KR20200128392A - Tas1r3 단백질을 발현하는 종양의 치료, 진단 및/또는 예후 예측을 위한 마커로서 tas1r3 단백질의 용도 - Google Patents

Tas1r3 단백질을 발현하는 종양의 치료, 진단 및/또는 예후 예측을 위한 마커로서 tas1r3 단백질의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20200128392A
KR20200128392A KR1020207023565A KR20207023565A KR20200128392A KR 20200128392 A KR20200128392 A KR 20200128392A KR 1020207023565 A KR1020207023565 A KR 1020207023565A KR 20207023565 A KR20207023565 A KR 20207023565A KR 20200128392 A KR20200128392 A KR 20200128392A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
tas1r3
biological sample
receptor
tumor
cancer
Prior art date
Application number
KR1020207023565A
Other languages
English (en)
Inventor
라 푸엔테 프레이레 마리아 데
로페즈 라파엘 로페즈
노셀로 마르타 알론소
리오스 아비 주디트 바스케스
Original Assignee
푼다시온 인스티튜토 데 인베스티가시온 사니타리아 데 산티아고 데 콤포스텔라 (에프아이디아이에스)
세르비조 갈레고 데 사우데 (세르가스)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 푼다시온 인스티튜토 데 인베스티가시온 사니타리아 데 산티아고 데 콤포스텔라 (에프아이디아이에스), 세르비조 갈레고 데 사우데 (세르가스) filed Critical 푼다시온 인스티튜토 데 인베스티가시온 사니타리아 데 산티아고 데 콤포스텔라 (에프아이디아이에스)
Publication of KR20200128392A publication Critical patent/KR20200128392A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6907—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a microemulsion, nanoemulsion or micelle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명에서, 암 진단, 모니터링 및 테라피에 사용하기 위한 바이오마커로서 TAS1R3 수용체의 용도를 최초로 개시한다. 이런 의미에서, 본 발명의 발명자들은, 진화 (evolution)를 모니터링하고, 치료를 선택하고, 치료학적 분자를 선택적으로 인가하기 위해, TAS1R3가 질병 진단에 유용하고 관련 정보를 제공할 수 있는 종양학에서 흥미로운 바이오마커라는 것을 입증하였다. 이 수용체에 대한 테라피를 동정할 수 있으며, 나노입자와 같은 약물의 접합체 또는 방출 제어 시스템을 향하게 하여, 원발성, 파종성 및 전이성 종양 세포에서 매우 효과적으로 세포내 축적을 관찰할 수 있는 것으로, 입증되었다. 한편, 순환성 종양 세포 (CTC)에 TAS1R3의 존재 역시 입증되었다. 이는 원발성 종양에 의해 혈류로 방출되는 종양 세포로서, 이는 전이 발생에 주요 인자로서 간주되며, 그래서 초기 단계에서 이의 검출은 전이의 초기 검출인자로서 이용될 것이며, 또한 질환을 모니터링하고 약물에 대한 반응을 평가하는데 유용하다.

Description

TAS1R3 단백질을 발현하는 종양의 치료, 진단 및/또는 예후 예측을 위한 마커로서 TAS1R3 단백질의 용도
본 발명은 상피 종양 및 기타 인간 질병에서의 새로운 마커 및 분자 타겟으로서 TAS1R3 단백질의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, TAS1R3 단백질을 정상적으로 발현하는 종양에 대한 치료, 진단 또는 예후 예측 마커로서, TAS1R3 단백질뿐 아니라 이의 발현 산물의 검출 용도는 본 발명의 일부이다.
지난 30년간 신생물 질환의 화학요법에 상당한 진척이 이루어졌다. 이는 새로운 화학요법제 개발, 특히 약물의 동시 투여 용법 개발에서의 일부 진척을 포함한다. 세포 수준 및 조직 수준에서 신생물 프로세스와 기본적인 항-신생물제의 작용 기전에 대한 상당한 이해는, 또한 융모암, 윌름 종양, 급성 백혈병, 횡문근육종, 망막모세포종, 호지킨 질환 및 버킷 림프종 등의 다수의 신생물 질환의 화학요법을 진보시킬 수 있게 하였다. 그러나, 종양 분야에서, 특히 화학요법에서 어느 정도 진보를 거두었음에도 불구하고, 가장 일반적인 인간 암들 다수가 현행 화학요법 치료제에 여전히 내성을 나타낸다.
이런 의미에서, 임의의 종양 치료 용법에서, 효과적이기 위해서는, "전체 세포 사멸 (total cell annihilation)" 개념이 중요하다. 이 개념은 외과적 접근법 또는 화학요법적 접근법 또는 이들 둘다를 통해 효과적인 치료 용법을 확보하기 위해서는, 소위 모든 "클론형성 (clonogenic)" 악성 세포, 즉 통제되지 않는 방식으로 증식하고 제거될 수 있는 임의의 종양 덩어리를 대체할 수 있는 세포의 전체 세포 사멸이 이루어져야 한다. 전체 세포 제거를 달성하는 치료학적 물질 및 용법 개발에 대한 궁극적인 필요성으로 인해, 특정 타입의 종양이 다른 것에 비해 테라피에 더 감수성이게 되었다. 예를 들어, 연조직 종양 (예, 림프종) 및 혈액 및 혈액-생성 장기의 종양 (예, 백혈병)은 일반적으로 암종과 같은 고형 종양보다 화학요법 테라피에 보다 충분하게 반응한다. 소프트 종양 (soft tumor)이 화학요법에 취약한 한가지 이유는 화학요법적 개입시 림프종 및 백혈병 세포에 대해 물리적 접근성이 더 높기 때문이다. 간단히 말해, 대부분의 화학요법제는 고형 종양 덩어리의 모든 세포에 도달하기가 소프트 종양에 도달하는 것 보다 훨씬 더 어렵고, 따라서 고형 종양의 경우 모든 세포 파괴를 달성하기 훨씬 더 어렵다. 이런 점에서, 이러한 종양, 즉 고형 종양을 치료하기 위해, 화학요법제의 용량은 현저하게 증가하게 되며, 이로써 일반적으로 테라피의 전반적인 효과를 제한하는 부작용이 발생한다.
따라서, 고형 종양을 치료할 수 있는 만족할만한 항-종양제 개발 전략은 종양 세포를 선택적으로 죽이면서, 만약에 있다면 정상 조직에 대한 유해한 작용이 상대적으로 거의 없는 물질을 개“u하는 것이다. 이러한 목표는, 신생물 조직과 정상 조직 간에 질적인 차이가 거의 없기 때문에, 달성하기 어렵다. 이런 이유로, 최근 수년간 화학요법 및 진단 목적 2가지로 면역학적 타겟으로서 이용할 수 있는 종양 특이적인 "마커 항원"을 동정하기 위한 시도들이 이루어져 왔다. 이런 의미에서, 본 발명은 원발성 종양 및 파종성 세포 둘다에서 종양 세포의 세포막에 차별적으로 발현되는 새로운 바이오마커를 제공함으로써, 이런 점을 해결한다. 아울러, 이런 바이오마커의 발현은 종양 세포의 더 강한 침습적이고 종양형성 능력과 관련되어 있어, 특히 영양분 부재 환경에서 이의 발현이 증가하므로, 암 진단/예후 예측에 이 바이오마커를 이용할 수 있다. 마지막으로, 이것은 막 수용체이므로, 세포 증식과 세포의 이동, 침입 및 전파 능력을 정지시키는, 타겟화된 테라피, 예를 들어 소형 분자, 펩타이드 또는 길항제와 같은 리간드를 설계할 수 있다. 그래서, 과거, 고형 종양의 암 세포를 선택적으로 타겟팅하기 위해 면역독소가 사용되었다. 면역독소는 특이적인 타겟 물질, 전형적으로 종양을 겨냥하는 항체 또는 이의 단편과, 독소 모이어티 등의 세포독성 물질의 접합체이다. 타겟 물질은 타겟 항원을 보유한 세포로 독소를 향하게 하여 이러한 세포를 죽이도록 설계된다. 한편, 면역독소가 간에 포집되는 것을 방지하고 간독성을 줄이기 위해, 탈당화된 리신 A 체인 (deglycosylated ricin A chain)을 이용한 면역독소 (Blakey et al., 1987a; b) 및 생체내 안정성이 더 높은 면역독소를 제공하기 위해 새로운 교차결합 (crosslink)을 가진 면역독소 (Thorpe et al., 1988)와 같은 "2세대" 면역독소가 개발되었다. 면역독소는 마우스 (Thorpe et al., 1988, Ghetie et al., 1991, Griffin et al., 1988a; b) 및 인간에서 (Vitetta et al., 1991)에서 림프종 및 백혈병을 치료하는데 효과적인 것으로 입증되었다. 이에, 본 발명은 면역독소를 합성하는데 유용한 본 발명의 바이오마커에 대한 특이적인 타겟 물질을 제공한다.
아울러, 본원에 상세히 기술된 것과 같은 새로운 바이오마커의 동정은 진단 및 예후 예측 목적에서 개인 맞춤형 의약 (personalized medicine)을 개발하고 타겟화된 테라피를 선별하고 치료를 모니터링하는데 특히 유용하다. 개인 맞춤형 의약은 각각의 종양이 고유하고 시간 경과에 따른 다이나믹한 변화를 겪는다는 전제에서 기반한 것이므로, 그래서 최상의 치료학적 접근법을 항상 결정할 수 있는 툴을 가지는 것이 중요하다. 개인 맞춤형 의약 분야에서, 액체 바이옵시는 이의 역할을 확인하는데 중요하다. 오늘날, 본 발명자들은, 종양이 세포의 증식 및 생존 기전에 영향을 미치는 유전자 변형 발생으로 인해 기원하고, 이의 분자 조성이 복잡하고 이종적 (heterogeneous)이라 것을, 알고 있다. 한편, 암을 진단하면, DNA, RNA 및 단백질 프로파일을 분석함으로써 원발성 종양 또는 이의 전이 특징을 규명하여야 한다. 동일한 종양에는 종양의 진화 및 다양한 테라피에 대한 내성을 보이는 서로다른 종양 클론들이 공존하며, 그래서 "다이나믹 종양 (dynamic tumor)"이라는 용어가 생겨났다. 이는 시간 경과에 따라 쉽게 변형되기 때문에, 각 시점에 지배적인 클론을 확인하는 것이 가장 효과적인 치료 전략을 선정하는데 중요하다. 비-소 세포 폐암 (NSCLC)의 진단은 통상적으로 침습적인 시술 (바이옵시)을 통한 추가적인 추적이 요구되는 민감하지만 특이적이지 않은 기법인 CT 스캔에 의해 수행되며, 이는 진단 영상에 나타난 정보를 제공하는 새로운 바이오마커뿐 아니라 바이옵시와 같이 공격적인 시술을 적용하지 않고도 정보를 제공할 수 있는 바이오마커가 임상 실무에서 필요한 이유이다.
본 발명에서는 암 진단, 모니터링 및 테라피에 이용하기 위한 바이오마커로서 TAS1R3 수용체의 용도를 최초로 기술한다. 이런 의미에서, 본 발명의 발명자들은 TAS1R3가 종양학에서 질환을 진단하데 유용하고; 진화를 모니터링하고, 치료를 선별하고, 치료학적 분자를 선택적으로 인가하기 위해 관련 정보를 제공할 수 있는, 흥미로운 바이오마커임을 입증하였다. 이 수용체에 대한 테라피를 동정할 수 있으며, 또한 접합체 및 제어된 약물-방출 시스템, 예를 들어 나노입자를 인가하여, 원발성, 파종성 및 전이성 종양 세포에서 이의 세포내 축적을 매우 효과적으로 관찰할 수 있다는 것이 확인되었다. 한편, 순환성 종양 세포 (circulating tumor cell, CTC)에 TAS1R3가 존재하는 것으로 또한 확인되었다. 이 세포는 원발성 종양에 의해 혈류로 분비되는 종양 세포로서, 전이 구축에 주요 인자로서 간주되므로, 초기 단계에서 이의 검출은 전이의 초기 검출인자로서 이용될 것이며, 또한 질환을 모니터링하고 약물 반응을 평가하는데 유용하다.
전반적으로, 이러한 발견은, 종양 세포, 특히 CTC (순환성 종양 세포) 및 원발성, 파종성 또는 전이성 종양 세포에 대한 약리학적 비히클 및/또는 진단 비히클로서 사용하기 위한, TAS1R3 수용체에 대한 리간드, 바람직하게는 항체, 항체 단편, 앱타머, 펩타이드 또는 락티솔 (lactisole)과 같은 저분자량의 소수성 또는 친수성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 리간드뿐 아니라 TAS1R3 수용체에 결합할 수 있는 리간드-약물 또는 리간드-방사성 동위원소 접합체, 또는 반응성 기들로 관능화된 리간드로서 작용하는 화합물로 임의 타입의 분자를 관능화하는 기회를 열어준다.
도 1. CTC의 생물학적 특성을 해석하기 위해 차별적인 발현에 대한 IPA (Ingenuity Pathway Analysis) 소프트웨어를 이용한 생물정보 분석. 상단 이미지: 주 정규 경로 (canonical pathway)와 더불어 메인 네트워크, 분자 및 세포 기능 및 대응되는 P 값들. 하단 이미지: CTC의 발현 프로파일에 따른 세포 이동 경로, 지질 대사 및 탄수화물들에 대한 상호작용 네트워크.
도 2. 건강한 공여자로 구성된 대조군 (n=16) 대비, 전이성 비-소 세포 폐암 (NSCLC) 환자로부터 분리된 순환성 종양 세포 (n=42)에서의 TAS1R3 발현 검증.
도 3. 전이성 폐암 (NSCLC) 환자의 종양 조직에서의 비-종양 대조군 조직 (n=6) 대비 TAS1R3 발현.
도 4. U87 세포주의 값을 참조한, 여러가지 종양 타입의 다양한 세포주, 결장 (SW620 및 SW480), 폐 (A549 및 H1755), 교모세포종 (U87 및 U118) 및 췌장 (MiaPaCa2)에서 TAS1R3 수용체 (mRNA)의 상대적인 발현 (P 값=0.0001).
도 5. 다양한 기원의 종양 세포 패널에서 면역형광에 의한 TAS1R3 발현 실험 (핵 주위에 좀더 밝은 도트형 신호) (A). 전이성 기원의 결장 세포 (SW620) 대 원발성 종양으로부터 분리된 결장 세포 (SW480)에서, 면역형광은 대상 단백질의 보다 높은 발현성을 나타낸다. (B). 세포 핵은 DAPI로 염색한다.
도 6. 글루코스 고 농도 및 저 농도 함유 배지에서 배양한 SW620 세포주에서의 TAS1R3 발현. RT-PCR (A). 웨스턴 블롯에 의한 단백질 발현의 농도측정 분석 (B).
도 7. 글루코스 고 농도 및 저 농도 함유 배지에서 배양한 SW620 세포주의 세포 증식 (A) 및 콜로니 형성 (B) 분석 (데이터는 15일간 배양 유지한 접종 세포 400주에 대한 것임).
도 8. 대조군 (글루코스 저 농도 배지에서 배양한 SW620) 대비, 9일간 세포를 락티솔과 접촉 유지한 경우의 수용체의 RT-PCR (A). 글루코스 저 농도 배지에서 락티솔의 농도를 증가시키면서 (0.44 mg/mL에서 7 mg/mL) 72시간 동안 배양한 SW620 세포의 세포 증식 (B). 대조군 SW620 세포 또는 락티솔 리간드와 3.5 mg/mL 농도로 접촉시킨 세포의 15일 배양 후 콜로니 형성 (C). 락티솔 (72시간 동안 3.5 mg/mL, 화살 표시는 염색을 관찰할 수 있는 세포를 표시함) 처리된 SW620 세포에서 세포 노화를 표시하는 β-갈락토시다제 염색 (D). 다양한 글루코스 농도 (고 농도 및 저 농도) 및 락티솔 (3.5 mg/ml)에 9일간 노출시, SW620 세포에서 종양 진행에 관여하는 여러가지 단백질의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 (E). 여러가지 수용체 리간드 (글루코스, 사이클라메이트 (cyclamate), 브라제인 (brazzein) 및 락티솔)가 첨가된 DMEM 배지에서 배양한 SW620 세포의 세포 증식 (p 값<0.0001) (F).
도 9. 락티솔로 관능화되고 DiR로 표지되고 TAS1R3 고 발현성 (글루코스 저 농도 조건에서 배양) 또는 TAS1R3 저 발현성 (글루코스 고 농도 조건에서 배양) SW620 세포에서 4시간 동안 인큐베이션한, 스핑고마이엘린 나노에멀젼 (O:SM:Lact 1:0.1:0.1)의 내재화. 형광 강도는 수용체 고 발현성 세포와 인큐베이션한 관능화된 나노에멀젼에서 더 강하다. 세포 핵은 DAPI로 염색하며, 가장 약한 신호는 나노에멀젼 내에 캡슐화된 DiD에 기인한 것이다.
도 10. 올레산 및 스핑고마이엘린으로 된 백색 나노에멀젼 (NE), 및 스핑고마이엘린 및 올레산으로 된 락티솔 관능화된 나노에멀젼 (F-NE) 처리, 또는 항-종양 약물 에토포시드의 캡슐화 후, 48시간 인큐베이션시, 결장 종양 세포 (SW620)의 세포 생존성 (MTT 분석) (p 값, ****=0.0001, ***=0.001).
도 11. 인간 항-TAS1R3 다클론 항체 (Ref sc50353, SCBT)로 관능화된 형광 양자점 (적색)의 내재화. 양자점은 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 양자점과의 공동-국지화 (co-localization)를 확인하기 위해 TAS1R3 수용체를 표지하였다 (녹색). 세포 핵은 DAPI로 염색한다.
도 12. TAS1R3 수용체 및 이의 리간드의 다이아그램.
도 13. CTC 검출 및 유전자 발현 프로파일. 진행된 단계의 비-소 세포 폐암 환자로부터 면역기법에 의해 분리한 CTC의 유전자 발현 프로파일에 대한 작업 흐름도. 환자 (n=10)와 대조군 (n=4) 간에 차별적으로 발현되는 유전자들 (CTC의 특이 유전자)의 계층 분류. 환자군과 대조군 간의 유전자 발현 차이를 보여주는, 마이크로어레이의 유의성 분석 결과 그래프. 강조 표시된 부분들은 환자군에서 대조군 대비 발현 수준이 증가되고 통계학적으로 유의한 유전자이며, 이는 전이성 폐암 CTC 개체군을 특정하는 것으로 간주된다.
도 14. 카플란- 마이어 곡선. 비-소 세포 폐암 환자 42명의 CTC 샘플에서 TAS1R3 고 또는 저/중 수준에 기반하여 전체 생존성 (overall survival)을 나타낸다. 환자의 전체 생존 (OS) 시간은 화합요법 개시 후 환자 사망에 이르기까지 걸리는 경과 시간으로서 확립하였다. TAS1R3 수용체 발현성이 낮은 환자에서 더 높은 생존성이 관찰된다 (값 ≥-7.5, 컷-오프 포인트는 TAS1R3의 발현 값들의 평균으로 설정함). 데이터 분석을 통계 분석 패키지 SPSS를 이용해 수행하였다.
정의
본 발명에서, "TAS1R3 수용체"는 미뢰뿐 아니라 간 및 췌장과 같은 기타 조직 및 종양 세포에서 발현되는 미각 G 단백질-커플링된 막관통 수용체로서 이해된다. 이 수용체는 HGNC: 15661 (NCBI Vega: OTTHUMG00000003071); Entrez Gene: 83756; Ensembl: ENSG00000169962; OMIM: 605865; UniProtKB: Q7RTX0 등의 여러가지로 지칭된다. 이는 TAS1R1 수용체 또는 TAS1R2와 헤테로다이머를 형성하는 것으로 확인될 수 있으며, 단맛 또는 감칠맛의 검출인자로서 작동하고, 여러가지 아미노산, 글루코스 등에 의해 활성화된다. TAS1R3 수용체와 이의 리간드의 다이아그램으로 도 12를 참조한다.
본 발명에서, TAS1R3 수용체의 리간드는, 단당류 및 이당류, 수크랄로스, 사이클라메이트, 네오에스페리딘, 다이하이드로칼콘 및 유도체와 같은 인공 감미료, 락티솔 및 유도체와 같은 단맛 저해제, 브라제인과 같은 단백질 또는 이의 단편뿐 아니라 항체, 항체 단편, 펩타이드, 앱타머, 소분자, 단백질 등과 같은 선택 시스템에 의해 특수 설계된 것 등의, TAS1R3 수용체와 상호작용할 수 있는 분자인 것으로 이해된다.
본 발명에서, "리간드와의 접합체"는 진단 목적으로 (방사성 동위원소, 킬레이터, 가돌리늄, 형광단 등) 또는 치료학적 활성을 가진 분자 및 리간드 (약물, 방사성 약제 등)가 병합된 화학 접합체이다.
본 발명에서, "반응성 기로 관능화된 리간드"는 화학적 또는 생화학적 반응에서 후속적으로 사용될 수 있거나 또는 다른 분자의 후속적인 결합 또는 선택적인 상호작용에 사용될 수 있는 반응성 기를 제시하도록 화학적으로 변형된 리간드를 의미한다.
본원에서, 용어 "환자로부터 분리된 생물학적 샘플"은 생물학적 종양 샘플을 지칭하거나, 또는 일상적인 임상 프로토콜에서 진단 용도를 위해 통례적인 외과적 시술에 의해 제거되는 종양 조직을 포함한다. 아울러, 이 용어는 종양 조직 또는 순환성 종양 세포 또는 종양에 의해 분비된 물질을 포함하는 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 분리되는 생물학적 샘플 또는 임의 조직을 망라하는 것으로 이해된다.
본원에서, 용어 "조직 관여 (tissue involvement)"는 조직에 종양 세포가 존재하는 것을 의미한다.
본원에서, 용어 "TAS1R3 발현 확인"은 단백질의 발현 또는 RNA와 같은 임의의 발현 산물을 평가할 수 있는 프라이머, 항체 또는 임의의 기타 시스템을 참조한다.
본원에서, 용어 "환자"는 바람직하게는 인간을 지칭한다. 그러나, 이 용어는 비-영장류 포유류 (예, 말, 개, 고양이, 랫, 마우스, 소 또는 돼지) 및 영장류 포유류 (예, 원숭이) 등의 포유류를 지칭할 수 있다.
본원에서, 용어 "분자 마커/종양 바이오마커"는 암의 생물학적 마커, 즉 종양 또는 기질 세포에 의해 생산되는 물질(들), 그리고 종양 세포에 의해 영향을 받는 조직 관여 상태에서 임상적인 관심 사항에 대한 정보를 제공하는 것을 지칭한다. "분자 마커/종양 바이오마커"는 또한 암의 생물학적 마커, 즉 종양 또는 이의 존재와 관련성이 매우 높은 기질 세포에 의해 생산되고, 수용체 리간드, 바람직하게는 접합체 형태의 리간드의 사용에 의한 세포에 대한 테라피를 지시하는 가능성을 제공하는 물질을 의미한다.
TAS1R3 발현 수준 확인은, 예를 들어, ELISA, ELONA, 면역블롯팅, 면역형광 또는 면역조직화학, 유세포 측정 및 앱타조직화학법 (aptahistochemistry)과 같은 면역학적 기법에 의해 수행할 수 있다. 면역블롯팅은, 특이 항체 및 현상 시스템 (예, 화학발광)과 인큐베이션함으로써, 변성 조건에서의 겔 전기영동에 의해 미리 분리하고 이를 막, 통상적으로 니트로셀룰로스에 고정된 단백질을 검출하는 것을 기초로 한다. 면역형광 시스템은 발현 분석을 위해 타겟 단백질에 특이적인 항체를 사용햐여야 한다. ELISA 및 ELONA는 효소로 표지된 항원, 항체 또는 앱타머의 사용을 기반으로 하며, 그래서 타겟 항원과 표지된 항체 간에 형성된 접합체가 효소적 활성 복합체를 형성하게 된다. 구성성분들 (항원 또는 표지된 항체 또는 앱타머) 중 하나가 지지체에 고정되어 있어, 항원-항체/앱타머 복합체는 지지체에 고정되고, 따라서 예를 들어 분광광도법 또는 형광측정법에 의해 검출가능한 산물로 효소에 의해 변환되는 물질을 첨가함으로써 검출할 수 있다.
면역학적 방법을 이용하는 경우, 소정량의 타겟 단백질을 검출하기 위해 고 친화성으로 타겟 단백질에 결합하는 것으로 알려진 항체 또는 앱타머와 같이 임의의 반응물을 사용할 수 있다. 그러나, 항체, 예를 들어, 다클론 혈청, 하이브리도마 상층액 또는 단일클론 항체, 항체의 단편, Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2, scFv, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 인간화된 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 한편, 단백질 발현 수준의 확인은 당해 기술 분야에 잘 공지된 면역조직 기법을 이용해 수행할 수 있다. 면역화학법 및/또는 적절한 조직화학법에 의해 확인하기 위해, 샘플은 신선, 냉동 또는 파라핀-포매 샘플일 수 있으며, 포르말린 타입의 보호제로 고정시킬 수 있다. 면역조직화학적 확인을 위해, 샘플을 TAS1R3에 특이적인 항체 또는 앱타머로 염색하고, 염색된 세포의 빈도 및 염색 강도를 확인한다. 전형적으로, 샘플은, 염색된 세포의 빈도 (0-4의 값) 및 염색된 세포 각각의 강도 (0-4의 가변적인 값)에 기반하여 계산된, 발현 및 총수를 나타내는 값을 매긴다. 샘플에 발현 값을 매기기 위한 전형적인 척도는 예를 들어 Handbook of Immunohistochemistry and In Situ Hybridization in Human Carcinomas, M. Hayat E d., 2004, Academic Press에 상세히 기술되어 있다. 아울러, 면역조직화학법을 이용해 암성 조직에 존재하는 세포 타입이 마커의 발현 수준의 변형이 존재하는 것인지를 식별할 수 있다. 바람직하게는, 면역조직화학적 검출은 양성 마커 및 음성 마커로 사용되는 세포 샘플과 함께 수행하며, 참조로서 분석 중인 종양과 동일한 기원의 건강한 조직을 사용할 수 있다. 또한, 백그라운드 대조군을 사용하는 것이 일반적이다.
많은 수의 샘플을 분석하여야 하는 경우 (예, 동일한 환자로부터 유래된 수종의 샘플 또는 여러 환자로부터 유래된 샘플들을 분석하는 경우), 매트릭스 포맷 및/또는 자동화된 공정을 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 여러가지 기법으로 수득할 수 있는 마이크로어레이 (조직 마이크로어레이 또는 TMA)를 사용하는 것이 가능하다. 마이크로어레이의 한 파트인 샘플은, 면역조직화학법, 인 시추 혼성화, 인 시추 PCR, RNA 또는 DNA 분석, 형태학적 검사 및 이들의 임의 조합 등의 다양한 방식으로 분석할 수 있다. 조직 마이크로어레이를 가공하는 방법들은, 예를 들어, Konenen, J. et al., (Nat. Med. 1987, 4: 844-7에 기술되어 있다. 조직 마이크로어레이는 파라핀 포매된 조직 샘플에서 0.6 - 2 mm 직경의 원통형 코어로부터 제조하고, 단일 수용체 블럭에서 재-포매한다. 이런 방식으로, 복수의 샘플로부터 유래된 조직을 단일 파라핀 블럭에 넣을 수 있다. TAS1R3의 발현 수준 확인시, 암을 앓고 있는 개체의 바이옵시 샘플의 종양 조직 콜렉션에서 측정된 TAS1R3 발현 수준의 중앙값에 해당하는 기준값과 상호연관시켜야 한다. 기준 샘플은 전형적으로 개체 집단으로부터 유래된 샘플들을 동량으로 조합함으로써 수득한다. 일반적으로, 전형적인 기준 샘플은 임상적으로 잘 확인되고 통상적인 한가지 방법 (디지털 직장 검사, 변의 잠혈 검사, S상 결장경검사, 결장경검사, 바이옵시), 암태아성 항원과 같은 종양 마커의 확인, 초음파, CT, 핵 자기 공명, 양전자 방사 단층촬영)에 의해 잘 특정된 질환을 가진 개체들로부터 수득한다. 이러한 샘플에서, 예를 들어, 기준 집단으로부터 평균 농도를 제공함으로써, 바이오마커의 정상 (기준) 농도를 정할 수 있다. 마커의 기준 농도 결정시 몇가지 고려사항을 참작한다. 이러한 고려사항으로는 관여 샘플 (예, 조직 또는 CSF), 환자의 나이, 체중, 성별, 전반적인 신체 상태를 포함한다. 예를 들어, 개체 2명 이상, 10명 이상, 100명 이상에서 바람직하게는 1000명 이상으로 구성된 군과 동일한 크기를, 바람직하게는 전술한 고려사항, 예를 들어 다양한 연령 카테고리에 따라 분류한, 기준 그룹으로 취한다. 기준값을 수득하는 샘플 콜렉션은 바람직하게는 실험 대상 환자와 동일한 타입의 암을 앓고 있는 개체로 구성될 것이다.
중앙값 또는 역치 값이 확립되면, 환자의 종양 조직에서 발현된 마커의 수준을 중앙값과 비교할 수 있으며, 이런 방식으로 발현의 수준 "증가" 또는 "감소"를 지정할 수 있다. 개체들 간의 (예, 나이, 인종 등과 관련된 특징) 편차로 인해, TAS1R3 발현의 절대 기준값을 확립하기 (실무적으로 불가능하지 않다면) 매우 어렵다. 따라서, 특정 구현예에서, TAS1R3 발현의 "증가된" 또는 "감소된" 발현에 대한 기준값은 전술한 한가지 방법에 의해 질환이 잘 입증된 개체로부터 분리된 하나 이상의 샘플에서 TAS1R3 발현 수준을 검사하는 것을 포함하는, 통례적인 수단에 의해 백분위수로 계산하여 결정한다. 그런 후, 바람직하게는 TAS1R3 발현 수준이 정상 개체군에서 50번째 백분위수 이하, 예를 들어 정상 개체군에서 60번째 백분위수 이하의 발현 수준, 정상 개체군에서 70번째 백분위수 이하의 발현 수준, 정상 개체군에서 80번째 백분위수 이하의 발현 수준, 정상 개체군에서 90번째 백분위수 이하의 발현 수준, 정상 개체군에서 95번째 백분위수 이하의 발현 수준인 샘플에는 APTX 수준 "감소"가 지정된다. 바람직하게는 TAS1R3 발현 수준이 정상 개체군에서 50번째 백분위수 이상, 예를 들어 정상 개체군에서 60번째 백분위수 이상의 발현 수준, 정상 개체군에서 70번째 백분위수 이상의 발현 수준, 정상 개체군에서 80번째 백분위수 이상의 발현 수준, 정상 개체군에서 90번째 백분위수 이상의 발현 수준, 정상 개체군에서 95번째 백분위수 이상의 발현 수준인 샘플에는 TAS1R3 수준 "증가"가 지정된다. 본원에서, "TAS1R3 발현 수준 증가"라는 용어는 TAS1R3 수준이 기준 샘플에서 확인된 수준보다 높은 것을 의미한다. 구체적으로, 발현 수준이, 기준 샘플과 관련하여, 환자로부터 분리된 샘플에 대해 적어도 1.1배, 1.5배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 또는 그 이상인 경우에는, TAS1R3 발현 수준이 증가된 것으로 간주할 수 있다.
설명
본 발명의 발명자들은 CTC (순환성 종양 세포) (실시예 1 참조) 및 종양에서 새로운 수용체 TAS1R3 (맛 수용체)를 동정하였으며, 이 수용체의 발현이 글루코스의 존재에 따라 달라지고 원발성, 파종성 또는 전이성 종양 세포의 존재와 관련있다는 것을 알게 되었다.
이런 의미에서, 도 2-5에서 알 수 있는 바와 같이, TAS1R3 고 발현성이 건강한 공여자 대조군 (n=16)과 비교해 전이성 폐암 환자로부터 분리된 순환성 종양 세포 (NSCLC) (n=42)에서 (도 2), 비-종양 대조군 조직과 비교해 (n=6) 전이성 폐암 (NSCLC) 환자의 종양 조직에서 (도 3)에서 입증되었으며, 서로 다른 종양 타입의 여러 세포주, 결장 (SW620 및 SW480), 폐 (A549 및 H1755), 교모세포종 (U87 및 U118) 및 췌장 (MiaPaCa2)에서 TAS1R3 수용체의 발현도 검증되었다 (도 4). 마찬가지로, TAS1R3의 발현을 여러가지 기원의 종양 세포 패널에서, 특히 분리된 원발성 결장 세포 (SW480)와 비교해 전이성 기원의 결장 세포 (SW620)에서 면역형광에 의해 시험하였다.
이들 데이터는, 도 2 및 도 3이 비-종양 대조군 조직과 비교해 종양 세포에서 명확한 차별적인 발현 수준이 예시된다는 점을 감안해, 바이오마커의 진단학적 가능성을 입증해주며, 전체 생존성이 TAS1R3 수용체 발현 수준이 낮은 환자들에서 우수함을 보여주는 도 14의 결과를 토대로, 이의 예후 예측 가능성이 입증된다.
따라서, 본 발명은 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플 또는 조직과 같은 생물학적 샘플에서 원발성, 파종성 또는 전이성 종양 세포의 존재를 검출할 수 있는 새로운 예후 예측/진단학적 종양 바이오마커에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 원발성, 파종성 또는 전이성 종양 세포의 생물학적 샘플 또는 조직에서 관여 또는 존재를 진단하기 위해 조직 또는 혈청 또는 혈액 혈장 샘플과 같은 생물학적 샘플에서 TAS1R3 발현 수준을 검출하는 것에 관한 것이다. 조직과 같은 생물학적 샘플 또는 혈액 혈청 또는 혈장 샘플에서 전이성 종양 세포의 동정, 또는 TAS1R3 수용체의 수준 및/또는 농도와, 건강한 개체 또는 건강한 장기 또는 조직의 일부로부터 유래된 생물학적 샘플 또는 종양 관여가 없는 생물학적 샘플 또는 기준값과의 비교가, 암을 앓고 있는 환자의 전체 생존 (OS) 정보와 같은 개체의 예후에 대한 유용한 정보를 제공할 것이므로, 이러한 정보는 또한 예후적 가치를 가질 것이다. 이런 의미에서, TAS1R3 발현 확인 및 이를 발현하는 세포 타입의 동정은 종양 세포에 의해 영향을 받은 조직의 관여를 예측할 수 있을 것이다. 아울러, TAS1R3 수용체의 발현 수준은 전이성 종양 세포에 의해 암시되는 잠재적인 관여를 예측하여, 명확한 예후적 가치를 제공할 것이다.
이에, 본 발명의 제1 측면은,
a) 환자로부터 분리된 하나 이상의 생물학적 샘플, 바람직하게는 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플 또는 조직 샘플, 바람직하게는 고정된 조직 샘플, 더 바람직하게는 고정 및 파라핀 포매된 샘플을 제공하는 단계; 및
b) 세포 타입 동정 기법을 이용해, 조직과 같은 생물학적 샘플 또는 혈액 혈청 또는 혈장과 같은 샘플의 세포에서 TAS1R3 발현 수준을 확인하는 단계; 및
c) 발현 수준을, 건강한 개체의 생물학적 샘플 또는 건강한 장기 또는 조직의 일부의 생물학적 샘플 또는 종양 관여가 없는 생물학적 샘플에서의 TAS1R3 발현 수준 또는 기준값과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하며,
건강한 개체의 생물학적 샘플 또는 건강한 장기 또는 조직의 일부의 생물학적 샘플 또는 종양 관여가 없는 생물학적 샘플에서의 TAS1R3 수용체의 발현 수준 또는 기준값과 비교해, 발현 수준의 증가는, 환자에서 종양 관여 또는 존재 (신생물 또는 전이성 관여 또는 존재)를 의미하는, 환자에서 종양 관여 또는 존재 (신생물 또는 전이성 관여 또는 존재)의 예측 또는 시험관내 진단 방법에 관한 것이다.
아울러, 제2 측면에서, 본 발명은,
a) 환자로부터 분리된 하나 이상의 생물학적 샘플, 바람직하게는 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플 또는 종양 조직 샘플, 바람직하게는 고정된 조직 샘플, 더 바람직하게는 고정 및 파라핀 포매된 샘플을 제공하는 단계; 및
b) 세포 타입 동정 기법을 이용해, 조직과 같은 생물학적 샘플 또는 혈액 혈청 또는 혈장 샘플의 세포에서 TAS1R3 발현 수준을 확인하는 단계; 및
c) 발현 수준을, 단계 a)의 생물학적 샘플 보다 이른 시점에 동일한 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서 TAS1R3 수용체의 발현 수준 또는 기준값과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하며,
단계 a)의 생물학적 샘플 보다 이른 시점에 동일한 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서 TAS1R3 수용체의 발현 수준 또는 기준값과 비교해 발현 수준의 증가는, 환자의 부정적인 임상적 진화 (negative clinical evolution)를 의미하는, 종양 관여 또는 존재 (신생물 또는 전이성 관여 또는 존재)를 나타내는 환자의 임상 경과를 시험관내 예후 예측하는 방법에 관한 것이다.
환자의 부정적인 임상적 진화는, 바람직하게는 예상되는 전체 생존이 5년 미만, 바람직하게는 3년 미만으로서 이해된다.
아울러, 제3 측면에서, 본 발명은,
a) 환자로부터 분리된 하나 이상의 생물학적 샘플, 바람직하게는 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플 또는 종양 조직 샘플, 바람직하게는 고정된 조직 샘플, 더 바람직하게는 고정 및 파라핀 포매된 샘플을 제공하는 단계; 및
b) 세포 타입 동정 기법을 이용해, 조직과 같은 생물학적 샘플 또는 혈액 혈청 또는 혈장 샘플의 세포에서 TAS1R3 발현 수준을 확인하는 단계; 및
c) 발현 수준을, 섹션 a)의 생물학적 샘플 보다 이른 시점에 동일한 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서 TAS1R3 수용체의 발현 수준 또는 기준값과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하며,
단계 a)의 생물학적 샘플 보다 이른 시점에 동일한 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서 TAS1R3 수용체의 발현 수준 또는 기준값과 비교해 발현 수준의 증가는, 환자의 부정적인 임상적 진화를 의미하는, 종양 관여 또는 존재 (신생물 또는 전이성 관여 또는 존재)를 나타내는 환자의 임상 경과를 시험관내 모니터링하는 방법에 관한 것이다.
아울러, 제4 측면에서, 본 발명은,
a) 환자로부터 분리된 하나 이상의 생물학적 샘플, 바람직하게는 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플 또는 종양 조직 샘플, 바람직하게는 고정된 조직 샘플, 더 바람직하게는 고정 및 파라핀 포매된 샘플을 제공하는 단계; 및
b) 세포 타입 동정 기법을 이용해, 조직과 같은 생물학적 샘플 또는 혈액 혈청 또는 혈장 샘플의 세포에서 TAS1R3 발현 수준을 확인하는 단계; 및
c) 발현 수준을, 섹션 a)의 생물학적 샘플 보다 이른 시점에 동일한 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서 TAS1R3 수용체의 발현 수준 또는 기준값과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하며,
단계 a)의 생물학적 샘플 보다 이른 시점에 동일한 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서 TAS1R3 수용체의 발현 수준 또는 기준값과 비교해 발현 수준의 증가는, 환자의 치료 반응 부족을 의미하는, 종양 관여 또는 존재 (신생물 또는 전이성 관여 또는 존재)를 나타내는 환자의 시험관내 치료에 대한 반응을 모니터링하는 방법에 관한 것이다.
"정의" 섹션에서 이미 언급한 바와 같이, 본원에서, 용어 "TAS1R3의 발현 확인"은 항체 또는 앱타머와 같은 단백질의 발현을 평가할 수 있는 임의의 다른 시스템을 참조한다. TAS1R3 발현 수준을 확인하는데 사용가능한 항체 또는 앱타머를 수득하기 위해, 인간 TAS1R3 단백질의 서열을 분석한다. 이러한 데이터로부터, (N-말단, 세포외 영역에 존재하는) 면역학적 관점에서 가장 적합한 서열을 다음과 같이 예측할 수 있다:
아세틸-LSQQLRMKGDYVLGGC-아미드 (서열번호 1)
아세틸-ERLKIRWHTSDNQKPVSRC-아미드 (서열번호 2)
이러한 데이터를 토대로, 이종의 발현 시스템 대장균 (Escherichia coli)을 이용해 펩타이드를 합성하였다 (아세틸-LSQQLRMKGDYVLGGC-아미드). 제조된 단백질을 최종 순도 90-95%의 동질성 (homogeneity)으로 정제하였으며, 2 mg은 KLH와, 3 mg은 BSA와 접합하였다. 게놈 구조체 설계는 문헌에 기반하여 수행하였다 (Maitrepierre et al., 2012). 마찬가지로, 보관 완충제 제형 실험을 수행하여, 단백질의 온전성을 보존하였다 (최종 제형에 디터전트 및 다당류의 사용은 제한됨). 수득한 배치를 라벨 첨부된 무균 바이얼에 나누어 넣고, 사용시까지 -80℃에서 보관하였다. 마우스에 펩타이드 50 ㎍을 4 + 2회 투여하여 수회 면역화한 다음, 펩타이드에 대한 반응 증가를 평가하기 위해 혈액을 타이트레이션하였다. 그 결과, 마우스는 생산 달성에 실패하는 매우 낮은 값이었음에도 불구하고, 펩타이드에 대해 일부 반응성을 나타내었다.
따라서, 본 발명의 제1 내지 제4 측면에 대한 바람직한 구현예에서, 조직과 같은 생물학적 샘플 또는 혈액 혈청 또는 혈장 샘플의 세포에서 TAS1R3 발현 확인은 서열번호 1 또는 2에 결합할 수 있는 앱타머 또는 항체 또는 이의 단편으로 수행한다.
본 발명의 제1 내지 제4 측면에 대한 바람직한 구현예에서, 본 발명은 상기 방법의 음성 예측도 (negative predictive value)가 80% 보다 높은, 더 바람직하게는 >90%, >95%, >96%, >97%, >98% 또는 >99%인 것을 특징으로 한다. 이는, TAS1R3의 발현이 환자의 생물학적 샘플의 세포에서 검출되지 않는다면, 샘플이 종양에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 의미한다.
본원에서, 용어 "음성 예측도"는 음성 결과가 나타난 경우가 질환 (종양 세포에 의해 영향을 받은 조직 관여)에 걸리지 않은 비율이다
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은, 환자가 고형 종양, 바람직하게는 유방암, 흑색종, 포도막 흑색종, 췌장암, 폐암, 전립선암, 위암, 두경부암, 육종, 교모세포종, 신경모세포종, 결장 및 직장의 암, 두경부의 암, 신장암, 방광암 및 간세포암 중에서 선택되는 질환을 앓는 것을 특징으로 한다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은, 단계 b)에서 정의된 세포 타입 동정 기법이 면역조직화학, 면역형광, 앱타조직화학 및 유세포 측정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 단계 b)에서 세포 타입 동정 기법은 면역조직화학, 더 바람직하게는, 하기 단계를 포함하는 면역조직화학이다:
i) 샘플 전처리,
ii) 면역염색,
iii) 대조염색; 및
iv) 면역염색 분석.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은, 단계 a)에서 정의된 조직으로부터 이미 수득된 샘플은 고정된 조직 샘플, 신선한 조직 샘플 및 동결된 조직 또는 혈액 샘플, 혈청 또는 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 이는 고정된 조직 샘플 또는 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플이다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 환자가 포유류인 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 포유류는 인간, 영장류 및 비-영장류로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 환자는 인간이다.
또한, 본 발명은, 본 발명의 제5 측면에서, 종양 바이오마커로서, 바람직하게는 전술한 방법에서 사용하기 위한 TAS1R3에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 전술한 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명의 구현예는 신선한 조직, 고정된 조직 또는 동결된 조직에서 유세포 측정, 면역조직화학, 면역형광 또는 그외 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 세포 타입을 동정할 수 있는 기타 기법에 의해 수행할 수 있다.
한편, 나노입자, 약물 또는 방사성 동위원소와 같은 분자를 선택적으로 인가하는 상기한 수용체의 다수의 잠재성으로 인해, 그리고 상기한 수용체와 상호작용하는 분자의 존재를 인지하고 있으며, 내인성이 아닌, 따라서 경쟁적인 현상이 발생하지 않는다는 점을 감안해, 본 발명자들은 수용체에 대한 테라피를 설계할 수 있다는 가설을 검증하기 위해 수용체의 몇가지 리간드, 특히 수종의 감미제를 선별하였다. 또한, 본 발명자들은 원발성 종양 또는 파종성 세포, 예를 들어 CTC (순환성 종양 세포) 및 전이성 세포 등의 TAS1R3를 발현하는 종양으로 향하게 하기 위해, 상기한 리간드로 관능화된 나노구조체를 확보하게 되었다. 또한, 본 발명자들은, 락티솔과 같은 일부 리간드 또는 이로 관능화된 나노구조가 독성 및 증식 측면에서 치료학적 효과를 발생시킬 수 있다는 것을, 관찰하였다.
이러한 관능화를 달성하기 위해, 표 2에 기술된 리간드를 입수하였으며, 소수성 모이어티 (예, LACT-C16)에의 공유 결합을 통해 또는 기형성된 나노에멀젼 (예, BRA)에서의 인큐베이션을 통해 이들을 연결하였다. 사용 펩타이드 서열과 제조되는 나노에멀젼의 물리화학적 특성은 아래에 나타낸다 (표 2).
표 1. 대상 리간드 수종으로 관능화된 나노에멀젼의 조성 및 물리화학적 특성.
리간드 설명 크기 * (nm) PDI * 표면 전하 *
ζ (mV)
LACT 락티솔 (N° CAS 150436-68-3)-C16 / 락티솔-C18 139±8 0.2 -59±4
BRA CFYDEKR 161±4 0.2 -33±2
LACT: 락티솔; BRA: 브라제인 펩타이드;
PDI: 다분산 지수
ζ: 제타 전위
*나노입자.
전술한 관능화를 수행한 후, 수용체를 발현하는 세포 (종양 세포)내, TAS1R3 리간드로 관능화된 나노에멀젼의 높은 내재화 능력이 관찰되었다. 예를 들어, 락티솔로 관능화된 나노에멀젼의 경우, 나노에멀젼 안에 캡슐화된 DiD 신호가 다른 비-관능화된 나노에멀젼보다 강하였다. 또한, 종양 세포가 타겟 수용체를 낮은 밀도로 발현하는 경우 (이 경우, 글루코스 고 농도 배지에서 배양한 SW620 세포에서 TAS1R3 (낮은 발현성, 실시예 2)), 신호 세기는 감소하였다 (실시예 4).
따라서, 본 발명은, 종양 세포의 세포막, 특히 파종성 및 전이성 종양 세포의 막에 발현된 TAS1R3에 대한 리간드로 나노시스템을 관능화하면, 높은 치료학적 잠재성을 가진 유닛이 구축됨을, 입증하였다. 특히, 이러한 나노시스템은 조합 테라피 개발용 비히클로서 사용할 수 있다. 아울러, 구조체를 양자점과 같은 나노에멀젼 이외의 다른 것으로의 관능화 가능성은 본 발명의 실시예 5에서 기술한다. 이러한 발견 사실은 나노입자, 마이셀 또는 리포좀과 같은 임의 타입의 나노시스템에 활용할 수 있으며, 즉 이러한 수용체에 대한 리간드는 임의 타입의 나노시스템을 관능화하기 위해 제공되는 선택적인 비히클로서 사용할 수 있다. 아울러, 이러한 발견 사실은 임의의 리간드-약물 접합체 및/또는 이 수용체에 대한 리간드를 포함하는 리간드-방사성 동위원소와 같은 임의 타입의 시스템에도 적용할 수 있으며, 이러한 약물 또는 방사성 동위원소를 관능화하는 선택적인 세포내 비히클로서 제공할 수 있다.
표 2. 관능화된 나노구조체의 조성 및 물리화학적 특성.
리간드 설명 조성 크기
(nm) 		PDI 표면 전하
ζ (mV)
BRA CFYDEKR O:SM:PC:BRA 1:0,1:0,1:0,005 161±4 0.2 -33±2
LACT 락티솔 (N° CAS 150436-68-3)-C16 / 락티솔-C18 O:SM:LACT 1:0,1:0,1 139±8 0.2 -59±4
O:SM:LACT 1:0,1:0,1 139±8 0.2 -59±4
LACT 149±22 0.5 -53±10
O:LACT 1:01 175±5 0.2 -71±5
O:LACT 1:0,2 155±15 0.2 -65±4
V: LACT 1:0,1 148±4 0.3 -71±5
SM: 스핑고마이엘린; O: 올레산; PC: 포스파티딜콜린; LACT: 락티솔-C16/-C18; BRA: 브라제인 펩타이드.
PDI: 다분산 지수.
ζ: 제타 전위.
따라서, 본 발명은, 리간드를 가진 임의 타입의 나노구조체, 리포좀, 약물 또는 방사성 동위원소가 본 발명의 수용체에 대해 관능화되면, 수용체를 발현하는 세포로 향하는 이러한 구조체의 비히클화 (vehiculation), 특히 원발성, 파종성 또는 전이성 종양 세포로 향하는 비히클화가 관찰됨을, 입증한다.
이에, 제6 측면에서, 본 발명은 수용체 리간드, 바람직하게는 접합체 또는 면역독소 형태의 리간드의 사용에 의한 종양 세포에 대한 테라피를 지시하기 위한 분자 마커/종양 바이오마커로서 TAS1R3 수용체의 용도에 관한 것이다. 면역독소는 특이적인 타겟 물질, 전형적으로 종양에 대한 항체 또는 이의 단편과, 독소 모이어티와 같은 세포독성 물질의 접합체이다. 타겟 물질은 타겟 항원을 보유한 세포로 독소를 향하게 하여 이러한 세포를 죽이도록 설계된다.
따라서, 본 발명은, 제7 측면에서,
- 특이적인 타겟 물질, 전형적으로 TAS1R3 수용체와 상호작용할 수 있는 분자, 예를 들어 단당류, 이당류, 인공 감미제, 예를 들어, 수크랄로스, 사이클라메이트, 네오에스페리딘, 다이하이드로칼콘 및 유도체, 감미료 저해제, 예를 들어, 락티솔 및 유도체, 브라제인과 같은 단백질뿐 아니라 항체, 항체 단편, 펩타이드, 앱타머, 소분자, 단백질과 같은 선택 시스템을 이용해 특이적으로 설계된 기타 물질과,
- 세포독성 물질, 예를 들어 세포독성 물질 또는 항-종양성 약물, 방사성 동위원소, 나노구조체 또는 나노에멀젼으로 된, 접합체를 제공한다.
본 발명의 제7 측면에 대한 바람직한 구현예에서, 타겟 물질은 서열번호 1 또는 서열번호 2에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편, 또는 펩타이드, 또는 앱타머이다.
본 발명의 제8 측면은 테라피 또는 생체내 진단에 사용하기 위한, 바람직하게는, 암의 생체내 치료 또는 진단에 사용하기 위한, 더 바람직하게는 고형 종양, 바람직하게는 유방암, 흑색종, 포도막 흑색종, 췌장암, 폐암, 전립선암, 위암, 두경부암, 육종, 교모세포종, 신경모세포종, 결장 및 직장의 암, 두경부암, 신장암, 방광암, 및 간세포암, 또는 파종성 세포 또는 전이성 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양의 치료 또는 생체내 진단에 사용하기 위한, 본 발명의 제7 측면에 따른 접합체에 관한 것이다.
본 명세서 및 청구항 전체에서, 용어 "포함한다" 및 이의 변형 형태는 다른 기술적인 특징, 첨가제, 구성성분 또는 단계를 배제하는 것으로 의도되지 않는다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명의 다른 목적, 이점 및 특징들이 본 발명의 설명으로부터 부분적으로, 그리고 본 발명의 실질적인 구현으로부터 부분적으로 파생될 것이다. 아래 도 및 실시예는 예시로서 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1. 종양 세포에서 TAS1R3 수용체 발현.
말초혈 샘플 (환자=10명, 대조군 n=4)로부터 분리하기 위한 자기 입자 (EpCAM-based CELLectionTM Epithelial Enrich Dynabeads® kit)를, 도 13에 나타낸 다이아그램에 따라 사용해, 전이성 폐암 환자의 CTC (순환성 종양 세포)에서 TAS1R3 수용체의 유전자 발현을 분석하였다. 샘플에서 RNA를 추출한 후, 이를 유전자 발현 어레이에 혼성화하였다. 신호를 포착 및 가공하여, 대조군 대비 환자에서 차별적으로 발현되는 유전자 리스트를 입수하였으며, 이는 TAS1R3 수용체였다. 요컨대, CTC의 전체 RNA를 증폭시키고, 유전자 발현 마이크로어레이 (Agilent)에서 상보적인 DNA를 혼성화한 다음 원 데이터를 가공하여 품질 척도에 부합되는 2,392개의 포인트 (7.01%)를 입수하였다. 평균 신호는 60,889 unit으로, 환자군 및 대조군이 각각 76,597 및 16,979 unit이었다. 표준화 (normalization)한 후, 프로브 1,810개는 후속적인 분석을 위한 적어도 환자 8명 및 대조군 2명에서 211 보다 높은 발현성을 가진 것으로 간주되었다. 소프트웨어 MeV v4.7 (Multiexperiment Viewer) (TM4 Microarray Software Suite)을 사용해, 진행된 비-소 세포 폐암 환자로부터 분리한 CTC 집단을 특정하는 유전자들을 식별하였다. 2가지 클래스의 마이크로어레이 데이터 분석 (SAM) 알고리즘을 이용해, 유의한 수준을 달성하는 엄격한 척도에 따라 후보 유전자들을 선별하였다. FDR (False Discovery Rate)의 중앙값에 대한 델타 파라미터를 3.3으로 가정하면, log2 비율이 1.5보다 높은 프로브 529종만 고려하여, 진행형 NSCLC 환자의 CTC 개체군을 특이적으로 특정하는, 유전자 2461종으로 구성된 리스트가 제공되었다. 유의한 수준으로 발현되는 이들 유전자를 대상으로 MeV를 사용해 계층 분류 (hierarchical grouping, HCL)하였다. MeV 옵션에서 컴플리트 링크 그룹핑 파라미터 (complete link grouping parameter) 및 절대 거리를 이용하여, 피어슨 상관관계를 거리 메트릭 (distance metric)으로서 선택하였다.
차별적인 발현에 대한 게놈 분석을 또한 수행하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 유전자 세트를 먼저 IPA (Ingenuity Pathway) 소프트웨어를 사용해 분석하여 유전자 네트워크를 구축하고, 전이성 폐암 환자의 CTC를 특정하는 신호전달 경로에 대한 개괄을 입수하였다. 유의한 수준에 해당되는 유전자 529종 중, 349종에는 유전자 주석이 존재하였으며, 따라서 IPA에 의해 동정되었다. 종양 세포의 활발한 파종성 하위집단과 일관되게, CTC 특이적인 유전자 세트에 의해 표시되는 주요 분자 및 세포 기능들은, 주로 G 단백질과 커플링된 수용체의 신호전달 및 보체 시스템의 경로에 의해 조정되는, 세포 이동, 세포 사멸, 신호전달 및 세포-세포 상호작용, 분자 수송 및 지질 대사와 관련 있었다. 유전자 리스트를, 1) 부착, 세포 운동 및 이동과 관련된 기능, 및 2) 세포 표면 상의 위치 측면에서 추가적으로 필터링하였다. 수득되는 분자는 Nocth1 및 TAS1R3였다.
다음으로, 본 발명자들은 환자 및 대조군의 독립 코호트에서 후보 유전자의 발현을 검증하기 위해 진행하였다. 정량적인 PCR을 이용해, 이 수용체의 발현 수준이 환자에서 현저하게 더 높다는 것을 검증하였다 (도 2). 표현 값은 비-특이적인 분리 마커로서 CD45 (조혈 세포 마커)를 사용해 표준화하였다. 또한, 파라핀 처리된 건강한 조직 및 종양 조직 샘플에서 수용체의 발현에 대해 보완적인 검증 (complementary validation)을 수행하였다 (도 3). 이를 위해, 파라핀 처리된 샘플에 대한 특수 추출 키트 (RNeasy FFPE kit, QIAGEN)를 사용해, 각각 14 ㎛의 파라핀 조직 단편 5개에서 RNA를 추출하였다. 이의 농도를 확인하기 위해, Nanodrop 장치 (Nanodrop 2000C, Thermoscientific)를 사용하였다. 이 데이터를 이용해, 각 샘플에서 RNA 농도를 표준화하고, 뉴클레아제-무첨가 물 중에 최종 부피 10 ㎕로 총 2 ㎍을 첨가하였다. 그런 후, 고성능 cDNA 역전사 키트 (Appliesbiosystems)를 사용하였으며, RNA를 DNA로 변환하는데 열 순환기 (thermal cycler) (peq STAR 96HPL, VWR®)를 사용하였다. cDNA가 수득되면, TAS1R3 특이 프로브 및 Taqman Universal PCR MasterMix를 사용해 혼합물을 증폭시켰다. GAPDH는 하우스키핑 또는 대조군으로 사용하였고, 중합효소 연쇄 반응을 StepOne Plus-Real-Time PCR system, AppliedBiosystems®에서 수행하였다.
마커의 예후적 가치 정보를 입수하기 위해, SPSS 통계학적 패키지로 카플란-마이어 생존 분석을 수행하였다 (도 14). 이 방법을 적용하기 위해, 관찰되는 모든 생존 기간을 최소에서 최장 순서로 정렬하고, 이들 각각에는 발생되는 사망 건수 및 불신임 (censure) 건수를 표시하였다. 각 시간 동안, 생존 확률을 계산하였으며, 카플란-마이어 함수는 "경시적으로 누적되는 개체 생존 확률 (probability of individual survival accumulated over time)"이다. 전체 생존성 (개월수로 측정)은, TAS1R3 발현 값이 컷 -7.5 미만인 CTC를 가진 환자 (연한 선)가, TASR13 발현 값이 높은 CTC를 가진 환자 (진한 선)와 비교해, 우수하였다, p 값 0.09.
세포 배양물에서 발현 평가와 관련하여, ATCC (American Type Culture Collection)에서 입수한 여러 타입의 세포주를 사용하였다 (도 4). 림프절로부터 유래된 전이성 결장 세포 (SW620, CCL-227), 결장직장 선암종 상피 세포 (SW480, CCL-228), 폐암 상피 세포 (A549, CCL-185) 및 간으로부터 유래된 전이성 폐 세포 (H1755, CRL-5892), 췌장암 세포 (MIA PaCa-2, CRL-1420) 및 교모세포종 세포 (U118, HTB-15 및 U87MG, HTB-14)를 사용하였다. SW620, SW480, A549, U118 및 U87MG 세포주는 DMEM HG 배지 (둘베코의 변형된 이글스 배지 - 글루코스 고 함유, Sigma-Aldrich)에서 유지시키고, H1755 세포주는 RPMI 1640 배지 (Gibco®, LifeTecnologies)에서 유지시켰으며, 이 둘다에 10% 소 태아 혈청 (Gibco®, LifeTecnologies) 및 1% 항생제 (페니실린 및 스트렙토마이신, Sigma-Aldrich)를 첨가하였다. TAS1R3 발현을 정량적으로 분석하기 위해, 배양한 모든 세포주로부터 추출한 RNA를 출발 물질로 하여 역전사효소 (RT-PCR)를 사용해 중합효소 연쇄 반응을 수행하였다. 먼저, 세포를 일반적으로 트립신 처리한 다음 Neubauer 챔버를 사용해 카운팅하였으며, 따라서 비슷한 세포수에서 시작해 각 세포주에서 세포 5백만개를 분리할 수 있었다. 추출 키트 (GeneJET RNA Purification Kit, ThermoScientic)를 사용해 RNA를 추출하고, 전술한 단락에 기술된 바와 비슷한 방식으로 분석하였다. 공정이 끝나면, 데이터를 분석하였다. 발현 결과는 도 4 및 5에 도시한다. 림프절로부터 분리된 전이성 암 세포주 (SW620)는, 동일한 환자의 분리 원발성 종양 세포주 SW480에 비해, 더 높은 발현성을 나타내었다. 이러한 차이는, 비슷한 발현 수준을 나타내는 이의 기원과 무관하게, 양쪽 세포주 (폐암으로부터 유래된 간의 전이성 폐 세포 H1755 및 A549 세포)가 비슷한 발현 수준을 나타내는 폐 선암종 세포주에서는, 이러한 차이는 관찰되지 않았다. 췌장 선암종 세포주, MiaPaCa-2는 나머지 세포주 (SW620 제외) 보다 약간 더 높은 발현 수준을 나타낸 반면, 신경교종 세포주 (U87MG 및 U118)는 수용체를 약한 수준으로 거의 발현하지 않았다.
도 5에 도시된 면역형광 실험과 관련하여, 시험 세포를 8웰 마이크로챔버 (PLC30108, SPL LifeSciences)에서 수행하는 검사 하루 전날 접종하였다. 24시간 후, 배양 배지를 흡인 제거하고, PBS 1X로 세척한 다음 실온에서 15분간 4% 파라-포름알데하이드로 세포를 고정하였다. 이를 PBS 1X로 2번 헹군 다음 10분간 실온에서 0.2% 트리톤 100X를 처리하여 세포를 투과화하였다. 트리톤을 세척한 후, 1차 항체 항-인간 (토끼) (MBiosource)를 1X PBS에 용해된 0.2% BSA에서 1:1000 희석하여 인큐베이션하고, 실온에서 1시간 동안 플레이트를 인큐베이션하였다. 그런 후, 1차 항체를 세척하고, 형광단 (항체에 따라 Alexa fluor 488 또는 594)으로 표지된 항-토끼 2차 항체 (ab150077 또는 111-585-144 Jackson Immunoresearch)를 BSA 0.2% PBS 1X에 1:500 희석 비율로 첨가하였다. 동시에, Hoechst 33342 (ThermoFisher®) (희석율 1:1000)를 첨가하여, 1시간 동안 가능한 광 분해로부터 형광단을 보호하면서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간이 끝나면, 교반 하에 PBS 1X로 3번 헹구어, 마이크로챔버의 벽부를 제거하고, Mowiol 마운팅 매질 (Calbiochem)을 적용한 다음 샘플 위에 커버슬립을 배치하였다. 이를 밤새 실온에서 암 차단 하에 건조시키고, 다음날 공초점 현미경 (Laser Microscope Confocal Leica SP8®)으로 관찰할 때까지 -20℃에 두었다. 도 5A에서 볼 수 있는 바와 같이, 종양 기원의 대부분의 세포주들에서 형광이 검출가능한 수준으로 관찰되었다. 결장 세포주들 SW480 (원발성) 및 SW620 (신경절 전이)에서 세기를 비교한 바 (도 5B), SW620 세포주에서 더 강한 세기를 관찰할 수 있었으며, 이 검사에서 수득한 결과를 RT-PCR의 데이터와 연관시켰다.
단백질의 품질 검사를 위해, SW620 세포주로부터 분리된 단백질에 대해 웨스턴 블롯을 수행하였으며, 그 결과는 도 6(B)에 나타낸다. 세포를 글루코스 고 농도 함유 배지 (둘베코의 변형된 이글스 배지-글루코스 고 농도, Sigma-Aldrich) 및 글루코스 저 농도 함유 배지 (둘베코의 변형된 이글스 배지-글루코스 저 농도, Sigma-Aldrich)에서 배양한 다음, 정상적인 횟수로 계대 배양하였다. 세포에 트립신을 처리하고, Neubauer 챔버를 사용해 카운팅하여, 모든 세포주들의 세포를 비슷한 개수로 취하였다. 그런 후, 이를 실온에서 5분간 150 xg로 원심분리 (Centrifuge SL 16R, rotor TX-400, ThermoScientific®)하고, 배지를 흡인한 다음 수득한 펠릿을 PBS 1X에 재현탁하여 동일 조건에서 새로운 원심분리를 수행하였으며, 먼저 PBS 1X를 흡인하고, 펠릿은 가능한 분리된 상태를 유지하게 하였다. 펠릿을 완전한 1X RIPA (8 ㎕ 소듐 플루오라이드 (NaF), 1.6 ㎕ 소듐 오르토바나데이트 (Na3OV4), 2 ㎕ 프로테아제 저해제 (PIC), 2 ㎕ 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF) 및 186,4 ㎕ RIPA 1X)에 재현탁하여, 얼음 위에서 20분간 인큐베이션한 다음 10분간 초음파 처리하고, 15분간 4℃에서 13800 xg로 원심분리 (Microcentrifuge 5415R, rotor F452411 Eppendorf®)한 후, 샘플에서 상층액을 수집하였다. 각 샘플의 총 단백질을 시판 키트 DC-분석 (BIO-RAD®)을 사용해 브래드포드 방법 (시스테인, 시스틴, 트립토판, 티로신과 같은 특정 아미노산 및 또한 펩타이드 체인에 의해 영향을 받는 알칼리 조건에서 2가 양이온 구리를 1가 양이온 구리로 변환하는 방법; 2가 양이온 구리의 양은 이들 성분의 양에 따라 결정되며, 이는 분광광도법으로 측정함)으로 정량하였으며, 소 혈청 알부민 (BSA, Sigma-Aldrich)으로 검량선을 확립하였다. 샘플의 흡광도를 VersaMax ELISA 마이크로플레이트 리더 (Molecular Devices®)에서 750 nm에서 측정하였다. 컨센트레이팅 겔 (concentrating gel), 4% SDS-PAGE (소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드) 및 10% 분리겔 SDS-PAGE로 구성된 전기영동을 위해 1.5 mm 두께의 수직 겔을 준비하였다. 동시에, 샘플을, 단백질 20 ㎍, 6X 로딩 완충제 (Tris pH 6.8, SDS, 글리세롤, 브로모페놀 블루 및 β-머캅토에탄올) 및 각 샘플의 단백질 농도에 따른 소정량의 물로 구성된 총량으로 준비하였다. 샘플을 써모블럭 (thermoblock)에서 5분간 95℃에서 변성시킨 다음, 샘플을 Mini-Protean II (Bio-Rad) 큐벳 안에 배치된 겔 웰에 로딩하고, 샘플이 겔 분리기의 제한선에 도달할 때까지 전류 50 V를 적용한 다음 이후 전압을 120 V까지 증가시켰으며, 예상 시간은 1시간 30분이다 (선두가 겔을 벗어날 때까지). 항상 겔은 러닝 완충제에 침지하였다. 이후, 단백질을 0.45 ㎛ 니트로셀룰로스 막 (BioRad)으로 옮기고, 전기영동 겔을 이 막과 접촉시켜 1시간 30분 동안 트랜스퍼 완충제에서 전압 100 V를 적용하였다. 이러한 공정 후, 막을 폰소 레드 (Ponceau Red) 용액에 침지하여, 단백질의 존재를 관찰하였다. 그런 후, TTBS 1X (트리스 완충제 염수 + Tween20) 중의 5% 밀크로 1시간 동안 실온에서 교반하면서 차단 처리하였다. 그 후, 막을 단백질에 특이적인 1차 항체와 함께 인큐베이션 (Santa Cruz commercial house의 농도 및 희석 비율로 사용)한 다음, 막을 특수 플라스틱 백에 넣어 밤새 교반하면서 4℃에 두었다. 다음날, 막을 꺼내 10분간 1X TTBS와 함께 교반하면서 3회 세척한 다음 막을 다시 플라스틱 백에 넣어 TTBS 1X에 1:5000으로 희석한 2차 항체와 함께 인큐베이션하였으며, 막은 실온에서 1시간 동안 교반 하에 두었다. 2차 항체와의 인큐베이션이 끝나면, 실온에서 1X TTBS와 함께 교반하면서 10분씩 3번 다시 헹구었다. 마지막으로, Pierce ECL 시약 (Enhanced chemioluminiscence) 웨스턴 블롯팅 기질 (Thermo Fisher) 1:1을 막에 적용하고, 현상하였다. 막을 레벌레이션 (revelation) 카세트 안에서 ECL과 함께 암 조건 하에 인큐베이션하고, 그 위에 자기방사 필름 (Mamorray)을 덮고 Curix 60 automatic developer, AGFA®를 사용해 다양한 시간 동안 노출시켰다. 필름을 스캐닝한 후, ImageJ 소프트웨어를 사용해 입수한 데이터를 상대적으로 처리하였다 (relativize).
실시예 2. 여러가지 글루코스 농도의 배양 배지에서 TAS1R3 발현.
결장 세포주 SW620에서 TAS1R3의 발현은 배양 배지의 글루코스 함유량에 따라 달라진다 (글루코스 고 농도는, 도 6A에서 글루코스 저 농도에서 배양한 세포에서 관찰되는 것보다 낮은 발현성을 유발함). 이러한 결과는, 부가적으로, 웨스턴 블롯에 의해 검증되었다 (도 6B). 아울러, 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, SW620 결장 세포를 글루코스 부재 조건 하에 배양하였을 때 수용체의 발현이 증가하였으며, 글루코스는 이 수용체의 발현을 세포 대사와 관련있었다.
세포 증식 실험을 글루코스 고 농도 및 저 농도 함유 배지에서 배양한 SW620 세포에서 수행하였다 (도 7A). 세포에 트립신을 처리하고, 트립신 처리 후 0, 24, 72, 96 및 168시간 경과시 세포수를 카운팅하기 위해 이를 위해 Neubauer 챔버를 사용해 동일한 개수의 세포를 접종하였다. 유사한 방식으로, 세포 증식 실험을 유리 리간드가 존재하는 배지에서 수행하였으며 (도 8), 리간드는 배양 배지에 다양한 농도로 첨가하였다. 현미경 (Leica DMIL® 현미경)으로 사진을 촬영한 다음 트립신 처리하였으며, 세포에 대한 리간드 효과를 관찰하기 위해 트립신 처리 세포와 초기 세포를 비교하여 세포수를 카운팅하였다. 세포 증식은 실험 조건들에서 비슷하였다. 그러나, 웰 당 세포 200개에서 시작해 15일간 대기하여 콜로니 형성 실험을 수행한 경우, 글루코스 저 농도 배지에서 배양한 세포는 수용체를 더 높은 수준으로 발현하고, 글루코스 고 농도 배지에서 배양한 세포보다 콜로니를 더 많이 형성하는 것으로 관찰되었다 (도 7B). 콜로니 형성 실험에서는, 12웰 플레이트를 사용하였으며, 글루코스 고 농도 (4500 mg/L) 및 저 농도 (1000 mg/L) 함유 배지에서 세포를 다양한 개수 (웰당 세포 200, 400, 600 및 800주)로 접종하였다. 현미경 없이 콜로니의 크기를 관찰할 수 있을 때까지, 광학 현미경 및 육안으로, 15일간, 플레이트를 관찰하였다. 그런 후, PBS (5 mg/mL)에 용해한 MTT 용액을 웰에 첨가하고, 4일간 인큐베이션한 다음 배지를 조심스럽게 흡인하였으며, 웰의 바닥부에는 보라색으로 염색된 콜로니만 잔류하였다. 플레이트를 실온에서 밤새 건조하고, 그후 스캐닝하여 각 웰의 콜로니 개수를 OpenCFU 프로그램을 사용해 카운팅하였다.
실시예 3. 새로운 항-종양 테라피 개발의 타겟 물질로서 TAS1R3 .
배양 배지에 TAS1R3 수용체의 리간드인 락티솔의 존재는 실험 중에 수용체의 발현 증가를 유발하였다 (도 8A). 고 농도에서는, 리간드의 존재가 세포 증식을 간섭하였으며 (도 8B), 세포 노화 유도와 연관되었다 (도 8D). 또한, SW620 배양 배지에 글루코스 (HG) 또는 락티솔과 같은 TAS1R3 리간드의 존재가 p-ERK, p-AKT 또는 IGF-IR과 같은 종양 진행과 관련된 경로를 활성화한다는 것을, 웨스턴 블롯에 의해 관찰할 수 있었다 (도 8E). 또한, TAS1R3의 다른 리간드, 즉 브라제인 및 사이클라메이트로부터 유래된 펩타이드는 농도 및 각 분자에 따라 더 강하게 또는 더 약한 수준으로 증식을 간섭하는 것으로 확인되었다 (도 8F).
세포를 리간드와 함께 인큐베이션한 후, 세포 노화 유도를 확인하기 위해, SW620 세포주 500,000주를 6웰 플레이트에서 글루코스 저 농도 배지에서 배양하였다. 수개의 웰에 리간드 (3.5 mg/mL)를 첨가하였다. 72시간 후, 웰을 헹구고, 실온에서 15분간 고정하였다 (2% 포름알데하이드 + 0.2% 글루타르알데하이드 / PBS). 용액을 제거하고 1X PBS로 3회 헹군 다음 염색액을 용액 1 ml 당 계산하여 첨가하였다: 구연산/포스페이트 완충제, pH 6.0 (다이베이직 소듐 포스페이트 (Na2HPO4) 0.2 M + 0.1 M 구연산) 200 ㎕, 5 M NaCl 30 ㎕, 100 mM 포타슘 패리시아니드 (K3[Fe(CN)6]) 50 ㎕, 100 mM 포타슘 패로시아니드 (K4[Fe(CN)6]) 50 ㎕, 1M 마그네슘 클로라이드 (MgCl2) 2 ㎕, X-gal 용액 (20 mg/mL 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 β D-갈락토피라노시드 / 다이메틸포름알데하이드) 50 ㎕ 및 증류수 618 ㎕. 이를 오븐에 넣어 밤새 37℃에서 인큐베이션하고, 웰을 증류수로 2회 헹군 다음, PBS 1X를 첨가하고, Vert 현미경 A1, Zeiss®에서 잠재적인 노화 세포를 관찰하였다. 노화 중인 세포에 해당되는 청색 염색이 관찰되었다.
유리 리간드가 첨가된 배지에서 콜로니 형성 실험을 위해, 동일한 공정을 수행하였지만, 이 경우에는 세포를 글루코스 1000 ml/L 농도에 (글루코스 저 농도) 접종하고, 24웰 각각에는 리간드를 3.5 mg/mL로 첨가하였다. 그 결과는 도 8C에 나타낸다. 처리 세포에서는, 글루코스 저 농도 (LG) 배지에 접종한 대조군 SW620 세포와는 대조적으로, 플레이트에 형성되는 대표적인 콜로니들이 관찰되지 않았다. 따라서, 리간드가 종양 증식, 즉 콜로니 형성력에 영향을 미친다고 할 수 있다.
이러한 사실은, 리간드를 2가지 기능, 나노입자의 능동적인 인가 (active direction) 및 약물로서 이용할 수 있으므로, 매우 흥미롭다.
실시예 4. TAS1R3에 대한 타겟 테라피 .
하기와 같이 나노에멀젼을 TAS1R3에 대한 여러가지 리간드로 관능화하였다. 부드럽게 자기 교반하면서, Milli-Q 워터 (MilliporeMilli-Q system®) 1 mL에, 올레산 및 스핑고마이엘린 (각각 5 mg 및 500 ㎍)을 함유한 에탄올 100 ㎕를, C16-C18 체인과 공유 연결된 락티솔 500 ㎍와 함께 첨가한 후, 자발적으로 나노에멀젼이 형성되었다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용해, G7111A 펌프, G7129A 자동샘플러 및 G7114A UV-Vis 검출기가 장착된 HPLC 시스템 (1260 Infinity II, Agilent)과 InfinityLab Poroshell 120EC-C18 컬럼 (Agilent, 4.6x 00 mm, 4 ㎛ 포어 크기)을 사용해 나노에멀젼내 리간드의 함유를 검증하였다.
대상 수용체를 발현하는 세포와 나노에멀젼의 상호작용하는 능력에 대한 관능화 효과를 실험하기 위해, 유세포 측정과 공초점 현미경 기법을 이용하였다. 구체적으로, SW620 세포를 사용하였으며, 공초점 현미경을 이용하였다. 이들 실험에서, 8웰 마이크로-챔버 (PLC30108, SPL LifeSciences)의 각 웰에 세포 80,000주를 접종하였다. 24시간 후, 니트로벤즈옥사다이아졸 (NBD)로 표지된 올레산 및 스핑고마이엘린 유도체로부터 제조한 다음 DiR을 캡슐화한 나노에멀젼 (OLM; O:SM1:0.1), 및 락티솔로 관능화된 동일한 나노에멀젼 (OLM-L; O:SM:Lact 1:0.1:0.1)을, 최종 농도 0.12 mg/mL의 나노에멀젼 웰에서 세포와 함께 인큐베이션하였다. 37℃에서 4시간 인큐베이션한 후, 세포를 1X PBS로 2번 헹구고, 4% 파라포름알데하이드를 사용해 15분간 고정한 다음 세포를 PBS 1X로 2번 헹구고, 세포 핵을 Hoechst 33342 (Thermo Fisher®)로 염색하였다. 마운팅 매질 (Mowiol, Calbiochem)을 첨가하고, 샘플을 공초점 현미경 (Laser Microscope Confocal Leica SP8®)에서 관찰하였다. 비슷한 실험을 수행하여, 이 경우, 실시예 2에 나타낸 바와 같이, 글루코스 고 농도 또는 저 농도 함유 배지에서 배양한 SW620 세포에서 인큐베이션한 후, 즉 수용체의 여러가지 발현 수준에서, 락티솔)로 관능화되고 DiD로 표지된 나노에멀젼 (O:SM:Lact 1:0.1:0.1의 내재화를 비교하였다. 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, 락티솔에 대한 TAS1R3 수용체의 발현 수준이 낮은 SW620 세포에서 인큐베이션한 경우, 나노에멀젼으로부터 기인한 형광 강도는 실제 감소하는 것으로 확인되었다.
O:SM:Lact 1:0.1:0.1 (NE-F)에 에토포시드 (etoposide)를 다른 성분들에 대해 1 중량%로 로딩하였다. 96웰 플레이트에 웰 당 세포 10,000주를 접종하였다. 24시간 배양한 후, 시험 제형 20 ㎕를 배양 배지 110 ㎕에 첨가하였으며, 대조군으로서 나노시스템이 용해된 비히클을 첨가한 양성 대조군과, 6% 트리톤 100X 희석물을 첨가한 음성 대조군 또는 완전 사멸한 경우를 확립하였다. 48시간 후, 플레이트의 배양 배지를 흡인하고, 1X PBS로 헹군 다음 MTT 시약을 1X PBS 중의 5 mg/mL 농도로 첨가하였으며, 그 후 상층액을 첨가하지 않은 DMEM 배지에서 1:10으로 희석하고, 0.22 ㎛ 필터에서 여과하였다. 각 웰에 110 ㎕를 첨가하였다. 인큐베이터에서 4시간 둔 후, 플레이트에서 배지를 제거하고, 1X DMSO (다이메틸설폭사이드, 99.7%, AcrosOrganics) 110 ㎕을 첨가하여 미토콘드리아 효소에 의해 생긴 포르마잔 결정을 용해하였다. 광 차단 플레이트를 37℃에서 15분간 인큐베이션하고, 이를 분광광도계 (Multiskan EX, ThermoLabsystems®)에서 570 nm 흡광도를 측정하였으며, GraphPad Prism 5 프로그램을 사용해 각 제형의 EC50 값을 구하였다. 항-종양제를 캡슐화하기 위해, 에토포시드를 선택하였으며, 40 mg/mL 용액 13.75 ㎕ (약물 550 ㎍)를 유기 상에 첨가하였다. 15℃에서 30분간 14000 xg에서 원심분리 (Microcentrifuge 5415R, rotor F452411 Eppendorf®)하여 모든 나노에멀젼을 분리하여, 나노에멀젼의 일부가 아닌 것은 모두 제거하였다. 도 10A에 나타낸 바와 같이, 약물 나노에멀젼으로 처리된 세포에서는, 특히 관능화된 나노에멀젼의 경우, 더 높은 세포독성 활성이 관찰되었다 (백색은 거의 활성을 나타내지 않음).
실시예 5. 양자점을 이용한 실험
양자점을 인간 단백질 TAS1R3에 대한 항체로 관능화하였다. TAS1R3 항체 (Ref sc50353, SCBT)를 SiteClick™ Qdot® 655 Antibody Labeling Kit (Ref S10453, ThermoFisher)를 공급사의 지침에 따라 사용해 양자점에 접합하였다. 최종 조제물내 농도는, 지정된 파장에서의 광학 밀도를 측정하고 이를 식 A = εcL로 계산하여 결정하였으며, 이때 A는 흡광도이고, ε는 분자 흡광 계수 (molar extinction coefficient)이고, c는 몰 농도이고, L은 통로 길이이다. 본 발명자들은 양자점의 크기 분포를 체크하였으며, 주 집단은 약 400 nm로 관찰되었다.
본 발명자들은, 관능화된 양자점과 폐 종양 세포 A549의 상호작용 실험을 현탁 및 부착 조건에서 수행하였다. 인큐베이션은 4시간 동안 4℃ 및 37℃에서 수행하였다. 인큐베이션 기간이 끝나면, 배양 배지는 제거하고 1X PBS로 헹구었다. 현탁 배양한 세포를, 부착을 허용하고 TAS1R3 수용체의 면역형광 실험을 수행하기 위해 경험적으로 접종하였다. 24시간 후, 배양 배지를 흡인에 의해 제거하고, PBS 1X로 헹군 다음, 실온에서 15분간 4% 파라포름알데하이드로 세포를 고정하였다. 그런 후, 항-인간 1차 항체 TAS1R3 (토끼) (Ref sc50353, SCBT)를, 1X PBS에 용해된 0.2% BSA에서 1:1000 희석 비율로 인큐베이션하였으며, 인큐베이션은 실온에서 1시간 동안 플레이트에서 수행하였다. 그런 후, 1차 항체를 세척하고, 형광단 (Alexa Fluor 488)으로 표지된 항-토끼 2차 항체 (111-545-144 Jackson Immunoresearch)를 BSA 0.2% PBS 1X에 1:500 희석율로 첨가하였다. 동시에, Hoechst 33342 (ThermoFisher®) (희석율 1:1000)를 첨가하여, 형광단을 가능한 광 분해로부터 보호하면서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간이 끝나면, 이를 PBS 1X로 3번 교반 하에 헹군 다음, 마이크로-챔버의 벽부를 제거하고 Mowiol 마운팅 매질 (Calbiochem)을 첨가한 후 샘플 위에 커버슬립을 배치하였다. 이를 암조건으로부터 보호된 상태에서 밤색 실온 건조하였으며, 다음날 공초점 현미경 (Leica SP8® 공초점 레이저 현미경)으로 관찰하였다.
<110> FUNDACION PARA A INVESTIGACION, DESENVOLVEMENTO E INNOVACION RAMON DOMINGUEZ SERVIZO GALEGO DE SAUDE <120> Use of the TAS1R3 protein as a marker for therapeutic, diagnostic, and/or prognostic purposes for tumors that express said protein. <130> 903 853 <140> EP18382013.3 <141> 2018-01-15 <160> 3 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> acetyllysine ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (16) <223> cysteinamide <400> 1 Leu Ser Gln Gln Leu Arg Met Lys Gly Asp Tyr Val Leu Gly Gly Cys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> acetylglutamic acid ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (19) <223> cysteinamide AMIDATION <400> 2 Glu Arg Leu Lys Ile Arg Trp His Thr Ser Asp Asn Gln Lys Pro Val 1 5 10 15 Ser Arg Cys <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BRA <400> 3 Cys Phe Tyr Asp Glu Lys Arg 1 5

Claims (15)

  1. 종양 바이오마커로서 TAS1R3 막 세포 수용체의 시험관내 용도.
  2. 환자에서 종양, 신생물 또는 전이의 존재를 시험관내 진단하는 방법으로서,
    a) 환자로부터 분리된 하나 이상의 생물학적 샘플을 출발 물질로 하여, 생물학적 샘플의 세포에서 TAS1R3의 발현 수준을 확인하는 단계, 및
    c) 상기 발현 수준을, 건강한 개체의 생물학적 샘플 또는 건강한 장기 또는 조직의 일부의 생물학적 샘플 또는 종양이 없는 생물학적 샘플에서의 TAS1R3 발현 수준 또는 기준값과 비교하는 단계를 포함하고,
    건강한 개체의 생물학적 샘플 또는 건강한 장기 또는 조직의 일부의 생물학적 샘플 또는 종양이 없는 생물학적 샘플에서의 TAS1R3 수용체의 발현 수준 또는 기준값과 비교해, 발현 수준의 증가는, 환자에 종양, 신생물 또는 전이가 존재하는 것을 의미하는 것인, 방법.
  3. 환자에서 종양, 신생물 또는 전이가 존재하는 환자의 임상 경과 (clinical course)를 시험관내 예후 예측하는 방법으로서,
    a) 환자로부터 분리된 하나 이상의 생물학적 샘플을 출발 물질로 하여, 생물학적 샘플의 세포에서 TAS1R3의 발현 수준을 확인하는 단계, 및
    c) 상기 발현 수준을, 단계 a)의 생물학적 샘플 수득 시점 보다 이른 시점에 동일한 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서의 TAS1R3 수용체의 발현 수준 또는 기준값과 비교하는 단계를 포함하고,
    단계 a)의 생물학적 샘플 수득 시점 보다 이른 시점에 동일한 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서의 TAS1R3 수용체의 발현 수준 또는 기준값과 비교해, 발현 수준의 증가는, 환자의 부정적인 임상적 진화 (negative clinical evolution)를 의미하는 것인, 방법.
  4. 환자에서 종양, 신생물 또는 전이가 존재하는 환자의 임상 경과를 시험관내 모니터링하는 방법으로서,
    a) 환자로부터 분리된 하나 이상의 생물학적 샘플을 출발 물질로 하여, 생물학적 샘플의 세포에서 TAS1R3의 발현 수준을 확인하는 단계, 및
    c) 상기 발현 수준을, 단계 a)의 생물학적 샘플 수득 시점 보다 이른 시점에 동일한 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서의 TAS1R3 수용체의 발현 수준 또는 기준값과 비교하는 단계를 포함하고,
    단계 a)의 생물학적 샘플 수득 시점 보다 이른 시점에 동일한 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서의 TAS1R3 수용체의 발현 수준 또는 기준값과 비교해, 발현 수준의 증가는, 환자의 부정적인 임상적 진화 (negative clinical evolution)를 의미하는 것인, 방법.
  5. 종양, 신생물 또는 전이가 존재하는 환자의 치료 반응을 모니터링하는 방법으로서,
    a) 환자로부터 분리된 하나 이상의 생물학적 샘플을 출발 물질로 하여, 생물학적 샘플의 세포에서 TAS1R3의 발현 수준을 확인하는 단계, 및
    c) 상기 발현 수준을, 단계 a)의 생물학적 샘플 수득 시점 보다 이른 시점에 동일한 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서의 TAS1R3 수용체의 발현 수준 또는 기준값과 비교하는 단계를 포함하고,
    단계 a)의 생물학적 샘플 수득 시점 보다 이른 시점에 동일한 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서의 TAS1R3 수용체의 발현 수준 또는 기준값과 비교해 발현 수준의 증가는, 치료 반응 부족 (lack of response to treatment)을 의미하는 것인, 방법.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    생물학적 샘플의 세포에서 TAS1R3 발현 확인이 앱타머, 항체 또는 Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2, scFv로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 단편을 이용해, 또는 TAS1R3 수용체에 선택적으로 결합할 수 있는 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디 및/또는 인간화된 항체를 이용해 수행되는, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 앱타머, 항체 또는 항체의 단편, 또는 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디 및/또는 인간화된 항체가 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열에 선택적으로 결합할 수 있는, 방법.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양이 고형 종양이거나, 또는 상기 환자가 유방암, 흑색종, 포도막 흑색종, 췌장암, 폐암, 전립선암, 위암, 두경부암, 육종, 교모세포종, 신경모세포종, 결장과 직장의 암, 두경부의 암, 신장암, 방광암 및 간세포암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 가진, 방법.
  9. 수용체 TAS1R3의 리간드, 바람직하게는 접합체 또는 면역독소 형태의 리간드의 사용에 의한 종양 세포에 대한 테라피 (therapy)를 지시하기 위한 분자 마커/종양 바이오마커로서 사용하기 위한, 세포막 수용체 TAS1R3.
  10. 수용체 TAS1R3의 리간드, 바람직하게는 방사성 약물 (radiopharmaceutical)과의 접합체 형태의 리간드의 사용에 의한 생체내 진단을 위한 분자 마커/종양 바이오마커로서 사용하기 위한, 세포막 수용체 TAS1R3.
  11. 종양 세포에 대한 테라피에 사용하기 위한 또는 생체내 진단에서 종양 바이오마커로서 사용하기 위한,
    a) TAS1R3 수용체와 상호작용하거나 또는 TAS1R3 수용체에 결합할 수 있는 특이적인 타겟 물질; 및
    b) 세포독성 물질, 방사성 동위원소, 나노구조체 또는 나노에멀젼
    을 포함하는, 접합체.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 TAS1R3 수용체와 상호작용하거나 또는 TAS1R3 수용체에 결합할 수 있는 특이적인 타겟 물질이 단당류 및 이당류; 수크랄로스와 같은 인공 감미제; 사이클라메이트; 네오에스페리딘; 다이하이드로칼콘; 락티솔과 같은 단맛 저해제 (sweetness inhibitor); 브라제인과 같은 단백질; 항체 또는 항체 단편; 펩타이드, 앱타머 또는 소분자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 접합체.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 타겟 물질이 앱타머, 항체, Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2, scFv로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 단편, 또는 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디 및/또는 인간화된 항체로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 타겟 물질이 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열에 선택적으로 결합할 수 있는, 접합체.
  14. a) 브라제인 및 락티솔로 이루어진 군으로부터 선택되는 특이적인 타겟 물질; 및
    b) 세포독성 물질, 방사성 동위원소, 나노구조체 또는 나노에멀젼
    을 포함하는, 접합체.
  15. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    고형 종양, 바람직하게는 유방암, 흑색종, 포도막 흑색종, 췌장암, 폐암, 전립선암, 위암, 두경부암, 육종, 교모세포종, 신경모세포종, 결장과 직장의 암, 두경부의 암, 신장암, 방광암 및 간세포암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양을 치료 또는 생체내 진단하는데 사용하기 위한 것인, 접합체.
KR1020207023565A 2018-01-15 2019-01-15 Tas1r3 단백질을 발현하는 종양의 치료, 진단 및/또는 예후 예측을 위한 마커로서 tas1r3 단백질의 용도 KR20200128392A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18382013 2018-01-15
EP18382013.3 2018-01-15
PCT/EP2019/050981 WO2019138140A1 (en) 2018-01-15 2019-01-15 Use of the tas1r3 protein as a marker for therapeutic, diagnostic, and/or prognostic purposes for tumors that express said protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200128392A true KR20200128392A (ko) 2020-11-12

Family

ID=61599078

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207023565A KR20200128392A (ko) 2018-01-15 2019-01-15 Tas1r3 단백질을 발현하는 종양의 치료, 진단 및/또는 예후 예측을 위한 마커로서 tas1r3 단백질의 용도

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20210275680A1 (ko)
EP (1) EP3740755B9 (ko)
JP (2) JP2021510835A (ko)
KR (1) KR20200128392A (ko)
CN (1) CN112074741A (ko)
AU (1) AU2019206268A1 (ko)
BR (1) BR112020014323A2 (ko)
CA (1) CA3088227A1 (ko)
ES (1) ES2953114T3 (ko)
RU (1) RU2020127079A (ko)
WO (1) WO2019138140A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023140700A1 (ko) * 2022-01-24 2023-07-27 서울대학교산학협력단 장 미각 수용체 tas1r3 발현 및 활성화 억제를 통한 서구식 식이 유발 염증성 장 질환의 예방 또는 치료

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7402400B2 (en) * 2001-07-03 2008-07-22 Regents Of The University Of California Mammalian sweet taste receptors
EP3067698A1 (en) * 2015-03-11 2016-09-14 Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) Pd-ecgf as biomarker of cancer
EP3510995A1 (en) * 2018-01-15 2019-07-17 Fundación Para A Investigación, Desenvolvemento E Innovación Ramón Domínguez Nanosystems as selective vehicles

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023140700A1 (ko) * 2022-01-24 2023-07-27 서울대학교산학협력단 장 미각 수용체 tas1r3 발현 및 활성화 억제를 통한 서구식 식이 유발 염증성 장 질환의 예방 또는 치료

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019138140A1 (en) 2019-07-18
EP3740755A1 (en) 2020-11-25
JP2023179455A (ja) 2023-12-19
RU2020127079A3 (ko) 2022-02-17
EP3740755B9 (en) 2023-10-04
RU2020127079A (ru) 2022-02-17
JP2021510835A (ja) 2021-04-30
AU2019206268A1 (en) 2020-09-03
ES2953114T3 (es) 2023-11-08
EP3740755C0 (en) 2023-06-07
BR112020014323A2 (pt) 2020-12-08
CA3088227A1 (en) 2019-07-18
CN112074741A (zh) 2020-12-11
US20210275680A1 (en) 2021-09-09
EP3740755B1 (en) 2023-06-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5689133B2 (ja) 結腸直腸癌におけるｐｏｄｘｌタンパク質
US10345310B2 (en) Diagnostic test for early stage cancer
Lopes-Rodrigues et al. Multidrug resistant tumour cells shed more microvesicle-like EVs and less exosomes than their drug-sensitive counterpart cells
US20170153241A1 (en) Cell response assay for cancer and methods of producing and using same
WO2012141285A1 (ja) 乳癌のバイオマーカー
US20210322513A1 (en) Method for detecting cancer cells, reagent for introducing substance into cancer cells, and composition for treating cancer
US20110027173A1 (en) Ephrin type-a receptor 10 protein
JP2018516244A (ja) 肺がんを処置するための方法
EP2765140A2 (en) Cadherin-2 or Mucin-13 binding molecules for cancer treatment
US20140005059A1 (en) Biomarkers for cancer
CA2914237A1 (en) Methods for treatment of ovarian cancer
JP2023179455A (ja) Ｔａｓ１ｒ３タンパク質を発現する腫瘍に関する治療目的、診断目的及び／又は予後診断目的のマーカーとしてのｔａｓ１ｒ３タンパク質の使用
Li et al. Identification of the target protein of the metastatic colorectal cancer-specific aptamer W3 as a biomarker by aptamer-based target cells sorting and functional characterization
US20170322216A1 (en) Pancreatic cancer diagnostic
KR20210105270A (ko) 동반진단용 바이오마커 조성물 및 이를 포함하는 동반진단용 키트
US20210231669A1 (en) Method for diagnosing pancreatic cancer using methionyl-trna synthetase, and pancreatic cancer diagnostic kit using same
EP3652541B1 (en) Combination of markers for diagnosing cancer
EP3118221A1 (en) Proteins
WO2020218322A1 (ja) 血中ケモカインを用いた免疫チェックポイント阻害薬の治療効果予測
US20210263038A1 (en) Composition for diagnosis of bone metastasis of cancer and kit comprising same
Carmicheal Novel Detection and Treatment Strategies for Pancreatic Ductal Adenocarcinoma
CN117157525A (zh) 使用免疫检查点抑制剂治疗癌症的方法
Wang et al. A preliminary study on the expression of tumor-associated glycoprotein-72 in human gliomas

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application