JP6430648B2 - 細菌由来のナノベシクルを用いた細菌性感染疾患の原因菌の同定方法 - Google Patents
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Description
本発明は細菌から由来するナノサイズの細胞外ベシクル、すなわちナノベシクルを含有する臨床サンプルで、ナノベシクルに含有されている遺伝子解析を通して細菌性感染疾患の原因因子（原因菌）を同定するとともに、上記の原因菌に対する抗生剤の耐性を予測する方法に関するものである。
細菌性重症感染疾患は細菌による感染疾患の中で肺炎、感染性心内膜炎、骨髄炎、骨関節炎、脳膜炎、敗血症などのように細菌感染の重症発現を特徴とする疾患であって、最近人口の高齢化により対象患者群の増加と無差別的な抗生剤の使用による多剤耐性菌の拡散により発生率が急増している。細菌性重症感染疾患を起こす多剤耐性菌としてＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．などが知られている。
多剤耐性菌による重症感染は主に院内感染の形態で現れて、重症感染による死亡率が高くて肺炎である場合には死亡率が５．４％であり、敗血症の場合には２９％の死亡率を見せることと報告された。また、細菌性重症感染にかかると患者の在院期間が長くなり、治療に入る投資対比効用が低くて、韓国の場合多剤耐性菌の感染による年間疾病費用は１兆ウオン以上であると調査されたことがある。さらに、最近多剤耐性菌による院内感染だけでなく地域社会で多剤耐性菌が報告されていて、今後国民保健に大きな問題になると予想される。
これに関連して、現在細菌性重症感染疾患を診断するために用いられている方法では、血液などの臨床サンプルを体外で細菌培養を行って生化学的な方法で原因菌を同定する方法がある。しかし、最近菌遺伝体学であるメタゲノム（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ）解析結果を基にする上記の伝統的な方法では全体の細菌の１％のみ確認することができ、細菌培養に所要される時間が最小五日がかかり、現在までは原因菌を知らない状態で臨床的な経験のみに根拠して抗生剤を用いる実情である。
一方、細菌のような原核細胞とヒトなどの宿主細胞である真核細胞は細胞外にベシクル（ｖｅｓｉｃｌｅｓ）を分泌して、分泌されたベシクルが様々な機能を行うことが報告された。細菌から分泌された細胞外ベシクルは内毒素（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＬＰＳ）と細菌由来のタンパク質と遺伝子を含有していて、サイズは２０−１００ナノメートル（ｎｍ）のサイズなので、通常的にナノベシクル（ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅ）と称する。ヒトまたは動物の様々な分泌物、排泄物または組織の洗浄液などで、細胞外ベシクルが発見されたことが報告されていて、組織に存在する細胞外ベシクルを分泌する組織の状態を反映していると知られており、疾病の診断に用いることができるということが報告されている。
しかし、まだヒトの体に存在する細菌から由来するナノベシクル内の遺伝子を通して重症細菌感染の原因菌を同定して、このような原因菌の抗生剤耐性を予測する方法に関する研究結果は報告されたことはない。
本発明者らは、哺乳動物の体内で分離したサンプルから由来する細菌由来のナノベシクル内の細菌から由来する遺伝子が存在することを発見して、ナノベシクルから抽出した遺伝子の塩基配列解析を通して重症細菌感染の原因因子（原因菌）を予測することができる方法を開発して本発明を完成することになった。
したがって、本発明は細菌由来のナノベシクルを含有する哺乳動物の臨床サンプルからナノベシクル内に存在する遺伝子を抽出して塩基配列解析を通して重症細菌感染の原因菌を同定して、上記の原因菌の抗生剤の耐性を予測する方法を提供することを目的とする。
しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、以下の記載から当業者に明確に理解することができるだろう。
本発明は、（Ａ）細菌由来のナノベシクルを含有する患者サンプルからナノベシクル内の遺伝子を抽出するステップ；（Ｂ）上記の抽出された遺伝子に対して配列番号１および２のプライマーペアを用いてＰＣＲを行うステップ；および（Ｃ）上記のＰＣＲの結果物が正常人に比べて増加されている場合、細菌性重症感染疾患の原因菌が存在することと判定するステップを含む、細菌性重症感染疾患の原因菌の同定方法を提供する。
また、本発明は、（Ａ）細菌由来のナノベシクルを含有する患者のサンプルからナノベシクル内の遺伝子を抽出するステップ；（Ｂ）上記の抽出された遺伝子に対して配列番号１および２のプライマーペアを用いてＰＣＲを行うステップ；および（Ｃ）上記のＰＣＲ結果物が正常人に比べて増加されている場合、細菌性重症感染疾患の原因菌に対して抗生剤の反応性が低いことと判断するステップを含む、細菌性重症感染疾患の原因菌に対する抗生剤の耐性を予測する方法を提供する。
本発明の一具体例として、上記の患者サンプルを尿、血液、口腔液、胃液、大便、鼻腔液、喀痰、皮膚洗浄液、胸膜液、腹膜液、関節液、脳脊髄液、羊水および膣洗浄液からなる群より選ばれることを特徴とする。
本発明の他の具体例として、上記のナノベシクル内の遺伝子は１６Ｓ ｒＤＮＡまたは１６Ｓ ｒＲＮＡであることを特徴とする。
本発明の他の具体例として、上記のナノベシクルは平均直径が１０−３００ｎｍであることが望ましく、２０−１００ｎｍであることがさらに望ましい。
本発明の他の具体例として、上記の細菌性重症感染疾患は、敗血症、副鼻腔炎、肺炎、結核、感染性心内膜炎、骨関節炎、骨髄炎、尿路感染、脳炎、脳膜炎および腎臓炎からなる群より選ばれることを特徴とする。
本発明の他の具体例として、上記の細菌性重症感染疾患は、敗血症、副鼻腔炎、肺炎、結核、感染性心内膜炎、骨関節炎、骨髄炎、尿路感染、脳炎、脳膜炎および腎臓炎からなる群より選ばれることを特徴とする。
本発明の他の具体例として、上記の原因菌はＳｋｅｒｍａｎｅｌｌａ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｋｏｃｕｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅおよびＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍからなる群より選ばれる多剤耐性菌であることを特徴とする。
本発明の他の具体例として、上記のステップ（Ａ）で遺伝子を抽出するステップは、（ａ）患者サンプルを遠心分離して上澄み液を得た後、フィルターにより細菌および異物質を除去するステップ；（ｂ）上記のフィルタリングの後、得た産物を遠心分離して濃縮するステップ；（ｃ）上記の濃縮産物を超高速遠心分離してナノベシクルペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を得るステップ；（ｄ）上記のナノベシクルペレットを熱処理するステップ；および（ｅ）上記の熱処理産物を遠心分離して、上澄み液を得るステップを含むことを特徴とする。
本発明の他の具体例として、上記のステップ（ｄ）で熱処理は９０−１１０℃で５−３０分間行うことを特徴とする。
本発明の他の具体例として、上記のステップ（ｄ）で熱処理は９０−１１０℃で５−３０分間行うことを特徴とする。
本発明の方法によれば、細菌由来のナノベシクルを含有する臨床サンプルでナノベシクル内の遺伝子塩基配列を解析することによって、細菌感染の原因菌に関する情報を提供して、細菌感染の原因因子を予測することができる。
また、本発明の方法によれば、細菌感染の原因菌に関する情報を提供することによって、細菌感染の原因菌に対する抗生剤の耐性を予測することができる。
また、本発明の方法によれば、細菌感染の原因菌に関する情報を提供することによって、細菌感染の原因菌に対する抗生剤の耐性を予測することができる。
本発明は細菌由来のナノベシクルを含有する尿などの臨床サンプルでナノベシクル内の遺伝子塩基配列を解析して重症細菌感染の原因菌を同定して、これに対する抗生剤の耐性を予測する方法に関するものである。
本発明者らは細菌から分泌されるナノベシクルが体内に吸収され血液を通して哺乳動物の様々な組織に分布して、これは尿と大便で排泄されることを発見した。それで、１１名の正常人（対照群）と２５名の重症細菌感染患者の尿サンプルで（ナノベシクルを分離して）遺伝子を抽出した後、細菌に特異的に存在する１６Ｓ ｒＤＮＡまたは１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を解析して重症細菌感染の原因菌を予測することができることを確認した。
この過程で、本発明者らはナノベシクルから抽出したＤＮＡに対してメタゲノム解析を実施した結果、正常人の尿に比べて細菌性重症感染患者の尿には１２個の細菌属から由来するナノベシクルが有意に増加されたことを確認した。
また、臨床サンプルに熱処理をする場合、抽出された遺伝子の純度が増加されることを明らかにした。
また、臨床サンプルに熱処理をする場合、抽出された遺伝子の純度が増加されることを明らかにした。
また、ナノベシクルの分離有無に関係なくサンプルに熱処理を通し遺伝子を抽出してメタゲノム解析をした結果、細菌由来のナノベシクルの分布が門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルおよび属（ｇｅｎｕｓ）レベルで類似することを確認した。すなわち、臨床サンプルから細菌由来のナノベシクルを分離しなくて、直接ナノベシクル内の遺伝子を抽出して遺伝子の塩基配列を解析しても同じ結果が出ることが分かった。
また、正常人と感染性心内膜炎（ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｅｎｄｏｃａｒｄｉｔｉｓ）、腎臓炎（ＡＰＮ）患者の尿サンプル由来のナノベシクルに熱処理方法で遺伝体を抽出した後、１６Ｓ ｒＤＮＡプライマーを用いて増幅しメタゲノム解析を属（ｇｅｎｕｓ）レベルで行った結果、正常人に比べて感染性心内膜炎の患者の尿にはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属から由来するナノベシクルが約６０％以上、確実に増加されていて、腎臓炎患者の尿ではＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ属から由来するナノベシクルが約４０％以上確実に増加されていたことを確認した。
本明細書で「細菌感染（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）または細菌性感染疾患（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ）とは、細菌または細菌由来の毒素により発生する疾患を総称する。一般的に細菌または細菌由来毒素が宿主の防御膜を突き抜けてきて感染疾患が発生することになるが、代表的な例として肺に発生する肺炎、肺結核；骨関節に発生する骨髄炎、骨関節炎；心臓に発生する感染性心内膜炎；脳に発生する脳炎、脳膜炎；腎臓に発生する腎臓炎；全身的に発生する敗血症などがある。
本発明で「重症細菌感染」または「細菌性重症感染疾患」とは、肺炎、敗血症、感染性心内膜炎、腎臓炎、骨関節炎なとのように細菌感染による死亡率が高かったり、治療が難しい場合を含む細菌感染の重症発現を意味する。
本明細書で「原因因子あるいは原因菌の予測」とは、細菌あるいは細菌由来の毒素により発生する感染疾患の原因菌に関する情報を提供することで適切な抗生剤を用いるようにしたり、抗生剤の使用の後、疾患の経過を予測することができることを含む意味である。
本明細書で「抗生剤の耐性の予測」とは、細菌あるいは細菌由来の毒素により発生する感染疾患の原因菌に対する抗生剤の耐性情報を提供することで適切な抗生剤を用いるようにしたり、抗生剤の使用の後、疾患の結果を予測することができることを含む意味である。
本明細書で「細菌由来のナノベシクル」とは臨床サンプルに含有された細菌が分泌するナノサイズのベシクルで、臨床サンプルからナノベシクルを分離して遺伝子を抽出したり、ナノベシクルが含有された臨床サンプルでナノベシクルの分離なしに熱処理、化合物の処理などの方法でナノベシクル内に含有されている遺伝子を抽出することができる。
本明細書でナノベシクルが含有された「臨床サンプル」は患者から得た試料であって、特に制限されていないが、目的にするところにより、血液、喀痰、大便、鼻腔液、口腔液、関節液、胸水、脳脊髄液などのようなものを用いることができる。
上記の臨床サンプルからナノベシクルを分離する方法は特に制限されなく、例えば尿や血液で、遠心分離、超高速遠心分離、フィルターによるろ過、ゲルろ過クロマトグラフィ、フリーフロー電気泳動、毛細管電気泳動などの方法、およびこれらの組合を挙げることができる。また、不純物の除去のための洗浄、遠心分離、収得されたナノベシクルの濃縮などの過程をさらに含むことができる。
上記の臨床サンプルからナノベシクルを分離する方法は特に制限されなく、例えば尿や血液で、遠心分離、超高速遠心分離、フィルターによるろ過、ゲルろ過クロマトグラフィ、フリーフロー電気泳動、毛細管電気泳動などの方法、およびこれらの組合を挙げることができる。また、不純物の除去のための洗浄、遠心分離、収得されたナノベシクルの濃縮などの過程をさらに含むことができる。
上記の臨床サンプルからナノベシクル内の遺伝子を抽出する方法は、臨床サンプルからナノベシクルを分離した後、物理的あるいは化学的な方法でナノベシクル内の遺伝子を抽出したり、ナノベシクルが含有された臨床サンプルでナノベシクルの分離過程を経なくて熱処理のような物理的あるいは化学的な方法で直接ナノベシクル内の遺伝子を抽出することができる。
上記の方法により分離されたナノベシクルは平均直径が１０−３００ｎｍであることができるが、望ましくは２０−１００ｎｍである。
本明細書で遺伝子は細菌由来のＤＮＡとＲＮＡを含む概念であり、「遺伝子塩基配列解析」は遺伝子塩基配列に相補的なプライマーを用いて遺伝子を増幅することを含む。
本明細書で「メタゲノム」とは「群遺伝子」とも言って、土、動物の腸などの孤立された地域内のすべてのウィルス、細菌、カビなどを含む遺伝体の総合を意味するもので、主に培養されていない微生物を解析するために配列解析機を用いて一度に多くの微生物を同定することを説明する遺伝体の概念として用いられる。特にメタゲノムは一種のゲノム、遺伝体をいうものではなく、一つの環境単位のすべての種の遺伝体であって一種の混合遺伝体を言う。 これはオミックス的に生物学が発展する過程で一つの種を定義する際に機能的に従来の一つの種だけでなく、様々な種がお互いに相互作用して完全な種を作るという観点から出た用語である。技術的には早い配列解析法を用いて、種に関係なくすべてのＤＮＡ，ＲＮＡを解析して、一つの環境内でのすべての種を同定して、相互作用、代謝作用を究明する技法の対象である。
以下、本発明の理解を助けるための実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより理解しやすくするために提供されるものであり、実施例により本発明の内容が限定されるものではない。
実施例１：尿サンプルからナノベシクルの分離
５０ｍｌチューブ内の尿サンプルを遠心分離法（３，５００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）で浮遊物を沈めて、上澄み液のみを取った後、０．２２μｍフィルターを用いて細菌および異物質を除去した。この後、セントリプレップチューブ（ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｉｇｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒｓ ５０ｋＤ）に移して１，５００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離して５０ｋＤより小さい物質は捨てて１０ｍｌまで濃縮させた。再び０．２２μｍ ｆｉｌｔｅｒを用いて、バクテリアおよび異物質を除去した後、Ｔｙｐｅ９０ｔｉローターで１５０，０００×ｇ、４℃で３時間の間、超高速遠心分離方法を用いて上澄み液を捨てて、塊になったｐｅｌｌｅｔを生理食塩水（ＰＢＳ）で溶かした。続いて、タンパク質の定量方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ａｓｓａｙ）を行って、ナノベシクルの量を測定した結果を下記の［表１］に示した。
５０ｍｌチューブ内の尿サンプルを遠心分離法（３，５００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）で浮遊物を沈めて、上澄み液のみを取った後、０．２２μｍフィルターを用いて細菌および異物質を除去した。この後、セントリプレップチューブ（ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｉｇｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒｓ ５０ｋＤ）に移して１，５００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離して５０ｋＤより小さい物質は捨てて１０ｍｌまで濃縮させた。再び０．２２μｍ ｆｉｌｔｅｒを用いて、バクテリアおよび異物質を除去した後、Ｔｙｐｅ９０ｔｉローターで１５０，０００×ｇ、４℃で３時間の間、超高速遠心分離方法を用いて上澄み液を捨てて、塊になったｐｅｌｌｅｔを生理食塩水（ＰＢＳ）で溶かした。続いて、タンパク質の定量方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ａｓｓａｙ）を行って、ナノベシクルの量を測定した結果を下記の［表１］に示した。
実施例２：尿サンプル内のナノベシクルの構造およびサイズ解析
上記の実施例１で分離したナノベシクルの構造を確認するために、下記のような方法で電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＪＥＭ １０１１ ｅｌｅｃｔｒｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｊｅｏｌ、Ｊａｐａｎ）を用いて観察した。
まず、ナノベシクルを５０μｇ／ｍｌ濃度で２０μｌを用意して、電子顕微鏡解析のためのグリッド表面に７μｌを落として１０秒間吸着させた後、ティッシュで表面に残った溶媒を吸収して除去する。続いて、陰性染色のための２％酢酸ウラニル７μｌを落として１０秒間吸着した後、またティッシュで除去して８時間常温で乾燥させて電子顕微鏡で撮影して、その結果を図１に示した。
また、上記の実施例１の方法で分離したナノベシクルのサイズを動的光散乱法（Ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ ＺＳ Ｍａｌｖｅｒｋ、ＵＫ）を用いて測定した。ナノベシクルを５μｇ／ｍｌ濃度で１ｍｌ用意した後、キュベット（ＺＥＮ０１１２）に移した後、定位置させた後、３０回ずつの３回撮影を行った。その結果、図２に示すように１０−１００ｎｍ内外のサイズであることを確認した。
上記の実施例１で分離したナノベシクルの構造を確認するために、下記のような方法で電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＪＥＭ １０１１ ｅｌｅｃｔｒｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｊｅｏｌ、Ｊａｐａｎ）を用いて観察した。
まず、ナノベシクルを５０μｇ／ｍｌ濃度で２０μｌを用意して、電子顕微鏡解析のためのグリッド表面に７μｌを落として１０秒間吸着させた後、ティッシュで表面に残った溶媒を吸収して除去する。続いて、陰性染色のための２％酢酸ウラニル７μｌを落として１０秒間吸着した後、またティッシュで除去して８時間常温で乾燥させて電子顕微鏡で撮影して、その結果を図１に示した。
また、上記の実施例１の方法で分離したナノベシクルのサイズを動的光散乱法（Ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ ＺＳ Ｍａｌｖｅｒｋ、ＵＫ）を用いて測定した。ナノベシクルを５μｇ／ｍｌ濃度で１ｍｌ用意した後、キュベット（ＺＥＮ０１１２）に移した後、定位置させた後、３０回ずつの３回撮影を行った。その結果、図２に示すように１０−１００ｎｍ内外のサイズであることを確認した。
実施例３：ナノベシクルでＤＮＡの抽出（熱処理方法）
尿サンプルから従来のＤＮＡ抽出キットでＤＮＡを抽出すると、遺伝子が抽出されないので、これを解決するために次のような熱処理方法を実施した。
まず、上記の実施例１の方法で分離したナノベシクル１００μｌをｈｅａｔｂｌｏｃｋ１００℃で１５分間熱処理してベシクル内部のＤＮＡを脂質膜の外に出るようにした後、氷で５分間冷やした。そして、残りの浮遊物を除去するために１０，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離して上澄み液のみを集めた後、Ｎａｎｏ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いてＤＮＡ量を定量した結果、尿μｌ当たり１，０００〜１，５００ｎｇのＤＮＡが抽出された。
続いて、抽出したＤＮＡに細菌由来の遺伝子が存在するかを確認するために、下記の１６Ｓ ｒＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒでＰＣＲを行って、その結果、図３に示すように、敗血症１および２で細菌由来の遺伝子が存在することを確認した。
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＡＧＡ ＧＴＴ ＴＧＡ ＴＣＭ ＴＧＧ ＣＴＣ ＡＧ−３’（配列番号１）
（塩基ＭはＡまたはＣを意味する）
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＧＴ ＴＡＣ ＣＴＴ ＧＴＴ ＡＣＧ ＡＣＴ Ｔ−３’（配列番号２）
尿サンプルから従来のＤＮＡ抽出キットでＤＮＡを抽出すると、遺伝子が抽出されないので、これを解決するために次のような熱処理方法を実施した。
まず、上記の実施例１の方法で分離したナノベシクル１００μｌをｈｅａｔｂｌｏｃｋ１００℃で１５分間熱処理してベシクル内部のＤＮＡを脂質膜の外に出るようにした後、氷で５分間冷やした。そして、残りの浮遊物を除去するために１０，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離して上澄み液のみを集めた後、Ｎａｎｏ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いてＤＮＡ量を定量した結果、尿μｌ当たり１，０００〜１，５００ｎｇのＤＮＡが抽出された。
続いて、抽出したＤＮＡに細菌由来の遺伝子が存在するかを確認するために、下記の１６Ｓ ｒＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒでＰＣＲを行って、その結果、図３に示すように、敗血症１および２で細菌由来の遺伝子が存在することを確認した。
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＡＧＡ ＧＴＴ ＴＧＡ ＴＣＭ ＴＧＧ ＣＴＣ ＡＧ−３’（配列番号１）
（塩基ＭはＡまたはＣを意味する）
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＧＴ ＴＡＣ ＣＴＴ ＧＴＴ ＡＣＧ ＡＣＴ Ｔ−３’（配列番号２）
実施例４：ナノベシクルから抽出したＤＮＡを用いたメタゲノム解析
正常人１１名と重症細菌性の感染疾患患者２５名の尿サンプルから上記の実施例１の方法でナノベシクルを分離した後、上記の実施例３の熱処理方法でナノベシクルからＤＮＡを抽出して、１６Ｓ ｒＤＮＡプライマーペア（配列番号１および２）を用いてＰＣＲ増幅してシークエンシングを行った（Ｒｏｃｈｅ ＧＳ ＦＬＸ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）。
その結果をＳｔａｎｄａｒｄ Ｆｌｏｗｇｒａｍ Ｆｏｒｍａｔ（ＳＦＦ）ファイルで出力して、ＧＳ ＦＬＸ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ２．９）を用いてＳＦＦファイルをｓｅｑｕｅｎｃｅファイル（．ｆａｓｔａ）とｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅファイルに変換した。その後、リードの信用度の評価を確認して、ｗｉｎｄｏｗ（２０ｂｐｓ）平均ｂａｓｅ ｃａｌｌ ａｃｃｕｒａｃｙが９９％未満（Ｐｈｒｅｄ ｓｃｏｒｅ＜２０）である部分を除去した後、リードの長さが３００ｂｐ以上であることのみを用いた（Ｓｉｃｋｌｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．３３）。
正常人１１名と重症細菌性の感染疾患患者２５名の尿サンプルから上記の実施例１の方法でナノベシクルを分離した後、上記の実施例３の熱処理方法でナノベシクルからＤＮＡを抽出して、１６Ｓ ｒＤＮＡプライマーペア（配列番号１および２）を用いてＰＣＲ増幅してシークエンシングを行った（Ｒｏｃｈｅ ＧＳ ＦＬＸ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）。
その結果をＳｔａｎｄａｒｄ Ｆｌｏｗｇｒａｍ Ｆｏｒｍａｔ（ＳＦＦ）ファイルで出力して、ＧＳ ＦＬＸ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ２．９）を用いてＳＦＦファイルをｓｅｑｕｅｎｃｅファイル（．ｆａｓｔａ）とｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅファイルに変換した。その後、リードの信用度の評価を確認して、ｗｉｎｄｏｗ（２０ｂｐｓ）平均ｂａｓｅ ｃａｌｌ ａｃｃｕｒａｃｙが９９％未満（Ｐｈｒｅｄ ｓｃｏｒｅ＜２０）である部分を除去した後、リードの長さが３００ｂｐ以上であることのみを用いた（Ｓｉｃｋｌｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．３３）。
Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ Ｕｎｉｔ（ＯＴＵ）解析のためにはＵＣＬＵＳＴとＵＳＥＡＲＣＨを用いてシークエンスの類似度によりクラスタリングを行って、ｇｅｎｕｓは９４％、ｆａｍｉｌｙは９０％、ｏｒｄｅｒは８５％、ｃｌａｓｓは８０％、ｐｈｙｌｕｍは７５％シークエンスの類似度を基準にクラスタリングをして、各ＯＴＵのｐｈｙｌｕｍ、ｃｌａｓｓ、ｏｒｄｅｒ、ｆａｍｉｌｙ、ｇeｎｕｓレベルの分類を行った後、ＢＬＡＳＴＮとＧｒｅｅｎＧｅｎｅｓの１６Ｓ ｒＤＮＡ配列データベース（１０８，４５３シークエンス）を用いて９７％以上のシークエンス類似度を有するバクテリアを解析した（ＱＩＩＭＥ）。
この際に、統計解析は、ｔ−ｔｅｓｔを用いて各群の平均分布比率が２−ｆｏｌｄ以上異なり、ｐ値が０．０５である場合にして、対照群と実験群に有意に異なる比率で存在する細菌を選定した。
この際に、統計解析は、ｔ−ｔｅｓｔを用いて各群の平均分布比率が２−ｆｏｌｄ以上異なり、ｐ値が０．０５である場合にして、対照群と実験群に有意に異なる比率で存在する細菌を選定した。
また、Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ、Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＰＣＡ）などを用いてサンプル間の類似度を解析した結果、図４に示すように、正常人の尿に比べて重症細菌感染患者の尿には１２個の細菌属から由来するナノベシクルが有意に増加されていることを確認した。具体的に、図４ａは正常人と重症細菌感染患者の尿サンプルから分離したナノベシクルをメタゲノム解析した結果であって、図４ｂは正常人に比べて重症細菌感染患者でナノベシクルが増加された細菌リスト（黄色のハイライトの表示）を示した結果であって、Ｓｋｅｒｍａｎｅｌｌａ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｋｏｃｕｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅおよびＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍの１２種が増加したことを分かることができた。
実施例５：ナノベシクルの熱処理、キット、化合物の処理によるＤＮＡ抽出量の差異
上記の実施例３の熱処理方法で正常人と重症細菌性感染疾患の患者の尿のナノベシクルからＤＮＡをそれぞれ抽出した後、ＤＮＡ抽出キット（（株）バイオニア）およびＤＮＡ抽出化合物（フェノール／クロロホルム ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）を用いた場合と比べてＤＮＡ抽出量に差があるかを確認した。
その結果、図５に示すように、ＤＮＡ抽出キットを用いた場合にはＤＮＡがほとんど抽出されなく、フェノール／クロロホルム化合物でｅｘｔｒａｃｔｉｏｎした場合にはキットを用いた場合よりＤＮＡの抽出量が増加したが、実施例３の熱処理方法がＤＮＡの抽出量において他の方法に比べてはるかに優秀であることが分かった。
上記の実施例３の熱処理方法で正常人と重症細菌性感染疾患の患者の尿のナノベシクルからＤＮＡをそれぞれ抽出した後、ＤＮＡ抽出キット（（株）バイオニア）およびＤＮＡ抽出化合物（フェノール／クロロホルム ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）を用いた場合と比べてＤＮＡ抽出量に差があるかを確認した。
その結果、図５に示すように、ＤＮＡ抽出キットを用いた場合にはＤＮＡがほとんど抽出されなく、フェノール／クロロホルム化合物でｅｘｔｒａｃｔｉｏｎした場合にはキットを用いた場合よりＤＮＡの抽出量が増加したが、実施例３の熱処理方法がＤＮＡの抽出量において他の方法に比べてはるかに優秀であることが分かった。
実施例６：ナノベシクルの分離の有無による細菌由来のナノベシクルの分布の差異
ナノベシクルの分離の有無に他の細菌由来のナノベシクルの分布の差を比べるために、尿サンプルから分離されたナノベシクルに熱処理した後と、別のナノベシクルの分離なしに尿サンプルそのものに熱処理した後、それぞれＤＮＡを抽出して上記の実施例４の方法でメタゲノム解析を実施した。
その結果、図６および７に示すように、ナノベシクルの分離の有無と関係なく尿の熱処理群と細胞外ベシクルの熱処理群、すべて細菌由来のナノベシクルの分布が門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルと属（ｇｅｎｕｓ）レベルで類似することが分かった。
ナノベシクルの分離の有無に他の細菌由来のナノベシクルの分布の差を比べるために、尿サンプルから分離されたナノベシクルに熱処理した後と、別のナノベシクルの分離なしに尿サンプルそのものに熱処理した後、それぞれＤＮＡを抽出して上記の実施例４の方法でメタゲノム解析を実施した。
その結果、図６および７に示すように、ナノベシクルの分離の有無と関係なく尿の熱処理群と細胞外ベシクルの熱処理群、すべて細菌由来のナノベシクルの分布が門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルと属（ｇｅｎｕｓ）レベルで類似することが分かった。
実施例７：感染性心内膜炎の尿で熱処理方法で遺伝子を抽出して行ったメタゲノム解析
正常人と感染性心内膜炎（ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｅｎｄｏｃａｒｄｉｔｉｓ）患者の尿サンプル、各１０個に対して、上記の実施例３の熱処理方法で抽出した遺伝体を１６Ｓ ｒＤＮＡプライマーペア（配列番号１および２）でＰＣＲ増幅した後、上記の実施例４の方法でメタゲノム解析を行った。その結果、正常人に比べて感染性心内膜炎の患者の尿にはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属から由来するナノベシクルが６１％確実に増加されていることを確認した。
正常人と感染性心内膜炎（ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｅｎｄｏｃａｒｄｉｔｉｓ）患者の尿サンプル、各１０個に対して、上記の実施例３の熱処理方法で抽出した遺伝体を１６Ｓ ｒＤＮＡプライマーペア（配列番号１および２）でＰＣＲ増幅した後、上記の実施例４の方法でメタゲノム解析を行った。その結果、正常人に比べて感染性心内膜炎の患者の尿にはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属から由来するナノベシクルが６１％確実に増加されていることを確認した。
実施例８：腎臓炎の尿で熱処理方法で遺伝子を抽出して行ったメタゲノム解析
正常人と腎臓炎（ＡＰＮ）患者の尿サンプル、各１０個に対して、上記の実施例３の熱処理方法で抽出した遺伝体を１６Ｓ ｒＤＮＡプライマーペア（配列番号１および２）でＰＣＲ増幅した後、上記の実施例４の方法でメタゲノム解析を行った。その結果、正常人に比べて腎臓炎患者の尿にはＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ属に由来するナノベシクルが４６％確実に増加されていることを確認した。
正常人と腎臓炎（ＡＰＮ）患者の尿サンプル、各１０個に対して、上記の実施例３の熱処理方法で抽出した遺伝体を１６Ｓ ｒＤＮＡプライマーペア（配列番号１および２）でＰＣＲ増幅した後、上記の実施例４の方法でメタゲノム解析を行った。その結果、正常人に比べて腎臓炎患者の尿にはＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ属に由来するナノベシクルが４６％確実に増加されていることを確認した。
上記では本発明の望ましい実施例を参考に説明したが、該当技術分野で通常の知識を有する者であれば、下記の特許請求の範囲に記載された本発明の思想および領域から逸脱しない範囲内で、本発明を多様に修正および変更することができることを理解できるだろう。
Claims (14)
- 下記の（Ａ）〜（Ｃ）のステップを含む、細菌性重症感染疾患原因菌の同定方法：
（Ａ）細菌由来のナノベシクルを含有する患者サンプルからナノベシクル内の遺伝子を抽出するステップ；
（Ｂ）上記の抽出された遺伝子に対して配列番号１および２のプライマーペアを用いてＰＣＲを行うステップ；および
（Ｃ）上記のＰＣＲ結果物が正常人に比べて増加されている場合、細菌性重症感染疾患の原因菌が存在するものと判定するステップ：
ここで、上記のステップ（Ａ）で遺伝子を抽出するステップは、下記のステップを含む：
（ａ）患者サンプルを遠心分離して上澄み液を得た後、フィルターにより細菌および異物質を除去するステップ；
（ｂ）上記のフィルターにより細菌および異物質を除去した後、得た産物を遠心分離して濃縮するステップ；
（ｃ）上記の濃縮した産物を超高速遠心分離してナノベシクルペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を得るステップ；
（ｄ）上記のナノベシクルペレットを熱処理するステップ；および
（ｅ）上記の熱処理した産物を遠心分離して上澄み液を得るステップ。 - 上記の患者のサンプルは、尿、血液、口腔液、胃液、大便、鼻腔液、喀痰、皮膚洗浄液、胸膜液、腹膜液、関節液、脳脊髄液、羊水および膣洗浄液からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の同定方法。
- 上記のナノベシクル内の遺伝子は１６Ｓ ｒＤＮＡまたは１６Ｓ ｒＲＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の同定方法。
- 上記のナノベシクルは平均直径が１０−３００ｎｍであることを特徴とする、請求項１に記載の同定方法。
- 上記の細菌性重症感染疾患は、敗血症、副鼻腔炎、肺炎、結核、感染性心内膜炎、骨関節炎、骨髄炎、尿路感染、脳炎、脳膜炎および腎臓炎からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の同定方法。
- 上記の原因菌は、Ｓｋｅｒｍａｎｅｌｌａ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｋｏｃｕｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅおよびＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍからなる群より選ばれる多剤耐性菌であることを特徴とする、請求項１に記載の同定方法。
- 上記のステップ（ｄ）で熱処理は９０−１１０℃で５−３０分間行うことを特徴とする、請求項１に記載の同定方法。
- 下記の（Ａ）〜（Ｃ）のステップを含む、細菌性重症感染疾患の原因菌に対する抗生剤耐性の予測方法：（Ａ）細菌由来のナノベシクルを含有する患者サンプルからナノベシクル内の遺伝子を抽出するステップ；
（Ｂ）上記の抽出された遺伝子に対して配列番号１および２のプライマーペアを用いてＰＣＲを行うステップ；および
（Ｃ）上記のＰＣＲ結果物が正常人に比べて増加されている場合、細菌性重症感染疾患の原因菌に対して抗生剤反応性が低いと判定するステップ：
ここで、上記のステップ（Ａ）で遺伝子を抽出するステップは、下記のステップを含む：
（ａ）患者サンプルを遠心分離して上澄み液を得た後、フィルターにより細菌および異物質を除去するステップ；
（ｂ）上記のフィルターにより細菌および異物質を除去した後、得た産物を遠心分離して濃縮するステップ；
（ｃ）上記の濃縮した産物を超高速遠心分離してナノベシクルペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を得るステップ；
（ｄ）上記のナノベシクルペレットを熱処理するステップ；および
（ｅ）上記の熱処理した産物を遠心分離して上澄み液を得るステップ。 - 上記の患者のサンプルは、尿、血液、口腔液、胃液、大便、鼻腔液、喀痰、皮膚洗浄液、胸膜液、腹膜液、関節液、脳脊髄液、羊水および膣洗浄液からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項８に記載の予測方法。
- 上記のナノベシクル内の遺伝子は１６Ｓ ｒＤＮＡまたは１６Ｓ ｒＲＮＡであることを特徴とする、請求項８に記載の予測方法。
- 上記のナノベシクルは平均直径が１０−３００ｎｍであることを特徴とする、請求項８に記載の予測方法。
- 上記の細菌性重症感染疾患は、敗血症、副鼻腔炎、肺炎、結核、感染性心内膜炎、骨関節炎、骨髄炎、尿路感染症、脳炎、脳膜炎、および腎臓炎からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項８に記載の予測方法。
- 上記の原因菌は、Ｓｋｅｒｍａｎｅｌｌａ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｋｏｃｕｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅおよびＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍからなる群より選ばれる多剤耐性菌であることを特徴とする、請求項８に記載の予測方法。
- 上記の（ｄ）で熱処理は９０−１１０℃で５−３０分間行うことを特徴とする、請求項８に記載の予測方法。
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