ES2589606T3

ES2589606T3 - Procedimiento para la detección y para la identificación de una cepa de C. difficile variante en una muestra

Info

Publication number: ES2589606T3
Application number: ES09776017.7T
Authority: ES
Inventors: Christoph Von Eichelstreiber; Michael Moos; Karina Gisch; Veit Braun
Original assignee: BIODICS GmbH
Current assignee: BIODICS GmbH
Priority date: 2009-07-27
Filing date: 2009-07-27
Publication date: 2016-11-15
Anticipated expiration: 2029-07-27
Also published as: CA2768528C; CA2768528A1; JP5591332B2; CN102482331A; AU2009350614B2; EP2459588B1; EP2459588A1; WO2011012098A1; CN102482331B; JP2013500479A; AU2009350614A1

Abstract

Procedimiento in vitro para la detección y para la identificación de una cepa de C. difficile variante, productora de LCT, virulenta en una muestra, caracterizado por las siguientes etapas de procedimiento: (a) poner en contacto una muestra de excreción o secreción corporal y/o de tejido corporal con en cada caso al menos un anticuerpo de al menos tres de los grupos de anticuerpos grupo I, grupo II, grupo III, grupo IV, grupo V y grupo VI, en el que el grupo I comprende los siguientes anticuerpos: anticuerpo monoclonal 2CV (DSM ACC 2321), anticuerpo monoclonal TGC 35 (DSM ACC2918) y anticuerpos pan-TcdB, el grupo II comprende los siguientes anticuerpos: anticuerpos monoclonales TGC23 (DSM ACC2917) y anticuerpos que reaccionan con las toxinas TcdB-10463 y TcdB-017, pero no con las toxinas TcdB-8864 y TcdB-027, el grupo III comprende los siguientes anticuerpos: anticuerpos monoclonales TGC41 (DSM ACC2919) y anticuerpos que reaccionan con TcdB-10463, pero no con las toxinas TcdB-8864, TcdB-017 y TcdB-027, el grupo IV comprende los siguientes anticuerpos: anticuerpos monoclonales TGC 16 (DSM ACC2915) y anticuerpos que reaccionan con las toxinas TcdB-8864, TcdB-017 y TcdB-027, pero no con la toxina TcdB- 10463, el grupo V comprende los siguientes anticuerpos: anticuerpos monoclonales TGC 19 (DSM ACC2916) y anticuerpos que reaccionan con las toxinas TcdB-8864 y TcdB-027, pero no con las toxinas TcdB-10463 y TcdB-017, el grupo VI comprende los siguientes anticuerpos: anticuerpos monoclonales TTC8 (DSM ACC 2322) y anticuerpos pan-TcdA; y en el que se cumple que: TcdB-10463 representa la toxina B de la cepa de C. difficile VPI-10463, TcdB-8864 representa la toxina B de la cepa de C. difficile 8864, TcdB-017 representa la toxina B de cepas de C. difficile con el ribotipo 017, en particular para la toxina B de la cepa de C. difficile 1470, TcdB-027 representa la toxina B de cepas de C. difficile con el ribotipo 027, en particular para la toxina B de la cepa de C. difficile 7002/8 (b) detectar la reacción de anticuerpo y crear el patrón de reacción, en el que a cada anticuerpo utilizado en (a) de cada grupo de anticuerpos I a VI se asocia un símbolo positivo (por ejemplo "+") para una reacción de anticuerpo positiva detectada y un símbolo negativo (por ejemplo "-") para una reacción de anticuerpo negativa detectada, y (c) comparar el patrón de reacción obtenido en (b) con patrones de referencia de modo que de las cepas de C. difficile Rx1, Rx2, Rxi conocidas en el estado de la técnica y que se examinan en la prueba de detección para determinar su presencia se utiliza al menos una de sus toxinas clostridiales grandes respectivas (LCT) LCT-Rx1, LCT-Rx2, LCT-Rxi en una prueba de reacción con los anticuerpos seleccionados en la etapa (a) de los al menos tres de los grupos de anticuerpos I a VI, y de modo que los resultados de reacción obtenidos para cada LCT y los al menos tres de los grupos de anticuerpos I a IV se registran a modo de patrón de tal manera que a cada grupo de anticuerpos se asocia o bien un símbolo positivo (por ejemplo "+") en el caso de una reacción de anticuerpo positiva detectada o un símbolo negativo (por ejemplo "-") en el caso de una reacción de anticuerpo negativa detectada, (d) evaluar una coincidencia entre el patrón de reacción obtenido en (b) con un patrón de referencia como indicio de que en la muestra está presente la cepa de C. difficile del patrón de referencia en cuestión.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento para la deteccion y para la identificacion de una cepa de C. difficile variante en una muestra

Clostridium difficile es una bacteria en forma de bastoncillo Gram positiva, obligatoriamente anaerobica con una longitud de 3-6 |jm y una anchura de aproximadamente 0,5 jm. El genero Clostridium pertenece a la familia de los Bacillaceae. El descubrimiento de C. difficile como un germen patogeno importante de la colitis asociada a antibioticos tuvo lugar a finales de los anos 70. El nombre C. difficile tiene su origen en el crecimiento lento en el cultivo y el dificil aislamiento de la bacteria. Sobre placas de agar sangre complementadas crecen grandes colonias, traslucidas de color gris sin hemolisis. Como todos los clostridios, C. difficile tiene la capacidad de formacion de esporas. De esta manera, las bacterias pueden sobrevivir tambien en condiciones medioambientales extremas.

Los adultos sanos portan hasta el 2-7 % de C. difficile en el tracto gastrointestinal. Durante una terapia con antibioticos se altera el efecto protector de la flora fisiologica y puede producirse un crecimiento excesivo de C. difficile en el intestino. La enfermedad asociada con Clostridium-difficile (CDAD) resultante de esto varia en cuanto a su grado de gravedad en funcion de la virulencia de la cepa de C. difficile presente. El cuadro clinico va desde una ligera diarrea hasta una colitis pseudomenbranosa grave con fiebre y dolores de tripa de tipo calambre y el riesgo de complicaciones graves tales como perforacion de colon, septicemia y megacolon toxico. Como factores de virulencia sirven en primer lugar una enterotoxina (toxina A) y una zitotoxina (toxina B). Las toxinas pertenecen a la familia de las toxinas clostridiales grandes (LCT, Large clostridial toxins) y tienen una actividad glicosiltransferasa. Ademas, algunas cepas tienen los genes para la toxina binaria CDT (ADp-ribosiltransferasa), que se discute como factor de virulencia adicional.

En el caso de las cepas de C. difficile se diferencia entre las denominadas cepas convencionales y sus variantes. Como cepas de C. difficile convencionales se denominan por regla general cepas del toxinotipo 0. Entre ellas figuran cepas con diferentes ribotipos, por ejemplo 001, 003 y 012. Las cepas del toxinotipo 0 se caracterizan por la presencia de los genes para las dos toxinas A y B, por el contrario faltan los genes para la toxina binaria.

En los ultimos anos se mostro que ademas de las cepas de C. difficile convencionales tambien existe una pluralidad de diferentes cepas de C. difficile variantes, que tienen una significancia clinica creciente y tambien se detectaron en animales domesticos (en particular perros, gatos) y animales utiles (en particular terneros y cerdos).

De este modo, desde 2003 en Canada, Los EE.UU., Gran Bretana y muchos otros paises de Europa, se observaron infecciones endemicas, a menudo clinicamente graves con cepas de C. difficile variantes.

Las cepas de C. difficile variantes aisladas en relacion con estas infecciones clinicamente graves tienen tanto los genes para las toxinas A (tcdA) y B (tcdB) como los genes para la CDT y presentan deleciones parciales en su regulador tcdC.

Estas cepas de C. difficile de alta virulencia del ribotipo PCR 027, toxinotipo III, REA-B1 y PFGE NAP1 tienen en el regulador tcdC una delecion de 18 pb y un desplazamiento del marco en la posicion 117, lo que se supone como causa para su produccion de toxinas aumentada detectada in vitro y como un motivo para su virulencia elevada. Estas cepas se caracterizan ademas por que, en comparacion con el resto de las cepas de C. difficile presentan proteinas de superficie modificadas y una adherencia elevada a las celulas epiteliales intestinales humanas. Ademas, estas cepas son resistentes frente a antibioticos de la clase de principios activos fluoroquinolonas y frente al antibiotico eritromicina, presuntamente debido a mutaciones en los genes para gyrA/ B y el 23sRNA.

En adelante, estas cepas de C. difficile de alta virulencia se denominan con la abreviatura "C.d.-027-hv".

Hasta la fecha, la mayoria de los pacientes afectados por una infeccion con C. difficile eran mayores de 60 anos, C.d.-027-hv se detecta tambien en pacientes mas jovenes y tambien fuera de hospitales en pacientes con un riesgo hasta ahora bajo. Su letalidad esta elevada por quintuplicado con respecto a las cepas de C. difficile detectadas hasta la fecha.

Otro grupo de cepas de C. difficile variantes, clinicamente relevantes, se clasifica como ribotipo 017, toxinotipo VIII y serotipo F. Estas cepas se caracterizan esencialmente por que presentan una delecion de 1,7 kB de tamano en el gen tcdA y no expresan ninguna toxina A debido a un codon de parada prematuro. Las cepas presentan una resistencia a antibioticos contra clindamicina y fluoroquinolonas, faltan los genes para la toxina binaria CDT, y ademas el regulador tcdC no presenta ninguna delecion. Una aparicion frecuente de tales cepas se informa, entre otros, desde Los EE.UU., Japon, Israel, Irlanda y Los Paises Bajos. La mortalidad en pacientes con infecciones de este tipo se encuentra con un 14-66 % por encima de la de las cepas convencionales.

En adelante estas cepas de C. difficile de alta virulencia se conocen con la abreviatura "C.d.-017-hv".

La deteccion diagnostica de C. difficile tiene lugar habitualmente a traves de la deteccion de la toxina A, en algunos casos tambien a traves de la deteccion combinada de toxina A y B. Una deteccion de cepas de C. difficile variantes

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no es posible con este procedimiento. Las cepas variantes o bien no se detectan en absoluto (cepas negativas para toxina A) o bien no se detectan por separado.

Para la identificacion y caracterizacion de cepas de C. difficile variantes es necesario tipificarlas. Los procedimientos para la tipificacion de C. difficile son conocidos en el estado de la tecnica, por ejemplo la toxinotipificacion, la serotipificacion, la ribotipificacion o las tipificaciones por medio de PFGE o REA. Sin embargo, todos estos procedimientos requieren mucho trabajo y tiempo, pueden llevarse a cabo solo por laboratorios especializados y requieren por adelantado el aislamiento costoso de las cepas de C. difficile en cuestion.

Para la identificacion exacta de cepas de C. difficile especificas se requieren ademas, en la mayoria de los casos, tambien ensayos adicionales, tales como por ejemplo en el caso de C.d.-027-hv la deteccion de la resistencia a antibioticos y la delecion en el gen tcdC.

En la practica de laboratorio se procede, por lo tanto, por ejemplo en un ensayo con respecto a una presencia de C.d.-027-hv tal como sigue:

1. deteccion de C. difficile en general mediante deteccion de las toxinas A y/o B, en las heces de los pacientes por medio de inmunoensayo,

2. cuando es positiva: cultivo de las bacterias C. difficile a partir del material de ensayo,

3. en el caso de un aislamiento satisfactorio de las bacterias: someter a ensayo la presencia de la eritromicina y la resistencia a moxifloxacina en la prueba E,

4. en el caso de una deteccion de resistencia positiva: someter a ensayo la presencia del ribotipo 027 por medio de preparacion de ADN y amplification por PCR del gen de ARN ribosomico (ribotipificacion) [Figura 1],

5. en el caso de una deteccion positiva del ribotipo 027: genotipificacion parcial para la deteccion de los genes de toxina tcdA y tcdB, de los genes cdtA/B para la toxina binaria CDT y las deleciones en el regulador tcdC,

6. en el caso de la presencia de ambas resistencias a antibioticos sometidos a ensayo y todas las caracteristicas del patron genotipico caracteristico: Diagnostico de una cepa de C. difficile hipervirulenta ribotipo 027 (C.d-027- hv).

Una desventaja de esta practica de laboratorio hasta el momento, que tiene igual complejidad para otras cepas de C. difficile variantes y de alta virulencia, consiste sobre todo en que requiere mucho tiempo: para el aislamiento y el cultivo del germen, la determination de la resistencia a antibioticos y la ribotipificacion existe un tiempo requerido de 7-10 dias.

Para una optima vigilancia de infection con el objetivo de impedir infecciones nosocomiales (infecciones hospitalarias) y controlar brotes infecciosos, ambos tanto para la protection de los pacientes y del personal como por motivos de ahorro de costes, en cambio, los procedimientos de identificacion deben ser sobre todo rapidos y lo mas precisos posibles.

La presente invention se basa por lo tanto en el objetivo de proporcionar un procedimiento para la deteccion y la identificacion rapidas y seguras de cepas de C. difficile variantes en una muestra, en particular una muestra de un paciente (de un paciente humano o animal).

Los problemas a resolver en el transcurso de este objetivo consisten en particular en que, (i) las toxinas de las distintas cepas de C. difficile no se diferencia por una unica region, (ii) no es trivial generar anticuerpos especificos frente a las LCT de una determinada cepa de C. difficile (la UE financia por ejemplo un programa de investigation especial n.° 37870, acronimo "EACCAD", que se ocupa de la investigacion de las cepas C.d.-027-hv y tiene como objetivo, entre otros, la generation de anticuerpos de este tipo frente a las LCT de C.d.-027-hv), (iii) la toxina binaria CDT tambien se forma por otras cepas de C. difficile, y (iv) no pueden detectarse mutaciones en determinados genes, tales como por ejemplo tcdC, por regla general inmunologicamente en muestras de heces.

Una solution para este objetivo consiste en la provision de un procedimiento que se caracteriza por las siguientes etapas:

(a) obtener una muestra de excretion o secretion corporal y/o de tejido corporal de un paciente humano o animal

(b) poner en contacto la muestra con en cada caso al menos un anticuerpo de al menos tres de los grupos de anticuerpos grupo I, grupo II, grupo III, grupo IV, grupo V y grupo VI, en el que

el grupo I el grupo II

el grupo III

el grupo IV

el grupo V

comprende los siguientes anticuerpos: anticuerpos anti pan-TcdB,

comprende los siguientes anticuerpos: anticuerpos que reaccionan con las toxinas TcdB-10463 y TcdB-017, pero no con las toxinas TcdB-8864 y TcdB-027,

comprende los siguientes anticuerpos: anticuerpos que reaccionan con TcdB-10463, pero no con las toxinas TcdB-8864, TcdB-017 y TcdB-027,

comprende los siguientes anticuerpos: anticuerpos que reaccionan con las toxinas TcdB-8864, TcdB-017 y TcdB-027, pero no con la toxina TcdB-10463,

comprende los siguientes anticuerpos: anticuerpos que reaccionan con las toxinas TcdB-8864 y

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TcdB-027, pero no con las toxinas TcdB-10463 y TcdB-017, el grupo VI comprende los siguientes anticuerpos: anticuerpos anti pan-TcdA

(c) detectar la reaccion de anticuerpo y crear el patron de reaccion, en el que a cada anticuerpo utilizado en (b) de cada grupo de anticuerpos I a VI se asocia un simbolo positivo (por ejemplo "+") para una reaccion de anticuerpo positiva detectada y un simbolo negativo (por ejemplo "-") para una reaccion de anticuerpo negativa detectada, y

(d) comparar el patron de reaccion obtenido en (c) con patrones de referencia, que se obtienen por que de las cepas de C. difficile Rxi, Rx2, Rxi conocidas en el estado de la tecnica y que se examinan en la prueba de deteccion para determinar su presencia al menos una de las o de sus toxinas clostridiales grandes respectivas LCT-Rxi, LCT-Rx2, LCT-Rxi se utiliza en una prueba de reaccion con los anticuerpos seleccionados en la etapa (b) de los al menos tres de los grupos de anticuerpos I a VI, y por que los resultados de reaccion obtenidos para cada LCT y los al menos tres de los grupos de anticuerpos I a VI se detectan a modo de patron o se registran o se representan, de tal manera que a cada grupo de anticuerpos se asocia o bien un simbolo positivo (por ejemplo "+") en el caso de una reaccion de anticuerpo positiva detectada o bien un simbolo negativo (por ejemplo "-") en el caso de una reaccion de anticuerpo negativa detectada,

(e) evaluar una coincidencia entre el patron de reaccion obtenido en (c) con un patron de referencia como indicio de que en la muestra esta presente la cepa de C. difficile del patron de referencia en cuestion.

En este sentido y en lo sucesivo significan:

LCT: Large Clostridial Toxin (toxina clostridial grande), en concreto toxina A y/o toxina B de C. difficile TcdB-10463: toxina B de la cepa de C. difficile VPI-10463 (= "toxina convencional")

TcdB-8864: toxina B de la cepa de C. difficile 8864 TcdB-1470: toxina B de la cepa de C. difficile 1470 TcdB-7002/8: toxina B de la cepa de C. difficile 7002/8 TcdB-017: toxina B de cepas de C. difficile con el ribotipo 017 TcdB-027: toxina B de cepas de C. difficile con el ribotipo 027

anticuerpo anti pan TcdA: anticuerpo que reconoce las proteinas TcdA de todas las cepas patogenas de C. difficile (por ejemplo TTC8)

• anticuerpo anti pan TcdB: anticuerpo que reconoce las proteinas TcdB de todas las cepas patogenas de C. difficile (por ejemplo 2CV, TGC35)

La ensenanza del procedimiento de acuerdo con la invencion se basa en el conocimiento sorprendente de que

(1.) los anticuerpos dirigidos frente a las LCT de C. difficile, en concreto frente a la toxina A o toxina B pueden dividirse en seis grupos, que se caracterizan tal como sigue:

grupo I = grupo II =

grupo III =

grupo IV =

grupo V =

grupo VI =

anticuerpos anti pan-TcdB TGC35 (DSM ACC 2918) y 2CV (DSM ACC 2321) y anticuerpos que tienen igual funcion y efecto que TGC35 y/o 2CV;

anticuerpos que reaccionan con la toxina convencional TcdB-10463 y la TcdB-017 variante, pero que no reaccionan con las toxinas variantes TcdB-8864 y TcdB-027, en particular anticuerpos TGC23 (DSM ACC2917) y con ello anticuerpos de igual funcion y efecto;

anticuerpos que reaccionan con la toxina convencional TcdB-10463, pero no con las toxinas variantes TcdB-8864, TcdB-017 y TcdB-027, en particular anticuerpos TGC41 (DSM ACC2919) y con ello anticuerpos de igual funcion y efecto;

anticuerpos que reaccionan con las toxinas variantes TcdB-8864 y TcdB-017 y TcdB-027, pero no con la toxina convencional TcdB-10463, en particular anticuerpos TGC16 (dSm ACC2915) y con ello anticuerpos de igual funcion y efecto;

anticuerpos que reaccionan con las toxinas variantes TcdB-8864 y TcdB-027, pero no con la toxina convencional TcdB-10463 y la TcdB-017 variante, en particular anticuerpos TGC19 (DSM ACC2916) y con ello anticuerpos de igual funcion y efecto;

anticuerpos anti pan-TcdA que reaccionan con las proteinas TcdA de todas las cepas patogenas de C. difficile, en particular anticuerpos TTC8 (DSM ACC 2322) y con ello anticuerpos de igual funcion y efecto (tal como el anticuerpo PCG4 descrito en el documento US 4879218);

y

(2.) las cepas de C. difficile variantes virulentas conocidas hasta el momento o sus LCT muestran en cada caso un patron de reaccion caracteristico con los anticuerpos de estos seis grupos - y en particular su toxina B con los anticuerpos de los cinco grupos I a V, que se diferencia de los patrones de reaccion de las toxinas de otras cepas de C. difficile variantes (altamente) virulentas y de los patrones de reaccion de las toxinas de cepas convencionales de C. difficile.

Por ejemplo, la cepa de C. difficile variante de alta virulencia C.d.-027-hv se caracteriza por el patron de reaccion "+-++ +" en el orden de los grupos I, II, III, IV, V, VI, mientras que la cepa de C. difficile asi mismo de alta virulencia

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C.d.-017-hvse caracteriza por el patron de reaccion "++-+--" (as^ mismo en el orden de los grupos I, II, III, IV, V, VI). Para la identification y detection de las distintas cepas de C. difficile variantes virulentas conocidas hasta el momento y relevantes desde el punto de vista diagnostico son necesarios y suficientes por regla general en cada caso al menos un anticuerpos de al menos tres grupos de anticuerpos distintos. Por ejemplo, para la diferenciacion de la cepa de C. difficile C.d.-027-hv de las cepas de C. difficile variantes relevantes restantes y de las cepas convencionales de C. difficile es suficiente el patron de reaccion de los tres grupos II, IV y VI, en concreto "-++" (en el orden de los grupos II, IV, VI), para la diferenciacion o identificacion de la cepa de C. difficile C.d.-017-hv es suficiente el patron de reaccion de los tres grupos II, IV y VI, en concreto "+ +-" (asi mismo en el orden de los grupos II, IV, VI).

El procedimiento de acuerdo con la invention va acompanado en particular de las siguientes ventajas:

directamente por medio de la muestra de heces mediante una prueba que puede llevarse a cabo de manera sencilla y en el plazo de algunas horas puede establecerse si esta presente o no una cepa de C. difficile variante de alta virulencia determinada: se examina para determinar por ejemplo la presencia de C.d.-027-hv y se obtiene un patron de reaccion de anticuerpo-antigeno, que para un anticuerpo de al menos uno de los grupos de anticuerpos I, IV, V y/o VI no muestra ninguna reaccion positiva, puede diagnosticarse de manera fiable que no esta presente ninguna cepa del tipo C.d.-027-hv. Si, por el contrario el patron de reaccion de anticuerpo-antigeno muestra una reaccion positiva para los cuatro grupos de anticuerpos I, IV, V y VI, existe, con muy alta probabilidad, una infection con una cepa C.d.-027-hv. Para confirmar el diagnostico sospechado pueden/deben entonces llevarse a cabo analisis especiales que requieren mucho tiempo y costes resistencia a antibioticos, ribotipificacion y/o analisis genicos (en particular deteccion de los genes de toxina tcdA, tcdB y tcd A/B y del gen regulador tcdC con las deleciones caracteristicas y desplazamientos del marco).

En otras palabras: El procedimiento de acuerdo con la invencion sustituye en el procedimiento de ensayo convencional las primeras tres etapas (deteccion de toxinas, cultivo de bacterias, prueba de resistencia a antibioticos) y permite, en un tiempo esencialmente mas corto, en concreto algunas horas con respecto a convencionalmente, varios dias, por lo menos un diagnostico por exclusion fiable en los casos en los que no existe ninguna infeccion con la cepa de C. difficile variante que va a someterse a ensayo por ejemplo C.d.-027-hv. Las etapas adicionales que requieren mucho tiempo y costes (4, 5 y 6) en el procedimiento de ensayo convencional necesitan en primer lugar y solo llevarse a cabo cuando el procedimiento de acuerdo con la invencion indica la presencia de la cepa de C. difficile variante que va a someterse a ensayo, por ejemplo C.d.-027-hv o C.d.-017-hv.

Tambien pueden utilizarse entonces de manera dirigida medidas preventivas tales como por ejemplo aislamiento, cuarentena, condiciones de higiene rigurosas, cuando se considera realmente alto el riesgo de una infeccion por C.d.-027-hv o infeccion por C.d.-017-hv debido al resultado de la prueba de deteccion de acuerdo con la invencion.

En el caso de los anticuerpos de los grupos I a VI se trata preferentemente de anticuerpos monoclonales. En principio se tienen en cuenta como anticuerpos para el procedimiento de acuerdo con la invencion tambien todas las alternativas de anticuerpos naturales, producidas mediante biotecnologia o producidas mediante ingenieria genetica, conocidas por el experto, por ejemplo anticuerpos de camello (nanobodies), Affibodies, Anticaline, mini-proteinas con nudos de cisteina.

En una forma de realization del procedimiento, que ha dado muy buen resultado en la practica, el al menos un anticuerpo procedente del grupo I es el anticuerpo monoclonal 2CV (DSM ACC 2321) o el anticuerpo monoclonal TGC 35 (DSM ACC2918), y/o el al menos un anticuerpo procedente del grupo II es el anticuerpo monoclonal TGC23 (DSM ACC2917), y/o el al menos un anticuerpo procedente del grupo III es el anticuerpo monoclonal TGC41 (DSM ACC2919), y/o el al menos un anticuerpo procedente del grupo IV es el anticuerpo monoclonal TGC 16 (DSM ACC2915), y/o el al menos un anticuerpo procedente del grupo V es el anticuerpo monoclonal TGC 19 (DSM ACC2916) y/o el al menos un anticuerpo procedente del grupo VI es el anticuerpo monoclonal TTC8 (DSM ACC 2322).

En el caso de la muestra de excrecion o secrecion corporal se trata en la practica preferentemente de una muestra de heces, y en el caso de la muestra de tejido corporal se trata preferentemente de una muestra de sangre.

Una forma de realizacion del procedimiento adicional, que es de alta relevancia para la practica, porque permite una deteccion rapida y fiable de cepas de C. difficile variantes, se caracteriza por que en la etapa (b) la muestra se pone en contacto con en cada caso un anticuerpo de cada uno de los grupos I, IV y VI, y por que en la etapa (c) una reaccion positiva de los anticuerpos de los grupos I, IV y VI indica la presencia de una cepa de C. difficile variante, de alta virulencia.

Una forma de realizacion del procedimiento de alta relevancia para la practica, que permite una deteccion rapida y fiable de la cepa de C. difficile de alta virulencia ribotipo 027, PFGE-NAP1, REA-Bl y toxinotipo III y con ello el examen de casos sospechosos de C.d.-027-hv, se caracteriza por que en la etapa (b) la muestra se pone en contacto con en cada caso al menos un anticuerpo de cada uno de los grupos de anticuerpos grupo II, grupo IV y grupo VI, y por que en la etapa (c) una reaccion positiva de los anticuerpos del grupo IV y grupo VI y una reaccion

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negativa del/de los anticuerpo(s) del grupo II indica la presencia de una cepa de C. difficile variante de alta virulencia del tipo de ribotipo 027, PFGE-NAP1, rEa-B1, toxinotipo III.

Esta forma de realizacion puede ampliarse tambien por que en la etapa (b) la muestra se pone en contacto

adicionalmente con en cada caso al menos un anticuerpo del grupo de anticuerpos I y/o del grupo de anticuerpos III

y/o del grupo de anticuerpos V, y por que en la etapa (c) adicionalmente una reaccion positiva del/de los anticuerpo(s) del grupo I y grupo V y una reaccion negativa del/de los anticuerpo(s) del grupo III indica la presencia de una cepa de C. difficile variante de alta virulencia del tipo de ribotipo 027, PFGE-NAP1, REA-B1, toxinotipo III.

Una forma de realizacion adicional del procedimiento, asi mismo de alta relevancia para la practica, que permite una deteccion rapida y fiable de la cepa de C. difficile de alta virulencia ribotipo 017, toxinotipo VIII y serotipo F y con ello el examen de casos sospechosos de C.d.-017-hv, se caracteriza por que en la etapa (b) la muestra se pone en contacto con en cada caso al menos un anticuerpo de cada uno de los grupos de anticuerpos grupo II, grupo IV y grupo VI, y por que en la etapa (c) una reaccion positiva de los anticuerpos del grupo II y grupo IV y una reaccion negativa del/de los anticuerpo(s) del grupo VI indica la presencia de una cepa de C. difficile variante de alta virulencia del tipo de ribotipo 017, toxinotipo VIII y serotipo F.

Esta forma de realizacion puede ampliarse aun porque en la etapa (b) la muestra se pone en contacto

y/o del grupo de anticuerpos V, y por que en la etapa (c) adicionalmente una reaccion positiva del/de los anticuerpo(s) del grupo I y una reaccion negativa de los anticuerpos del grupo III y grupo V indica la presencia de una cepa de C. difficile variante de alta virulencia del tipo de ribotipo 017, toxinotipo VIII y serotipo F.

El objetivo en el que se basa la presente invencion se consigue tambien con la provision del anticuerpo monoclonal que se produce por la linea celular de hibridoma depositada en la DSMZ, Braunschweig, Alemania, desde el 05 de junio de 2008 con el numero DSM ACC2916 (TGC 19), y que es adecuado y esta previsto para su uso en el procedimiento de acuerdo con la invencion para la deteccion y para la identificacion de cepas de C. difficile variantes, en particular en la variante de procedimiento para la deteccion y para la identificacion de la cepa de C. difficile ribotipo 027, PFGE-NAP1, REA-B1 y toxinotipo III.

El objetivo mencionado se consigue ademas con la provision del anticuerpo monoclonal que se produce por la linea celular de hibridoma depositada en la DSMZ, Braunschweig, Alemania desde el 05 de junio de 2008 con el numero DSM ACC2917 (TGC 23), y que es adecuado y esta previsto para su uso en el procedimiento de acuerdo con la invencion para la deteccion y para la identificacion de cepas de C. difficile variantes, en particular en la variante de procedimiento para la deteccion y para la identificacion de la cepa de C. difficile ribotipo 017, toxinotipo VIII y serotipo F.

El objetivo mencionado se consigue ademas con la provision del anticuerpo monoclonal que se produce por la linea celular de hibridoma depositada en la DSMZ, Braunschweig, Alemania con el numero DSM ACC2915 (TGC 16), y que es adecuado y esta previsto para su uso en el procedimiento para la deteccion y para la identificacion de una cepa de C. difficile variante en una muestra, en particular, en particular en las variantes de procedimiento para la deteccion y para la identificacion de cepas de C. difficile con el ribotipo 017, toxinotipo VIII y serotipo F y/o de cepas de C. difficile con el ribotipo 027, PFGE-NAP1, REA-B1 y toxinotipo III.

El objetivo mencionado se consigue por ultimo tambien mediante la provision del anticuerpo monoclonal que se produce por la linea celular de hibridoma depositada en la DSMZ, Braunschweig, Alemania con el numero DSM ACC2918 (TGC 35), y que es adecuado y esta previsto para su uso en el procedimiento para la deteccion y para la identificacion de una cepa de C. difficile variante en una muestra, en particular, en particular en las variantes de procedimiento para la deteccion y para la identificacion de cepas de C. difficile con el ribotipo 017, toxinotipo VIII y serotipo F y/o de cepas de C. difficile con el ribotipo 027, PFGE-NAP1, REA-B1 y toxinotipo III.

La invencion se explica en detalle a continuacion por medio de ejemplos de realizacion:

Las figuras mencionadas en los Ejemplos muestran:

La Figura 1:

La Figura 2:

La Figura 3:

la ribotipificacion de las cepas usadas. Las cepas se ribotipificaron segun las instrucciones de Stubbs et al. y a traves de comparacion con cepas de referencia as asociaron a los diferentes ribotipos. A este respecto se asocio la cepa VPI-10463 y la cepa 8864 a ribotipos desconocidos hasta el momento y la cepa 1470 al ribotipo 017 y la cepa 7002/8 al ribotipo 027. Las bandas de marcador discurren en 600 pb, 500 pb, 400 pb y 300 pb (desde arriba). variantes de toxina B purificadas. Distintas variantes de toxina B estan representadas en SDS-PAGE con tincion con Coomassie. De las toxinas individuales se aplicaron entre 250-400 ng por carril

la deteccion de la especificidad de anticuerpos monoclonales anti-toxina B. Distintas variantes de toxina B se separaron en SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de nailon y a continuacion se revelaron con los anticuerpos correspondientes. Se muestran las

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La Figura 4:

La Figura 5:

La Figura 6:

especificidades de los anticuerpos monoclonales TGC35 (Figura 3 A), TGC16 (Figura 3 B), TGC41 (Figura 3 C), TGC23 (Figura 3 D) y TGC19 (Figura 3 E).

las regiones de union de los anticuerpos monoclonales. La Figura 4 A es una

representacion esquematica de la estructura de la toxina B. La Figura 4 B representa la region de union de los anticuerpos dentro de la toxina B. La Figura 4C muestra las reactividades de los anticuerpos monoclonales.

patron de referencia de cepas de C. difficile. La expresion de toxina A y toxina B en el sobrenadante de cultivo de cuatro cepas de C. difficile distintas se sometio a prueba por medio de ELISA de tipo sandwich con el uso de anticuerpos de captura de los grupos de anticuerpos I, II, IV y VI. Como anticuerpos de captura se utilizaron del grupo I: TGC35, del grupo II: TGC23, del grupo IV: TGC16, grupo VI: TTC8. Se muestran los patrones de reconocimiento de las cepas de C. difficile VPI-10463 (Figura 5 A), 8864 (Figura 5 B), 1470 ribotipo 017 (Figura 5 C) y 7002/8 ribotipo 027 (Figura 5 D)

patron de reaccion de distintas cepas de C. difficile en el ELISA de captura. Como anticuerpo de identificacion se uso del grupo I el TGC35, del grupo II el TGC23, del grupo IV el TGC16 y del grupo VI el TTC8. En la Figura 6A estan representados los resultados de 17 cepas distintas de C. difficile y en la Figura 6B los resultados de otras cepas de C. difficile.

Ejemplo 1: Produccion de anticuerpos monoclonales que reaccionan de manera especifica con toxina B de C. difficile

(A) Obtencion de toxina B de C. difficile purificada de distintas cepas de C. difficile

Se usaron las cepas de C. difficile: VPI-10463 (ATCC43255), 8864 (CCUG20309), 1470 (ATCC43598) y 7002/8 (aislado humano de una muestra de un paciente).

Las cepas se ribotipificaron de acuerdo con el procedimiento de ribotipificacion segun Stubbs et al. 1999. Los resultados obtenidos a este respecto estan representados en la Figura Fig. 1. Se mostro que la cepa 1470 corresponde al ribotipo 017 y la cepa 7002/8 al ribotipo 027, mientras que las cepas VPI-10463 y 8864 pueden asociarse a ribotipos hasta el momento no conocidos oficialmente.

La toxina B (TcdB-10463) expresada por la cepa VPI-10463 se denomina en general en el estado de la tecnica como toxina convencional.

La cepa 8864 produce una variante de esta toxina B (TcdB-8864), que se diferencia de la toxina convencional sobre todo en el dominio de union a receptor C-terminal (Soehn et al. 1998).

La cepa 1470 expresa una toxina B (TcdB-1470), que se diferencia de la toxina B convencional en particular en el dominio enzimatico N-terminal (de Eichel-Streiber et al. 1995).

Se desconoce la secuencia de la toxina B de la cepa 7002/8 ribotipo 027. Por el contrario se determinaron las secuencias de la TcdB-027 en dos cepas C.d.-027-hv distintas (cepa QCD-32g58, n.° de registro de Genbank NZ_AML00000000, cepa R20291,
www.sanger.ac.uk). Una comparacion de estas secuencias de TcdB-027 con la toxina B convencional y otras toxinas TcdB variantes da como resultado que TcdB-027 se asemeja en el dominio enzimatico, N-terminal, a la toxina convencional TcdB-10463, pero en el dominio C-terminal a la toxina TcdB-8864 variante.

Para la purificacion de las toxinas se cultivaron de manera anaerobica las bacterias en medios de cultivo Brain Heart Infusion (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania). A continuacion se purificaron las toxinas A y B a partir del sobrenadante de estos cultivos, tal como se describe en Moos et al. (2000). La pureza de las toxinas se examino en el gel de Coomassie (vease la Figura 2).

La TcdB aislada y purificada de las cepas de C. difficile VPI-10463, 8864 y 1470 se inactivaron con los procedimientos habituales y conocidos en el estado de la tecnica y se examino el exito de la inactivacion en la prueba de citotoxicidad.

(B) Obtencion de anticuerpos monoclonales frente a las variantes de toxina-B de (A)

En una serie de preparaciones, en primer lugar se sometieron a inmunizacion de base en cada caso varios ratones con las variantes de toxina B inactivadas TcdB-8864 y TcdB-1470 y la toxina convencional TcdB 10163 y a continuacion se sometieron a dos inmunizaciones de refuerzo.

Se determino el titulo de los animales frente al inmunogen y se extrajo el bazo, en caso de que se hubiera desarrollado un titulo significativo. Las celulas de bazo aisladas se fusionaron con los procedimientos habituales y conocidos en el estado de la tecnica con la linea celular de mieloma de raton X63Ag8.653 (ATCC CRL1580) y las celulas de fusion se seleccionaron y clonaron a continuacion. Los clones de hibridoma obtenidos a este respecto se

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seleccionaron de manera inmunologica en cuanto a la production de anticuerpos monoclonales espetificos frente a la toxina B usada para la inmunizacion.

En total se llevaron a cabo 15 fusiones y por ultimo se aislaron 21 lineas celulares de hibridoma distintas que expresan los anticuerpos especificos de toxina B.

Para los otros ensayos se purificaron los anticuerpos del sobrenadante del cultivo celular. Para ello se cultivaron las lineas celulares de hibridoma en medio libre de suero ISF-1 (Biochrom, Berlin, Alemania) y a continuation se cultivaron en un volumen de 250 ml en un sistema Spinner (Bellco, Vineland, EE.UU.) a 50 rpm, hasta que la vitalidad del cultivo cayo hasta menos del 30 %. El sobrenadante del cultivo se purifico por medio de una columna de proteina A (HiTrap MabSelect SuRe, GE Healthcare, Freiburg, Alemania). La concentration de los anticuerpos purificados se encontraba en 1-2 mg/ml, la pureza se examino en el gel de Coomassie.

Ejemplo 2: Caracterizacion de los anticuerpos anti-toxina B

Para la caracterizacion de los anticuerpos purificados en el Ejemplo 1 se examinaron estos en la inmunotransferencia de tipo Western.

Para ello se separaron en primer lugar en cada caso 250-400 ng de la toxina B convencional 10463 y las variantes de toxina B TcdB-8864, TcdB-017 y TcdB-027 en el SDS-PAGE y a continuacion se transfirieron en el procedimiento de transferencia semiseco a membranas de nailon. El revelado tuvo lugar de acuerdo con los procedimientos conocidos en el estado de la tecnica.

Para la detection de las toxinas se utilizaron los anticuerpos monoclonales generados en el Ejemplo 1.

Los resultados para los anticuerpos con el nombre de laboratorio TGC 16, TGC 19, TGC 23, TGC 35 y TGC 41 estan resumidos en la Figura 3:

Los resultados muestran que la mayoria de los anticuerpos generados reconocen un subgrupo de distintas variantes de toxina B y no de manera monoespecifica solo una variante de toxina determinada.

Se identificaron en total 11 anticuerpos distintos que se unen a la toxina B convencional y a todas las variantes de toxina B. Un representante caracteristico de dichos anticuerpos anti pan-TcdB es el anticuerpo TGC 35. La linea celular de hibridoma que produce estos TGC 35, esta depositada en la DSMZ (Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (Coleccion Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares), Braunschweig, Alemania) desde el 05 de junio de 2008 con el numero DSM ACC2918.

Algunos anticuerpos reaccionan tanto con la toxina convencional como con la toxina TcdB-017. Un representante caracteristico de este grupo de anticuerpos es el anticuerpo TGC 23. La linea celular de hibridoma, que produce estos TGC 23, esta depositada en la DsMz desde el 05 de junio de 2008 con el numero DSM ACC2917.

Algunos anticuerpos reaccionan de manera especifica con la toxina convencional TcdB-10463. Un representante caracteristico de este grupo de anticuerpos es el anticuerpo TGC 41. La linea celular de hibridoma, que produce estos TGC 41, esta depositada en la DsMz desde el 05 de junio de 2008 con el numero DSM ACC2919.

Sorprendentemente pudieron generarse tambien dos anticuerpos que reaccionan con una o varias de las variantes de toxina B, pero no con la toxina convencional B.

El anticuerpo TGC 16 no se une a la toxina B convencional, pero si a las toxinas variantes TcdB-8864, TcdB-017 y TcdB-027. La linea celular de hibridoma, que produce estos TGC 16, esta depositada en la DSMZ desde el 05 de junio de 2008 con el numero DSM ACC2915.

El anticuerpo TGC 19 no se une a la toxina B convencional o la variante toxina TcdB-017, pero si a las toxinas variantes TcdB-8864 y TcdB-027. La linea celular de hibridoma, que produce estos TGC 19, esta depositada en la DSMZ desde el 05 de junio de 2008 con el numero DSM ACC2916.

Los anticuerpos se examinaron en un ELISA de captura con respecto a su limite de deteccion de antigeno. Para ello se incubaron placas de ELISA por pocillo con 50 |jl tampon de recubrimiento (Na2CO3 50 mM, NaHCO3 50 mM, pH 9,6) y 250 ng del anticuerpo respectivo durante 3 h a temperatura ambiente y a este respecto se anadio el anticuerpo a la placa de ELISA. Sitios de union no especificos se bloquearon mediante posterior incubation con 200 jl 5x wApU (12,5 ml de TritonX100, 62,5 ml de Tris-HCl 1 M pH 7,5, 62,5 ml de una solution de gelatina al 20 %, hasta 500 ml con H2O) durante la duration de 30 minutos. A continuacion se aplicaron diferentes concentraciones de los antigenos, en concreto en el caso de TGC16 y TGC 19 del antigeno TcdB-027 y en el caso de TGC 23 y TGC 35 del antigeno TcdB-017. La deteccion tuvo lugar con suero policlonal (266 ng/ml). Los resultados de reaction (en este caso no representados) muestran que para los anticuerpos TGC 16 y TGC 23 el limite de deteccion para la toxina B respectiva se encuentra en < 300 pg/ml, para el anticuerpo TGC 35 se encuentra en menos de 1 ng/ml y para el

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anticuerpo TGC 19 se encuentra en 1 ng/ml.

Los anticuerpos TGC 16, TGC 19, TGC 23, TGC 35 y TGC 41 se examinaron en cuanto a sus sitios de union a la toxina B. Mediante digestion proteolitica de la toxina B o mediante la clonacion y expresion de fracciones parciales de toxina B recombinante en E. coli se produjeron fragmentos de proteina de la toxina B. Estos fragmentos parciales de toxina B se separaron en experimentos de inmunotransferencia de tipo Western y se incubaron las transferencias a continuacion con los anticuerpos TGC 16, TGC 19, TGC 23, TGC 35 y TGC 41. Los resultados de estos ensayos estan resumidos esquematicamente en la Figura 4 y muestran que los anticuerpos individuales reconocen o se unen a diferentes regiones de la molecula de toxina B:

Todos las indicaciones de posiciones de aminoacidos estan indicadas en referencia a las posiciones correspondientes en la toxina convencional TcdB-10463.

TGC 16 se une a TcdB-8864, TcdB-017 y Tcd-027 en cada caso dentro del dominio de glicosiltransferasa y alli en la zona de las posiciones de aminoacido 122 a 261. TGC 19 se une a TcdB-8864 y Tcd-027 en cada caso en la zona al otro lado del dominio de glicosiltransferasa entre las posiciones de aminoacido 543 y 2366.

TGC 23 se une a la toxina convencional y TcdB-017 en cada caso el dominio de ligando con separation del extremo C-terminal entre las posiciones de aminoacido 1692 y 2113. TGC 35 se une a la toxina convencional, TcdB-8864, TcdB-017 y Tcd-027 en cada caso dentro del dominio de traslocacion entre el dominio de glicosiltransferasa en el extremo N-terminal de la toxina y el dominio de ligando en el extremo C-terminal entre las posiciones de aminoacido 543y1692.

TGC 41 se une a la toxina convencional de manera analoga al TGC 16, es decir, dentro del dominio de glicosiltransferasa y alli en la zona de las posiciones de aminoacido 122 a 261. TGC 16 y TGC 41 se unen en la misma region de toxina B, en concreto en el dominio de glicosiltransferasa, pero de distintas variantes de toxina B, en concreto de toxina convencional por un lado (TGC 41) y de TcdB-8864, TcdB-017 y Tcd-027 por otro lado (TGC 16). Con ello se ha identificado por primera vez una region en la toxina B que permite una diferenciacion especifica entre la toxina B convencional TcdB-10463 y las toxinas variantes TcdB-8864, TcdB-017 y Tcd-027. Sorprendentemente en el caso de esta region se trata precisamente del dominio de glicosiltransferasa, que media la actividad enzimatica de la toxina B. La actividad enzimatica es en principio la misma en todas las toxinas B.

Con los anticuerpos recien generados en el transcurso de la presente invention pueden establecerse distintos grupos (clases) de anticuerpos (grupos de anticuerpos/clases de anticuerpos), que se diferencian entre si en cuanto a su reactividad con la toxina convencional B y con las distintas variantes de toxina B:

el grupo de los anticuerpos anti-pan-TcdB se denomina en adelante grupo I. Representantes tipicos de este grupo son los anticuerpos monoclonales TGC 35 y 2CV (conocidos por el documento EP 0994904).

El grupo de aquellos anticuerpos que reaccionan tanto con la toxina convencional como con la toxina TcdB-017, pero no con las toxinas variantes TcdB-027 y TcdB-8864 se denomina en adelante grupo II. Un representante tipico de este grupo es el anticuerpo monoclonal TGC 23.

El grupo de aquellos anticuerpos que reaccionan con la toxina convencional TcdB-10463, pero no con las toxinas variantes TcdB-027, TcdB-8864 y TcdB-1470, se denomina en adelante grupo III. Un representante tipico de este grupo es el anticuerpo monoclonal TGC 41.

El grupo de aquellos anticuerpos, que no interreaccionan con la toxina convencional B, pero si con las toxinas TcdB- 8864, TcdB-017 y TcdB-027, se denomina en adelante grupo IV. Un representante tipico de este grupo es el anticuerpo monoclonal TGC 16.

El grupo de aquellos anticuerpos que no reacciona con la toxina convencional B o la toxina TcdB-017, pero si con las toxinas TcdB-8864 y TcdB-027, se denomina en adelante grupo V. Un representante tipico de este grupo es el anticuerpo monoclonal TGC 19.

De la bibliografia se conoce ademas el grupo de los anticuerpos especificos de pan-TcdA, que se denomina en adelante grupo VI. Un representante tipico de este grupo es el anticuerpo monoclonal TTC8 (conocido por el documento EP 0994904).

Ejemplo 3: Deteccion de LCT en el ELISA de captura - Creacion de patrones de referencia de antigeno- anticuerpo para cepas de C. difficile variantes conocidas con el uso de los grupos de anticuerpos I, II, IV y VI

En principio se lleva a cabo la creacion de patrones de referencia de antigeno-anticuerpo de la siguiente manera: De las cepas de C. difficile Rxi, Rx2, Rxi conocidas en el estado de la tecnica y que van a examinarse para determinar su presencia en la prueba de deteccion se obtiene en cada caso al menos la toxina B, preferentemente ambas toxinas clostridiales grandes (LCT) (en forma del sobrenadante de cultivo o de las toxinas purificadas). Con estas toxinas conocidas LCTRxi, LCT-Rx2, LCT-Rxi se lleva a cabo una prueba de reaction con en cada caso al menos un

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anticuerpo de preferentemente cada uno de los grupos de anticuerpos I a VI. Los resultados de reaccion obtenidos para cada LCT (LCT-Rxi, LCT-Rx2, LCT-Rxi) y los grupos de anticuerpos utilizados se registran a modo de patron de tal manera que a cada grupo de anticuerpos se asocia o bien un simbolo positivo (por ejemplo "+") en el caso de una reaccion de anticuerpo positiva detectada o bien un simbolo negativo (por ejemplo "-") en el caso de una reaccion de anticuerpo negativa detectada.

En el ejemplo presentado se procedio en concreto tal como sigue:

placas de ELISA se equiparon con los anticuerpos TGC35 (grupo I), TGC23 (grupo II), TGC16 (grupo IV) y TTC8 (grupo VI) purificados descritos en el Ejemplo 2 tal como sigue: Por pocillo se incubaron 50 pl de tampon de recubrimiento (Na2CO3 50 mM, NaHCO3 50 mM, pH 9,6) con un contenido de 250 ng del anticuerpo respectivo durante 3 h a temperatura ambiente y a este respecto se anadio el anticuerpo a las placas de ELISA. A continuacion se bloquearon sitios de union no especificos mediante incubacion con 200 pl 5x WAPU (12,5 ml de TritonX100, 62,5 ml de Tris-HCl 1 M pH 7,5, 62,5 ml de una solucion de gelatina al 20 %, hasta 500 ml con H2O) durante la duracion de 30 minutos.

Las cepas de C. difficile 10463, 8864, 1470 y 7002/8 se cultivaron tal como se describe en el Ejemplo 1, y se anadieron alicuotas de 50 pl del sobrenadante de cultivo sobre las placas de microtitulo recubiertas con los anticuerpos. Proteinas unidas de manera no especifica se retiraron mediante un lavado por triplicado con TBST (NaCl 150 mM, Tris 10 mM, Tween20 al 0,05 %, pH 8,0). A continuacion se detectaron las toxinas unidas opcionalmente por el anticuerpo respectivo con 50 pl de suero policlonal anti-toxina-B (266 ng/ml) en el ELISA de captura. El revelado tuvo lugar a traves de fosfatasa alcalina con procedimientos convencionales.

Los resultados de este ELISA estan representados graficamente en la Figura 5. En la Figura 5 puede apreciarse que cada una de las cuatro cepas de C. difficile distintas con los cuatro anticuerpos utilizados, muestra un patron de reaccion caracteristico para ella, que se diferencia de los patrones de reaccion de las otras cepas: El sobrenadante de la cepa VPI-10463 reacciona positivamente con los anticuerpos TGC 35/grupo I, TGC 23/grupo II y TTC8/grupo VI y negativamente con TGC 16/grupo IV (vease la Figura 5A).

El sobrenadante de la cepa 8864 reacciona positivamente con los anticuerpos TGC 35/grupo I y TGC 16/grupo IV y negativamente con TGC 23/grupo II y TTC8/grupo VI (vease la Figura 5B).

El sobrenadante de la cepa 1470 (ribotipo 017) reacciona positivamente con los anticuerpos TGC 35/grupo I, TGC 23/grupo II y TGC 16/grupo IV y negativamente con TTC8/grupo VI (vease la Figura 5C).

El sobrenadante de la cepa 7002/8 (ribotipo 027) reacciona positivamente con los anticuerpos TGC 35/grupo I, TGC 16/grupo IV y TTC8/grupo VI y negativamente con TGC 23/grupo II (vease la Figura 5D).

Un examen de estos resultados en ensayos paralelos con toxina B de cepas de C. difficile del ribotipo 027 y distintas combinaciones de anticuerpos de los grupos de anticuerpos I a VI confirma que TcdB-027 con anticuerpos de los grupos I, IV, V y VI reacciona siempre positivamente y con anticuerpos de los grupos II y III siempre negativamente.

En otras palabras: El patron de reaccion "+-- +++" de la toxina B de una cepa de C. difficile desconocida con los anticuerpos de los seis grupos de anticuerpos en el orden grupo I, grupo II, grupo III, grupo IV, grupo V, grupo VI permite la conclusion de que en el caso de la cepa de C. difficile desconocida se trata del o de un ribotipo 027, al que pertenecen tambien las cepas de alta virulencia C.d.-027-hv.

Un examen de estos resultados en ensayos paralelos con toxina B de cepas de C. difficile del ribotipo 017 y distintas combinaciones de anticuerpos de los grupos de anticuerpos I a VI confirma que TcdB-017 reacciona con anticuerpos de los grupos I, II y IV siempre positivamente y con anticuerpos de los grupos III, V y VI siempre negativamente.

En otras palabras: El patron de reaccion "++- +--" de toxina B de una cepa de C. difficile desconocida con los anticuerpos de los seis grupos de anticuerpos en el orden grupo I, grupo II, grupo III, grupo IV, grupo V, grupo VI permite la conclusion de que en el caso de la cepa de C. difficile desconocida se trata del o de un ribotipo 017, al que pertenecen tambien las cepas de alta virulencia C.d.-017-hv.

Ejemplo 4: Identificacion de ribotipos de C. difficile por medio de patrones de referencia de patron antigeno- anticuerpo

Para la creacion del patron de referencia de reaccion antigeno-anticuerpo se procede tal como se describe en el Ejemplo 3.

Para la creacion del patron de reaccion especifico de una muestra se procede tal como sigue: La cepa de C. difficile que va a examinarse se cultiva con procedimientos conocidos y se somete a prueba el sobrenadante o las toxinas purificadas. Para ello se aplica sobre una superficie adecuada, por ejemplo una membrana, en cada caso al menos un anticuerpo de al menos dos, preferentemente tres o cuatro de los grupos I, II, III, IV, V y VI, por ejemplo los

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anticuerpos TGC 16, TGC 19, TGC 23, TGC 41, TGC 35 y TTC8 con procedimientos habituales y conocidos por el experto.

A continuacion se pone en contacto la muestra con estos anticuerpos, denominados en adelante anticuerpos de identificacion. Procedimientos adecuados para ello son conocidos por el experto, por ejemplo ELISA o el denominado procedimiento "lateral flow" (de flujo lateral) tal como se describe en el documento EP 1143248.

Al final del tiempo de reaccion especifico de procedimiento cada preparacion se libera (se lava) o esta libre de material de muestra no unido.

Para detectar que anticuerpo de identificacion muestra una reaccion antigeno-anticuerpo con la muestra y cual no ha reaccionado, se utiliza un anticuerpo de deteccion. Como anticuerpos de deteccion pueden usarse sueros policlonales frente a toxina A y toxina B (de manera monoespecifica o con reactividad cruzada), o tambien anticuerpos de uno o varios de los grupos I, II, III, IV, V o VI. En el caso de la eleccion de los anticuerpos de deteccion ha de tenerse en cuenta que su epitopo objetivo se diferencia de los epitopos objetivo de los anticuerpos de identificacion o esta presente en principio varias veces en cada toxina, para que el anticuerpo de deteccion pueda unir la toxina en interconexion con el anticuerpo de identificacion. Los anticuerpos de deteccion estan marcados con marcadores adecuados tales como por ejemplo oro coloidal, particulas de carbon o de latex o marcadores enzimaticos tales como HRP (Horse Radish Peroxidase (peroxidasa del rabano picante)) o fosfatasa alcalina.

El anticuerpo de deteccion se anade a la preparacion o bien antes de la aplicacion de la muestra o bien junto con la muestra o despues de transcurrir el tiempo de reaccion especifico del procedimiento entre anticuerpos de identificacion y muestra.

Dado que al final del tiempo de reaccion especifico de procedimiento la toxina de muestra, que no esta unida a los anticuerpos de identificacion, y proteinas contaminantes eventualmente presentes en la muestra se retiran (se separan por lavado), aparece una senal de marcador (senal positiva "+") solo cuando se ha formado una interconexion (complejo) de anticuerpo de identificacion, toxina de muestra y anticuerpo de deteccion.

Las senales de marcador obtenidas para cada anticuerpo de identificacion "+" o "-" se reunen en el patron de reaccion. Un patron de reaccion de este tipo puede tener el aspecto por ejemplo de la Figura 5A. La comparacion con los patrones de referencia lleva en este caso a la conclusion (o al diagnostico sospechado), de que esta presente la cepa de C. difficile VPI-10463.

Cuando el patron de reaccion tiene por ejemplo el aspecto de la Figura 5B, la comparacion con los patrones de referencia lleva a la conclusion (el diagnostico sospechado), de que esta presente la cepa de C. difficile 8864. Cuando el patron de reaccion tiene por ejemplo el aspecto de la Figura 5C, la comparacion con los patrones de referencia lleva a la conclusion (el diagnostico sospechado), de que esta presente la cepa de C. difficile 1470 o una cepa de C. difficile del ribotipo 017. Cuando el patron de reaccion tiene por ejemplo el aspecto de la Figura 5D, la comparacion con los patrones de referencia lleva a la conclusion (el diagnostico sospechado), de que esta presente la cepa de C. difficile 7002/8 o una cepa de C. difficile del ribotipo 027.

Ejemplo 5: Analisis de distintas cepas de C. difficile con anticuerpos de los grupos I, II, IV, VI

En el siguiente experimento se llevo a cabo el procedimiento de acuerdo con la invencion para la identificacion y deteccion de cepas de C. difficile variantes por medio de una serie de cepas con ribotipo conocido, en concreto 19 cepas del ribotipo 027 (Lumc-1, Lumc-2, Lumc-3, Lumc-4, Lumc-5, Lumc-6, Lumc-8, Lumc-9, Lumc-10, Lumc-11, Lumc-12, Lumc-13 ,Lumc-14, Lumc-16, Lumc-17, Lumc-19, Lumc-20, Lumc-21, 7002-42), 4 cepas del ribotipo 017 (Lumc-22, Lumc-23, Lumc-40, Lumc-41), 2 cepas del ribotipo 001 (7002-29, 7002-43) y una cepa del ribotipo 014 (Lumc-31). Como cepas de referencia se usaron las cepas VPI-10463, 8864 y 7002/8. Se usaron anticuerpos de los grupos I, II, IV y VI en un ELISA de captura y se comparo el patron de reaccion resultante con los patrones de referencia creados (vease el Ejemplo 3).

Las distintas cepas de C. difficile se cultivaron tal como se describe en el Ejemplo 1 y el sobrenadante se uso en los experimentos subsiguientes. Como anticuerpos de identificacion se anadieron a las placas de ELISA los anticuerpos TGC 35 (grupo I), TGC 23 (grupo II), TGC 16 (grupo IV) y TTC8 (grupo VI) tal como se describe en el Ejemplo 3. A este respecto usaron en cada caso 250 ng/pocillo TGC 23, 128 ng/pocillo de TGC 16 y TGC 35, asi como 1 |jlg/pocillo de TTC8 y se lavaron las placas a continuacion en PBS.

Para llevar a cabo el ELISA se bloquearon los sitios de union no especificos de las placas en primer lugar mediante incubacion de 1 h a 37°C en PBS+BSA al 3 %. A continuacion se aplicaron 50 jl/pocillo del sobrenadante de los cultivos de C. difficile y se incubaron las placas de nuevo durante 1 h a 37°C. Se retiraron las proteinas no unidas mediante lavado de tres veces con PBS+BSA al 3 %. Como anticuerpo de deteccion se uso en el caso de TGC 35, TGC 16 y TGC 23 suero anti-toxina B policlonal marcado con biotina (0,32 jg/ml). En el caso de la deteccion de toxina A se uso el anticuerpo TTC8 en forma biotinilada tambien como anticuerpo de deteccion. Despues de un nuevo lavado con PBS+BSA al 3 % se anadieron 50 jl de estreptavidina-HRP (0,1 jg/ml, Pierce, Rockford, EE.UU.)

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por pocillo y las placas se incubaron durante 1 h a 37°C. A continuacion se lavaron las placas con PBS y se usaron para el desarrollo 50 |jl/pocillo de TMB (1-Step Ultra TMB, Pierce, Rockford, EE.UU.). Las placas se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad y la reaccion se detiene a continuacion con 100 jl/pocillo de H2SO4 2M. La evaluation tuvo lugar a DO450 frente a un valor vacio. Como valor cut-off se establecio 0,5.

Los resultados de este ensayo estan representados graficamente en la Figura 6A y la Figura 6B:

• en 19 cepas distintas se detecto el patron de reaccion "+ - + +" en el orden de los grupos I, II, IV y VI.

• en 4 cepas C.d.-017-hv distintas se detecto el patron de reaccion "+++-" en el orden de los grupos I, II, IV y VI. El analisis de las cepas 017 muestra que las cepas producen in vitro en total relativamente poca toxina (tambien la senal de TGC 35 es relativamente debil). En cambio es evidente que solo en el caso de estas cepas tiene lugar una reaccion especifica entre el anticuerpo TGC 23 (DSM ACC 2917) y la toxina B-017. Mientras que en todos los otros sobrenadantes (es decir todas las cepas C.d.-027-hv, asi como todas las cepas de ribotipo 001 sometidas a prueba) los valores en el caso del uso del anticuerpo de detection TGC 23 no se encuentra por encima de 0,4, en el caso de las cepas C.d.-017-hv la absorcion se encontraba en cada caso claramente por encima del valor cut-off de 0,5.

Los resultados confirman que el patron de reaccion antigeno-anticuerpo "+ - + +" en el orden de los grupos I, II, IV y VI permite la conclusion de que en el caso de la cepa examinada se trata de una cepa C.d.-027-hv, y que en el caso de un patron de reaccion "+ + + -" en el orden de los grupos I, II, IV y VI se concluye que esta presente una cepa C.d.-017-hv.

Lista de las citas bibliograficas mencionadas:

Moos et al. (2000) "Purification and evaluation of large clostridial cytotoxins that inhibit small GTPases of Rho and Ras subfamilies" Meth Enzymol. 325: 114-125.

Soehn et al. (1998) "Genetic rearrangement in the pathogenicity locus of Clostridium difficile strain 8864 - implications for transcription, expression and enyzmatic activity of toxin A and B" Mol Gen Genet 258: 222-232.

Stubbs et al (1999) "PCR targeted to the 16-23rRNA gene intergenic space region of Clostridium difficile and construction of a library of 116 different PCR ribotypes" J Clin Microbiol 37: 461-463.

von Eichel-Streiber et al. (1995) "Closing in on the toxic domain through analysis of a variant Clostridium difficile cytotoxin B" Mol Microbiol 17: 313-321.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Procedimiento in vitro para la deteccion y para la identificacion de una cepa de C. difficile variante, productora de LCT, virulenta en una muestra, caracterizado por las siguientes etapas de procedimiento:

(a) poner en contacto una muestra de excrecion o secrecion corporal y/o de tejido corporal con en cada caso al menos un anticuerpo de al menos tres de los grupos de anticuerpos grupo I, grupo II, grupo MI, grupo IV, grupo V y grupo VI, en el que

el grupo I comprende los siguientes anticuerpos:

anticuerpo monoclonal 2CV (DSM ACC 2321), anticuerpo monoclonal TGC 35 (DSM ACC2918) y anticuerpos pan-TcdB,

el grupo II comprende los siguientes anticuerpos: anticuerpos monoclonales TGC23 (DSM ACC2917) y anticuerpos que reaccionan con las toxinas TcdB-10463 y TcdB-017, pero no con las toxinas TcdB-8864 y TcdB-027,

el grupo III comprende los siguientes anticuerpos: anticuerpos monoclonales TGC41 (DSM ACC2919) y anticuerpos que reaccionan con TcdB-10463, pero no con las toxinas TcdB-8864, TcdB-017 y TcdB-027, el grupo IV comprende los siguientes anticuerpos: anticuerpos monoclonales TGC 16 (DSM ACC2915) y anticuerpos que reaccionan con las toxinas TcdB-8864, TcdB-017 y TcdB-027, pero no con la toxina TcdB- 10463,

el grupo V comprende los siguientes anticuerpos: anticuerpos monoclonales TGC 19 (DSM ACC2916) y anticuerpos que reaccionan con las toxinas TcdB-8864 y TcdB-027, pero no con las toxinas TcdB-10463 y TcdB-017,

el grupo VI comprende los siguientes anticuerpos: anticuerpos monoclonales TTC8 (DSM ACC 2322) y anticuerpos pan-TcdA;

y en el que se cumple que:

TcdB-10463 representa la toxina B de la cepa de C. difficile VPI-10463,

TcdB-8864 representa la toxina B de la cepa de C. difficile 8864,

TcdB-017 representa la toxina B de cepas de C. difficile con el ribotipo 017, en particular para la toxina B de la cepa de C. difficile 1470,

TcdB-027 representa la toxina B de cepas de C. difficile con el ribotipo 027, en particular para la toxina B de la cepa de C. difficile 7002/8

(b) detectar la reaccion de anticuerpo y crear el patron de reaccion, en el que a cada anticuerpo utilizado en (a) de cada grupo de anticuerpos I a VI se asocia un simbolo positivo (por ejemplo "+") para una reaccion de anticuerpo positiva detectada y un simbolo negativo (por ejemplo "-") para una reaccion de anticuerpo negativa detectada, y

(c) comparar el patron de reaccion obtenido en (b) con patrones de referencia de modo que de las cepas de C. difficile Rxi, Rx2, Rxi conocidas en el estado de la tecnica y que se examinan en la prueba de deteccion para determinar su presencia se utiliza al menos una de sus toxinas clostridiales grandes respectivas (LCT) LCT-Rxi, LCT-Rx2, LCT-Rxi en una prueba de reaccion con los anticuerpos seleccionados en la etapa (a) de los al menos tres de los grupos de anticuerpos I a VI, y de modo que los resultados de reaccion obtenidos para cada LCT y los al menos tres de los grupos de anticuerpos I a IV se registran a modo de patron de tal manera que a cada grupo de anticuerpos se asocia o bien un simbolo positivo (por ejemplo "+") en el caso de una reaccion de anticuerpo positiva detectada o un simbolo negativo (por ejemplo "-") en el caso de una reaccion de anticuerpo negativa detectada,

(d) evaluar una coincidencia entre el patron de reaccion obtenido en (b) con un patron de referencia como indicio de que en la muestra esta presente la cepa de C. difficile del patron de referencia en cuestion.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que los anticuerpos son anticuerpos monoclonales.
3. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que el al menos un anticuerpo procedente del grupo IV es el anticuerpo monoclonal TGC 16 (DSM ACC2915).
4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que el al menos un anticuerpo procedente del grupo V es el anticuerpo monoclonal TGC 19 (DSM ACC2916).
5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que el al menos un anticuerpo procedente del grupo VI es el anticuerpo monoclonal TTC8 (DSM ACC 2322).
6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que el al menos un anticuerpo procedente del grupo I es el anticuerpo monoclonal 2CV (DSM ACC 2321) o el anticuerpo monoclonal TGC 35 (DSM ACC2918).

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7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que el al menos un anticuerpo procedente del grupo II es el anticuerpo monoclonal TGC23 (DSM ACC2917).
8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que el al menos un anticuerpo procedente del grupo III es el anticuerpo monoclonal TGC41 (DSM ACC2919).
9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que en la etapa (a) la muestra se pone en contacto con en cada caso un anticuerpo de cada uno de los grupos I, IV y VI, y por que en la etapa (b) una reaccion positiva de los anticuerpos de los grupos I, IV y VI indica la presencia de una cepa de C. difficile variante, de alta virulencia.
10. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que en la etapa (a) la muestra se pone en contacto con en cada caso al menos un anticuerpo de cada uno de los grupos de anticuerpos grupo II, grupo IV y grupo VI, y por que en la etapa (b) una reaccion positiva de los anticuerpos del grupo IV y del grupo VI y una reaccion negativa del/de los anticuerpo(s) del grupo II indican la presencia de la cepa de C. difficile de alta virulencia de ribotipo 027, PFGE-NAP1, REA-B1 y toxinotipo III.
11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 10, caracterizado por que en la etapa (a) la muestra se pone en contacto adicionalmente con en cada caso al menos un anticuerpo del grupo de anticuerpos I y/o del grupo de anticuerpos III y/o del grupo de anticuerpos V, y por que en la etapa (b) adicionalmente una reaccion positiva del/de los anticuerpo(s) del grupo I y del grupo V y una reaccion negativa del/de los anticuerpo(s) del grupo III indican la presencia de la cepa de C. difficile de alta virulencia de ribotipo 027, PFGE-NAP1, REAB1 y toxinotipo III.
12. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8 caracterizado por que en la etapa (a) la muestra se pone en contacto con en cada caso al menos un anticuerpo de cada uno de los grupos de anticuerpos grupo II, grupo IV y grupo VI, y por que en la etapa (b) una reaccion positiva de los anticuerpos del grupo II y del grupo IV y una reaccion negativa del/de los anticuerpo(s) del grupo VI indican la presencia de la cepa de C. difficile de alta virulencia ribotipo 017, toxinotipo VIII y serotipo F.
13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 12, caracterizado por que en la etapa (a) la muestra se pone en contacto adicionalmente con en cada caso al menos un anticuerpo del grupo de anticuerpos I y/o del grupo de anticuerpos III y/o del grupo de anticuerpos V, y por que en la etapa (b) adicionalmente una reaccion positiva del/de los anticuerpo(s) del grupo I y una reaccion negativa de los anticuerpos del grupo III y del grupo V indican la presencia de la cepa de C. difficile de alta virulencia ribotipo 017, toxinotipo VIII y serotipo F.
14. Uso del anticuerpo monoclonal, que se produce a partir de la linea celular de hibridoma depositada en la DSMZ, Braunschweig, Alemania, con el numero dSm ACC2916 (TGC 19), en un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 13.
15. Uso del anticuerpo monoclonal, que se produce a partir de la linea celular de hibridoma depositada en la DSMZ, Braunschweig, Alemania, con el numero dSm ACC2917 (TGC 23), en un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 13.
16. Uso del anticuerpo monoclonal, que se produce a partir de la linea celular de hibridoma depositada en la DSMZ, Braunschweig, Alemania, con el numero dSm ACC2915 (TGC 16), en un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 13, en particular de acuerdo con una de las reivindicaciones 10 a 13.
17. Uso del anticuerpo monoclonal, que se produce a partir de la linea celular de hibridoma depositada en la DSMZ, Braunschweig, Alemania, con el numero DSM ACC2918 (TGC 35), en un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 13.