ES2215126T3

ES2215126T3 - Procedimiento para la demostracion de helicobacter pylori y heilmanii.

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Publication number: ES2215126T3
Application number: ES01919280T
Authority: ES
Inventors: Franz Paul Immundiagnostik AG ARMBRUSTER; Katarina Crevar; Jana Ruppert
Original assignee: GANZIMMUN LABOR fur FUNKTIONEL; GANZIMMUN LABOR fur FUNKTIONELLE MEDIZIN AG; Immundiagnostik AG
Current assignee: GANZIMMUN LABOR fur FUNKTIONEL; GANZIMMUN LABOR fur FUNKTIONELLE MEDIZIN AG; Immundiagnostik AG
Priority date: 2000-02-14
Filing date: 2001-02-14
Publication date: 2004-10-01
Anticipated expiration: 2021-02-14
Also published as: CZ20023063A3; EP1257823B1; AU4643301A; DK1257823T3; DE10006432A1; DE50101435D1; CZ299992B6; JP4122419B2; US20030148411A1; WO2001063285A2; JP2003526779A; WO2001063285A3; ATE259065T1; EP1257823A2; US20070087395A1; AU2001246433B2; DE10190630D2

Abstract

Procedimiento para la demostración de organismos causantes de enfermedades en muestras de heces, saliva y secreciones mediante un ensayo de unión sándwich de doble anticuerpo caracterizado por la toma o dispersión de la muestra con antígeno del agente causal en una solución tampón y puesta en contacto de la solución tampón con una fase sólida a la que están ligados al menos dos anticuerpos primarios de los cuales uno se liga de manera específica a antígeno del agente causal y el otro a inmunoglobulina A humana; lavado de la fase sólida de las proteínas no ligadas específicamente y puesta en contacto de la fase sólida con un anticuerpo secundario que se liga de manera específica a antígeno del agente causal y determinación de la cantidad de anticuerpo secundario ligado de manera específica.

Description

Procedimiento para la demostración de helicobacter pylori y heilmanii.

La invención de refiere a un procedimiento para la demostración de antígenos de Helicobacter en muestras de heces y saliva o en material de biopsia.

La mucosa gástrica humana se encuentra frecuentemente colonizada por bacterias de los géneros Helicobacter pylori y heilmanii o Campylobacter. La infección con estas bacterias tiene lugar seguramente de persona a persona, pero tampoco se excluye el agua potable y los alimentos como fuentes de infección. La cepa Helicobacter heilmanii es transmitida por animales domésticos como gatos, perros, conejos, pero también por animales útiles como vacas. Por ello, las personas en la agricultura y en el cuidado de animales se encuentran especialmente afectadas por las infecciones. En Alemania aproximadamente el 10% de los escolares, el 30% de las personas de 30 años y aproximadamente el 75% de las personas de la tercera edad están infectadas con H. pylori. En todo el mundo, aproximadamente un 50% de las personas portan esta infección. El 80% de los trastornos gástricos, el 95% de los casos de úlcera de duodeno y el 70% de los casos de úlcera gástrica están provocados por H. pylori. Además, la gastritis crónica por H. pylori (Gastritis tipo B) se considera precancerosa para el adenocarcinoma de estómago y el linfoma gástrico. H. pylori es, según la OMS, un carcinógeno de máximo grado de riesgo de cáncer. Sólo una pequeña parte de las personas infectadas por H. pylori desarrollan síntomas. Muchos viven sin molestias dignas de mención a pesar de una gastritis o atribuyen las molestias más bien inespecíficas a otras causas. Una gastritis aguda por H. pylori se manifiesta a través de dolores indeterminados en el abdomen superior y medio, sensación de opresión y de plenitud, pirosis, ardor de estómago así como náuseas y arcadas. Para casi todos los pacientes con una gastritis tipo B se puede demostrar una infección por
H. pylori. A pesar de la, en la mayoría de los casos, masiva reacción inmunitaria, la infección en estos pacientes se vuelve crónica. Si se desarrolla una úlcera, depende del sistema inmunitario del paciente y de la agresividad de las bacterias, así como del tipo de cepa bacteriana. Las curaciones espontáneas son poco frecuentes. Por lo general, una infección por H. pylori perdura toda la vida si no se aplica una terapia.

Se puede diagnosticar una infección por H. pylori a través del cultivo del agente causante a partir de una biopsia del antro o del cuerpo o a través de un examen histiológico del tejido. Otros procedimientos de diagnóstico son el test CLO (Test del organismo similar a Campylobacter) o el test rápido de la ureasa, el test del aliento con isótopos de ^{13}C, la demostración de anticuerpos frente a H. pylori en el suero, la demostración por PCR del ADN de Helicobacter en una muestra de jugos gástricos o de heces y la demostración de antígenos de H. pylori en una muestra de heces.

Los documentos US 5 716 791 (Larka y col.) y EP 0 806 667 (Meridian Diagnostics Inc.) describen un inmunoensayo para antígenos de H. pylori en heces. El ensayo se basa en dos anticuerpos policlonales frente a antígeno de H. pylori purificados por afinidad. Además hay un test instantáneo de Connex GmbH, Martinsried, Alemania, que se basa en una cromatografía de flujo lateral de anticuerpos monoclonales frente a antígenos de H. pylori en heces marcados con oro. Estos tests conocidos como HpSA (Helicobacter pylori Stool Antigen) han dado como resultado en distintos estudios clínicos una buena concordancia con los casos diagnosticados de otro modo, pero un alto porcentaje de los exámenes no conduce a ninguna manifestación clara. El test HpSA es además inapropiado para el control de una terapia de erradicación, ya que sólo funciona en caso de cantidades abundantes de antígeno de H. pylori en heces. Los demás procedimientos de diagnóstico son en parte muy costosos, gravosos para el paciente o demasiado caros para exámenes de rutina. La desventaja de los procedimientos serológicos es que no permiten un control de la terapia, ya que los títulos de anticuerpos permanecen altos aun meses después de la erradicación de las bacterias. Pero un control de la terapia es esencial, ya que pueden existir resistencias frente a los antibióticos usados habitualmente en el tratamiento, como Claritromicina, Metronidazol, Amoxicilina, Omeprazol e inhibidores de la bomba de protones. La terapia de las infecciones mediante antibióticos y alternativas naturistas requiere por lo tanto un procedimiento simple, de confianza y sensible para el test de H. pylori.

Este objetivo se consigue mediante un inmunoensayo según la reivindicación 1. Las formas de realización preferentes de la invención se describen en las reivindicaciones subordinadas.

El procedimiento de acuerdo con la invención para la demostración de antígenos del agente causal Helicobacter en una muestra está caracterizado por la toma de una muestra humana para la investigación del agente causal y su suspensión en un tampón de muestra; la puesta en contacto del tampón de muestra con el antígeno del agente causal con una fase sólida, a la que están ligados al menos dos anticuerpos primarios distintos, de los cuales uno es capaz de ligarse a antígenos del agente causal y el otro a inmunoglobulina humana; lavado de la fase sólida de los antígenos ligados de manera inespecífica; puesta en contacto de la fase sólida con un anticuerpo secundario que reconoce de manera específica antígenos del agente causal y determinación de la cantidad de anticuerpos secundarios ligados.

La cantidad de anticuerpo secundario ligado a la fase sólida puede determinarse por ejemplo mediante un marcaje del anticuerpo. El marcaje puede ser radiactivo, un grupo luminiscente o fluorescente, un grupo como biotina, que puede ser ligado por otra molécula como estreptavidina, o un enzima como peroxidasa que cataliza una reacción de demostración. La cantidad de anticuerpo secundario ligado se puede determinar también mediante otro anticuerpo que reconoce de manera específica el tipo del anticuerpo secundario y lleva uno de los marcajes anteriormente mencionados.

El segundo anticuerpo primario frente a inmunoglobulina humana ligado a la fase sólida es preferentemente un anticuerpo que se liga a IgA humana y más preferentemente a IgA secretora humana que se secreta en la saliva y en el intestino grueso. La designación IgA secretora humana abarca aquí IgA humana y dado el caso también los llamados componentes secretores (PM: 70 kDa), que son producidos por las células epiteliales para el transporte y la protección de la IgA frente a los enzimas proteolíticos. Son especialmente preferentes los anticuerpos frente a IgA2, ya que Helicobacter y también otros microorganismos producen proteasas que disocian la IgAs. Mucho más preferente es una mezcla de dos anticuerpos primarios que se ligan de manera específica a IgA1 e IgA2.

En una forma de realización preferente de la invención el primer anticuerpo primario ligado a la fase sólida es un anticuerpo policlonal de conejo anti-H. pylori. El segundo anticuerpo primario ligado a la fase sólida es un anticuerpo policlonal de cabra anti-IgAs humana que ha sido examinado en cuanto a su reactividad cruzada. El anticuerpo secundario es un anticuerpo de conejo anti-H. pylori conjugado con biotina, de manera que la cantidad de anticuerpo secundario ligado puede determinarse mediante la unión de estreptavidina conjugada con peroxidasa y una reacción de color con tetrametilbencidina.

En una segunda forma de realización preferente, el primer anticuerpo primario ligado a la fase sólida es un anticuerpo de conejo anti-H. pylori, el segundo anticuerpo primario es un anticuerpo de conejo anti-IgAs humana y el anticuerpo secundario es un anticuerpo policlonal de cabra anti-H. pylori conjugado con peroxidasa de rábano picante. Pero también se pueden usar otras inmunoglobulinas de caballo, ternera, cerdo, oveja, cabra, conejo, conejillo de indias, rata, ratón o de otro animal. Hay que tener especial cuidado de que el segundo anticuerpo primario para inmunoblobulina humana no se ligue al anticuerpo secundario frente al antígeno del agente causal en la muestra de saliva o heces. Los anticuerpos pueden en principio ser monoclonales. Especialmente, el segundo anticuerpo primario puede ser un anticuerpo monoclonal frente a IgA2 humana. Se recomienda usar varios anticuerpos monoclonales que reconozcan distintos epítopos del agente causal o de las inmunoglobulinas humanas. En el caso de los anticuerpos primarios monoclonales se recomienda usar una mezcla de varios anticuerpos monoclonales para ampliar la especificidad del ensayo.

Los anticuerpos secundarios están preferentemente conjugados con uno o varios marcadores como biotina, fluoresceína, rutenio, europio, partículas de oro, fosfatasa alcalina, galactosidasa o peroxidasa de rábano picante. Pero también se pueden usar otros marcadores o sistemas de demostración adecuados.

Principio del test con el ejemplo de un ELISA

El ELISA (ensayo inmunoabsorbente con enzima conjugada) de acuerdo con la invención sirve para la determinación cualitativa y cuantitativa de antígeno de H. pylori en muestras de heces y saliva y material de biopsia. En un primer paso se libera el antígeno de H. pylori de la muestra y se liga mediante un anticuerpo policlonal preferente anti-H. pylori, que está ligado a una placa de microtitulación o a otra fase sólida de la manera habitual. En la fase sólida está además fijado un segundo anticuerpo primario que reconoce inmunoglobulina humana y preferentemente IgA secretora humana. Debido a que los antígenos de H. pylori en una muestra de heces o saliva han entrado en contacto con el sistema inmunitario del propio organismo humano, algunos o todos los epítopos de H. pylori fueron ya ligados por inmunoglobulinas humanas y ya no son accesibles para una unión mediante el primer anticuerpo primario frente al agente causal. Pero sin embargo, del segundo anticuerpo primario frente a inmunoglobulina humana se concentran y ligan en la fase sólida los antígenos del agente causal en la muestra de heces o saliva y material de biopsia aun cuando frente a estos exista ya una reacción inmune. Por un lado, se ligan antígenos de H. pylori directamente y por otro lado indirectamente a través de su unión a la inmunoglobulina secretora humana en la saliva o en el tracto gastrointestinal. En el segundo paso, el antígeno de H. pylori ligado se detecta entonces inmediatamente a través de los anticuerpos secundarios anti-H. pylori. Entonces se cuantifica por medio de un sistema adecuado la cantidad de anticuerpo secundario ligado.

Debido a la alta especificidad del anticuerpo secundario frente al antígeno de H. pylori se descartan dictámenes falsos positivos. Esto se debe a que la especificidad general de un ensayo con doble anticuerpo se determina esencialmente por la especificidad del anticuerpo secundario. El que en el primer paso de unión se liguen también anticuerpos secretores humanos con antígenos del agente causal aumenta en el caso de H. pylori no sólo la sensibilidad, sino también el ancho de banda del test. Sorprende de manera especial que aparentemente en un considerable número de casos todos los epítopos inmunógenos de H. pylori son reconocidos por la existente reacción inmune humana. Aparentemente, en los organismos Helicobacter el número de epítopos inmunógenos está limitado, por lo que los epítopos del agente causal reconocidos por el sistema inmunológico humano y por los anticuerpos primarios y secundarios animales del ensayo de unión de doble anticuerpo son frecuentemente idénticos. Esto se considera especialmente en el caso de una colonización de la cavidad bucal por H. pylori y para la fase tardía de una terapia de erradicación, en la que la reacción inmunitaria humana cubre la ahora reducida cantidad de epítopos de H. pylori que están todavía presentes en la muestra de heces o de saliva. Mediante el principio del test de acuerdo con la invención se pueden registrar cantidades pequeñas o enmascaradas de antígeno de H. pylori.

La presencia de Helicobacter pylori en saliva provocó hasta la fecha solamente interés científico respecto a la supuesta vía de transmisión. (Navamar F. y col., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 1995, 14(3), pág. 234-7; Shimada T. y col., Lancet, 1994, 343(8913), pág. 1636-7). Mediante el procedimiento de acuerdo con la invención se establece un límite inferior de demostración para H. pylori tan bajo que un examen de la saliva permite también el diagnóstico de una infección por H. pylori. Especialmente para el control de la terapia es importante examinar la saliva del paciente en cuanto a antígenos de H. pylori. Las investigaciones de la solicitante dieron como resultado que en la cavidad bucal -supuestamente bajo los sellados metálicos y las prótesis dentales, etc- se pueden encontrar nidos de infección de H. pylori que pueden sobrevivir a una terapia medicamentosa tradicional de erradicación y tras la conclusión de la terapia conducen a una nueva infestación de la mucosa gástrica. Por tanto, una terapia de erradicación sólo se puede considerar terminada si tanto en la muestra de heces como en la muestra de saliva no se pueden demostrar más antígenos de H. pylori.

El principio del test sándwich de acuerdo con la invención con un segundo anticuerpo primario frente a inmunoglobulina humana, especialmente frente a IgA secretora humana, no está limitado al uso de una placa de microtitulación. Se puede adaptar a procedimientos totalmente automatizados que trabajan con cuentas o partículas revestidas. El principio de acuerdo con la invención con un segundo anticuerpo primario frente a IgA humana secretora es adecuado en general para el diagnóstico de agentes causales que se establecen en la cavidad bucal o en el tracto gastrointestinal y provocan una reacción inmunitaria masiva.

En general se prefiere que el primer anticuerpo primario sea un pool de anticuerpos policlonales frente a diferentes cepas de H. pylori. Esto se considera también para el anticuerpo secundario, ya que esto mejora la seguridad del test.

La invención y sus ventajas se describen ahora con formas de realización preferentes, ejemplos y respecto a los dibujos adjuntos. Muestra:

Fig. 1 un esquema del principio del inmunoensayo para el antígeno de H. pylori de acuerdo con la invención.

Fig. 2 otra forma de realización del inmunoensayo de acuerdo con la invención

Fig. 3 representación gráfica de la concentración de antígeno de H. pylori determinada según la invención en saliva antes y después de un tratamiento de erradicación.

Ejemplo 1 Demostración de antígeno de H. pylori en heces y saliva

Preparación de la muestra de heces: Se pesaron aproximadamente 100 mg de heces y se dispersaron a temperatura ambiente en 5 ml de tampón de lavado PBS con 0,1% de Tritón X-100 (Na_{2}HPO_{4} 8 mM, K_{2}H_{2}PO_{4} 15 mM, KCl 3 mM, NaCl 12,5 mM, Tritón X-100 0,1%, timerosal 0,02%, pH 7,4). La dosificación y homogeneización de las muestras de heces tuvo lugar preferentemente con un sistema de preparación de muestras de Roche Diagnostik, Mannheim, Alemania (Número de pedido 745804). El homogeneizado se centrifugó en una centrífuga de mesa durante 10 minutos a 3000 rpm, se llevó 1 ml de sobrenadante a un tubo Eppendorf y se centrifugó en una centrífuga para tubos Eppendorf durante 5 minutos a 13000 rpm. El sobrenadante se empleó directamente en el test de ELISA.

Preparación de la muestra de saliva: Las muestras de saliva se diluyeron 1:4 o 1:5 según la viscosidad en tampón de ensayo e inmediatamente se emplearon en el ensayo de unión. En las muestras de saliva es ventajoso si el tampón de ensayo contiene un inhibidor de proteasa, como por ejemplo PMSF 5 mM. También se pueden usar inhibidores de proteasa comerciales como Pefabloc SC (Roche Diagnostics).

Revestimiento de la placa de microtitulación: Las cavidades de una placa de microtitulación se revistieron con anticuerpos policlonales frente a antígeno de H. pylori e inmunoglobulina A humana. Aquí se puso en cada cavidad 100 \mug de anticuerpos policlonales comerciales de conejo anti-H. pylori (DAKO, Hamburgo), se disolvió en 200 \mul de NaCO_{3} 60 mM, pH 9,6 y la placa se incubó toda la noche a 4 ºC. Se retiró la solución de anticuerpos de conejo anti-H. pylori de las cavidades y cada cavidad se lavó con 200 \mul de tampón de lavado (PBS, pH 7,4 con Tritón X-100 0,1%). Entonces se puso en cada cavidad 100 \mug de anticuerpos de conejo anti-IgAs humana (DAKO, Hamburgo), se disolvió en 200 \mul de NaCO_{3} 60 mM, pH 9,6 y la placa se incubó una hora a temperatura ambiente. Se retiró la solución de anticuerpos anti-IgA humana de las cavidades y cada cavidad se lavó nuevamente 5 veces con 250 \mul de tampón de lavado cada vez. Tras el último lavado se cubrieron las cavidades de la placa de microtitulación con papel absorbente.

Ensayo de unión: Todas las determinaciones tuvieron lugar de forma doble. Se pipeteó 100 \mul de estándar y de muestra de forma doble en las cavidades de microtitulación revestidas de anticuerpos y se incubó una hora bajo agitación a temperatura ambiente. Se retiraron las soluciones y se lavaron las cavidades de la placa 5 veces con 250 \mul de tampón de lavado cada vez. Tras el último lavado se dejó secar la placa de microtitulación sobre papel absorbente.

Determinación de la unión: En cada caso se diluyó 1:1000 en tampón de lavado 100 \mul de anticuerpos policlonales de conejo anti-H. pylori conjugados con biotina (1:10000; de DAKO, Hamburgo) o anticuerpos policlonales de cabra anti-H. pylori conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (KPL, Kirkegaard and Perry Laboratoires, Gaithersburg, Maryland; una mezcla de anticuerpos policlonales frente a las cepas de H. pylori ATCC 43504, 43526, 43579), se puso en las cavidades y se incubó a temperatura ambiente durante una hora bajo agitación. La solución se retiró de las cavidades y cada cavidad se lavó 5 veces con 200 \mul de tampón de lavado cada vez.

Determinación cuantitativa: Para la reacción de color, en el caso de los anticuerpos de cabra anti-H. pylori conjugados con peroxidasa de rábano picante se puso en las cavidades 100 \mul de solución de sustrato de tetrametilbenzidina (TMB) (listo para el uso de NOVUM Diagnostika GmbH, Dietzenbach, Alemania) y después de aproximadamente 20 minutos se detuvo el desarrollo de color mediante la adición de 50 \mul de H_{2}SO_{4} 0,4 M. En el caso del anticuerpo de conejo anti-H. pylori acoplado a biotina se aplicó 100 \mul de estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (DAKO) diluida 1:10000 en tampón de lavado, se incubó una hora a temperatura ambiente bajo agitación, se lavó cinco veces con tampón de lavado y hasta ese momento no se adicionó el cromógeno. Se determinó el desarrollo de color siempre mediante la medición de la extinción a 450 nm. Las tablas 1 y 2 siguientes muestran resultados representativos de pacientes sanos e infectados por H. pylori, en los que las determinaciones de acuerdo con la invención se repitieron durante distintos días. Las determinaciones tuvieron lugar como se explica, con distintos sistemas de demostración y anticuerpos secundarios.

Ejemplo comparativo 2

Inmunoensayo sin segundo anticuerpo frente a inmunoglobulina A humana

Las preparaciones de las muestras de heces y saliva y del ensayo de unión tuvieron lugar exactamente como en el ejemplo 1, solo que las cavidades correspondientes de la placa de microtitulación se revistieron exclusivamente con inmunoglobulina policlonal de conejo frente a Helicobacter pylori purificada por afinidad o con anticuerpos de conejo anti-IgAs humana. Todos los pasos de lavado, revestimiento y unión así como los desarrollos de color tuvieron lugar de forma paralela en la misma placa de microtitulación.

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Discusión

Las tablas 1 y 2 muestran que en algunos pacientes los antígenos de H. pylori existentes en la muestra de heces fueron totalmente enmascarados por el sistema inmunitario del propio organismo y por ello no pudieron ser ligados por anticuerpos primarios analíticos frente al agente causal. En el caso de un enmascaramiento tal de los antígenos, un inmunoensayo tradicional de doble anticuerpo conduce al resultado equivocado de que no existe o de que ya no existe infección por H. pylori. En el procedimiento de acuerdo con la invención, por el contrario, los antígenos de H. pylori ya ligados o enmascarados por el sistema inmunitario humano fueron ligados a la fase sólida por un segundo anticuerpo primario anti-IgAs humana (ver tabla 2, casillas coloreadas de gris). El efecto de enmascaramiento no dependía del anticuerpo secundario usado, y tampoco de si la muestra se trataba de saliva o de heces. Además, los resultados sugieren que las uniones primarias de H. pylori a la fase sólida mediante anticuerpos anti-IgAs humana o anticuerpos anti-H. pylori en muchos casos se excluyen mutuamente, que también había una clara situación de "un caso u otro" respecto a la unión. La posible unión primaria de los antígenos de H. pylori a la fase sólida mediante la unión a inmunoglobulina A humana es así pues un componente esencial del diagnóstico de acuerdo con la invención.

Ejemplo 3 Examen en serie de saliva

De 150 pacientes con sospecha de una infección por H. pylori o tras una terapia de erradicación realizada se tomó una muestra de saliva y se examinó en cuanto a la presencia de antígeno de H. pylori. El análisis tuvo lugar como se explica en el ejemplo 1 con la excepción de que el tampón de ensayo contenía además un inhibidor de proteasa. En los sistemas de test existentes descritos (con anticuerpos de cabra anti-H. pylori conjugados con HRP y con tetrametilbencidina) el límite de demostración para antígeno de Helicobacter en saliva está en aproximadamente 2 pg de antígeno de H. pylori por mililitro de tampón de ensayo. Mediante la optimización del segundo anticuerpo seleccionado frente al antígeno del agente causal y la elección de un sistema de detección luminiscente deberían alcanzarse límites de demostración de 0,2 pg de antígeno por mililitro e inferiores.

El resultado del examen en serie se resume en la figura 3 en un gráfico de barras. El diagrama de barras muestra que los pacientes con una infección por H. pylori existente poseen en saliva por lo general más de 60 ng/ml de antígenos de H. pylori. El examen de saliva es, por tanto, apropiado para la demostración de una infección por H. pylori existente. Concentraciones de antígeno de H. pylori por debajo de 25 ng por ml de saliva indican por el contrario una reacción inespecífica cruzada con otro agente causal.

Con ello se adujo por primera vez la prueba de que se puede demostrar una infección por H. pylori mediante un examen inmunológico de saliva comparativamente sencillo de llevar a cabo. Así también se puede seguir de cerca el éxito de una terapia de erradicación de forma comparativamente sencilla. Por el contrario, el análisis de la saliva en cuanto a H. pylori realizado hasta ahora, no permitía el diagnóstico de una infección por H. pylori del tracto gastrointestinal, sino que se basaba en una investigación científica de la posible vía de transmisión.

Claims

1. Procedimiento para la demostración de organismos causantes de enfermedades en muestras de heces, saliva y secreciones mediante un ensayo de unión sándwich de doble anticuerpo caracterizado por

la toma o dispersión de la muestra con antígeno del agente causal en una solución tampón y puesta en contacto de la solución tampón con una fase sólida a la que están ligados al menos dos anticuerpos primarios de los cuales uno se liga de manera específica a antígeno del agente causal y el otro a inmunoglobulina A humana;

lavado de la fase sólida de las proteínas no ligadas específicamente y puesta en contacto de la fase sólida con un anticuerpo secundario que se liga de manera específica a antígeno del agente causal y determinación de la cantidad de anticuerpo secundario ligado de manera específica.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el segundo anticuerpo primario se liga a IgA humana secretora.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el segundo anticuerpo primario se liga a IgA2 humana secretora.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo secundario está conjugado con un grupo seleccionado entre biotina, fluoresceína, rutenio, europio, partículas de oro, fosfatasa alcalina, galactosidasa y peroxidasa de rábano picante.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el primer anticuerpo primario y el anticuerpo secundario se ligan a antígenos de Helicobacter pylori.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el primer anticuerpo primario es una mezcla de anticuerpos policlonales y/o monoclonales frente a diferentes cepas de Helicobacter pylori.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el anticuerpo secundario es una mezcla de anticuerpos policlonales y/o monoclonales frente a diferentes cepas de Helicobacter pylori.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el agente causal es Campylobacter.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el agente causal es Helicobacter heilmanii.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el agente causal provoca una reacción inmunitaria masiva en el cuerpo humano.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes 1 a 10 para el diagnóstico de agentes causales que permanecen en la cavidad bucal tras una terapia medicamentosa de erradicación.