CN102482331B - 用于检测和鉴别样品中变异艰难梭菌菌株的方法 - Google Patents

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Abstract

用于检测和鉴别样品中变异艰难梭菌菌株的方法，其特征在于下述步骤：(a)获得患者的身体排泄物样品和/或身体组织样品，(b)使该样品与至少一种抗体接触，所述抗体各来自抗体组组I、组II、组III、组IV、组V和组VI中的至少三组，(c)检测抗体反应并生成反应模式，(d)将在(c)中获得的反应模式与现有技术中已知的且在检测测试中就存在待检测的艰难梭菌菌株的参考模式进行比较，(e)评估在(c)中获得的反应模式与参考模式之间的一致性作为样品中存在具有相关参考模式的艰难梭菌菌株的指示。

Description

用于检测和鉴别样品中变异艰难梭菌菌株的方法
艰难梭菌(Clostridium difficile)是3-6μm长和大约0.5μm宽的严格厌氧的革兰氏阳性杆状细菌。梭菌属属于芽孢杆菌科(Bacillaceae)。发现艰难梭菌作为抗生素相关结肠炎的重要病原体是在70年代末实现的。名称艰难梭菌源于培养中的缓慢生长和所述细菌困难的分离。在补充的血琼脂平板上，生长出大的、灰色的透明克隆，而没有溶血作用。像所有的梭菌一样，艰难梭菌具有孢子形成能力。以这种方式，所述细菌在极端环境条件下也能够存活。
健康成人在胃肠道中携带有2-7％的艰难梭菌。在抗生素治疗期间，生理菌群的保护作用受到干扰并可在肠中发生艰难梭菌的过度繁殖。由此引起的艰难梭菌相关4疾病(CDAD)的严重程度取决于所存在的艰难梭菌菌株的毒力而变化。临床现象从轻微腹泻直到伴有发烧和痉挛性腹痛的严重假膜性肠炎以及严重并发症(例如结肠穿孔、脓毒症和中毒性巨结肠)的危险。作为毒力因子，首先涉及肠毒素(毒素A)和细胞毒素(毒素B)。这些毒素属于大梭菌毒素(LCT，Largeclostridial toxins)家族并且具有糖基转移酶活性。此外，数种菌株具有二元毒素CDT(ADP-核糖基转移酶)的基因，其被作为另外的毒力因子进行讨论。
将艰难梭菌分为所谓的标准菌株和其变种。作为标准艰难梭菌菌株，通常称为毒素型0菌株。对此，分为具有不同核糖核酸型(例如001、003和012)的菌株。毒素型0菌株的特征在于：存在毒素A和B两者的基因，而缺少二元毒素的基因。
近年来显示，除了标准艰难梭菌外，还有许多不同的变异艰难梭菌菌株，其具有增加的临床重要性并且也在家畜(特别是狗、猫)和有用动物(Nutztieren)(特别是牛犊和猪)中检测到。
因此，自2003年以来，在加拿大、USA、英国和许多其它欧洲国家观察到了地方性的、经常严重进展的变异艰难梭菌菌株感染。
与这些严重进展的感染相关而分离的变异艰难梭菌菌株既具有毒素A(tcdA)和毒素B(tcdB)的基因，也具有CDT的基因并且在其调控基因tcdC中具有部分缺失。
这些PCR-核糖核酸型027、毒素型III、REA-B1和PFGE NAP1的高毒力艰难梭菌菌株在调控基因(tcdC)中具有18bp的缺失并在117位具有移码，这被推测为是其在体外检测到的增加的毒素产生的原因和其提高的毒力的基础。此外，这些菌株的特征在于，与其它的艰难梭菌菌株相比，它们具有改变的表面蛋白和提高的对人肠表皮细胞的粘附。此外，这些菌株针对氟喹诺酮效果类的抗生素以及针对红霉素抗生素具有抗性-推测是由于gyrA/B和23sRNA的基因中的突变。
下文中，这些高毒力艰难梭菌菌株简称为“C.d-027-hv”。
迄今为止，艰难梭菌感染大多涉及超过60岁的患者，而C.d.-027-hv也在年轻患者中以及在医院之外在迄今具有低危险的患者中检测到了。其致死性相对于迄今为止检测到的艰难梭菌提高至五倍。
另一组临床相关的变异艰难梭菌菌株被归类为核糖核酸型017、毒素型VIII和血清型F。这些菌株主要的特征在于：它们在tcdA基因中具有1.7kB的大缺失并且由于提前的终止密码子而不表达毒素A。所述菌株具有针对克林霉素和氟喹诺酮的抗生素抗性，而缺少二元毒素CDT的基因，并且调控基因tcdC也不具有缺失。美国、日本、以色列、爱尔兰和荷兰等报道了这样的菌株大量出现。在具有这种感染的患者中死亡率超过标准菌株的死亡率14-66％。
下文中，将这些高毒力艰难梭菌菌株简称为“C.d-017-hv”。
艰难梭菌的诊断检测通常是通过检测毒素A、在一些情况下也通过联合检测毒素A和B而进行的。用该方法检测变异艰难梭菌菌株是不可能的。变异菌株根本不被检出(毒素A阴性菌株)或者不被单独检出。
为了鉴别和表征变异艰难梭菌菌株，需要对其进行分型。用于对艰难梭菌进行分型的方法是现有技术中已知的，例如毒素型分型、血清分型、核糖核酸分型或者通过PFGE或REA进行分型。然而，所有这些方法都是费力和费时的，只能由专业化的实验室进行并且首先需要对所牵涉的艰难梭菌菌株进行昂贵的分离。
此外，为了准确鉴别具体的艰难梭菌菌株，大多还需要进一步的研究，例如，在C.d.-027-hv的情形中，检测抗生素抗性和tcdC基因中的缺失。
因此，在实验室实践中，例如关于Cd.-027-hv的存在的研究，如下进行：
1.通过免疫测定，在患者的大便中通过检测毒素A和/或B而一般性地检测艰难梭菌，
2.当为阳性时：由研究材料培养艰难梭菌细菌，
3.在成功分离细菌的情况下：在E-测试中测试红霉素和莫西沙星抗性的存在，
4.在阳性抗性检测的情况下：通过DNA制备和核糖体RNA基因的PCR扩增(核糖核酸分型)[图1]测试核糖核酸型027的存在，
5.在核糖核酸型027为阳性检测的情况下：进行部分基因分型以检测毒素基因tcdA和tcdB二者、二元毒素CDT的基因cdtA/B和调控基因tcdC中的缺失，
6.在存在所测试的两种抗生素抗性和特征性基因分型模式的所有特征的情况下：诊断为高毒力艰难梭菌菌株核糖核酸型027(C.d.-027-hv)。
该迄今的实验室实践(其对于其它变异的和高毒力的艰难梭菌菌株相似的复杂)的缺点，首先在于其非常费时：为了分离和培养病菌，测定抗生素抗性和核糖核酸分型，时间需求为7-10天。
为了目标为阻止医院感染和控制感染爆发(既保护患者和工作人员也出于费用节省)的最佳感染监测，鉴别方法首先必须是快速和尽可能准确的。
因此，本发明的任务在于提供快速和安全地检测和鉴别样品(特别是患者样品(人或动物患者))中的变异艰难梭菌菌株的方法。
在所述任务的过程中特别存在的待解决的问题是(i)不同艰难梭菌菌株的毒素不是通过独特的区域相区别，(ii)产生针对确定的艰难梭菌菌株的LCT的特异性抗体不是微不足道的(EU资助的例如从事C.d.-027-hv菌株的研究的特别研究项目编号37870(缩写“EACCAD”)、并且此外具有产生针对C.d.-027-hv的LCT的抗体的目标)，(iii)还由其它的艰难梭菌形成二元毒素CDT，和(iv)允许检测大便样品中确定基因(例如tcdC)中的突变，通常不是免疫学地。
该任务的解决在于提供方法，所述方法的特征在于下述步骤：
(a)获得人或动物患者的身体排泄物样品和/或身体组织样品，
(b)使该样品与各来自抗体组组I、组II、组III、组IV、组V和组VI中的至少三组的至少一种抗体接触，其中
组I  包含下述抗体：泛TcdB抗体，
组II 包含下述抗体：与毒素TcdB-10463和TcdB-017反应，而不与毒素TcdB-8864和TcdB-027反应的抗体，
组III  包含下述抗体：与TcdB-10463反应，而不与毒素TcdB-8864、TcdB-017和TcdB-027反应的抗体，
组IV  包含下述抗体：与毒素TcdB-8864、TcdB-017和TcdB-027反应，而不与毒素TcdB-10463反应的抗体，
组V  包含下述抗体：与毒素TcdB-8864和TcdB-027反应，而不与毒素TcdB-10463和TcdB-017反应的抗体，
组VI  包含下述抗体：泛TcdA抗体
(c)检测抗体反应并生成反应模式，其中关于每个在(b)中所采用的、各抗体组I至VI的抗体，对于检测到的阳性抗体反应分配阳性符号(例如，“+”)，对于检测到的阴性抗体反应分配阴性符号(例如，“-”)，和
(d)将在(c)中获得的反应模式与参考模式进行比较，所述参考模式通过下述方式获得：来自现有技术中已知的且在就存在而进行检测的检测测试中的艰难梭菌菌株Rx1、Rx2、Rxi，在与步骤(b)中所选择的来自抗体组I至VI中至少三组的抗体的反应测试中采用了至少一种所述的或者Rx1、Rx2、Rxi各自的大梭菌毒素LCT-Rx1、LCT-Rx2、LCT-RXi，并且将对于每种LCT与抗体组I至VI中至少三组所获得的反应结果如此地以模式方式进行检测、或登记或描绘：在检测到阳性抗体反应的情况下给各抗体组分配阳性符号(例如，“+”)，或者在检测到阴性抗体反应的情况下给各抗体组分配阴性符号(例如，“-”)，
(e)评估在(c)中获得的反应模式与参考模式之间的一致性作为样品中存在相关参考模式的艰难梭菌菌株的指示。
在本文中含义如下：
.LCT：大梭菌毒素，即艰难梭菌的毒素A和/或毒素B
.TcdB-10463：艰难梭菌菌株VPI-10463的毒素B(＝“标准毒素”)
.TcdB-8864：艰难梭菌菌株8864的毒素B
.TcdB-1470：艰难梭菌菌株1470的毒素B
.TcdB-7002/8：艰难梭菌菌株7002/8的毒素B
.TcdB-017：具有核糖核酸型017的艰难梭菌菌株的毒素B
.TcdB-027：具有核糖核酸型027的艰难梭菌菌株的毒素B
.泛TcdA抗体：识别所有致病性艰难梭菌菌株的TcdA蛋白的抗体(例如，TTC8)
.泛TcdB抗体：识别所有致病性艰难梭菌菌株的TcdB蛋白的抗体(例如，2CV、TGC35)
根据本发明的方法的教导基于令人惊讶的认识，即
(1.)可以将针对艰难梭菌的LCT(即针对毒素A或毒素B)的抗体划分为六个组，对其表征如下：
组I＝泛TcdB抗体TGC35(DSM ACC 2918)和2CV(DSM ACC2321)以及与TGC35和/或2CV功能相同且作用相同的抗体；
组II＝与标准毒素TcdB-10463和变异的TcdB-017反应，但不与变异的毒素TcdB-8864和TcdB-027反应的抗体，特别是抗体TGC23(DSM ACC2917)和与其功能及作用相同的抗体；
组III＝与标准毒素TcdB-10463反应，但不与变异的毒素TcdB-8864、TcdB-017和TcdB-027反应的抗体，特别是抗体TGC41(DSM ACC2919)和与其功能及作用相同的抗体；
组IV＝与变异的毒素TcdB-8864和TcdB-017及TcdB-027反应但不与标准毒素TcdB-10463反应的抗体，特别是抗体TGC16(DSMACC2915)和与其功能及作用相同的抗体；
组V＝与变异的毒素TcdB-8864和TcdB-027反应但不与标准毒素TcdB-10463及变异的TcdB-017反应的抗体，特别是抗体TGC19(DSMACC2916)和与其功能及作用相同的抗体；
组VI＝泛TcdA抗体，其与所有致病性艰难梭菌菌株的TcdA蛋白反应，特别是抗体TTC8(DSM ACC 2322)和与其功能及作用相同的抗体(如US4879218中所描述的抗体PCG4)；
和
(2.)迄今已知的毒力变异艰难梭菌菌株或其LCT与这六个组的抗体(特别是其毒素B与I至V五个组的抗体)各显示特征性的反应模式，其区别于其它(高)毒力变异艰难梭菌菌株的毒素的反应模式和标准艰难梭菌菌株的毒素的反应模式。
例如，高毒力变异艰难梭菌菌株C.d.-027-hv通过反应模式“+--+++”来以组I、II、III、IV、V、VI的顺序被表征，而同样高毒力的艰难梭菌菌株C.d.-017-hv通过反应模式“++-+--”被表征(同样以组I、II、III、IV、V、VI的顺序)。
为了鉴别和检测不同的目前已知的和诊断上相关的毒力变异艰难梭菌菌株，通常来自至少三个不同抗体组的各至少一种抗体是必要的且足够的。例如，为了将艰难梭菌菌株C.d.-027-hv与其余的相关变异艰难梭菌菌株以及与标准艰难梭菌菌株相区分，II、IV和VI三组的反应模式(即“-++”(以组II、IV、VI的顺序))是足够的，为了区分或鉴别艰难梭菌菌株C.d.-017-hv，II、IV和VI三组的反应模式(即“++-”(同样以组II、IV、VI的顺序))是足够的。
根据本发明的方法特别伴有下述优势：
可以直接借助大便样品、通过简单进行的测试并且在几小时内确定特定的高毒力变异艰难梭菌菌株是否存在：例如研究C.d.-027-hv的存在并获得抗体-抗原反应模式，其对于来自抗体组I、IV、V和/或VI的至少一组的抗体不显示阳性反应，则可以可靠地诊断不存在C.d0-027-hv类型的菌株。反之，对于所有四个抗体组I、IV、V和VI，抗体-抗原反应模式均显示阳性反应，则存在非常高的被C.d.-027-hv菌株感染的可能性。为了证实该怀疑诊断，则可以/应当进行费时和耗资的特异性分析、抗生素抗性、核糖核酸分型和/或基因分析(特别是毒素基因tcdA、tcdB和tcd A/B以及具有特征性缺失和移码的调控基因tcdC的检测)。
换言之：根据本发明的方法代替了常规研究方法中的前三个步骤(毒素检测、细菌培养、抗生素抗性测试)并且使得能够在显著更短的时间(即几个小时，相对于常规方式的若干天)中、在不存在待检变异艰难梭菌菌株(例如C.d.-027-hv)感染的情形中，有至少一个可靠的排除诊断。当根据本发明的方法指明存在待检变异艰难梭菌菌株(例如C.d.-027-hv或C.d.-017-hv)时，才需要进行常规研究方法中费时和耗资的其它步骤(4、5和6)。
当基于本发明的检测测试的结果，确实给出了高度的C.d.-027-hv感染或C.d.-017-hv感染的风险时，那么也可以有针对性地采取预防措施例如分离、隔离、严格的卫生措施。
组I至VI的抗体优选地是单克隆抗体。原则上，作为用于本发明的方法的抗体，也考虑所有的、技术人员已知的天然的、生物技术制造的或基因技术制造的抗体备选物，例如骆驼抗体(纳米抗体)、Affibodies、Anticaline、半胱氨酸结微小蛋白。
在本方法的一个实施方案(其在实践中被证明是非常好的)中，至少一种来自组I的抗体是单克隆抗体2CV(DSM ACC 2321)或单克隆抗体TGC 35(DSM ACC2918)，和/或至少一种来自组II的抗体是单克隆抗体TGC23(DSM ACC2917)，和/或至少一种来自组III的抗体是单克隆抗体TGC41(DSM ACC2919)，和/或至少一种来自组IV的抗体是单克隆抗体TGC 16(DSM ACC2915)，和/或至少一种来自组V的抗体是单克隆抗体TGC 19(DSM ACC2916)和/或至少一种来自组VI的抗体是单克隆抗体TTC8(DSM ACC 2322)。
在实践中，身体排泄物样品优选地是大便样品，并且身体组织样品优选地是血液样品。
本方法的另一个实施方案(其对于实践是高度相关的，因为它使得能够快速可靠地检测变异艰难梭菌菌株)的特征在于，在步骤(b)中，使样品与来自组I、IV和VI的每组的各抗体接触，和在步骤(c)中，来自组I、IV和VI的抗体的阳性反应显示存在高毒力变异艰难梭菌菌株。
对于实践高度相关的本方法的一个实施方案(其使得能够快速可靠地检测核糖核酸型027、PFGE-NAP1、REA-B1和毒素型III高毒力艰难梭菌菌株并由此核实C.d.-027-hv的疑似情形)的特征在于，在步骤(b)中，使样品与来自抗体组组II、组IV和组VI的每组的各至少一种抗体接触，和在步骤(c)中，来自组IV和组VI的抗体的阳性反应以及来自组II的抗体的阴性反应显示存在核糖核酸型027、PFGE-NAP1、REA-B1、毒素型III类型的高毒力变异艰难梭菌菌株。
该实施方案还可以扩展，其中在步骤(b)中，还使样品与抗体组I和/或抗体组III和/或抗体组V的各至少一种抗体接触，并且其中此外在步骤(c)中，来自组I和组V的抗体的阳性反应以及来自组III的抗体的阴性反应显示存在核糖核酸型027、PFGE-NAP1、REA-B1、毒素型III类型的高毒力变异艰难梭菌菌株。
对于实践同样高度相关的本方法的另一个实施方案(其使得能够快速可靠地检测核糖核酸型017、毒素型VIII和血清型F高毒力艰难梭菌菌株并由此核实C.d.-017-hv的疑似情形)的特征在于，在步骤(b)中，使样品与来自抗体组组II、组IV和组VI的每组的各至少一种抗体接触，和在步骤(c)中，来自组II和组IV的抗体的阳性反应以及来自组VI的抗体的阴性反应显示存在核糖核酸型017、毒素型VIII和血清型F类型的高毒力变异艰难梭菌菌株。
该实施方案还可以扩展，其中在步骤(b)中还使样品与抗体组I和/或抗体组III和/或抗体组V的各至少一种抗体接触，并且其中此外在步骤(c)中，来自组I的抗体的阳性反应和来自组III及组V的抗体的阴性反应显示存在核糖核酸型017、毒素型VIII和血清型F类型的高毒力变异艰难梭菌菌株。
本发明所基于的任务也通过提供这样的单克隆抗体而被解决，所述单克隆抗体由自2008年6月5日以来、以编号DSM ACC2916(TGC19)保藏于德国布伦瑞克的DSMZ的杂交瘤细胞系产生，并且用于根据本发明的方法中以检测和鉴别变异艰难梭菌菌株，特别适于并被计划用于用来检测和鉴别核糖核酸型027、PFGE-NAP1、REA-B1和毒素型III艰难梭菌菌株的方法变体中。
所述任务还通过提供这样的单克隆抗体而被解决，所述单克隆抗体由自2008年6月5日以来、以编号DSM ACC2917(TGC 23)保藏于德国布伦瑞克的DSMZ的杂交瘤细胞系产生，并且用于根据本发明的方法中以检测和鉴别变异艰难梭菌菌株，特别适于并被计划用于用来检测和鉴别核糖核酸型017，毒素型VIII和血清型F艰难梭菌菌株的方法变体中。
此外，所述任务通过提供这样的单克隆抗体而被解决，所述单克隆抗体由以编号DSM ACC2915(TGC 16)保藏于德国布伦瑞克的DSMZ的杂交瘤细胞系产生，并且用于所述方法中以检测和鉴别样品中的变异艰难梭菌菌株，特别地，特别适于并被计划用于用来检测和鉴别具有核糖核酸型017，毒素型VIII和血清型F的艰难梭菌菌株和/或具有核糖核酸型027、PFGE-NAP1、REA-B1和毒素型III的艰难梭菌菌株的方法变体中。
最后，所述任务通过提供这样的单克隆抗体而被解决，所述单克隆抗体由以编号DSM ACC2918(TGC 35)保藏于德国布伦瑞克的DSMZ的杂交瘤细胞系产生，并且用于所述方法中以检测和鉴别样品中的变异艰难梭菌菌株，特别地，特别适于并被计划用于用来检测和鉴别具有核糖核酸型017，毒素型VIII和血清型F的艰难梭菌菌株和/或具有核糖核酸型027、PFGE-NAP1、REA-B1和毒素型III的艰难梭菌菌株的方法变体中。
下面根据实施例进一步说明本发明：
在实施例中提及的图表示：
图1：所使用的菌株的核糖核酸分型。根据Stubbs等人的报告对菌株进行核糖核酸分型并通过用参考菌株进行的调整而对不同的核糖核酸型进行归类。由此将菌株VPI-10463和菌株8864归入迄今未知的核糖核酸型，而将菌株1470归入核糖核酸型017和将菌株7002/8归入核糖核酸型027。标记物条带行进在600bp、500bp、400bp和300bp(从上面起)。
图2：纯化的毒素B变异体。在经考马斯染色的SDS-PAGE中显示不同的毒素B变异体。每道加载250-400ng单一毒素。
图3：单克隆抗毒素B抗体特异性的检测。在SDS-PAGE中使不同的毒素B变异体分离，将其印迹到尼龙膜上并随后用相应的抗体显色。所显示的是单克隆抗体TGC35(图3A)、TGC16(图3B)、TGC41(图3C)、TGC23(图3D)和TGC19(图3E)的特异性。
图4：单克隆抗体的结合区。图4A是毒素B的结构的图示。图4B显示了毒素B内的抗体结合区。图4C显示单克隆抗体的反应活性。
图5：艰难梭菌菌株的参考模式。通过使用来自抗体组I、II、IV和VI的捕获抗体用夹心ELISA测试了四种不同的艰难梭菌菌株在培养上清液中的毒素A和毒素B表达。作为捕获抗体所使用的是来自组I：TGC35，来自组II：TGC23，来自组IV：TGC16，组VI：TTC8。所显示的是艰难梭菌菌株VPI-10463(图5A)、8864(图5B)、1470核糖核酸型017(图5C)和7002/8核糖核酸型027(图5D)的识别模式。
图6：捕获-ELISA中不同艰难梭菌菌株的反应模式。被用作鉴别抗体的是来自组I的TGC35，来自组II的TGC23，来自组IV的TGC16和来自VI的TTC8。图6A中描绘了来自17种不同的艰难梭菌菌株的结果，且在图6B中描绘了其它艰难梭菌菌株的结果。
实施例1：与艰难梭菌的毒素B特异性反应的单克隆抗体的制备
(A)获得来自不同艰难梭菌菌株的纯化的艰难梭菌毒素B
所使用的艰难梭菌菌株：
VPI-10463(ATCC43255)，
8864(CCUG20309)，
1470(ATCC43598)，和
7002/8(来自患者样品的人分离株)。
根据Stubbs等人(1999)的核糖核酸分型方法对所述菌株进行核糖核酸分型。由此获得的结果表示在图Abb.1中。它显示，菌株1470符合核糖核酸型017且菌株7002/8符合核糖核酸型027，而菌株VPI-10463和8864被归入迄今尚未正式命名的核糖核酸型。
由菌株VPI-10463表达的毒素B(TcdB-10463)在现有技术中一般被称作标准毒素。
菌株8864产生此毒素B的变异体(TcdB-8864)，其主要在C末端受体结合结构域中与标准毒素相区别(Soehn等人，1998)。
菌株1470表达毒素B(TcdB-1470)，其特别在N末端酶结构域中与标准毒素B相区别(来自Eichel-Streiber等人，1995)。
不知道菌株7002/8核糖核酸型027的毒素B的序列。相反，确定了两种其它的C.d.-027-hv菌株(菌株QCD-32g58，Genbank登录号NZ_AML00000000，菌株R20291，www.sanger.ac.uk)中的TcdB-027序列。这些TcdB-027序列与标准毒素B和其它变异TcdB毒素的比较表明，TcdB-027在N末端、酶结构域中与标准毒素TcdB-10463相似，然而在C末端结构域中与毒素TcdB-8864相似。
为了纯化毒素，使细菌厌氧地吸附在脑心输注营养培养基(BectonDickinson，Heidelberg，德国)中。随后将毒素A和B从该培养的上清液中纯化，如Moos等人(2000)所描述的。在考马斯凝胶中检验毒素的纯度(比较，图2)。
用现有技术中已知的和常用的方法将艰难梭菌菌株VPI-10463、8864和1470的经分离和纯化的TcdB灭活并在细胞毒性测试中检验灭活的效果。
(B)获得针对来自(A)的毒素B变异体的单克隆抗体
顺次各使多只小鼠经受灭活的毒素B变异体TcdB-8864和TcdB-1470以及标准毒素TcdB 10163，首先经受基础免疫且随后经受两次加强免疫。
测定所述动物对免疫原的滴度，如果产生了显著的滴度则取出脾脏。用现有技术中已知和常用的方法使分离的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞系X63Ag8.653(ATCC CRL1580)融合并随后挑选和克隆融合细胞。根据针对用于进行免疫的毒素B的特异性单克隆抗体的产生，免疫学地筛选由此获得的杂交瘤克隆。
总共进行了15次融合，且最后分离了21个不同的、表达毒素B特异性抗体的杂交瘤细胞系。
对于其它研究，从细胞培养上清液纯化抗体。为此，使杂交瘤细胞系吸附于无血清培养基ISF-1(Biochrom，德国柏林)中，并随后在Spinner-System(Bellco，Vineland，USA)中、以50rpm、在250ml的体积中进行培养，直至培养物的活力降低至小于30％。用蛋白A柱(HiTrap MabSelect SuRe，GE Healthcare，Freiburg，德国)纯化培养物上清液。所纯化的抗体的浓度为l-2mg/ml，在考马斯凝胶中检验所述纯度。
实施例2：抗毒素B抗体的表征
为了表征在实施例1中产生的抗体，在蛋白质印迹中测试所述抗体。
为此首先在SDS-PAGE中分离各250-400ng的标准毒素B-10463和毒素B变异体TcdB-8864、TcdB-017以及TcdB-027并随后在半干燥印迹方法中印迹到尼龙膜上。按照现有技术中已知的方法进行显色。
为了检测毒素，使用在实施例1产生的单克隆抗体。
带有实验室符号TGC 16、TGC 19、TGC 23、TGC 35和TGC 41的抗体的结果总结在图3中：
这些结果显示，大多数所产生的抗体识别不同毒素B变异体的亚组并且不是仅对确定的毒素变异体为单特异性的。
总共鉴别了11种与标准毒素B和所有的毒素B变异体结合的不同的抗体。这种所谓泛TcdB抗体的一个特征性的代表是抗体TGC35。产生所述TGC 35的杂交瘤细胞系自2008年6月5日以来、以编号DSM ACC2918保藏于DSMZ(德意志微生物保藏中心，德国布伦瑞克)。
一些抗体既与标准毒素反应也与毒素TcdB-017反应。这一抗体组的一个特征性代表是抗体TGC 23。产生所述TGC 23的杂交瘤细胞系自2008年6月5日以来、以编号DSM ACC2917保藏于DSMZ。
一些抗体与标准毒素TcdB-10463特异性反应。这一抗体组的一个特征性代表是抗体TGC 41。产生所述TGC 41的杂交瘤细胞系自2008年6月5日以来、以编号DSM ACC2919保藏于DSMZ。
令人惊讶地，还可以产生与一种或多种毒素B变异体反应而不与标准毒素B反应的两种抗体。
抗体TGC 16不与标准毒素B结合，但与变异毒素TcdB-8864、TcdB-017和TcdB-027结合。产生所述TGC 16的杂交瘤细胞系自2008年6月5日以来、以编号DSM ACC2915保藏于DSMZ。
抗体TGC 19不与标准毒素B或变异毒素TcdB-017结合，但与变异毒素TcdB-8864及TcdB-027结合。产生所述TGC 19的杂交瘤细胞系自2008年6月5日以来、以编号DSM ACC2916保藏于DSMZ。
在捕获ELISA中关于其抗原检测范围对抗体进行研究。为此将ELISA平板的每孔用50μl包被缓冲液(50mM Na2CO3、50mMNaHCO3，pH9.6)和250ng每种抗体在室温下孵育3h并从而使抗体附加至ELISA平板。通过之后用200μl 5x WAPU(12.5ml TritonX100，62.5ml 1M Tris-HCl pH7.5，62.5ml 20％的明胶溶液，用H2O加至500ml)孵育30分钟的时间来封闭非特异性结合位点。随后施用不同浓度的抗原，即在TGC 16和TGC 19的情况下施用抗原TcdB-027，而在TGC 23和TGC 35的情况下施用抗原TcdB-017。用多克隆血清(266ng/ml)进行检测。反应结果(本文未描述)显示，对于抗体TGC 16和TGC 23，各毒素B的检测范围为＜300pg/ml，对于抗体TGC 35，其为低于lng/ml以及对于抗体TGC 19，其在lng/ml附近。
关于其与毒素B的结合位置对抗体TGC 16、TGC 19、TGC 23、TGC 35和TGC 41进行了研究。通过毒素B的蛋白水解消化或通过在大肠杆菌(E.coli)中克隆和表达重组毒素B部分片段而制备毒素B的蛋白片段。在蛋白质印迹实验中使这些毒素B片段分离并且随后用抗体TGC 16、TGC 19，TGC 23、TGC 35和TGC 41孵育所述印迹。该研究的结果被图示总结在图4中并且显示，单一的抗体识别或结合毒素B分子的不同区域。
所有氨基酸位置说明都是参照标准毒素TcdB-10463中的相应位置而标明的。
TGC 16在糖基转移酶结构域中与TcdB-8864、TcdB-017和Tcd-027各自结合，并且在那里在氨基酸位置122至261的范围内。
TGC 19在糖基转移酶结构域之后的氨基酸位置543和2366之间的范围内与TcdB-8864和Tcd-027各自结合。
TGC 23在具有氨基酸位置1692和2113之间的C末端区段的配体结构域中与标准毒素和TcdB-017各自结合。
TGC 35在易位结构域内与标准毒素、TcdB-8864、TcdB-017及Tcd-027各自结合，所述易位结构域在毒素N末端处的糖基转移酶结构域和氨基酸位置543和1692之间的C末端处的配体结构域之间。
TGC 41与TGC 16类似地结合标准毒素，也就是说，在糖基转移酶结构域内并且在那里在氨基酸122至261的范围内。
TGC 16和TGC 41在相同的毒素B区中结合，即在糖基转移酶结构域中，然而来自不同的毒素B变异体，即一方面来自标准毒素(TGC 41)而另一方面来自TcdB-8864、TcdB-017和Tcd-027(TGC16)。由此第一次在毒素B中鉴别了这样的区域，其使得能够特异性地区分标准毒素B TcdB-10463与变异毒素TcdB-8864、TcdB-017和Tcd-027。令人惊讶地，该区域恰好涉及糖基转移酶结构域，其介导毒素B的酶活性。原则上，酶活性在所有毒素B中是相同的。
用本发明中新产生的抗体允许建立不同组(类)的抗体(抗体组/抗体类)，其关于与标准毒素B和与不同的毒素B变异体的反应活性而彼此相区别：
泛-TcdB抗体的组在下文中被称为组I。该组的典型代表是单克隆抗体TGC 35和2CV(从EP 0994904中获知)。
这样的抗体的组在下文中被称为组II：所述抗体既与标准毒素反应也与毒素TcdB-017反应，但不与变异毒素TcdB-027和TcdB-8864反应。该组的典型代表是单克隆抗体TGC 23。
这样的抗体的组在下文中被称为组III：所述抗体与标准毒素TcdB-10463反应，但不与变异毒素TcdB-027、TcdB-8864和TcdB-1470反应。该组的典型代表是单克隆抗体TGC 41。
这样的抗体的组在下文中被称为组IV：所述抗体不与标准毒素B相互作用，但与毒素TcdB-8864、TcdB-017和TcdB-027相互作用。该组的典型代表是单克隆抗体TGC 16。
这样的抗体的组在下文中被称为组V：所述抗体不与标准毒素B或毒素TcdB-017反应，但与毒素TcdB-8864和TcdB-027反应。该组的典型代表是单克隆抗体TGC 19。
此外，从文献中已知泛TcdA特异抗体的组，其在下文中被称为组VI。该组的典型代表是单克隆抗体TTC8(从EP 0994904中获知)。
实施例3：在捕获-ELISA中检测LCT-通过使用抗体组I、II、IV和VI建立对已知的变异艰难梭菌菌株的抗原-抗体参考模式
原则上，抗原-抗体参考模式的建立如下进行：从现有技术中已知的且就存在待检测的检测测试中的艰难梭菌菌株Rx1、Rx2、Rxi中各至少获得毒素B，优选两种大梭菌毒素(LCT)均获得(以培养物上清液或纯化的毒素的形式)。用这些已知的毒素LCT-Rx1、LCT-Rx2、LCT-Rxi，与来自优选地抗体组I至VI的每组的各至少一种抗体进行反应测试。将对于每种LCT(LCT-Rx1、LCT-Rx2、LCT-Rxi)和所采用的抗体组所获得的反应结果如此地以模式方式进行登记：在检测到阳性抗体反应的情况下给各抗体组分配阳性符号(例如“+”)，或者在检测到阴性抗体反应的情况下给各抗体组分配阴性符号(例如，“-”)。
在所设想的实施例中，具体如下进行：
用实施例2中所描述的纯化的抗体TGC35(组I)、TGC23(组II)、TGC 16(组IV)和TTC8(组VI)如下装载ELISA-平板：每孔用50μl包被缓冲液(50mM Na2CO3、50mM NaHCO3，pH9.6)与250ng含量的每种抗体在室温下孵育3小时并从而使所述抗体附加至ELISA平板。随后通过用200μl 5xWAPU(12.5ml Triton X100，62.5ml 1M Tris-HClpH7.5，62.5ml 20％的明胶溶液，用H2O加至500ml)孵育30分钟的时间来封闭非特异性结合位点。
如在实施例1中所描述地吸附艰难梭菌菌株10463、8864、1470和7002/8，并且在用抗体涂布的微量滴定板上给予50μl等份的培养物上清液。通过用TBST(150mM NaCl、10mM Tris、0.05％Tween20，pH8.0)清洗三次而去除非特异性结合的蛋白质。随后，任选地，用50μl多克隆抗毒素B-血清(266ng/ml)在捕获-ELISA中检测各个结合了抗体的毒素。用标准方法通过碱性磷酸酶进行显色。
这些ELISA的结果以图表显示在图5中。从图5中显而易见的是，四种不同的艰难梭菌菌株中的每一种与四种所采用的抗体显示出独特的、对于其为特征性的反应模式，这使其与其它菌株的反应模式相区别：
菌株VPI-10463的上清液与抗体TGC 35/组I、TGC 23/组II和TTC8/组VI阳性地反应，且与TGC 16/组IV阴性地反应(见图5A)。
菌株8864的上清液与抗体TGC 35/组I和TGC 16/组IV阳性地反应，且与TGC 23/组II和TTC8/组VI阴性地反应(见图5B)。
菌株1470(核糖核酸型017)的上清液与抗体TGC 35/组I、TGC23/组II和TGC 16/组IV阳性地反应，且与TTC8/组VI阴性地反应(见图5C)。
菌株7002/8(核糖核酸型027)的上清液与抗体TGC 35/组I、TGC16/组IV和TTC8/组VI阳性地反应，且与TGC 23/组II阴性地反应(见图5D)。
在用核糖核酸型027的艰难梭菌菌株的毒素B与抗体组I至VI的抗体的不同组合进行的平行试验中，证实了该结果，TcdB-027与组I、IV、V和VI的抗体总是阳性地反应，且与组II和III的抗体总是阴性地反应。
换言之，未知的艰难梭菌菌株的毒素B与六个抗体组的抗体的反应模式“+--+++”(以组I、组II、组III、组IV、组V、组VI的顺序)允许了这样的推论：所述未知的艰难梭菌菌株涉及核糖核酸型-027或所述核糖核酸型-027，而高毒力菌株c.d.-027-hv也属于此类型。
在用核糖核酸型017的艰难梭菌菌株的毒素B与抗体组I至VI的抗体的不同组合进行的平行试验中，证实了该结果，TcdB-017与组I、II和IV的抗体总是阳性地反应，且与组III、V和VI的抗体总是阴性地反应。
换言之，未知的艰难梭菌菌株的毒素B与六个抗体组的抗体的反应模式“++-+--”(以组I、组II、组III、组IV、组V、组VI的顺序)允许了这样的推论：所述未知的艰难梭菌菌株涉及核糖核酸型-017或所述核糖核酸型-017，而高毒力菌株c.d.-017-hv也属于此类型。
实施例4：根据抗原-抗体反应参考模式鉴别艰难梭菌核糖核酸型
为了建立抗原-抗体-反应参考模式，如在实施例3中所描述地进行。
对于建立样品特异性反应模式，如下进行：用已知的方法吸附待研究的艰难梭菌菌株并测试上清液或经纯化的毒素。为此，通过技术人员已知的和常用的方法将来自组I、II、III、IV、V和VI的至少两组、优选三组或四组的各至少一种抗体(例如TGC16、TGC19、TGC23、TGC 41、TGC 35和TTC8)涂布在合适的表面(例如膜)上。
随后，使样品与这些抗体(下文中称作鉴别抗体)接触。对此适合的方法是技术人员已知的，例如ELISA或所谓的“侧流”方法(如在EP 1143248中所描述的)。
在方法特异性反应时间的最后，从各配制物释放未结合的样品材料(清洗)。
为了检测哪种鉴别抗体与样品显示抗原-抗体反应而哪种不反应，利用检测抗体。作为检测抗体，可以使用针对毒素A和毒素B的多克隆血清(单特异性的或交叉反应的)，或者还使用来自组I、II、III、IV、V和VI中一组或多组的抗体。在选择检测抗体时需注意，其目标表位与鉴别抗体的目标表位相区别或者原则上在各毒素中多重存在，从而检测抗体能够结合与鉴别抗体相结合的毒素。用适当的标记，例如胶体金、碳颗粒或乳胶颗粒或酶标记(例如HRP(辣根过氧化物酶)或碱性磷酸酶)标记检测抗体。
在应用样品之前、或者与样品同时或者在方法特异性反应时间的过程中，在鉴别抗体和样品之间向配制物中加入检测抗体。
在方法特异性反应时间的最后去除(清洗掉)未与鉴别抗体相结合的样品-毒素以及可能存在于样品中的污染蛋白，是为了当由鉴别抗体、样品-毒素和检测抗体形成结合物(复合物)时只出现一个标记物信号(正信号“+”)。
在反应模式中，将对于每种鉴别抗体所获得的标记信号“+”或“-”排列在一起。这样的反应模式可以例如看起来如图5A。在此情形中，与参考模式的比较得出这样的推论(或怀疑诊断)：存在艰难梭菌菌株VPI-10463。
当反应模式例如看起来如图5B时，与参考模式的比较得出这样的推论(怀疑诊断)：存在艰难梭菌菌株8864。当反应模式例如看起来如图5C时，与参考模式的比较得出这样的推论(怀疑诊断)：存在艰难梭菌菌株1470或核糖核酸型017的艰难梭菌菌株。当反应模式例如看起来如图5D时，与参考模式的比较得出这样的推论(怀疑诊断)：存在艰难梭菌菌株7002/8或核糖核酸型027的艰难梭菌菌株。
实施例5：用组I、II、IV、VI的抗体分析不同的艰难梭菌菌株
在下面的实验中，根据一系列具有已知核糖核酸型的菌株，即19种核糖核酸型027的菌株(Lumc-1、Lumc-2、Lumc-3、Lumc-4、Lumc-5、Lumc-6、Lumc-8、Lumc-9、Lumc-10、Lumc-11、Lumc-12、Lumc-13、Lumc-14、Lumc-16、Lumc-17、Lumc-19、Lumc-20、Lumc-21、7002-42)、4种核糖核酸型017的菌株(Lumc-22、Lumc-23、Lumc-40、Lumc-41)、2种核糖核酸型001的菌株(7002-29、7002-43)和一种核糖核酸型014的菌株(Lumc-31)进行根据本发明的方法以鉴别和检测变异艰难梭菌菌株。作为参考菌株，使用菌株VPI-10463、8864和7002/8。在捕获-ELISA中采用组I、II、IV和VI的抗体并且将所得到的反应模式与所建立的参考模式进行比较(见实施例3)。
如实施例1中所描述的，吸附不同的艰难梭菌菌株并将上清液用于随后的实验中。作为鉴别抗体，如实施例3中所描述的，向ELISA平板上加载抗体TGC 35(组I)、TGC 23(组II)、TGC 16(组IV)和TTC8(组VI)。其中各使用250ng/孔TGC 23、128ng/孔TGC 16和TGC 35，以及lμg/孔TTC8，并随后在PBS中清洗平板。
为了进行ELISA，首先通过在37℃下、在PBS+3％BSA中孵育1小时来封闭非特异性的结合位点。随后加载50μl/孔的艰难梭菌培养物上清液并将平板在37℃下再孵育1小时。通过用PBS+3％BSA清洗三次来去除未结合的蛋白质。作为检测抗体，在TGC 35、TGC 16和TGC 23的情形中，使用经生物素标记的多克隆抗毒素B血清(0.32μg/ml)。在毒素A检测的情形中，也可将生物素化形式的抗体TTC8用作检测抗体。在用PBS+3％BSA再次清洗后，加入50μl抗生蛋白链菌素-HRP(0.lμg/ml，Pierce，Rockford，USA)/孔并将该平板在37℃下孵育1小时。随后，用PBS清洗所述平板并用50μl/孔TMB(1-Step Ultra TMB，Pierce，Rockford，USA)进行显色。将平板在室温下在黑暗中孵育30分钟并随后用l00μl/孔的2M H2SO4终止反应。相对于空白值在OD450处进行评估。将0.5确定为阈值。
该试验的结果以图的形式表示在图6A和图6B中：
·在19个不同的菌株中，以组I、II、IV和VI的顺序检测反应模式“+-++”。
·在4个不同的C.d.-017-hv-菌株中，以组I、II、IV和VI的顺序检测反应模式“+++-”。017菌株的分析显示，该菌株在体外总体产生相对少的毒素(TGC 35信号也按比例地弱)。但是，明确的是，只在这些菌株中发生抗体TGC 23(DSM ACC 2917)与毒素B-017之间的特异反应。而在所有其它上清液的情形中(即所有C.d.-027-hv菌株，以及全部所测试的核糖核酸型001菌株)，在使用检测抗体TGC 23时的值不超过0.4，在C.d.-017-hv菌株的情况下，吸光度总是清楚地超过0.5的阈值。
结果证实了，以组I、II、IV和VI的顺序的抗原-抗体反应模式“+-++”允许这样的论断：所研究的菌株是C.d.-027-hv菌株，并且在以组I、II、IV和VI的顺序的反应模式为“+++-”时必然推断出存在C.d.-017-hv菌株。
所提及文献的列表：
Moos等人(2000)″Purification and evaluation of large clostridialcytotoxins that inhibit small GTPases of Rho and Ras subfamilies″，Meth Enzymol.325：114-125。
Soehn等人(1998)″Genetic rearrangement in the pathogenicitylocus of Clostridium difficile strain 8864-implications fortranscription，expression and enyzmatic activity of toxin A and B″Mol Gen Genet 258：222-232。
Stubbs等人(1999)″PCR targeted to the 16-23rRNA gene intergenicspace region of Clostridium difficile and construction of a library of116 different PCR ribotypes″，J Clin Microbiol 37：461-463。
von Eichel-Streiber等人(1995)″Closing in on the toxic domainthrough analysis of a variant Clostridium difficile cytotoxin B″MolMicrobiol 17：313-321。

Claims (18)

1.用于检测和鉴别样品中具有核糖核酸型017或核糖核酸型027的变异艰难梭菌(C.difficile)菌株的体外方法，其特征在于下述步骤：
(a)使身体排泄物样品和/或身体组织样品与各来自抗体组组I、组II、组III、组IV、组V和组VI中的至少三组的至少一种抗体接触以检测与样品的阳性或阴性反应，其中
组I由下述抗体组成：泛TcdB抗体TGC35(DSM ACC2918)，泛TcdB抗体2CV(DSM ACC2321)以及与TGC35和/或2CV功能相同且作用相同的抗体，
组II由下述抗体组成：抗体TGC23(DSM ACC2917)和与其功能及作用相同的抗体，其与毒素TcdB-10463和TcdB-017反应，而不与毒素TcdB-8864和TcdB-027反应，
组III由下述抗体组成：抗体TGC41(DSM ACC2919)和与其功能及作用相同的抗体，其与TcdB-10463反应，而不与毒素TcdB-8864、TcdB-017和TcdB-027反应，
组IV由下述抗体组成：抗体TGC16(DSM ACC2915)和与其功能及作用相同的抗体,其与毒素TcdB-8864、TcdB-017和TcdB-027反应，而不与毒素TcdB-10463反应，
组V由下述抗体组成：抗体TGC19(DSM ACC2916)和与其功能及作用相同的抗体，其与毒素TcdB-8864和TcdB-027反应，而不与毒素TcdB-10463和TcdB-017反应，
组VI由下述抗体组成：抗体TTC8(DSM ACC2322)和与其功能及作用相同的抗体，其与所有致病性艰难梭菌菌株的TcdA蛋白反应；
且其中TcdB-10463代表艰难梭菌菌株VPI-10463的毒素B，
TcdB-8864代表艰难梭菌菌株8864的毒素B，
TcdB-017代表具有核糖核酸型017的艰难梭菌菌株的毒素B，
TcdB-027代表具有核糖核酸型027的艰难梭菌菌株的毒素B，
(b)对于(a)的抗体组I至VI中的所述至少三组检测抗体反应并生成样品特异性反应模式，其中关于每个在(a)中所采用的、各抗体组I至VI的抗体，对于检测到的阳性抗体反应分配阳性符号，对于检测到的阴性抗体反应分配阴性符号，和
(c)将在(b)中获得的样品特异性反应模式与参考模式进行比较，所述参考模式通过下述方式获得：来自现有技术中已知的且在检测测试中就其存在而进行检测的艰难梭菌菌株Rx1、Rx2、Rxi，在与步骤(a)中所选择的来自抗体组I至VI中所述至少三组的抗体的反应测试中采用了至少一种、Rx1、Rx2、Rxi各自的大梭菌毒素(LCT)LCT-Rx1、LCT-Rx2、LCT-Rxi，并且将对于每种LCT与抗体组I至VI中至少三组所获得的反应结果如此地以模式方式进行登记：在检测到阳性抗体反应的情况下给各抗体组分配阳性符号，或者在检测到阴性抗体反应的情况下给各抗体组分配阴性符号，
(d)评估在(b)中获得的样品特异性反应模式与(c)的参考模式之间是否存在一致性，其中所述一致性指示样品中存在相关参考模式的艰难梭菌菌株，
其中所述方法不是外科手术方法。
2.根据权利要求1的方法，其中所述身体组织样品为血液样品。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体。
4.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述至少一种来自组IV的抗体是单克隆抗体TGC16(DSM ACC2915)。
5.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述至少一种来自组V的抗体是单克隆抗体TGC19(DSM ACC2916)。
6.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述至少一种来自组VI的抗体是单克隆抗体TTC8(DSM ACC2322)。
7.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述至少一种来自组I的抗体是单克隆抗体2CV(DSM ACC2321)或单克隆抗体TGC35(DSM ACC2918)。
8.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述至少一种来自组II的抗体是单克隆抗体TGC23(DSM ACC2917)。
9.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述至少一种来自组III的抗体是单克隆抗体TGC41(DSM ACC2919)。
10.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，
在步骤(b)中，使样品与来自组I、IV和VI的每组的各抗体接触，以及
在步骤(c)中，来自组I、IV和VI的抗体的阳性反应显示高毒力变异艰难梭菌菌株的存在。
11.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，
在步骤(b)中，使样品与来自抗体组组II、组IV和组VI的每组的各至少一种抗体接触，以及
在步骤(c)中，来自组IV及组VI的抗体的阳性反应和来自组II的抗体的阴性反应显示高毒力艰难梭菌菌株核糖核酸型027、PFGE-NAP1、REA-B1和毒素型III的存在。
12.根据权利要求11的方法，其特征在于，
此外，在步骤(b)中，使样品与抗体组I和/或抗体组III和/或抗体组V的各至少一种抗体接触，以及
此外，在步骤(c)中，来自组I及组V的抗体的阳性反应和来自组III的抗体的阴性反应显示高毒力艰难梭菌菌株核糖核酸型027、PFGE-NAP1、REA-B1和毒素型III的存在。
13.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，
在步骤(b)中，使样品与来自抗体组组II、组IV和组VI的每组的各至少一种抗体接触，以及
在步骤(c)中，来自组II及组IV的抗体的阳性反应和来自组VI的抗体的阴性反应显示高毒力艰难梭菌菌株核糖核酸型017、毒素型VIII和血清型F的存在。
14.根据权利要求13的方法，其特征在于，
此外，在步骤(b)中，使样品与抗体组I和/或抗体组III和/或抗体组V的各至少一种抗体接触，以及
此外，在步骤(c)中，来自组I的抗体的阳性反应和来自组III及组V的抗体的阴性反应显示高毒力艰难梭菌菌株核糖核酸型017、毒素型VIII和血清型F的存在。
15.单克隆抗体，其由以编号DSM ACC2916(TGC19)保藏于德国布伦瑞克的DSMZ的杂交瘤细胞系产生，所述抗体用于根据权利要求1至14之一的方法，以检测和鉴别艰难梭菌菌株核糖核酸型027、PFGE-NAP1、REA-B1和毒素型III。
16.单克隆抗体，其由以编号DSM ACC2917(TGC23)保藏于德国布伦瑞克的DSMZ的杂交瘤细胞系产生，所述抗体用于根据权利要求1至14之一的方法，以检测和鉴别艰难梭菌菌株核糖核酸型017、毒素型VIII和血清型F。
17.单克隆抗体，其由以编号DSM ACC2915(TGC16)保藏于德国布伦瑞克的DSMZ的杂交瘤细胞系产生，所述抗体用于根据权利要求1至14之一的方法，以检测和鉴别具有核糖核酸型017、毒素型VIII和血清型F和/或具有核糖核酸型027、PFGE-NAP1、REA-B1和毒素型III的艰难梭菌菌株。
18.单克隆抗体，其由以编号DSM ACC2918(TGC35)保藏于德国布伦瑞克的DSMZ的杂交瘤细胞系产生，所述抗体用于根据权利要求1至14之一的方法，以检测和鉴别具有核糖核酸型017、毒素型VIII和血清型F和/或具有核糖核酸型027，PFGE-NAP1、REA-B1和毒素型III的艰难梭菌菌株。
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