関連していることを見出すことができる。

本発明者らは、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）と呼ばれる重要な真菌病原体の分生子に対して生成された抗体のクラスを以前に同定した。これらの抗体は、哺乳動物への感染後に尿中に急速に排泄されるｇａｌＦ抗原を同定することが見出された。抗体および技術は、尿診断アッセイとしての使用を可能にする。

しかしながら、必要とされるのは、診断を改善し、検出アッセイの感度を最適化するための方法、すなわち、病原菌に関連する生物学的実体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｎｔｉｔｙ）または化学物質（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｔｉｔｙ）、ならびにバイオマーカーの改善された検出である。また、最小限の試料処理でこのような検出アッセイの感度および性能を向上させる方法も必要である。さらに、尿等であるが、これに限定されない入手が容易な試料に使用できる改善された診断方法が必要である。

一つまたは複数の実施形態によれば、本発明は、試料中の生物学的実体または化学物質を検出するための方法を提供し、ここで生物学的実体または化学物質は、細胞外小胞に関連し、試料の処理、細胞外小胞の存在を検出し、細胞外小胞を単離するための検出アッセイの使用、生物学的実体または化学物質を露出または放出するための細胞外小胞の処理、および細胞外小胞から放出された生物学的実体または化学物質の検出の工程を含む。試料は、カルシウムを除去するカラムを介した遠心分離を含む、様々な方法で処理することができる。これにより、ウロモジュリンが断片化され、モノマーのウロモジュリンが結合している細胞外小胞の共沈が可能になる。細胞外小胞が単離されると、それはさらに処理されて、検出される実体を「放出」することができる。特定の実施形態では、本明細書の方法は、ウロモジュリンを含むがこれに限定されないタンパク質等の他の沈殿可能な生物学的成分に関連する、またはその中に結合する細胞外小胞の同定を可能にする。ウロモジュリンは、主に尿に含まれるタンパク質である。

特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、競合阻害剤であるヒトレクチン、インテレクチン－１を、米国特許出願第１３／５１１，２６４号に以前に開示されたアッセイプロセスから無効化または他の方法で除去することによって、およびｇａｌＦ抗原または他のインテレクチン認識リガンドを含むか、そうでなければ関連する細胞外小胞の検出を可能にすることによって、ヒト体液中の改善されたｇａｌＦ抗原検出を可能にする。細胞外小胞は特定の微生物細胞によって分泌されることが知られており、細胞外小胞は尿中に存在することが知られているが、尿が外因性の細胞外小胞を含み、場合によってはｇａｌＦ抗原等の目的の抗原を含むことはこれまで知られていなかった。本発明者らは、インテレクチンが尿中に存在し、哺乳動物対象における微生物感染の診断の一部として使用される場合、それがｇａｌＦに向けられた抗体と競合するのに役立つことを以前に示した。この発見は、ｇａｌＦ抗原が細胞外小胞に関連しているという発見とともに、感度および精度が向上した検出アッセイの開発、および多重化アッセイの開発を可能にする。

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ ｆｕｎｇｉ）、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、フサリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）、コクシジオイデス種（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、クリプトコッカス種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、接合菌、およびヒストプラズマ種（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｓｐｅｃｉｅｓ）からなる群から選択される生物によって引き起こされるもの等の他の微生物感染の検出をさらに包含する。

一部の実施形態では、微生物感染は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、ノカルジア種（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ ｆｕｎｇｉ）、マイコバクテリア種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、を含むグラム陽性菌種、グラム陰性菌種、ならびに真菌生物（ｆｕｎｇａｌ ｏｒｇａｎｉｓｍ）、たとえばアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、クリプトコッカス種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、ヒストプラズマ種（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、ニューモシスチス種（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、ケカビ目種（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）および他の接合菌を含むが、これらに限定されない、肺感染を引き起こす傾向がある生物によって引き起こされる。したがって、一つまたは複数の実施形態によれば、本発明は、尿、呼吸器液、胃腸液、および血液を含む、インテレクチンを含む液中のｇａｌＦ抗原同定の最適化のための方法を提供する。本発明者らは、これが、真菌抗原に特に焦点を当てるこれらの方法を最適化するために重要であることを見出した。この有用性は、微生物抗原にｇａｌＦが遍在していることを考えると、多くの異なる診断システムでｇａｌＦを含む抗原を標的とする診断に広く適用することができる。

本明細書での発見は、ｇａｌＦの検出に関連し、特にｇａｌＦに適用されるという観点から示されているが、本発明者らは、これらの発見を、ｇａｌＦ以外の抗原の検出に適用することを企図している。たとえば、他の微生物の場合、細胞外小胞は、生物の細胞質内にあり、細胞壁上に発現され、したがっていくつかの他の抗原を含む成分を輸送する可能性があることが企図される。たとえば、一つの実施形態では、本明細書の発見は、結核を診断するための結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に関連するＭＰＢ６４等の抗原またはその断片を含む細胞外小胞の検出に適用される可能性がある。一つの実施形態によれば、本発明は、哺乳動物対象の生体試料中のガラクトフラノース（ｇａｌＦ）残基を含む少なくとも一つの多糖類の存在を検出することにより、微生物感染を有する、有する、または有すると疑われる哺乳動物対象由来の生体試料における微生物感染を診断するための方法を提供する。ここで、この方法は、尿試料中の真菌抗原を検出するための方法を含み、ここで真菌抗原は、細胞外小胞に関連し、脱塩カラムを使用した試料の処理、細胞外小胞の存在を検出し、細胞外小胞を単離するための検出アッセイの使用、真菌抗原を露出または放出するための細胞外小胞の処理、および細胞外小胞から放出された真菌抗原の検出の工程を含む。方法は、処理された試料の、検出可能な量の抗体－多糖複合体を生成するための有効量のガラクトフラノース残基を含む少なくとも一つの多糖または糖タンパク質に特異的な少なくとも一つの抗体との接触；および試料中の微生物の存在の診断である、少なくとも一つの抗体－多糖複合体の存在の検出の工程を含む細胞外小胞から放出された前記真菌抗原の検出をさらに含み、抗体はｍＡｂ４７６を含んでもよい。

一部の実施形態によれば、試料を処理するための方法は、試料を、高い親和性でＣａ²⁺イオンを結合またはキレート化する基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）と接触させることを含む。

一部の実施形態によれば、試料を処理するための方法は、試料を、ｈＩｎＴＬに高い親和性で結合する基材と接触させることを含む。

一部の実施形態によれば、試料を処理するための方法は、試料を、グリセロール、３－ケト－２－デオキシオクトン酸；Ｄ－グリセロール－１－リン酸、Ｄ－マンノヘプトース、セファロース、セファロース含有粒子（すなわち、ラテックス、ポリスチレンまたはガラスビーズ、ミクロスフェアまたはゲル）からなる群から選択される、ｈＩＮＴＬに高い親和性で結合される一つまたは複数の化合物と接触させることを含む。

一部の実施形態によれば、細胞外小胞はタンパク質に結合している。

一部の実施形態によれば、細胞外小胞は、ウロモジュリン等のタンパク質に結合している。

図１は、ｍＡｂ４７６が、ｇａｌＦを産生する真菌のエタノール沈殿物（ＥＰ）中の多糖に対して新規の特異性を有することを示すグラフを提供する。パネルＡ～Ｂ：ｍＡｂ４７６はＧＭよりもＥＰと強く反応する；パネルＣ：ｍＡｂ４７６は、ｇａｌＦを生成する真菌のエタノール沈殿物（ＥＰ）中の多糖類に対して新規の特異性を有する。 図２は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）－複合糖質に対するｍＡｂ４７６ ＥＬＩＳＡを示しており、長鎖ｇａｌＦに対する反応性、および二量体および単量体両方のｇａｌＦに対する比較的強い反応性を示している。 図３は、細胞壁リモデリング、輸送、セルロース分解、ストレス応答等の機能群に配置された、ＩＡ対象由来の尿中にヒトホモログを有さないｍＡｂ４７６反応性タンパク質の質量分析測定を提供する。 図４は、アスペルギルスがＥＶを生成することを示すデータを示している。Ａ）アスペルギルスのＥＶは、ナノ粒子追跡分析によって５０～５００ｎＭを測定する；Ｂ）ｍＡｂ４７６はＥＶごとに複数のエピトープに結合する；Ｃ）ＥＶ由来の抗原の認識は溶解とともに増加する；Ｄ）ｍＡｂ４７６－休眠中の分生子の細胞壁における反応性ＥＶ；Ｅ）発芽中の分生子へのｍＡｂ４７６結合の増加；Ｆ）菌糸壁および細胞外マトリックスは、ｍＡｂ４７６に結合した小胞（大小）を露出させる。 図５は、ＩＡ尿において顕著なｇａｌＦ含有ＥＶを示している。Ａ）ＩＡ対象尿は広いサイズ分布のＥＶを有する；Ｂ）症例の尿由来のＥＶは、真菌（上）およびヒト（下）起源の表面マーカーを別々に示す；Ｃ）培養由来のＥＶと形態学的に類似した尿中ＥＶ。 図６は、総タンパク質含有量と比較した尿中のウロモジュリンレベルを実証するデータを提供する。モノマー化されたウロモジュリンのレベルは、塩を除去するための処理の有無にかかわらず、対照および侵襲性アスペルギルス症（ＩＡ）の人々由来の尿に示されている。 図７は、試料処理、すなわちカルシウムの除去を示す概略図を提供し、糸状のウロモジュリンタンパク質をモノマーに断片化する；次に、これらのモノマーを脱塩カラムで遠心分離して、ＥＶを濃縮することができる。

以下の詳細な説明は、例示的かつ説明的であり、本明細書に記載される本開示のさらなる説明を提供することを意図している。他の利点、および新規の特徴は、本開示の以下の詳細な説明から当業者には容易に明らかになるであろう。本明細書に完全に記載されているかのように、あらゆる目的のために参照により組み込まれるのは、以下の特許出願である：米国仮特許出願第６１／２６３，４９８号、米国特許出願第１３／５１１，２６４号、米国特許出願第９，９１５，６５７号、米国特許出願第１５／８８２，２７８号、米国特許出願第１５／８８９，８４５号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５７８１９、米国仮特許出願第６２／５０３，４９２号、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１８／３１８８８。

細胞外小胞
細胞外小胞（ＥＶ）は、すべての細胞型によって分泌され、間質腔または循環体液に放出される二層膜小胞であり、ここでそれらは受容体細胞に取り込まれるまで長距離を移動することができる（Ｌｅｅ ＴＨ ｅｔ ａｌ． Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ． ３３：４５５-４６７． ２０１１）。ＥＶの形態および細胞産生の方式に基づいて、ＥＶを説明するために様々な用語が使用されている。エクソソーム、微小胞、エクトソーム、微小粒子等は、サイズ、形状、膜表面組成に基づいて分類される（Ｚｈａｎｇ ＨＧ ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ． １８４：２８-４１． ２０１４）。文献で最も受け入れられている分類は、ＥＶの２つの主要なグループを、それらの生合成のメカニズムおよびサイズに基づいて示す：エクソソームおよび微小胞（またはエクトソーム。さらに、アポトーシス小体はＥＶの第三のカテゴリーと見なす人もいる（Ｃｈｏｉ ＤＳ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． １３：１５５４-１５７１． ２０１３）。

エクソソームは、エンドサイトーシス起源の直径４０～１４０ｎｍの二重膜小胞であり、カップ型の形態を有し、１．１３～１．１９ｇ／ｍｌの範囲の密度を示す（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｏｌ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ． ６４：６７６-７０５． ２０１２）。エクソソームは、原形質膜のクラスリン被覆ドメインの内向きの出芽によって発生し、後期エンドソームに腔内小胞（ＩＬＶ）を含む多胞体（ＭＶＢ）を生成する。ＩＬＶの形成は、エンドソームの成熟中に、特定の細胞質タンパク質がｄｅ ＭＶＢ内のこれらの小胞に組み込まれるときに起こる。これらの最初の工程は、ＥＳＣＲＴ（エンドソーム輸送選別複合体）機構の制御下で起こる。その後、ＭＶＢは分解のためにリソソームと融合するか、または細胞膜と融合して細胞外空間にエクソソームを放出する。このプロセスはＲＡＢファミリーによって制御される（Ｓｉｍｐｓｏｎ ＲＪ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． ８：４０８３-４０９９． ２００８）。微小胞（またはエクトソーム）はエクソソームよりも大きく、サイズは直径１００～１，０００ｎｍの範囲で、形態は不均一である。エクソソームとは異なり、微小胞（ＭＶ）は、細胞外空間への直接的な外側への出芽を介して原形質膜から発生する。このプロセス中に、新しく発生した小胞は、ドナー細胞の細胞質の内容物および原形質膜上の受容体を捕捉する。ＭＶの生合成の制御は細胞内カルシウム依存性であり、細胞表面受容体の活性化、リン脂質の再分布、および細胞骨格タンパク質の収縮の結果である（Ｐｒｉｎｃｉｐｅ Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． １３：１６０８-１６２３． ２０１３）。アポトーシス小体（ＡＢ）は膜小胞であり、形状が不均一で、直径５０～５００ｎｍの範囲のサイズを示す。ＡＢは、アポトーシスによる細胞死の後期の間に原形質膜の外向きの突起から放出され、小胞内の細胞小器官の存在によって特徴づけられる（Ａｋｅｒｓ ＪＣ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ． １１３：１-１１． ２０１３）。
エクソソームは、様々な宿主組織、特に腫瘍の体液に見られ、多くの報告により、タンパク質、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびＤＮＡとしてのエクソソームの内容物が疾患の状態を反映し、非侵襲的診断および予後の目的のバイオマーカーに適していることが証明されている。本明細書の本発明者らはさらに、エクソソームまたは細胞外小胞が、肺感染症を頻繁に引き起こす特定の病原菌で産生されることを発見した。この例では、糸状菌アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）がｉｎ ｖｉｔｒｏで液体増殖（ｌｉｑｕｉｄ ｇｒｏｗｔｈ）中にＥＶを生成することが示されている；確認されたアスペルギルス症のヒトでは、真菌のＥＶが急速に尿中に排泄されることが示されている。本発明者らは、真菌ＥＶの尿検出が、新規の尿診断試験の基礎であることを発見した。

ＥＶ－関連するタンパク質と生体成分
通常、ＥＶは、高速超遠心分離による場合を除いて、溶液から沈殿させることができない。 特定の状況では、ＥＶは、タンパク質等の追加の生体成分と関連して生体液中に存在する場合がある。そのようなタンパク質の一つは、ウロモジュリン（タム・ホースフォールタンパク質としても知られている）を含み、腎臓でのみ産生され、正常な尿において最も豊富なタンパク質である（Ｄｅｖｕｙｓｔ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ１３， ｐａｇｅｓ ５２５-５４４ （２０１７））。これまで、ウロモジュリンの機能のほとんどはとらえどころのないままであったが、入手可能なデータは、このタンパク質が塩輸送を制御し、尿路感染症および腎臓結石から保護し、腎臓損傷および先天免疫において役割を果たす可能性があることを示唆した。ウロモジュリンへの関心は、まれおよび一般的な腎臓病の範囲における、ウロモジュリンをコードするＵＭＯＤ遺伝子の関与を報告した遺伝学的研究によって後押しされた。ＵＭＯＤのまれな変異は、常染色体優性尿細管間質性腎疾患（ＡＤＴＫＤ）を引き起こし、それが慢性腎疾患（ＣＫＤ）を引き起こす。さらに、ゲノムワイド関連解析により、ＣＫＤのリスク、ならびに一般集団の高血圧および腎臓結石と強く関連しているＵＭＯＤの一般的なバリアントが特定された。

糸状のウロモジュリンは、ヒトＥＶを尿中に「閉じ込める」のに役立つこと、およびウロモジュリン－ＥＶ複合体は低速遠心分離で共沈させることができることが知られている（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ - Ｌｌａｍａ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ７７， ７３６－４２ （２０１０）； Ｋｏｓａｎｏｖｉｃ ＆ Ｊａｎｋｏｖｉｃ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ５７： １４３－４９ （２０１４））。発明者らは、脱塩を伴う尿試料の処理が、高速遠心分離ではなく低速遠心分離を使用するＥＶ－ウロモジュリン共沈の最適化を可能にし、ＥＶを含むｇａｌＦの免疫診断を含むがこれに限定されない技術を使用してＥＶ抗原の認識を保つことを発見した。

生体試料中の微生物感染を診断するための現在の方法
ガラクトマンナン、または抗体ＥＢＡ１／ＥＢＡ２によって同定された交差反応性エピトープを有する抗原が、アスペルギルス種に感染したウサギおよびヒトの尿中に排泄されることが以前に報告されている。Ｋｌｏｎｔ， Ｒ． Ｒ．， Ｍ． Ａ． Ｍｅｎｎｉｎｋ－Ｋｅｒｓｔｅｎ， ａｎｄ Ｐ． Ｅ． Ｖｅｒｗｅｉｊ， Ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｏｔｈｅｒ ｔｈａｎ ｓｅｒｕｍ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ． Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， ２００４． ３９（１０）： ｐ． １４６７－７４； Ｄｕｐｏｎｔ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇａｌａｃｔｏｍａｎｎａｎ ａｎｔｉｇｅｎｅｍｉａ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎｕｒｉａ ｉｎ ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ： ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｒａｂｂｉｔｓ． Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， １９８７． １５５（１）： ｐ． １－１１； Ｂｅｎｎｅｔｔ， Ｊ． Ｅ．， Ｍ． Ｍ． Ｆｒｉｅｄｍａｎ， ａｎｄ Ｂ． Ｄｕｐｏｎｔ， Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇａｌａｃｔｏｍａｎｎａｎ． Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， １９８７． １５５（５）： ｐ． １００５－１０； Ｒｏｇｅｒｓ， Ｔ． Ｒ．， Ｋ． Ａ． Ｈａｙｎｅｓ， ａｎｄ Ｒ． Ａ． Ｂａｒｎｅｓ， Ｖａｌｕｅ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ． Ｌａｎｃｅｔ， １９９０． ３３６（８７２５）： ｐ． １２１０－３； Ａｎｓｏｒｇ， Ｒ．， Ｅ． Ｈｅｉｎｔｓｃｈｅｌ ｖｏｎ Ｈｅｉｎｅｇｇ， ａｎｄ Ｐ． Ｍ． Ｒａｔｈ， Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｕｒｉａ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ａｎｔｉｇｅｎｅｍｉａ ｉｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ． Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， １９９４． １３（７）： ｐ． ５８２－９； Ｓａｌｏｎｅｎ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｓｅｒｕｍ， ｕｒｉｎｅ ａｎｄ ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ ｌａｖａｇｅ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ． Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， ２０００． ３２： ｐ ４８５－４９０を参照されたい。現在、アスペルギルス種の診断アッセイは、尿中の抗原の検出に依存していない。

アスペルギルス種によって引き起こされる疾患
アスペルギルス種は、外因的に肺に獲得される。生物は環境の胞子形成期に成長し、そこで無性生殖は小さく、疎水性で、容易にエアロゾル化する、遍在する分生子を生み出す。肺に吸入された分生子が食作用を逃れ、血管侵入性の菌糸に発芽すると、疾患が発症する。臨床症状は、微生物の侵入および異常な炎症反応の両方から生じ、アレルギー、腐生、半侵襲的、および侵襲性の症状の範囲を作り出す。特に非好中球減少症の宿主では、肺疾患時に生物が血液中を循環していない可能性があるため、血液ベースの診断の開発には、循環細胞を必要とせずにバイオマーカーを検出することができるプラットフォームが必要である。幸いなことに、アスペルギルス種を含む多くの真菌は、成長中に多糖類または他の代謝物を分泌し、実際の血流侵入の前にこれらの産生物の検出を可能にする。たとえば、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）カプセルのガラクトキシロマンナン（ＧＸＭ）多糖類の吸収は、生物が血液感染するかなり前に起こる；したがって、この抗原の検出に依存する診断試験は感度が高く、「早期」の診断結果を提供する。

疫学および真菌感染症へのアプローチ
１９９０年代に、主にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、によって引き起こされる感染症の効果的な予防のために、血液悪性腫瘍の患者およびＨＣＴのレシピエントにおいて起こる日和見感染症に顕著な変化が起こった。初期の研究では、ＣＭＶ疾患を予防するためにｐｐ６５抗原血症の状況で先制的に投与されるガンシクロビルの使用（Ｂｏｅｃｋｈ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｐ６５ ａｎｔｉｇｅｎｅｍｉａ－ｂａｓｅｄ ｅａｒｌｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ． Ｂｌｏｏｄ， １９９９． ９３（５）： ｐ． １７８１－２； Ｂｏｅｃｋｈ， Ｍ．， Ｔ． Ｇｏｏｌｅｙ， ａｎｄ Ｒ． Ｂｏｗｄｅｎ， Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｄｏｓｅ ａｃｙｃｌｏｖｉｒ ｏｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ ｗｈｏ ｒｅｃｅｉｖｅｄ ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ ａｔ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｏｒ ｆｏｒ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｐｐ６５ ａｎｔｉｇｅｎｅｍｉａ． Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， １９９８． １９９８（１７８）： ｐ． １１５３－７； Ｂｏｅｃｋｈ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｓｍａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ａｆｔｅｒ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ： ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ， ｐｐ６５ ａｎｔｉｇｅｎｅｍｉａ， ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， １９９７． ６４： ｐ． １０８－１１３； Ｂｏｅｃｋｈ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｐｐ６５ ａｎｔｉｇｅｎｅｍｉａ－ｇｕｉｄｅｄ ｅａｒｌｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ ｖｅｒｓｕｓ ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ ａｔ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ａｆｔｅｒ ａｌｌｏｇｅｎｉｅｃ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ： ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄ ｓｔｕｄｙ． Ｂｌｏｏｄ， １９９６． ８８（１０）： ｐ． ４０６３－４０７１）、カンジダ症を予防するための予防的フルコナゾールの有用性（Ｓｌａｖｉｎ， Ｍ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｆｌｕｃｏｎａｚｏｌｅ ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ ｆｏｒ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ａｆｔｅｒ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ－－ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ， ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ， ｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄ ｓｔｕｄｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．， １９９５． １７１（６）： ｐ． １５４５－５２）が検証された。その後の移植結果の独立した分析では、慢性骨髄性白血病のＨＣＴ後の生存率に関連する２つの変数は、ガンシクロビルとフルコナゾールの投与であることが示された（Ｈａｎｓｅｎ， Ｊ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｕｎｒｅｌａｔｅｄ ｄｏｎｏｒｓ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ． Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １９９８． ３３８： ｐ． ９６２－８）。これらの研究は、感染の予防が移植およびがん化学療法の全体的な転帰を改善する上で重要な要素であることを示している。したがって、転帰を改善する試みは、早期診断のための方法を確立することだけでなく、標的とされた予防を可能にする方法を開発することにも焦点を合わせるべきである。

残念ながら、感染症の予防の成功は、病原性カビ、特にアスペルギルス種の出現によって制限されてきた。１９８７年から１９９３年までのフレッド・ハッチンソンがん研究センター（ＦＨＣＲＣ）でのアスペルギルス症のレビューは、感染症の発生率が１９９３年の最初の６ヶ月間に増加したことを示した。より最近の研究は、感染症の全体的な発症率は過去１０年間で３倍になり、この感染症は現在、同種異系のＨＣＴレシピエントの死亡の１０～２０％を占めていることを示している（Ｍａｒｒ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｍｏｕｌｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ． Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， ２００２． ３４： ｐ． ９０９－９１７； Ｗａｌｄ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｌａｒｇｅ ｃｏｈｏｒｔ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， １９９７． １７５： ｐ． １４５９－６６）。

しかしながら、報告された発生率は、主に、診断の偏りおよび感染症を確立する際の積極性対推定的な治療の違いに起因して変化する。たとえば、最近の多施設共同研究は、自家および同種異系のＨＣＴレシピエントの両方におけるアスペルギルス症の発生率は施設ごとに異なり、一部の施設では非常に多くの症例が報告され、他の施設では認識された感染がほとんどまたはまったく報告されていないことを示している（Ｎｅｏｆｙｔｏｓ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ： ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ （ＰＡＴＨ） Ａｌｌｉａｎｃｅ ｒｅｇｉｓｔｒｙ． Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， ２００９． ４８（３）： ｐ． ２６５－７３）。アスペルギルス症の症例の大部分は、重度のＧＶＨＤおよび副腎皮質ステロイドの使用に関連して、移植後遅くの非好中球減少期中に発生し、同種異系ＨＣＴのレシピエントの中央値は約８２日である。驚くべきことに、自家移植片のレシピエントでさえ、ＨＣＴ後の中央値５１日で、ＨＣＴ後遅くにＩＡを発症するようになった。ＩＡ診断の日数は非常に広範囲である；この最新の多施設共同研究では、ＩＡ診断は幹細胞の受領後０日目から６，５４２日目までの範囲であった。

他のカビによって引き起こされる侵襲性真菌感染症は、同種異系および自家ＨＣＴのさらに後で発生する。効果的なレジメンでは、薬剤の長期投与または外来患者での頻繁なモニタリング（あるいはその両方）が必要になるため、ＨＣＴと比較した感染症のタイミング、および好中球減少症のリスク期間をはるかに超えるリスク期間の増加は、予防戦略の開発を複雑にする。ＩＡの発症が遅れる傾向は、固形臓器移植（ＳＯＴ）を受けたことにより感染のリスクがある患者にも当てはまる。米国の１７のセンター（ＰＡＴＨアライアンス）の４２９人のＳＯＴレシピエントにおける侵襲性真菌感染症を要約した上記のＩＡの疫学および転帰について評価された同じ多施設コホートでは、ＩＡは、移植後の中央値１００日（範囲１０、１４６）、５０４日（範囲３、４１７）および３８２日（範囲３１、３０９）で、肝臓、肺、および心臓の移植レシピエントにおける移植後の退院をはるかに超えて発症することが確認された（Ｎｅｏｆｙｔｏｓ ｅｔ ａｌ， Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｏｌｉｄ ｏｒｇａｎ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ． Ｔｒａｎｓｐｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， ２０１０． １２（３）： ｐ． ２２０－９）。したがって、最近の単一施設および多施設疫学研究の転帰は、真菌感染症、特にアスペルギルス種によって引き起こされる感染症は、通常、移植等の免疫抑制処置後、予測できないタイミングで発症することを示している。したがって、進行性疾患を予防し、ＩＡを早期に診断する方法を確立するには、アッセイ性能パラメーターの最適化以上のものが必要であるが、外来診療の場で効果的に使用できるＰＯＣ試験等の戦略も必要である。

病原性真菌感染症の診断：概要
侵襲性真菌感染症は、一部には、生物を実験室で培養することが困難であるために、診断するのが難しいことで有名である。この困難さは、単純な二分裂によって複製されない形態での生物の増殖、および実験室における代替増殖条件の要件を含む、複数の要因に続発する。また、過度の罹患率を誘発することなく、最も頻繁に関与する部位、すなわち肺から適切な組織試料を取得することは困難な場合がある。補助的な診断試験が開発され、一般的に使用されているが、クリプトコッカス症および複数の風土病真菌によって引き起こされる感染症（ヒストプラズマ症およびコクシジウム菌症等）を含む複数の真菌感染症の場合、血液、尿、または脳脊髄液等の他の液体中の真菌多糖類抗原を検出するイムノアッセイを使用して頻繁に診断される。たとえば、尿中のヒストプラズマ、ブラストミセス、およびコクシジオイデスガラクトマンナンを検出する新しい試験が開発されており、病気の早期診断に役立つようである（Ｄｕｒｋｉｎ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ ｗｉｔｈ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ． Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， ２００８． ４７（８）： ｐ． ｅ６９－７３； Ｓｐｅｃｔｏｒ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ ｉｎ ｄｏｇｓ． Ｊ Ｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ， ２００８． ２２（４）： ｐ． ８３９－４３）。抗原の形態、特に抗原が遊離多糖で尿中に排泄されるか、またはＥＶに関連するかは、アスペルギルス症以外の感染症では不明のままである。

これらの生物は、抗原を提示し、細胞内成分の検出を複雑にするのに役立つ大きく複雑な多糖に富む細胞壁を特徴的に有するので、今日使用されている最も成功した補助アッセイが真菌多糖を検出することは偶然ではない。クリプトコッカス種等の一部の生物では、細胞カプセルに関連する多糖類（たとえば、グルクロノキシロマンナン）がｉｎ ｖｉｖｏで放出および吸収され、末梢分画での検出が容易になる。

ウイルス感染にうまく利用されてきた核酸を検出する成功した診断試験の開発は、世界的な努力にもかかわらず、真菌にとってよりとらえどころのないものであった。部分的には、この困難は、真菌細胞からの核酸の採取の複雑さ、多細胞糸状生物内の複数のゲノムの存在、および局所コンパートメント（肺）から体循環への核酸の当てにならない「放出」によるものである。

アスペルギルス症を診断するための現在の方法
アスペルギルス症の治療の進歩は限られているが、これは、臨床症状の非特異的性質を考えると、通常、感染症の発症の後半に通常起こる放射線学的異常の発症まで、アスペルギルス症の診断が確立されないことが多いためである。アスペルギルス症の予防は、現在、支持療法の最大の重要なニーズの一つを構成している。成功した予防および治療戦略の確立は、治療を導くためのより良い方法を開発することを条件としている。

循環真菌要素を検出するために複数のプラットフォームが存在し、ほとんどのプラットフォームは多糖抗原または核酸の検出に依存している。ＧＭ ＥＩＡおよびＧＬ試験の性能は良好であるが、変動があり、血清および気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）の両方に適用した場合、各試験には独自の強度および制限がある。研究は、診断の補助としてアッセイ性能を最適化することに焦点を合わせてきた。しかし、これらの技術をポイントオブケア検査に適したプラットフォームに発展させようとした研究はない。病院の外で発症するＩＡの発生率の増加を考えると、ポイントオブケア検査は初期の病気を検出するために不可欠である。

ＩＡを診断するための現在の方法は、「示唆的な」異常のＸ線写真による検出に依存している。ＩＡの初期段階では、最も頻繁な異常所見は結節性病変であり、血管侵襲性菌糸によって引き起こされた局所出血に対応する低密度の「ハロー」に囲まれている場合と囲まれていない場合がある（Ｋｉｍ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｈａｌｏ ｓｉｇｎ ｏｎ ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＣＴ： ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ． Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ａｓｓｉｓｔ Ｔｏｍｏｇｒ， １９９９． ２３（４）： ｐ． ６２２－６）。ある程度の組織的な免疫応答を有する宿主で病変が進行すると、病変は空洞形成し、「空気－三日月（ａｉｒ－ｃｒｅｓｃｅｎｔ）」の兆候が現れる。残念ながら、これらのレントゲン写真の異常は、病気の発症の比較的遅い時期に発生する。ある研究では、ＣＴスキャンによるスクリーニングで早期診断が可能になる可能性があることが報告されているが（Ｃａｉｌｌｏｔ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｖｅ ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ ｉｎ ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｅａｒｌｙ ｔｈｏｒａｃｉｃ ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｃａｎ ａｎｄ ｓｕｒｇｅｒｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， １９９７． １５（１）： ｐ． １３９－１４７）、日常的なＣＴは費用がかかり、患者がリスクにさらされている全期間中、たとえば医療施設から退院して自宅にいる間は実行可能な選択肢ではない。

現在の診断方法に関する他の問題は、糸状菌に対する組織培養の非感受性および侵襲的処置によって引き起こされる有害イベントである。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）の微生物学的収量は、約６０％に過ぎず、Ｘ線写真の病変の性質および微生物学研究室の専門知識に依存する（Ｌｅｖｙ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ ｌａｖａｇｅ ａｎｄ ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ｗａｓｈｉｎｇｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ． Ｒｅｓｐｉｒ Ｍｅｄ， １９９２． ８６（３）： ｐ． ２４３－８）。あるセンターでＨＣＴを受けた後にＩＡを発症した２１４人の患者のレビューでは、７７％の症例のみが死前に認識されたことが見出された（Ｗａｌｄ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｌａｒｇｅ ｃｏｈｏｒｔ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， １９９７． １７５： ｐ． １４５９－６６）。開腹手術（ｏｐｅｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）または経皮的に達成される生検の組織病理学的および微生物学的収量は変動し、また、特に子供において頻繁な出血合併症をもたらす（Ｈｏｆｆｅｒ， Ｆ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｌｕｎｇ ｂｉｏｐｓｙ ｆｏｒ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ． Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒａｄｉｏｌ， ２００１． ３１（３）： ｐ． １４４－５２）。

要約すると、２つの臨床的必要性を満たすために新しい方法が必要とされる：（１）感染を早期に検出するためのスクリーニングに使用することができる高感度の試験を開発し、それによって効果的な予防アルゴリズムを可能にする；（２）標準的な組織病理学的および微生物学的手法と併用した場合の真菌の検出感度を高める（診断の補助として）。これらの適応症について検討されてきた２つの主要な方法は、それぞれイムノアッセイまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した真菌抗原または核酸の検出に依存している。

一つの実施形態では、試料中の生物学的実体または化学物質を検出するための方法が本明細書で提供され、生物学的実体または化学物質は、細胞外小胞に関連し、（ａ）試料の処理、（ｂ）細胞外小胞の存在を検出し、細胞外小胞を単離するための検出アッセイの使用、（ｃ）生物学的実体または化学物質を露出または放出するための細胞外小胞の処理、および （ｅ）細胞外小胞から放出された生物学的実体または化学物質の検出の工程を含む。特定の実施形態では、細胞外小胞は、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、脂質、核酸、または他の細胞成分に結合する。タンパク質は、ウロモジュリンおよびその断片を含んでもよい。一つの実施形態では、ウロモジュリンは、細胞外小胞の外側に結合してもよい。

本明細書で企図されるように、試料の処理は、試料を脱塩カラムに通し、試料を高速液体クロマトグラフィーカラムに通し、エタノール沈降、遠心分離、ろ過、サイズに基づく分離、電荷に基づく分離、形態に基づくろ過、サイズおよび流速（ｆｌｏｗ）に基づいて分離するマイクロ流体処理、免疫磁気分離（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）の実行、沈殿、免疫沈降、酵素分解、凝固、滅菌、インキュベーション、または溶解を含んでもよい。

生物学的実体または化学物質を露出または放出するための細胞外小胞の処理は、界面活性剤による溶解を含んでもよく、生物学的実体または化学物質の検出は、イムノアッセイの使用を含んでもよい。一般に、本明細書で使用することが企図されるイムノアッセイアッセイは、少なくとも一つの抗体－抗原複合体の存在を検出することを含んでもよく、少なくとも一つの抗体－抗原複合体の存在の検出は、試料中の微生物の存在の診断である。本明細書で使用される場合、抗原という用語は、抗原応答を生成することができる任意のタンパク質、糖タンパク質、またはそれらの断片を包含することを意図している。

特定の実施形態では、試料は、細菌、ウイルス、真菌、マイコバクテリア、原虫、カビ、酵母、植物、ヒト、非ヒト、多細胞寄生虫、動物、および古細菌からなる群から選択される供給源から得られる。試料は、ヒト供給源から得られてもよい。試料は、尿、組織、血液、血清、血漿、痰、気管支肺胞洗浄液、唾液、涙、膣分泌物、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、胚組織、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹水（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｆｌｕｉｄ）、腹水（ａｓｃｉｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）、糞便、および体の滲出液からなる群から選択される供給源から得られてもよい。特定の実施形態では、生物学的実体または化学物質は、試料が採取された種とは異なる種由来であってもよい。特定の実施形態では、異なる種は、真菌、細菌、ウイルス、マイコバクテリア、原虫、カビ、酵母、植物、ヒト、非ヒト、多細胞寄生虫、動物、および古細菌からなる群由来であってもよい。

一つの実施形態では、真菌は、薬剤感受性真菌または薬剤耐性真菌である。本明細書で企図されるように、真菌は、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕs）、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・シドウィイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｙｄｏｗｉ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕs）、アスペルギルス・グラウクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ）、カンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・ステラトイデア（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・パラクルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・ルシタニエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎａｅ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・ギリエルモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、クリプトコッカス種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、ヒストプラズマ種（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、コクシジオイデス種（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、パラコクシジオイデス種（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、ブラストミセス種（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、バシジオボラス種（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、コニディオボラス種（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、接合菌、クモノスカビ種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｅｃｅｉｓ）、リゾムコール種（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｓｐｅｃｉｅｓ）、ケカビ種（Ｍｕｃｏｒ ｓｐｅｃｉｅｓ）、アブシディア種（Ａｂｓｉｄｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、モルチエレラ種（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、クスダマカビ種（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、サクセネア種（Ｓａｋｓｅｎａｅａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、シュードアレシェリア種（Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、スケドスポリウム種（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）、アルテルナリア種（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、スポロトリコーシス、フサリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）、白癬菌種（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）、小胞子菌種（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）、エピデルモフィトン種（Ｅｐｉｄｅｎｎｏｐｈｙｔｏｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ、マラセチア種（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、放線菌、スポロトリクス、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）、サッカロミセス、およびニューモシスチス（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）を含んでもよい。

一部の実施形態では、寄生虫は、薬剤感受性寄生虫または薬剤耐性寄生虫である。寄生虫は、リーシュマニア種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉｉ）、マラリア原虫種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、二日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ）、トリパノソーマ種（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎａｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、ストロンギロイデス種（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、トキソプラズマ種（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、蠕虫、Ａｇａｍｏｃｏｃｃｉｄｉｏｒｉｄａ（Ｇｅｍｍｏｃｙｓｔｉｓ、Ｒｈｙｔｉｄｏｃｙｓｔｉｓ）、Ｅｕｃｏｃｃｉｄｉｏｒｉｄａ、Ｉｘｏｒｈｅｏｒｉｄａｏｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｃｃｉｄｉｏｒｉｄａを含んでもよい。

一つの実施形態では、細菌は、薬剤感受性細菌または薬剤耐性細菌である。本明細書で企図されるように、細菌は、アシダミノコッカス、アシネトバクター、アシネトバクター・ルオフィイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ Ｉｗｏｆｆｉ）、エロモナス、アルカリゲネス、バクテロイデス、ボルデテラ、ブランハメラ、ブルセラ、カリマトバクテリウム（Ｃａｌｙｒｎｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンピロバクター、カルジオバクテリウム、クロモバクテリウム、シトロバクター、シトロバクター・フロインデイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、大腸菌群（Ｃｏｔｉｆｏｒｍ ｇｒｏｕｐ）、エドワージエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター、エンテロバクター・サカザキ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、エンテロコッカス、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エシェリキア・コリＯ１５７（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ－Ｏ１５７）、フラボバクテリウム、フランシセラ、フソバクテリウム、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ）、クレブシエラ、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、レジオネラ、モラクセラ、モルガネラ、モルガネラ・モルガニー（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）、ナイセリア、パスツレラ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ）、プレジオモナス、プロテウス、プロビデンシア、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、シュードモナス、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、サルモネラ、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シゲラ、シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ストレプトバチルス、ベイロネラ、ビブリオ、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、エルシニア、エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｌｉｔｉｃａ）、ザントモナス・マルトフィリア（Ｘａｎｔｈｏｍａｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、スタフィロコッカス、スタフィロコッカス・アルバス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミデス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｔｉｓ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｅｎｅｎｓｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉｃａｅ）、ミクロコッカス、ペプトコッカス、ペプトストレプトコッカス、バチルス、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、クロストリジウム、ラクトバチルス、リステリア、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、エリシペロスリクス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびコリネバクテリウムからなる群から選択されてもよい。

一つの実施形態では、本明細書で特許請求される方法を使用して検出されるウイルスは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスを含む。ウイルスは、レトロウイルス、病原性ウイルス、非病原性ウイルス、薬剤耐性ウイルス、薬剤感受性ウイルス、アデノ随伴ウイルス、鳥インフルエンザウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ネコ白血病ウイルス、フラビウイルス、ヘモフィルス・インフルエンザ（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、出血熱ウイルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、およびＢ型肝炎を含む肝炎ウイルス、ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルスＡ型およびＢ型、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ Ｔｙｐｅ Ｉ）ヒトＴリンパ球向性ウイルス２型（ＨＴＬＶ Ｔｙｐｅ ＩＩ）、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、モラクセラ・カタラーリス（ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、分類できないヘモフィルス（ｎｏｎ－ｔｙｐｅａｂｌｅ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、レオウイルス、パラインフルエンザ、パルボウイルス、パポーバウイルス（ｐａｐｏｖａ ｖｉｒｕｓ）、呼吸器合胞体ウイルス、風疹ウイルス、ロタウイルス、ＳＡＲＳ、トマトブッシースタントウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、およびワクシニアウイルスからなる群から選択されてもよい。

一つの実施形態では、本明細書に記載される方法によって検出される生物学的実体または化学物質は、疾患または障害のバイオマーカーを含んでいてもよい。疾患または障害は、がん、心臓血管疾患、呼吸器疾患、脳血管疾患、アルツハイマー病、糖尿病、インフルエンザ、肺炎、腎炎、または肝硬変を含んでもよい。特定の実施形態では、がんは、膀胱がん、乳がん、気管支がん、結腸がん、腎がん、肝がん、肺がん、食道がん、胆のうがん、卵巣がん、膵臓がん、胃がん、子宮頸がん、甲状腺がん、前立腺がん、および皮膚がん；小細胞肺がん、扁平上皮がん、リンパ球系の造血器腫瘍（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｉｎｅａｇｅ）、白血病、急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫（ｈａｉｒｙ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、バーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋｅｔｔ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、骨髄細胞系列の造血器腫瘍（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｉｎｅａｇｅ）、急性および慢性の骨髄性白血病、骨髄異形成症候群および前骨髄球性白血病、間葉に由来する腫瘍（ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｏｒｉｇｉｎ）、線維肉腫および横紋筋肉腫、中枢神経系および末梢神経系の腫瘍、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫およびシュワン腫、メラノーマ、セミノーマ、奇形がん腫、骨肉腫、色素性乾皮症（ｘｅｎｏｄｅｒｏｍａ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ）、角化棘細胞腫（ｋｅｒａｔｏｃｔａｎｔｈｏｍａ）、甲状腺濾胞がんおよびカポジ肉腫を含んでもよい。

特定の実施形態では、本明細書に記載の新規の方法は、（ａ）試料中に存在するガラクトフラノース残基を含む微生物抗原のヒトインテレクチン（ｈＩｎｔＬ）結合を減少／最小化／減少させるための試料の処理；（ｂ）細胞外小胞の存在を検出し、細胞外小胞を単離するための検出アッセイの使用、（ｃ）生物学的実体または化学物質を露出または放出するための細胞外小胞の処理、（ｄ）処理された試料の、検出可能な量の抗体－抗原複合体を生成するための有効量のガラクトフラノース残基を含む少なくとも一つの抗原、多糖、または糖タンパク質に特異的な少なくとも一つの抗体との接触；および（ｅ）少なくとも一つの抗体－抗原複合体の存在の検出、ここで該少なくとも一つの抗体－抗原複合体の存在の検出は試料中の微生物の細胞外小胞の存在の診断である、の工程を含む。方法は、試料を基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）と接触させることによる試料の処理を含んでもよく、該基材は、インテレクチン結合成分を含む。特定の実施形態では、インテレクチン結合成分は、グリセロール、３－ケト－２－デオキシオクトン酸；Ｄ－グリセロール－１－リン酸、Ｄ－マンノヘプトース、セファロース、またはセファロース含有粒子（すなわち、ラテックス、ポリスチレンまたはガラスビーズ、ミクロスフェアまたはゲル）を含む。抗体は、ｍＡｂ４７６を含んでもよく、試料は尿を含んでもよい。抗体－抗原複合体の存在の検出は、体内のアスペルギルスの存在の診断であってもよい。

本明細書で提供されるのは、尿試料中の真菌抗原を検出する方法であり、ここで真菌抗原は、細胞外小胞と関連しており、脱塩カラムを使用した試料の処理、細胞外小胞の存在を検出し、細胞外小胞を単離するための検出アッセイの使用、真菌抗原を露出または放出するための細胞外小胞の処理、および細胞外小胞から放出された真菌抗原の検出の工程を含む。細胞外小胞は、ウロモジュリンに結合することができ、試料は、インテレクチン結合成分を結合するための基材を含む脱塩カラムを通過させることによって処理することができる。一つの実施形態では、脱塩等による試料の処理は、ウロモジュリンの分解をもたらし、沈殿および／または遠心分離を可能にする。真菌抗原は、処理された試料を、有効量のガラクトフラノース残基を含む少なくとも一つの多糖に特異的な少なくとも一つの抗体と接触させて、検出可能な量の抗体－多糖複合体を生成する工程；および試料中の微生物の細胞外小胞の存在の診断である、少なくとも一つの抗体－多糖複合体の存在の検出によって細胞外小胞から放出されうる。抗体はｍＡｂ４７６を含んでもよい。抗体－多糖複合体の存在の検出は、試料中のアスペルギルスの存在の診断である。

ラテラルフローデバイスおよびディップスティックアッセイ等のポイントオブケア診断
患者および／または医療提供者に迅速に試験結果を提供する能力は、複数の状態の転帰に影響を与えるために非常に重要である。診断を支援し、複数の疾患および生理的状態の早期発見を可能にする迅速検査が開発されている。このような試験は、自己測定で適用でき、実験室での処理をほとんど必要としない場合に特に役立つ。今日一般的に使用されているポイントオブケア（ＰＯＣ）検査装置の例は、妊娠および受胎能の検査、ならびに糖尿病患者の血糖値を追跡するためのアッセイを含む。ＰＯＣ検査を使用する感染症の診断試験の開発は、リソースが不足している環境では特に重要である；このため、ＰＯＣ検査は、ＨＩＶ、マラリア、および肝炎等の感染症に対して達成されるべき新しい目標になっている。同様に、ＰＯＣ検査は、病気の兆候を提供するだけでなく、より強力な予防アルゴリズムの開発を可能にすることによって、外来診療の場で発生する感染症に適用されると、臨床転帰に影響を与える可能性がある。

診断および研究用途で一般的に使用されるイムノアッセイは、ラジオイムノアッセイおよび酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を含む。これらの精巧に構成されたイムノアッセイの多くは、試験される分析物に特異的に結合する能力を有するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用し、それによってアッセイの精度を高めている。酵素免疫測定法を行うための様々なアプローチが記載されている。初期のＥＬＩＳＡから始まるこれらのアプローチのかなりの数は、検出される分析物が直接（直接ＥＬＩＳＡ）または間接的に（サンドイッチＥＬＩＳＡ）固体マトリックスに結合され、その中で一次試薬（ｐｒｉｍａｒｙ ｒｅａｇｅｎｔ）上に分析物が捕捉される固相イムノアッセイである。固体マトリックスの選択は、手順上の考慮事項によって異なる。一般的なマトリックスは、マルチウェルマイクロタイタープレートのポリスチレン表面である。

これらのタイプのアッセイはまた、ＰＯＣデバイスの開発に適しており、システムは、ユーザーがアウトプットを読み取ることができるように、自己完結型であってもよい。この特性は、検査対象の試料の収集に医学的介入（たとえば、尿、唾液、痰）が必要ない場合に特に役立つ。これを可能にするデバイスの一つは、ラテラルフローデバイス（ＬＦＤ）である。これらのデバイスは、吸収性成分および非吸収性成分の両方を含む多層構造を使用して、固相を形成する。捕捉および／または認識試薬（抗原または抗体）は、組み立てられた装置内の特定の領域に事前に適用され、分析物はシステムを通って流れ、試薬と接触することができる。多くの場合、自給式にする目的で、試薬成分は乾燥状態で添加され、試料由来の液体が再水和してそれらを活性化する。次に、従来のＥＬＩＳＡ技術を使用して、抗原－抗体複合体中の分析物を検出することができる。一部の実施形態では、システムは、二値応答（「はい」または「いいえ」）の目測のための比色測定値（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｒｅａｄｉｎｇ）を提供するように設計することができ、または定量的であるように構成することができる。

ラテラルフローデバイスは、血清および尿を含む複数の体液中の分析物を検出するために使用される。現在まで、これらのタイプのデバイスは、循環する内因性分析物を検出するために最も多く使用されてきた；おそらく、このタイプのデバイスの最も一般的な使用法は、広範なＰＯＣ妊娠検査である。現在の努力は、ウイルス感染症（たとえば、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス等）の状況において、核酸を含む微生物分析物を検出することに向けられている（Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｅｐ ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｃｈｉｃｋｅｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ， ２００７． ２８（４）： ｐ． ３０７－１８； Ｍｏｋｋａｐａｔｉ， Ｖ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＵＰｌｉｎｋ－ＲＳＶ： ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ ｒａｐｉｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ２００７． １０９８： ｐ． ４７６－８５； ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ （ｅ．ｇ．， Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ， Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ， Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）， Ｋｏｉｄｅ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｕｏｐａｔｈ Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ ａｓｓａｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ ａｎｄ Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ａｎｉｓａ ｓｔｒａｉｎｓ． Ｊｐｎ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， ２００７． ６０（４）： ｐ． ２１４－６）。

世界中で使用されているアッセイの一つは、ＢｉｎａｘＮＯＷ肺炎球菌尿中抗原検査である；このアッセイは、血清ベースのプラットフォームが効果的であることが示された後、発展したが、煩雑である。尿中ＰＯＣデバイスは、リスクの高い患者にＰＯＣ検査デバイスとして使用する場合に特に役立つ（Ｒｏｓｏｎ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｕｒｉｎａｒｙ ａｎｔｉｇｅｎ ａｓｓａｙ （Ｂｉｎａｘ ＮＯＷ） ｔｏ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ． Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， ２００４． ３８（２）： ｐ． ２２２－６； Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ， Ｃ．， Ｒ． Ｐａｏｌｏｎｉ， ａｎｄ Ｔ． Ｇｏｔｔｌｉｅｂ， Ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－ｃａｒｅ ｕｒｉｎａｒｙ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｔｅｓｔ ｉｎ ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ． Ｅｍｅｒｇ Ｍｅｄ Ｊ， ２００８． ２５（３）： ｐ． １４４－８）。肺炎球菌莢膜中の多糖類はアスペルギルスのものと構造的に類似しているため、この問題は現在開示されている主題の状況に特に関連している（Ｋａｐｐｅ， Ｒ． ａｎｄ Ａ． Ｓｃｈｕｌｚｅ－Ｂｅｒｇｅ， Ｎｅｗ ｃａｕｓｅ ｆｏｒ ｆａｌｓｅ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｐａｓｔｏｒｅｘ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｌａｔｅｘ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９３． ３１（９）： ｐ． ２４８９－９０； Ｓｔｙｎｅｎ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｒａｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇａｌａｃｔｏｍａｎｎａｎ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ， １９９２． ６０（６）： ｐ． ２２３７－４５； Ｓｗａｎｉｎｋ， Ｃ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇａｌａｃｔｏｍａｎｎａｎ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９７． ３５（１）： ｐ． ２５７－６０）。

微生物感染症を診断するためのラテラルフローデバイスおよびその最適化された使用方法
予備研究は、Ａ．フミガーツス（Ａ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の多糖抗原（たとえば、ｇａｌＦ）が動物モデルで腎臓に濃縮され、尿ベースのアッセイの感度および特異性が血清ベースの検査の感度および特異性と同等またはそれを超える可能性があるように尿中に排泄されることを示した。抗原の尿中検出は、外来診療の場で頻繁な検査を可能にする使いやすいＰＯＣ検査方法の開発を可能にし、したがって、疾患の初期段階で感染症を検出するために採用されるスクリーニング戦略を診断および最適化する能力に役立つ。したがって、一部の実施形態では、現在開示されている主題は、尿中のアスペルギルスｇａｌＦ含有抗原を検出するためのＰＯＣ試験を提供する。Ａ．フミガーツス（Ａ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ｇａｌＦのガラクトフラノース残基を認識するモノクローナル抗体が開発され、現在開示されているｇａｌＦ試験で使用されている。

固定化されたデバイス上での捕捉に使用する抗体を同定するためのスクリーンとして、標準的なＥＬＩＳＡフォーマットを使用した。同定された抗体は、ポイントオブケア検査装置（ストリップ）を備えた捕捉抗体として使用することができ、ｇａｌＦ抗原を検出するための条件（抗体濃度、インキュベーション条件等）に最適化することができる。

本明細書で使用される「ディップスティックアッセイ」という用語は、試料溶液がディップスティックと接触して、試料溶液を毛細管現象によってディップスティックの捕捉ゾーンに移動させ、それによって試料溶液中の標的抗原を捕捉ゾーンで捕捉および検出できるようにする、ディップスティックを使用する任意のアッセイを意味する。分析物の存在を試験するには、ディップスティックの接触端を試験溶液に接触させる。分析物が試験溶液中に存在する場合、それは毛細管現象によってディップスティックの捕捉ゾーンに移動し、そこで捕捉抗体によって捕捉される。ディップスティックの捕捉ゾーンでの分析物の存在は、たとえば、コロイド金で標識されたさらなる抗分析物抗体（検出抗体）によって検出される。

これらのディップスティック試験にはいくつかの利点がある。それらは実行が簡単で安価であり、専門の機器は必要なく、結果は迅速に取得され、視覚的に読み取ることができる。したがって、これらの試験は、診療所、自宅、遠隔地、および専門機器が利用できない可能性のある発展途上国での使用に特に適している。それらは、たとえば、患者がＡ．フミガーツス（Ａ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）等の病気を引き起こす微生物に感染しているかどうかを試験するために使用することができる。

本発明の第一の態様の方法を行うために、標的化薬剤および標識を単に試験溶液に添加し、次に試験溶液をクロマトグラフィーストリップの接触端と接触させることができる。このような方法は、２つの別個のウィッキング工程が必要とされる国際公開第００／２５１３５号に開示されている方法よりも行うのが容易である。したがって、結果はより迅速に取得できるが、分析物検出の感度は高くなる。

「クロマトグラフィーストリップ」という用語は、本明細書では、毛細管現象によって溶液を輸送することができる材料の任意の多孔質ストリップを意味するために使用される。クロマトグラフィーストリップは、吸湿性または非吸湿性の横方向の流れが可能であり得るが、好ましくは、吸湿性の横方向の流れである。「非吸湿性の横方向の流れ」という用語は、液体の溶解または分散した成分のすべてが実質的に等しい速度で運ばれ、「吸湿性の横方向の流れ」で発生するような一つまたは複数の成分の優先的な保持とは対照的に、膜を横方向に比較的損なわれない流れで運ばれる液体の流れを意味する。吸湿性の横方向の流れが可能な材料は、紙、ニトロセルロース、およびナイロンを含む。好ましい例はニトロセルロースである。

標的化薬剤が試験溶液に添加される（またはそうでなければ接触される）前に、標的化薬剤を標識と予備混合することによって、標識を標的化薬剤のリガンドに結合させることができる。しかしながら、状況によっては、標的化薬剤および標識を事前に混合しないことが好ましい。なぜなら、そのような予備混合は、標的化薬剤および標識を沈殿させる可能性があるからである。したがって、標的化薬剤および標識は、試験溶液に別々に追加する（または別々に接触させる）ことができる。標的化薬剤および標識は、実質的に同時に、または任意の順序で試験溶液に添加（または接触）することができる。

複合体形成を確実にするために、試験溶液をクロマトグラフィーストリップの接触端と接触させる前に、試験溶液を標的化薬剤および標識とプレインキュベートすることができる。プレインキュベーションの最適な時間は、試薬の比率およびクロマトグラフィーストリップの流速によって異なる。場合によっては、プレインキュベーションが長すぎると、得られる検出シグナルが減少し、偽陽性の検出シグナルにつながることさえある。したがって、使用する特定の条件に対してプレインキュベーション時間を最適化する必要がある場合がある。

標識を標的化薬剤に結合する前に、標的化薬剤を試験溶液とプレインキュベートして、標的化薬剤が最適な結合条件下で試験溶液中の分析物に結合できるようにすることが望ましい場合がある。一般に、現在開示されている主題は、哺乳動物対象の生体試料中の、ｇａｌＦ残基を含む少なくとも一つの多糖の存在を検出することによって、微生物感染を有する、有する、または有すると疑われる哺乳動物対象由来の生体試料中の微生物感染を診断するための方法を提供する。方法は、（ａ）試料中に存在するｇａｌＦ残基のヒトインテレクチン１（ｈＩｎｔＬ－１）結合を減少または最小化させるための試料の処理；（ｂ）処理された（ａ）の試料の、検出可能な量の抗体－多糖複合体を生成するための有効量のｇａｌＦ残基を含む少なくとも一つの多糖に特異的な少なくとも一つの抗体との接触；および（ｃ）少なくとも一つの抗体－多糖複合体の存在の検出、ここで該少なくとも一つの抗体－多糖複合体の存在の検出は哺乳動物対象の微生物感染の診断である、の工程を含む。

別の実施形態によれば、本発明は、哺乳動物対象の生体試料中のｇａｌＦ残基を含む少なくとも一つの多糖の存在を検出することによって、微生物感染を有する、有する、または有すると疑われる哺乳動物対象由来の生体試料における微生物感染を診断するための方法を提供する。方法は、（ａ）試料を、インテレクチンに直接結合するリガンド、またはカルシウムまたは高親和性の一価および二価カチオン等の基材と接触させて、試料中に存在するｇａｌＦ残基のヒトインテレクチン（ｈＩｎｔＬ）結合を阻害することを含む、生体試料の処理；（ｂ）処理された（ａ）の試料の、検出可能な量の抗体－多糖複合体を生成するための有効量のｇａｌＦ残基を含む少なくとも一つの多糖に特異的な少なくとも一つの抗体との接触；および（ｃ）少なくとも一つの抗体－多糖複合体の存在の検出、ここで該少なくとも一つの抗体－多糖複合体の存在の検出は哺乳動物対象の微生物感染の診断である、の工程を含む。

微生物感染症は、細菌感染症および真菌感染症からなる群から選択することができる。一部の実施形態では、細菌感染は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の感染によって引き起こされる。他の実施形態では、微生物感染症は、アスペルギルス種、フサリウム種、コクシジオイデス種（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、クリプトコッカス種、およびヒストプラズマ種からなる群から選択される生物の感染によって引き起こされる真菌感染症である。

一部の実施形態では、微生物感染は、ストレプトコッカス種、シュードモナス種、ノカルジア種、放線菌種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、マイコバクテリア種を含むグラム陽性菌種、グラム陰性菌種、ならびにアスペルギルス種、クリプトスポリジウム種、ヒストプラズマ種、ケカビ目種（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）および他の接合菌種（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）等の真菌生物を含むが、これらに限定されない、肺感染を引き起こす傾向がある生物によって引き起こされる。

特定の実施形態では、ガラクトフラノース残基を含む少なくとも一つの多糖に特異的な少なくとも一つの抗体は、配列番号１の可変重（ＶＨ）ドメインおよび配列番号２の可変軽（ＶＬ）ドメインを含むモノクローナル抗体２０５（ＭＡｂ２０５）；配列番号３のＶＨドメインおよび配列番号４のＶＬドメインを含むモノクローナル抗体２４（ＭＡｂ２４）；配列番号５のＶＨドメインおよび配列番号６のＶＬドメインを含むモノクローナル抗体６８６（ＭＡｂ６８６）；配列番号７のＶＨドメインおよび配列番号７のＶＬドメインを含むモノクローナル抗体８３８（ＭＡｂ８３８）；および配列番号９のＶＨドメインおよび配列番号１０のＶＬドメインを含むモノクローナル抗体４７６（ＭＡｂ４７６）からなる群から選択される。

現在開示されている主題を検討する際の当業者は、ガラクトフラノース残基を含む少なくとも一つの多糖が分泌される任意の体液が、現在開示されている方法での使用に適していることを理解するであろう。特定の実施形態では、生体試料は、尿、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液、血清、胃腸液、血液、および脳脊髄液（ＣＳＦ）からなる群から選択される。

一部の実施形態では、本開示の方法は、生体試料を、ガラクトフラノース残基を含む少なくとも一つの多糖に特異的な少なくとも一つの抗体と接触させる前に、生体試料を前処理することをさらに含む。前処理工程は、生体試料のろ過、希釈、および濃縮、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される工程を含んでもよい。

特定の理論に拘束されることなく、本発明の方法で使用されるＭａｂ４７６抗体は、ＣｅｌＡ／ＡＳＰＦ様タンパク質に関連するｇａｌＦ含有Ｏ－グリカン部分に結合すると考えられている。上記のように、Ｍａｂ４７６抗体は、感染性生物によって放出された細胞外小胞に存在するｇａｌＦを含む、任意の起源由来のｇａｌＦに結合することができる。

一部の実施形態によれば、工程（ａ）で試料を処理するための方法は、試料を、Ｃａ²⁺イオンに高親和性で結合する基材と接触させることを含む。

二価カチオンを高親和性で結合することができる基材の例は、たとえば、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラキス－（２－ピリジルメチル）エチレンジアミン（ＴＰＥＮ、膜透過性キレート剤）およびジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ、膜不透過性キレート剤）、ＡＧ５０、Ｃｈｅｌｅｘ、ポリ（アクリル酸）等の陽イオン交換樹脂、およびセファロース等の他の樹脂を含む。

一部の実施形態によれば、工程（ａ）で試料を処理するための方法は、試料を、高親和性でＣａ²⁺イオンをキレート化する化合物と接触させることを含む。キレート剤の例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール－ビス（２－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２－ビス（ｏ－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、１－（２－ニトロ－４，５－ジメトキシフェニル）－１，２－ジアミノエタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸、４Ｎａ、ジメトキシニトロフェナミン（ＤＭ－ニトロフェン）等を含むが、これらに限定されない。

一部の実施形態によれば、工程（ａ）で試料を処理するための方法は、試料を、ＥＤＴＡおよび／またはＥＧＴＡと接触させることを含む。

ｈＩｎｔＬ－１と結合する化合物の例は、グリセロール、３－ケト－２－デオキシオクトン酸、Ｄ－グリセロール－１－リン酸、Ｄ－マンノヘプトース、およびｈＩｎｔＬ－１が結合する他の化合物を含むが、これらに限定されない。

一部の実施形態によれば、工程（ａ）で試料を処理するための方法は、試料を、ｈＩｎｔＬ－１に特異的な抗体と接触させることを含む。一部の実施形態では、抗体は、ウサギポリクローナルＩｇＧ抗ヒトＩＮＴＬ－１抗体であってもよい。

一部の実施形態によれば、工程（ａ）で試料を処理するための方法は、試料を、ｈＩｎｔＬ－１と高親和性で結合する一つまたは複数の化合物と接触させることを含む。

一部の実施形態によれば、工程（ａ）で試料を処理するための方法は、試料を、グリセロール、３－ケト－２－デオキシオクトン酸；Ｄ－グリセロール－１－リン酸、Ｄ－マンノヘプトース、セファロース、セファロース含有粒子（すなわち、ラテックス、ポリスチレンまたはガラスビーズ、ミクロスフェアまたはゲル）からなる群から選択される、高親和性でｈＩｎｔＬと結合する一つまたは複数の化合物と接触させることを含む。

一部の実施形態によれば、工程（ａ）で試料を処理するための方法は、たとえば、試料を、キレート剤およびｈＩＮＴＬと高親和性で結合している一つまたは複数の化合物、ならびに抗ＩｎｔＬ抗体で処理することを含む、上記の方法の一つまたは複数の組み合わせを含む。上記の方法のいずれかを組み合わせて、ｈＩｎｔＬ－１が生体試料中のｇａｌＦに結合するのをさらに防ぐことができる。

一部の実施形態によれば、工程（ａ）で試料を処理するための方法は、試料を脱塩カラムと接触させることを含む。脱塩カラムの例は、たとえば、ポリアクリルアミドサイズ排除樹脂でプレパックされた脱塩カラムを含み、当技術分野で知られている。

それらの多くの実施形態において現在開示されている方法によって処理される対象は、望ましくはヒト対象であるが、本明細書に記載の方法は、用語「対象」に含まれることが意図されるすべての脊椎動物種に関して有効であることが理解されるべきである。したがって、「対象」は、既存の状態または疾患の治療または状態または疾患の発症を予防するための予防的治療等の医療目的のヒト対象、または医学的、獣医学的目的、または開発目的の動物対象を含むことができる。好適な動物対象は、霊長類、たとえば、ヒト、サル、類人猿等；ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）、たとえばウシ（ｃａｔｔｌｅ）、ウシ（ｏｘｅｎ）等；ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、たとえばヒツジ（ｓｈｅｅｐ）等；ヤギ（ｃａｐｒｉｎｅ）、たとえばヤギ（ｇｏａｔ）等；ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）、たとえばブタ（ｐｉｇ）、ブタ（ｈｏｇ）等；ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）、たとえばウマ（ｈｏｒｓｅ）、ロバ、シマウマ等；野生およびイエネコを含むネコ（ｆｅｌｉｎｅ）；イヌ（ｄｏｇ）を含むイヌ（ｃａｎｉｎｅ）；ウサギ、ノウサギ等を含むウサギ目の動物（ｌａｇｏｍｏｒｐｈ）；ネズミ、ラット等を含むげっ歯類を含むが、これらに限定されない哺乳動物を含む。動物はトランスジェニック動物であってもよい。一部の実施形態では、対象は、胎児、新生児、乳児、若年、および成人の対象を含むがこれらに限定されないヒトである。さらに、「対象」は、状態または疾患に罹患している、または罹患している疑いのある患者を含めることができる。したがって、「対象」および「患者」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。特定の実施形態では、対象は、微生物感染を有する、有する、または有すると疑われるヒト成人である。他の実施形態では、対象は、微生物感染を有する、有する、または有すると疑われる、ヒトの子供、たとえば、約１９歳未満のヒトである。

現在開示されている方法は、病状または状態の診断、予後診断、またはモニタリングに使用することができる。本明細書で使用される場合、「診断」という用語は、疾患、障害、または他の病状の存在、不在、重症度、または治療の経過が評価される予測プロセスを指す。本明細書の目的のために、診断はまた、治療から生じる転帰を決定するための予測プロセスを含む。同様に、「診断する」という用語は、試料標本が状態または疾患の一つまたは複数の特徴を示すかどうかの同定を指す。「診断する」という用語は、たとえば、標的抗原または試薬に結合した標的の存在または不在を確認すること、またはタイプ、グレード、段階、または同様の状態を含む状態または疾患の一つまたは複数の特徴を確認するか、さもなければ同定することを含む。本明細書で使用される場合、「診断する」という用語は、ある形態の疾患を別の形態の疾患から区別することを含んでもよい。「診断する」という用語は、状態または疾患の初期診断または検出、予後診断、およびモニタリングを包含する。

「予後」という用語、およびその派生語は、疾患または状態の経過の決定または予測を指す。疾患または状態の経過は、たとえば、平均余命または生活の質に基づいて決定することができる。「予後」は、治療の有無にかかわらず、疾患または状態の時間経過の終了を含む。治療が企図される場合、予後は、疾患または状態に対する治療の有効性を決定することを含む。

本明細書で使用される場合、「リスク」という用語は、特定の転帰の確率が評価される予測プロセスを指す。「疾患または状態の経過をモニターする」などの「モニタリング」という用語は、疾患または状態を有するまたは有すると疑われる対象から得られた試料の進行中の診断を指す。「マーカー」という用語は、多糖類等の抗原を含む分子を指し、試料中で検出されたときに、疾患または状態の存在に特徴的であるか、またはその存在を示す。

したがって、一部の実施形態では、本開示の主題は、微生物感染を有する、有する、または有すると疑われる哺乳動物対象における微生物感染を診断するための方法を提供し、ここでこの方法は、治療レジメンの有効性を決定するための、微生物感染の治療レジメンのモニタリングを含む。

いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示される方法は、米国特許出願第１３／５１１，２６４号に開示され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるもの等のラテラルフローデバイスで使用することができる。現在開示されている方法は、直接（二重抗体サンドイッチ）反応に依存する免疫クロマトグラフィーストリップ試験を含むラテラルフローデバイスまたはディップスティックアッセイを使用することができる。特定の理論に縛られることを望むわけではないが、この直接反応スキームは、複数の抗原部位を有する可能性のあるより大きな分析物をサンプリングする場合に最適である。異なる抗体の組み合わせを使用することができ、たとえば、異なる抗体を捕捉（検出）ライン、制御ラインに含めることができ、たとえば、金粒子、たとえば、金微粒子または金ナノ粒子に結合したものとして、アッセイの移動相に含めることができる。

一つの実施形態では、本開示は、哺乳動物対象の生体試料中のガラクトフラノース残基を含む少なくとも一つの多糖の存在を検出することによって、微生物感染を有する、有する、または有すると疑われる哺乳動物対象由来の生体試料における微生物感染を診断するためのキットを含む。このようなキットは、試料中に存在するガラクトフラノース残基のヒトインテレクチン（ｈＩｎｔＬ）結合を阻害するために生体試料を処理するために必要なすべての試薬、コンポーネント、装置、および説明書を含んでいてもよい；一つの実施形態では、キットは、検出可能な量の抗体－多糖複合体を生成するための有効量のガラクトフラノース残基を含む少なくとも一つの多糖に特異的な少なくとも一つの抗体をさらに含んでもよい；一つの実施形態では、キットはさらに、少なくとも一つの抗体－多糖複合体の存在を検出することを可能にし、ここで少なくとも一つの抗体－多糖複合体の存在の検出は、哺乳動物対象における微生物感染の診断である。特定の実施形態では、キットは、ラテラルフロー装置、ディップスティック、免疫クロマトグラフィー検出ディスプレイを備えたアッセイスティック、および当業者に知られているそのような装置の使用を含む。特定の実施形態では、試薬および／または検出成分は、装置自体（すなわち、ディップスティック）に固定化されていてもよい。特定の実施形態では、カルシウムをキレート化するための試薬がキットに含まれている。

本明細書で使用される場合、「ラテラルフロー」という用語は、基材または担体、たとえば、ラテラルフロー膜の平面に沿った液体の流れを指す。一般に、ラテラルフローデバイスは、毛細管現象、すなわち、ウィッキングまたはクロマトグラフィー作用によって溶液を輸送することができる材料のストリップ（または流体連絡における複数のストリップ）を含み、ここでストリップ内の異なる領域またはゾーンは、溶液がそのようなゾーンに輸送されるか、またはそのようなゾーンを通って移動するときに検出可能な信号を生成する、基材に拡散的または非拡散的に結合するアッセイ試薬を含む。典型的には、そのようなアッセイは、液体試料を受け入れるように適合された適用ゾーン、適用ゾーンから横方向に間隔をあけて適用ゾーンと流体連絡する試薬ゾーン、および試薬ゾーンから横方向に間隔をあけて流体連絡する検出ゾーンを含む。試薬ゾーンは、液体中で移動可能であり、試料中の分析物と相互作用して、たとえば、分析物－試薬複合体を形成することができ、および／または検出ゾーンに結合した分子と相互作用することができる化合物を含んでもよい。検出ゾーンは、ストリップ上に固定化され、分析物および／または試薬および／または分析物－試薬複合体と相互作用して検出可能な信号を生成することができる結合分子を含んでもよい。このようなアッセイは、直接（サンドイッチアッセイ）または競合結合を介して試料中の分析物を検出するために使用することができる。ラテラルフローデバイスの例は、米国特許第６，１９４，２２０号からＭａｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．；米国特許第５，９９８，２２１号からＭａｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．；米国特許第５，７９８，２７３号からＳｈｕｌｅｒ ｅｔ ａｌ．；およびＲＥ３８，４３０からＲｏｓｅｎｓｔｅｉｎに提供されている。

一部の実施形態では、現在開示されている方法は、サンドイッチラテラルフローまたはディップスティックアッセイを含むアッセイと共に使用することができる。サンドイッチアッセイでは、目的の分析物を含む場合と含まない場合がある液体試料が適用ゾーンに適用され、毛細管現象によって試薬ゾーンに入ることができる。本明細書で使用される「分析物」という用語は、ガラクトフラノース残基を含む多糖を指す。特定の実施形態では、試料中の分析物の存在または不在は、定性的に決定される。他の実施形態では、試料中の分析物の量または濃度の定量的決定が決定される。

分析物は、存在する場合、試薬ゾーン内の標識試薬と相互作用して分析物－試薬複合体を形成し、分析物－試薬複合体は、毛細管現象によって検出ゾーンに移動する。分析物－試薬複合体は、分析物および／または試薬に特異的な結合分子と相互作用することにより、検出ゾーンにトラップされる。未結合の試料は、毛細管現象によって検出ゾーンを通過して、横方向に並置され、検出ゾーンと流体連絡している制御ゾーンまたは吸収パッドに到達することができる。次に、標識試薬は、適切な手段によって検出ゾーンで検出することができる。

一般に、限定するわけではないが、ラテラルフローデバイスはサンプルパッドを含む。サンプルパッドは、液体試料を受け入れるように適合された、本明細書では「試料適用ゾーン」とも呼ばれる膜表面を含む。標準的なセルロースサンプルパッドは、尿を含むがこれに限定されない生体試料の吸収および流れを促進することが示されている。サンプルパッドは、液体試料と直接接触するラテラルフローデバイスの一部を含む。つまり、目的の分析物について試験される試料を受け入れる。サンプルパッドは、ラテラルフロー膜の一部にすることも、分離することもできる。したがって、液体試料は、ラテラルフローまたは毛管流を介して、サンプルパッドから検出ゾーンを含むラテラルフロー膜の一部に向かって移動することができる。サンプルパッドは、分析物検出ゾーンを含むラテラルフロー膜と流体連絡している。この流体連絡は、サンプルパッドおよびラテラルフロー膜の間のオーバーラップ、上から下、または端から端までの流体接続のいずれかによって発生する可能性がある。特定の実施形態では、サンプルパッドは、たとえば、紙に限定されない多孔質材料を含む。特定の実施形態では、診断方法の標的化薬剤、分子または他の試薬は、コンジュゲートパッド上に固定化することができる。特定の実施形態では、診断方法の標的化薬剤、分子または他の試薬は、代替の形式で存在してもよい。

本明細書で使用される「試料」という用語は、検出用の分析物を含むと疑われる任意の生体試料、または目的の分析物を実質的に含まないと予想される対照試料を指す。特定の実施形態では、試料は、微生物感染を有する、有する、または有すると疑われる対象の体液を含む。一部の実施形態では、生体試料は液体形態であるが、他の実施形態では、それは、たとえば、適切な溶媒、たとえば、水溶液中での再構成によって、液体形態に変えることができる。現在開示されているラテラルフローデバイスは、尿、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液、血清、血液、胃腸液、および脳脊髄液（ＣＳＦ）を含むがこれらに限定されない様々な生体試料における使用に適している。

典型的には、サンプルパッドは、コンジュゲートパッドに隣接して、そしてそれと流体連絡して配置される。コンジュゲートパッドは、目的の一つまたは複数の分析物に対して特異性を有する標識試薬を含む。一部の実施形態では、コンジュゲートパッドは、その内容物の放出を確実にするために、非吸収性の合成材料（たとえば、ポリエステル）を含む。検出コンジュゲートはコンジュゲートパッド上の所定の位置に乾燥され、液体試料がサンプルパッドに適用されたときにのみ放出される。検出コンジュゲートは、浸漬またはスプレーによってパッドに添加することができる。

特定の実施形態では、検出コンジュゲートは、ガラクトフラノース残基を含む多糖に対して特異性を有する抗体を含む。代表的な実施形態では、抗体は、配列番号１の可変重（ＶＨ）ドメインおよび配列番号２の可変軽（ＶＬ）ドメインを含むモノクローナル抗体２０５（ＭＡｂ２０５）；配列番号３のＶＨドメインおよび配列番号４のＶＬドメインを含むモノクローナル抗体２４（ＭＡｂ２４）；配列番号５のＶＨドメインおよび配列番号６のＶＬドメインを含むモノクローナル抗体６８６（ＭＡｂ６８６）；配列番号７のＶＨドメインおよび配列番号７のＶＬドメインを含むモノクローナル抗体８３８（ＭＡｂ８３８）；および配列番号９のＶＨドメインおよび配列番号１０のＶＬドメインを含むモノクローナル抗体４７６（ＭＡｂ４７６）からなる群から選択される。抗体、たとえば、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、金粒子、たとえば、約４０ｎｍの金ナノ粒子などの金ナノ粒子を含む金ミクロスフェアを含む金コロイドにコンジュゲートすることができる。たとえば、ストレプトアビジンでコーティングされたミクロスフェアを使用して、ビオチンがストレプトアビジンに対して有する強い親和性を利用するために、結合したＭＡｂをビオチン化することが可能である。代替物は、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するプロテインＡでコーティングされたミクロスフェアを含む。金コロイドに対する最適な最適化を定義するための条件は、たとえばマイクロタイターウェルで決定することができる。たとえば、１ＯＤ５３０の１００μＬの金コロイドを各ウェルに添加し、続いて可変のｐＨ（０．５刻みで５．５～１０）の２２ ｍＭバッファー（ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ）を１０μＬ添加することができる。抗体を、約１．２５μｇ／１ ＯＤコロイドから約１０μｇ／１ ＯＤコロイドの範囲の濃度で添加し、１５分間インキュベートした後、２５μｌの１．５ ＮａＣｌを添加することができる。コンジュゲート粒子は安定してピンク色になる；最低濃度の抗体を必要とする最適条件を決定することができる。

通常、コンジュゲートパッドは、ラテラルフロー膜に隣接し、流体連絡している。毛細管現象により、流体混合物がサンプルパッドを上って、抗体－多糖複合体が形成されるコンジュゲートパッドを通り、ラテラルフロー膜に引き込まれる。ラテラルフローは、ラテラルフロー膜の特性の機能である。ラテラルフロー膜は、通常、非常に薄く、濡れるのに十分な親水性であり、それにより、妨げられないラテラルフロー、および本質的に同じ速度での反応物と分析物との混合を可能にする。

ラテラルフロー膜は、ニトロセルロース、ポリエステルまたはセルロースとのニトロセルロース混合物、未処理の紙、多孔質紙、レーヨン、ガラス繊維、アクリロニトリルコポリマー、プラスチック、ガラス、またはナイロンの基材を含むがこれらに限定されない、液体の流れを提供できる任意の基材を含むことができる。ラテラルフロー膜は多孔性であってもよい。典型的には、ラテラルフロー膜の細孔は、粒子、たとえば、分析物と複合体を形成することができる試薬を含む微小粒子が膜全体を通って流れるように十分なサイズである。ラテラルフロー膜は、一般に、約３μｍから約１００μｍの範囲の孔径を有することができ、一部の実施形態では、約１０μｍから約５０μｍの範囲の孔径を有する。細孔径は、キャピラリーの流量およびデバイスの全体的なパフォーマンスに影響する。

一次膜にニトロセルロースを使用することには複数の利点：低コスト、毛細管流動、タンパク質結合に対する高い親和性、および取り扱いの容易さがある。ニトロセルロースはタンパク質結合が高い。別の代替物は、タンパク質結合が低い酢酸セルロースである。表面積を決定するサイズは、膜の容量を決定する（単位時間あたりに膜を通過できる試料の量＝長さ×幅×厚さ×多孔性。これらの変数はラテラルフローが発生する速度を制御するため、アッセイの感度および特異性に影響を与える可能性がある。流量は試料の粘度によっても異なる。ミクロスフェアとして使用できるサイズおよびポリマーはいくつかあり、流体試料の導入により膜を下って移動する。最適な流量は通常、膜の細孔径の１／１０のスフェアを使用して達成される。

当業者は、液体の流れを可能にする他の材料に気付くであろう。一部の実施形態では、ラテラルフロー膜は、流体連絡において一つまたは複数の基材を含むことができる。たとえば、コンジュゲートパッドは、同じ基材上に存在することができ、またはラテラルフロー膜内または流体連絡中の別個の基材（すなわち、パッド）上に存在することができる。一部の実施形態では、ニトロセルロース膜は、ニトロセルロース層でコーティングされた非常に薄いマイラーシートを含むことができる。

ラテラルフロー膜は、少なくとも一つの指示薬ゾーンまたは検出ゾーンをさらに含むことができる。「指示薬ゾーン」および「検出ゾーン」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、固定化された結合試薬を含む担体または多孔質膜の部分を意味する。本明細書で使用される場合、「結合試薬」という用語は、任意の分子または粒子に結合した分子を意味し、ここで、分子は、問題の分析物を認識または結合する。結合試薬は、分析物－標識試薬複合体と結合複合体を形成することができる。結合試薬は検出ゾーンに固定化されており、膜に固定化されているため、液体試料のラテラルフローの影響を受けない。結合試薬が分析物－標識試薬複合体に結合すると、分析物－標識試薬複合体が液体試料の流れを流れ続けるのを防ぐ。一部の実施形態では、結合試薬は、少なくとも一つのガラクトフラノース残基を有する多糖に対する特異性を有する抗体である。

したがって、分析物と試薬との間の実際の反応中に、第一のメンバーは、指示薬ゾーンで第二のメンバーに結合し、得られた結合複合体は、特定の抗体で検出される。検出は、様々な標識および／またはマーカー、たとえば、酵素（適切な基質を有するアルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）、放射性同位元素、リポソームまたは蛍光タグ、ポリマー染料または着色粒子を浸透させたラテックスビーズ等のいずれかを使用することができる。したがって、結果は、直接的または間接的な反応によって解釈することができる。紫色または赤色を与えるコロイド金粒子は、現在最も一般的に使用されている。

指示薬ゾーンでのアッセイ試薬（結合対の相補的メンバー）の捕捉および固定化は、共有結合によって、またはより一般的には、乾燥等による吸着によって達成することができる。このような捕捉はまた、たとえば、試薬でコーティングされたラテックスビーズの結合による間接的なものであってもよい。ラテラルフロー膜を構成する材料の性質に応じて、たとえばグルタルアルデヒドまたはカルボジイミドを使用して、共有結合を可能にすることができる。イムノアッセイでは、最も一般的な結合ペアは抗原－抗体ペアである；しかしながら、酵素－基質および受容体－リガンド等、他の複数の結合ペアを実行できる。

一部の実施形態では、指示薬ゾーンは、試験ラインおよび制御ラインをさらに含む。試験ラインは、固定化された結合試薬を含むことができる。サンドイッチタイプのアッセイを採用するＬＦＤで試験ラインを開発するために抗体を使用する場合、抗体は幅１ｍｍのストリップの幅全体に約１～３μｇ／ｃｍの比率で適用される；したがって、抗体濃度は約１０～３０μｇ／ｃｍ²であり、ＥＬＩＳＡで使用される濃度の約２５～１００倍である（Ｂｒｏｗｎ， Ｍ． Ｃ．， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ｋｅｙ ｔｏ ａ ｒｏｂｕｓｔ ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， ｉｎ Ｌａｔｅｒａｌ Ｆｌｏｗ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， Ｈ．Ｙ．Ｔ． Ｒ．Ｃ． Ｗｏｎｇ， Ｅｄｉｔｏｒ． ２００９， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． ｐ． ５９－７４）。

さらに、一部の実施形態では、現在開示されているラテラルフローアッセイを使用して、試料中の複数の分析物を検出することができる。たとえば、ラテラルフローアッセイでは、試薬ゾーンは、それぞれが液体試料中の異なる分析物に結合することができる複数の標識試薬、または複数の分析物に結合することができる単一の標識試薬を含むことができる。ラテラルフローアッセイで複数の標識試薬を使用する場合、液体試料中の様々な種類の分析物を区別するために、試薬に異なる標識を付けることができる。

異なる分析物を検出するために、膜上に捕捉抗体の複数のラインを配置することも可能である。グリカンの異なるエピトープを検出する抗体の組み合わせは、一つの抗体が低い定量的検出限界で機能するが、ある程度の非特異的結合（または対照動物の尿成分への結合）を示すことがわかった場合、特異性を最適化する可能性がある。一つの可能性は、検出された病原体の潜在的な範囲を増加させ、反応の特異性を増加させるために、デバイスがｇａｌＦおよび別の真菌成分を検出するように適合できることである。アスペルギルス種はｇａｌＦおよび他の真菌成分を分泌すると考えられているが、他の「汚染物質」由来のグリカンは他の真菌成分を含むべきではない。

品質管理のために、典型的には、ラテラルフロー膜は、制御ラインを含む制御ゾーンを含むことができる。「制御ゾーン」という用語は、標識された試薬を捕捉するように構成された結合分子を含む試験装置の一部を指す。ラテラルフローアッセイでは、液体試料が毛細管現象によって検出ゾーンから輸送されるときに、標識試薬が制御ライン上に捕捉されるように、制御ゾーンが担体の検出ゾーンと液体の流れで接触している場合がある。制御ラインで標識試薬を検出すると、アッセイが意図した目的で機能していることが確認される。制御ラインの配置は、マイクロプロセッサ制御のＴＬＣスポッターを使用して行うことができる。この場合、ディスペンサーポンプが一定量の試薬を膜全体に放出する。

典型的なラテラルフローデバイスはまた、吸収性パッドを含むことができる。吸収パッドは、「吸収材料」を含み、これは、本明細書で使用される場合、アッセイ試薬および任意の洗浄溶液の実質的にすべての液体を吸収し、任意選択で毛細管現象を開始し、 試験装置を通して液体を分析する。適切な吸収性材料は、たとえば、ニトロセルロース、ポリエステルまたはセルロースとのニトロセルロース混合物、未処理の紙、多孔質紙、レーヨン、ガラス繊維、アクリロニトリルコポリマー、プラスチック、ガラス、またはナイロンを含む。

一部の実施形態では、ラテラルフロー膜は、一つまたは複数の実質的に流体不透過性のシートに結合され、一方はいずれかの側にあり、たとえば、底部シートおよび、適用ゾーンおよび指示薬ゾーンを規定する一つまたは複数の窓を備えた相補的な上部シートである。

典型的なラテラルフローデバイスはまた、ハウジングを含むことができる。「ハウジング」という用語は、現在開示されているラテラルフローデバイスに適した任意の筐体を指す。例示的なハウジングは、当業者に知られているであろう。ハウジングは、たとえば、ベース部分および蓋部分を有することができる。蓋部分は、上壁および実質的に垂直な側壁を含むことができる。周縁部は、上壁から上向きに突出していてもよく、さらに、対象から試料を収集するように適合された収納部を規定していてもよい。適切なハウジングは、米国特許第７，０５２，８３１号からＦｌｅｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌで提供されているもの、ならびにＢＤ Ｄｉｒｅｃｔｉｇｅｎ（商標） ＥＺ ＲＳＶラテラルフローアッセイデバイスで使用されるものを含む。

すぐ上で説明した一般的な方法と同様に、微生物感染症は、細菌感染症および真菌感染症からなる群から選択することができる。一部の実施形態では、細菌感染症は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の感染によって引き起こされる。特定の実施形態では、微生物感染症は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アスペルギルス種、フサリウム種、コクシジオイデス種、クリプトコッカス種、およびヒストプラズマ種からなる群から選択される生物の感染によって引き起こされる真菌感染症である。

一部の実施形態では、微生物感染症は、ストレプトコッカス種、シュードモナス種、ノカルジア種、放線菌種、マイコバクテリア種を含むグラム陽性菌種、グラム陰性菌種、ならびにアスペルギルス種、クリプトスポリジウム種、ヒストプラズマ種、ニューモシスチス種、ケカビ目種および接合菌種等の真菌生物を含むが、これらに限定されない、肺感染を引き起こす傾向がある生物によって引き起こされる。

一部の実施形態では、ガラクトフラノース残基を有する多糖は、現在開示されている方法およびデバイスを使用して、全体の、濃縮されていない、またはさもなければ未処理の生体試料を測定することができる。他の実施形態では、生体試料は、試験を実施する前に、たとえば、濃縮、希釈、ろ過等で処理することができる。尿試料の前処理は、尿試料を水溶液で希釈すること、尿試料を濃縮すること、尿試料をろ過すること、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。

現在開示されている主題を検討する際の当業者は、前処理工程を任意の特定の順序で実行できること、たとえば、一部の実施形態では、試料を希釈または濃縮してからろ過することができる一方で、他の実施形態では、試料をろ過し、次に希釈または濃縮することができることを理解するであろう。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、たとえば、脱塩カラムを通して尿試料をろ過して、尿試料中の抗原の検出に干渉する阻害剤を除去することを含む。この工程は、試料のさらなる希釈または濃縮の有無にかかわらず行うことができる。

したがって、一部の実施形態では、ラテラルフローデバイスは、生体試料を、ｇａｌＦ残基を含む少なくとも一つの多糖に特異的な少なくとも一つの抗体と接触させる前に、生体試料を前処理するように適合された装置をさらに含む。特定の実施形態では、装置は、生体試料、またはそれらの組み合わせをろ過、希釈、または濃縮するように適合されている。より具体的には、装置は、生体試料、特に尿試料中のｇａｌＦ残基を含む少なくとも一つの多糖の検出に干渉する阻害剤を除去するように適合させることができる。

他の実施形態では、試験の異なるパラメーター、たとえば、インキュベーション時間を操作して、試験の感度および／または特異性を高めて、生体試料を処理する必要性を排除することができる。したがって、一部の実施形態では、現在開示されている主題は、微生物によって分泌される多糖の少なくともエピトープに特異的な抗体を提供する。特定の実施形態では、多糖は、ｇａｌＦ残基を含む。より特定の実施形態では、抗体は、アスペルギルス種、フサリウム種、コクシジオイデス種、クリプトコッカス種、ヒストプラズマ種、および特定のストレプトコッカス種からなる群から選択される微生物によって分泌される多糖の少なくとも一つのエピトープに特異的である。追加の実施形態では、抗体は、ストレプトコッカス種、シュードモナス種、ノカルジア種、放線菌種、マイコバクテリア種を含むグラム陽性菌種、グラム陰性菌種、ならびにアスペルギルス種、クリプトスポリジウム種、ヒストプラズマ種、ニューモシスチス種、ケカビ目種および接合菌種等の真菌生物からなる群から選択される微生物によって分泌される多糖類の少なくとも一つのエピトープに特異的である。

診断レジメンの構成要素、たとえば、検出アッセイ、ラテラルフローデバイス、ディップスティック、およびそれらを使用するための説明書とともに試料を処理するための構成要素を含むキットも本明細書で提供される。キットはまた、診断アッセイの少なくとも一つまたは複数の構成要素を収容する包装または容器を含んでもよく、また、保管、投与、投薬等に関する指示、および／または有効成分に関する挿入物を含んでもよい。キットはまた、投与された感染性生物（またはその代謝産物）の存在および／または有病率をモニタリングするための説明書、および任意選択で、たとえば、試薬、ウェルプレート、容器、マーカーまたはラベル等を含むそのようなアッセイを行うための材料も含んでもよい。本開示のキットに含まれる他の適切な構成要素は、検出される感染性生物、処理される試料、および保管条件を考慮して、当業者には容易に明らかになるであろう。

本明細書では特定の用語が使用されているが、それらは一般的かつ説明的な意味でのみ使用されており、制限する目的ではない。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、この現在記載されている主題が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。

長年の特許法条約に従い、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、特許請求の範囲を含めて、本出願で使用される場合、「一つまたは複数」を指す。したがって、たとえば、「対象（ａ ｓｕｂｊｅｃｔ）」への言及は、文脈が明らかに反対である場合を除いて（たとえば、複数の対象）等々、複数の対象を含む。

本明細書および特許請求の範囲を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、文脈上別段の必要がある場合を除き、非排他的な意味で使用される。同様に、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語およびその文法上の変形は、列挙内の項目の記載が、列挙された項目に置換または追加できる他の同様の項目を除外しないように、非限定的であることを意図している。

本明細書および添付の特許請求の範囲の目的のために、特に明記しない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される量、サイズ、寸法、比率、形状、配合、パラメーター、パーセンテージ、パラメーター、量、特性、および他の数値を表すすべての数値は、「約」という用語が値、量、または範囲で明示的に表示されない場合でも、すべての場合に「約」という用語によって変更されると理解されるべきである。したがって、反対に示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメーターは、正確ではなく、正確である必要はないが、許容値、換算係数、四捨五入、測定誤差等、および現在開示されている主題によって得られることが求められる所望の特性に応じて当業者に知られている他の要因を反映して、概算および／または必要に応じて大きくまたは小さくなり得る。たとえば、値を指す場合の「約」という用語は、そのような変動は、開示された方法を行うため、または開示された組成物を使用するために適切であるため、指定された量から、一部の実施形態では±１００％、一部の実施形態では±５０％、一部の実施形態では±２０％、一部の実施形態では±１０％、一部の実施形態では±５％、一部の実施形態では、±１％、一部の実施形態では±０．５％、および一部の実施形態では±０．１、の変動を包含することを意味することができる。

さらに、一つまたは複数の数または数値範囲に関連して使用される場合の「約」という用語は、範囲内のすべての数値を含むそのようなすべての数値を指し、記載された数値の上下の境界を拡張することによってその範囲を変更することを意味すると理解すべきである。エンドポイントによる数値範囲の記載は、その範囲内およびその範囲内の任意の範囲内に含まれるすべての数値、たとえば、その小数を含む整数（たとえば、１～５の記載は、１、２、３、４、および５、ならびにその小数、たとえば１．５、２．２５、３．７５、４．１等）を含む。

以下の実施例は、現在開示されている主題の代表的な実施形態を実施するために当業者にガイダンスを提供するために含まれている。本開示および当技術分野における一般的なレベルの技能に照らして、当業者は、以下の実施例が単なる例示を意図するものであり、多数の変更（ｃｈａｎｇｅ）、改変、および変更（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）を、現在開示されている主題の範囲から逸脱することなく、採用することができることを理解できる。以下の総合的な記載および特定の例は、例示の目的でのみ意図されており、他の方法によって本開示の化合物を製造することをいかなる方法でも限定するものとして解釈されるべきではない。

尿中に排泄されるｍＡｂ４７６反応性ガラクトフラノース（Ｇａｌｆ）含有アスペルギルス抗原の特性化
尿抗原検査は、異なる真菌感染症（クリプトコッカス症、ヒストプラズマ症）に一般的に使用され、本発明者らは、感染した動物の尿に迅速に局在する、新規のモノクローナル抗体を使用する、複数の子嚢菌（＋アスペルギルス症）の尿診断のための動物モデルおよびヒト試料における概念実証を以前に実証した。現在、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）およびラテラルフローデバイス（ＬＦＤ）は開発の進んだ段階にある。プロトタイプは、侵襲性肺アスペルギルス症（ＩＰＡ）を診断するための早期支援として、約８０～９０％の感度／特異性を備えている。

背景
本発明者らは、培養上清のエタノール沈殿画分中のアスペルギルスガラクトフラノース（Ｇａｌｆ）含有複合糖質に特異的な新規モノクローナル抗体（ｍＡｂ４７６）を以前に記載した。動物モデルは、全身投与された抗体が、肺でＡ．フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）に感染した動物の膀胱に急速に局在することを明らかにした。侵襲性アスペルギルス症（ＩＡ）を診断するための補助としてｍＡｂ４７６を使用するための概念実証は、ラテラルフローディップスティックアッセイで実証されている。侵襲性アスペルギルス症の尿診断検査の新規性を考慮し、抗体の特異性および腎抗原排泄のメカニズムを理解するために、本発明者らは微生物および臨床試料中のｍＡｂ４７６反応性抗原の性質を調査した。

方法
ｍＡｂ４７６エピトープの特異性は、Ｇａｌｆを含む複合糖質に対するＥＬＩＳＡスクリーニングによって決定された。微生物試料と臨床試料の両方における免疫反応性抗原の物理的性質は、ナノ粒子追跡分析および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用した超遠心分離によって特性化された。ｍＡｂ４７６反応性尿抗原は、ウエスタンブロッティングおよび免疫沈降とそれに続く質量分析によって、ＩＡが記録されている２人の代表的な患者で同定された。
●ＥＢ－Ａ２（Ｐｌａｔｅｌｉａキットから抽出）と比較した、精製ガラクトマンナン（ＧＭ）およびエタノール沈殿物（ＥＰ）に対するｍＡｂ４７６の特異性
●ＥＬＩＳＡを使用して特性化されたｍＡｂ４７６ ｇａｌｆエピトープ特異性（ｇａｌｆ－コンジュゲートＢＳＡ）
●２人の反応性患者の尿で行われた質量分析によるｍＡｂ４７６免疫沈降
●特性化された抗原の物理的性質

図に示され、以下で詳細に説明されるように、ｍＡｂ４７６は、ＥＰ中の多糖に対して新規の特異性を有する。

結果
ＥＬＩＳＡでは、ｍＡｂ４７６は、単量体のＧａｌｆ、二糖のＧａｌｆ－β－（１→５）－Ｇａｌｆ、および３つ以上のＧａｌｆ－β－（１→５）ユニットを有するオリゴ糖リガンドを認識した。免疫蛍光法およびＴＥＭにより、分生子および菌糸の両方の細胞壁に抗体が結合していることが明らかになった。培養上清の免疫反応性は、細胞外小胞（ＥＶ、４０～２００ｎｍ）およびＥＶ枯渇画分の両方にあった。ＴＥＭにより、微生物のｍＡｂ４７６反応性の細胞および分泌型ＥＶが確認された。同様のｍＡｂ４７６反応性ＥＶがＩＡ患者の尿で観察された。ウエスタンブロットは、一つまたは複数のｍＡｂ４７６反応性２０～３０ｋＤａバンドを示した。ｍＡｂ４７６免疫沈降物質の質量分析により、ＥＶカーゴと一致する顕著な真菌Ｏ糖化（Ｏ－ｇｌｙｃａｔｅｄ）セルラーゼおよび膜、代謝およびハウスキーピングタンパク質が明らかになった。

結論
ｍＡｂ４７６は、アスペルギルスの細胞および分泌糖タンパク質上で曝露された末端Ｇａｌｆモノマーの独自の認識を示している。微生物試料および臨床試料の両方にＥＶ内の免疫反応性画分が含まれており、真菌のＧａｌｆを含むＥＶの生理学的腎クリアランスが臨床診断応用の可能性を秘めていることを示唆している。

本明細書で引用される刊行物、特許出願、および特許を含むすべての参考文献は、各参考文献が個別にかつ具体的に参照により組み込まれることが示され、その全体が本明細書に記載されるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明を説明する文脈（特に以下の特許請求の範囲）における「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語および類似の指示対象の使用は、本書に別段の記載がない限り、または文脈によって明確に矛盾しない限り、単数形および単数形の両方をカバーすると解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、特に断りのない限り、制限のない用語（すなわち、「含むが、これに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書の値の範囲の列挙は、本明細書に別段の記載がない限り、範囲内にある各個別の値を個別に参照する略記法として役立つことを単に意図し、各個別の値は、本明細書に個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されているすべての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例、または例示的な文言（たとえば、「等」）の使用は、単に本発明をよりよく理解させることを意図しており、別段の請求がない限り、本発明の範囲を制限するものではない。明細書のいかなる文言も、本発明の実施に不可欠であるとしてクレームされていない要素を示すと解釈されるべきではない。

本発明の好ましい実施形態は、本発明を実施するために発明者に知られているベストモードを含めて、本明細書に記載されている。これらの好ましい実施形態の変形例は、前述の説明を読むと、当業者には明らかになる可能性がある。本発明者らは、当業者がそのような変形を適切に使用することを期待し、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されている以外の方法で本発明を実施することを意図している。したがって、本発明は、適用される法律によって許可されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載された主題のすべての改変および同等物を含む。さらに、そのすべての可能な変形における上記の要素の任意の組み合わせは、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。

Claims (42)

1. 生物学的実体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｎｔｉｔｙ）または化学物質（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｔｉｔｙ）が細胞外小胞に関連している、
   （ａ）試料の処理、
   （ｂ）前記細胞外小胞の存在を検出し、前記細胞外小胞を単離するための検出アッセイの使用、
   （ｃ）前記生物学的実体または化学物質を露出または放出するための前記細胞外小胞の処理、および
   （ｅ）前記細胞外小胞から放出された前記生物学的実体または化学物質の検出
   の工程を含む、試料中の前記生物学的実体または化学物質を検出するための方法。
2. 前記細胞外小胞は、外因性感染病原体によって作成され、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、脂質、核酸、または他の細胞成分を含み、および／または発現する、請求項１に記載の方法。
3. 前記試料の処理は、細胞外小胞を濃縮するために、試料を干渉する宿主タンパク質の断片化をもたらす脱塩カラム等に通すこと、試料を高速液体クロマトグラフィーカラムに通すこと、エタノール沈殿、遠心分離、ろ過、サイズに基づく分離、電荷に基づく分離、形態に基づくろ過、サイズおよび流速（flow）に基づいて分離するマイクロ流体処理、免疫磁気分離（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）の実行、沈殿、免疫沈降、酵素分解、凝固、滅菌、インキュベーション、または溶解を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記生物学的実体または化学物質を露出または放出するための細胞外小胞の処理は、界面活性剤による溶解を含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記生物学的実体または化学物質の検出は、イムノアッセイの使用を含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記イムノアッセイは、少なくとも一つの抗体－抗原複合体の存在の検出を含み、該少なくとも一つの抗体－抗原複合体の存在の検出が、試料中の微生物の存在の診断に役立つ、請求項５に記載の方法。
7. 前記試料は、細菌、ウイルス、真菌、マイコバクテリア、原虫、カビ、酵母、植物、ヒト、非ヒト、多細胞寄生虫、動物、および古細菌からなる群から選択される供給源から得られる、請求項１に記載の方法。
8. 前記試料は、ヒト供給源から得られる、請求項１に記載の方法。
9. 前記試料は、尿、組織、血液、血清、血漿、痰、気管支肺胞洗浄液、唾液、涙、膣分泌物、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、胚組織、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹水（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｆｌｕｉｄ）、腹水（ａｓｃｉｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）、糞便、および体の滲出液からなる群から選択される供給源から得られる、請求項１に記載の方法。
10. 前記生物学的実体または化学物質は、前記試料が採取された種とは異なる種由来である、請求項１に記載の方法。
11. 前記異なる種は、真菌、細菌、ウイルス、マイコバクテリア、原虫、カビ、酵母、植物、ヒト、非ヒト、多細胞寄生虫、動物、および古細菌からなる群由来である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記真菌は、薬剤感受性真菌または薬剤耐性真菌である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記真菌は、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕs）、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・シドウィイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｙｄｏｗｉ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕs）、アスペルギルス・グラウクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ）、カンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・ステラトイデア（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・パラクルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・ルシタニエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎａｅ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・ギリエルモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、クリプトコッカス種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、ヒストプラズマ種（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、コクシジオイデス種（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、パラコクシジオイデス種（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、ブラストミセス種（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、バシジオボラス種（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、コニディオボラス種（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、接合菌、クモノスカビ種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｅｃｅｉｓ）、リゾムコール種（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｓｐｅｃｉｅｓ）、ケカビ種（Ｍｕｃｏｒ ｓｐｅｃｉｅｓ）、アブシディア種（Ａｂｓｉｄｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、モルチエレラ種（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、クスダマカビ種（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、サクセネア種（Ｓａｋｓｅｎａｅａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、シュードアレシェリア種（Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、スケドスポリウム種（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）、アルテルナリア種（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、スポロトリコーシス、フサリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）、白癬菌種（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）、小胞子菌種（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）、エピデルモフィトン種（Ｅｐｉｄｅｎｎｏｐｈｙｔｏｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ、マラセチア種（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、放線菌、スポロトリクス、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）、サッカロミセス、およびニューモシスチス種（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
14. 前記寄生虫は、薬剤感受性寄生虫または薬剤耐性寄生虫である、請求項１１に記載の方法。
15. 前記寄生虫は、リーシュマニア種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉｉ）、マラリア原虫種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、二日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ）、トリパノソーマ種（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎａｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、ストロンギロイデス種（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、トキソプラズマ種（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、および蠕虫からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記細菌は、薬剤感受性細菌または薬剤耐性細菌である、請求項１１に記載の方法。
17. 前記細菌は、アシダミノコッカス、アシネトバクター、アシネトバクター・ルオフィイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ Ｉｗｏｆｆｉ）、エロモナス、アルカリゲネス、バクテロイデス、ボルデテラ、ブランハメラ、ブルセラ、カリマトバクテリウム（Ｃａｌｙｒｎｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンピロバクター、カルジオバクテリウム、クロモバクテリウム、シトロバクター、シトロバクター・フロインデイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、大腸菌群（Ｃｏｔｉｆｏｒｍ ｇｒｏｕｐ）、エドワージエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター、エンテロバクター・サカザキ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、エンテロコッカス、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エシェリキア・コリＯ１５７（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ－Ｏ１５７）、フラボバクテリウム、フランシセラ、フソバクテリウム、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ）、クレブシエラ、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、レジオネラ、モラクセラ、モルガネラ、モルガネラ・モルガニー（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）、ナイセリア、パスツレラ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ）、プレジオモナス、プロテウス、プロビデンシア、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、シュードモナス、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、サルモネラ、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シゲラ、シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ストレプトバチルス、ベイロネラ、ビブリオ、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、エルシニア、エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｌｉｔｉｃａ）、ザントモナス・マルトフィリア（Ｘａｎｔｈｏｍａｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、スタフィロコッカス、スタフィロコッカス・アルバス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミデス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｔｉｓ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｅｎｅｎｓｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉｃａｅ）、ミクロコッカス、ペプトコッカス、ペプトストレプトコッカス、バチルス、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、クロストリジウム、ラクトバチルス、リステリア、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、エリシペロスリクス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびコリネバクテリウムからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記ウイルスは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスである、請求項１１に記載の方法。
19. 前記ウイルスは、レトロウイルス、病原性ウイルス、非病原性ウイルス、薬剤耐性ウイルス、薬剤感受性ウイルス、アデノ随伴ウイルス、鳥インフルエンザウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ネコ白血病ウイルス、フラビウイルス、ヘモフィルス・インフルエンザ（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、出血熱ウイルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、およびＢ型肝炎を含む肝炎ウイルス、ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルスＡ型およびＢ型、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ Ｔｙｐｅ Ｉ）ヒトＴリンパ球向性ウイルス２型（ＨＴＬＶ Ｔｙｐｅ ＩＩ）、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、モラクセラ・カタラーリス（ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、分類できないヘモフィルス（ｎｏｎ－ｔｙｐｅａｂｌｅ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、レオウイルス、パラインフルエンザ、パルボウイルス、パポーバウイルス（ｐａｐｏｖａ ｖｉｒｕｓ）、呼吸器合胞体ウイルス、風疹ウイルス、ロタウイルス、ＳＡＲＳ、トマトブッシースタントウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、およびワクシニアウイルスからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
20. 前記生物学的実体または化学物質は、疾患または障害のバイオマーカーである、請求項１に記載の方法。
21. 前記疾患または障害は、がん、心臓血管疾患、呼吸器疾患、脳血管疾患、アルツハイマー病、糖尿病、インフルエンザ、肺炎、腎炎、または肝硬変を含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記がんは、膀胱がん、乳がん、気管支がん、結腸がん、腎がん、肝がん、肺がん、食道がん、胆のうがん、卵巣がん、膵臓がん、胃がん、子宮頸がん、甲状腺がん、前立腺がん、皮膚がん；小細胞肺がん、扁平上皮がん、リンパ球系の造血器腫瘍（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｉｎｅａｇｅ）、白血病、急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫（ｈａｉｒｙ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、バーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋｅｔｔ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、骨髄細胞系列の造血器腫瘍（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｉｎｅａｇｅ）、急性および慢性の骨髄性白血病、骨髄異形成症候群および前骨髄球性白血病、間葉に由来する腫瘍（ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｏｒｉｇｉｎ）、線維肉腫および横紋筋肉腫、中枢神経系および末梢神経系の腫瘍、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫およびシュワン腫、メラノーマ、セミノーマ、奇形がん腫、骨肉腫、色素性乾皮症（ｘｅｎｏｄｅｒｏｍａ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ）、角化棘細胞腫（ｋｅｒａｔｏｃｔａｎｔｈｏｍａ）、甲状腺濾胞がんおよびカポジ肉腫からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
23. （ａ）前記試料中に存在するガラクトフラノース残基を含む微生物抗原のヒトインテレクチン（ｈＩｎｔＬ）結合を減少／最小化／減少させるための前記試料の処理；
    （ｂ）前記細胞外小胞の存在を検出し、前記細胞外小胞を単離するための検出アッセイの使用、
    （ｃ）前記生物学的実体または化学物質を露出または放出するための前記細胞外小胞の処理、
    （ｄ）前記処理された試料の、検出可能な量の抗体－抗原複合体を生成するための有効量のガラクトフラノース残基を含む少なくとも一つの抗原、多糖、または糖タンパク質に特異的な少なくとも一つの抗体との接触；および
    （ｅ）少なくとも一つの前記抗体－抗原複合体の存在の検出、ここで該少なくとも一つの抗体－抗原複合体の存在の検出は前記試料中の微生物の細胞外小胞の存在の診断である、
    の工程を含む、請求項１に記載の方法。
24. 工程（ａ）において、前記試料の処理は、前記試料を基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）と接触させることを含む、請求項２３に記載の方法。
25. 前記基材は、インテレクチン結合成分を含む、請求項２４に記載の方法。
26. 前記インテレクチン結合成分は、グリセロール、３－ケト－２－デオキシオクトン酸；Ｄ－グリセロール－１－リン酸、Ｄ－マンノヘプトース、セファロース、またはセファロース含有粒子（すなわち、ラテックス、ポリスチレンまたはガラスビーズ、ミクロスフェアまたはゲル）を含む、請求項２５に記載の方法。
27. 前記基材は、脱塩カラムを含む、請求項２６に記載の方法。
28. 前記抗体は、ｍＡｂ４７６を含む、請求項２７に記載の方法。
29. 前記試料は、尿を含む、請求項２３に記載の方法。
30. 前記抗体－抗原複合体の存在の検出は、体内の子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ ｆｕｎｇｉ）の存在の診断である、請求項２６に記載の方法。
31. 尿試料中の真菌抗原を検出する方法であって、ここで該真菌抗原は細胞外小胞に関連しており、
    脱塩カラムを使用した前記試料の処理、前記細胞外小胞の存在を検出し、前記細胞外小胞を単離するための検出アッセイの使用、前記真菌抗原を露出または放出するための前記細胞外小胞の処理、および前記細胞外小胞から放出された前記真菌抗原の検出
    の工程を含む、方法。
32. 前記細胞外小胞は、タンパク質に結合している、請求項３１に記載の方法。
33. 前記タンパク質は、ウロモジュリンを含む、請求項３２に記載の方法。
34. 前記試料の処理は、前記試料を、ウロモジュリンを細胞外小胞と共沈させる脱塩カラムに通すことを含む、請求項３１に記載の方法。
35. 前記脱塩カラムは、インテレクチン結合成分を含む、請求項３４に記載の方法。
36. 前記インテレクチン結合成分は、グリセロール、３－ケト－２－デオキシオクトン酸；Ｄ－グリセロール－１－リン酸、Ｄ－マンノヘプトース、セファロース、セファロース含有粒子（すなわち、ラテックス、ポリスチレンまたはガラスビーズ、ミクロスフェアまたはゲル）を含む、請求項３５に記載の方法。
37. 前記細胞外小胞から放出された前記真菌抗原の検出は、
    前記処理された試料の、検出可能な量の抗体－多糖複合体を生成するための有効量のガラクトフラノース残基を含む少なくとも一つの多糖に特異的な少なくとも一つの抗体との接触；および前記試料中の微生物の細胞外小胞の存在の診断である、少なくとも一つの前記抗体－多糖複合体の存在の検出
    の工程を含む、請求項３１に記載の方法。
38. 前記抗体は、ｍＡｂ４７６を含む、請求項３７に記載の方法。
39. 前記試料は、尿を含む、請求項３７に記載の方法。
40. 前記抗体－多糖複合体の存在の検出は、前記試料中の子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ ｆｕｎｇｉ）の存在の診断である、請求項３７に記載の方法。
41. 前記真菌抗原は、薬物感受性真菌または薬物耐性真菌に由来する、請求項４０に記載の方法。
42. 前記真菌抗体は、アスペルギルス、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕs）、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・シドウィイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｙｄｏｗｉ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖａｔｕｓ）、アスペルギルス・グラウクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ）、フサリウム、スケドスポリウム、ヒストプラズマ、コクシジオイデス、パラコクシジオイデス、ブラストミセス、シュードアレシェリア、フサリウム、白癬菌、毛芽胞菌、小胞子菌、エピデルモフィトン（Ｅｐｉｄｅｎｎｏｐｈｙｔｏｎ）、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、マラセチア、ペニシリウム、およびニューモシスチスからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。

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