JP4122419B2 - 便、唾液試料および生検材料中のヘリコバクターピロリおよびハイルマニの検出方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、便および唾液試料または生検材料中のヘリコバクター抗原を検出する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
ヒトの胃粘膜にはしばしばヘリコバクター属のHelicobacter pylori(ヘリコバクターピロリ)やHelicobacter heilmanii(ヘリコバクターハイルマニ)またはカンピロバクター属の細菌に感染している。これらの細菌への感染はおそらくヒトからヒトに起こるが、飲み水や食物も感染源として除外されない。Helicobacter heilmanii株は猫、犬、ウサギのようなペットや、牛のような家畜で伝染する。この理由のため、畜産や動物の飼育に関わっている人々は、特に感染しやすい。ドイツでは約10%の生徒、30%の30歳代の人々、および約75%の高齢者がヘリコバクターピロリに感染している。世界中では、約50%の人々がこの感染を媒介している。胃炎の発生の80%、十二指腸潰瘍の95%、空洞の潰瘍の70%がヘリコバクターピロリによって引き起こされる。さらに、慢性ヘリコバクターピロリ胃炎(B型胃炎)は、胃腺癌および胃リンパ腫の前兆と考えられている。WHOによれば、ヘリコバクターピロリは最もガンのリスクが高いクラスの発ガン要因である。ヘリコバクターピロリに感染した人々のうちの少数の一部で症状が進行する。彼らの多くは胃炎にも関わらず、顕著な不平を言わずに生活し、むしろ、その非特異的な症状を他の原因のせいにする。急性ヘリコバクターピロリ胃炎は、胃の上部および中部の不明確な痛み、圧迫感および満腹感、酸性のおくび、胸やけを通じて、およびむかつきや吐き気を通じて、兆候が現れる。実際には、B型胃炎をもつすべての患者で、ヘリコバクターピロリの感染が見られる。一般に大量な免疫反応にも関わらず、その感染は、これらの患者に慢性化する。潰瘍が進行するかどうかは、患者の免疫系および菌の攻撃性または菌種に依存する。自発的な回復は稀である。一般にヘリコバクターピロリ感染は、治療しなければ、一生持続する。
【0003】
ヘリコバクターピロリ感染は、洞からの病原体の培養または生体組織検査によって、または組織の組織学的検査によって診断できる。さらに、診断方法はCLO試験(カンピロバクター様生物の検査)またはウレアーゼ尿素試験、13C−同位体呼気試験、血清中の抗ヘリコバクターピロリ抗体の検出、胃の液体または便の試料中のヘリコバクターDNAのPCR法による検出、および便試料中のヘリコバクターピロリ抗原の検出である。
【0004】
米国特許第5716791号(ラルカ他)および欧州特許第0806667号(メリディアン・ダイアグノスティックス社)は、便中のヘリコバクターピロリ抗原の免疫学的検定法(イムノアッセイ)を開示している。その検定法はアフィニティーにより精製された、ヘリコバクターピロリ抗原に対する2つのポリクローナル抗体に基づいている。さらに、コネックス GmbH,マルティンスリード,独国による、便のヘリコバクターピロリ抗原に対する、金で標識されたモノクローナル抗体の側方フロークロマトグラフィーに基づいている即時試験も利用可能である。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
これらのいわゆるHpSA(Helicobacter pylori Stool(便) Antigen(抗原))試験は、様々な臨床的研究において他の方法により診断された場合と良好な一致を与えているが、試験のうちの高いパーセンテージが、明確な結果となっていない。HpSA試験はさらに、便中にふんだんな量のヘリコバクターピロリ抗原があるときのみ機能するため、除菌処理をモニターするのに適していない。さらに別の診断方法は一部、非常に複雑であり、患者に精神的な負荷が大きいか、あるいは日常的な試験としては高価すぎる。血清の方法は、除菌の数ヶ月後さえ抗体の滴定量が高いままであるため、治療の過程をモニターできない点で不利である。しかしながら、クラリスロマイシン、メトロニダゾール、アモキシシリン、オメプラゾールまたはプロトンポンプ阻害剤のような使用される抗生物質に対する耐性が存在する可能性があるため、治療の過程のモニターは不可欠である。したがって、抗生物質および天然薬の代替物による感染の治療に、単純で信頼できる高感度なヘリコバクターピロリの試験方法が要求される。
【0006】
【課題を解決するための手段】
この目的は、請求項1によるイムノアッセイによって達成される。本発明の好適な実施形態は従属請求項に示される。
【0007】
本発明による試料中のヘリコバクター病原体抗原の検出方法は、病原体の試験が行われるヒトの試料を採取し、試料緩衝液に懸濁して、病原体抗原を含む試料緩衝液と、少なくとも2つの異なる一次抗体であって、一つが病原体の抗原に結合可能であり、他の一つがヒト免疫グロブリンに結合可能であるものが結合された固相とを一緒にして、固相の非特異的に結合した抗原を洗浄し、固相と病原体の抗原を特異的に認識する二次抗体とを一緒にして、結合した二次抗体の量を決定することを特徴とする。
【0008】
固相に結合した二次抗体の量は、例えば抗体を標識することにより定量できる。標識は放射性であっても、発光性または蛍光性原子団であって、ストレプトアビジンのようなさらに別の分子と結合できるビオチンのような原子団、または検出反応を触媒するペルオキシダーゼのような酵素のような原子団でもよい。結合した二次抗体の量は、抗体の型を特異的に認識し、上記の標識の一つを保有するさらに別の抗体によっても定量できる。
【0009】
固相に結合したヒト免疫グロブリンに対する第2の一次抗体は、好適にはヒトIgAに結合する抗体であり、特に好適には、唾液中および大腸中に分泌される分泌型ヒトIgAに結合する抗体である。ここで、分泌型ヒトIgAの意味はヒトIgAと、もし当てはまれば上皮細胞によって産生される輸送用、およびタンパク質分解酵素からのIgAの保護用のいわゆる分泌成分(分子量70kDa)を含む。ヘリコバクターおよび他の微生物はsIgA1を分断できるタンパク質分解酵素を産生するため、特に好適なのはIgA2に対する抗体である。IgA1とIgA2に特異的に結合する2つの一次抗体の混合物が、さらに特に好適である。
【0010】
本発明の好適な実施形態では、固相に結合した第1の一次抗体はポリクローナルウサギ抗ヘリコバクターピロリ抗体である。固相に結合した第2の一次抗体は、交差反応性の試験のためのポリクローナルヤギ抗ヒトsIgA抗体である。二次抗体はビオチン複合ウサギ抗ヘリコバクターピロリ抗体であり、したがって、結合した二次抗体の量を、ペルオキシダーゼ複合ストレプトアビジンの結合とテトラメチルベンジジンとの呈色反応を通して定量できる。
【0011】
第2の好適な実施形態では、固相に結合した第1の一次抗体はウサギ抗ヘリコバクターピロリ抗体であり、第2の一次抗体はウサギ抗ヒトsIgA抗体であり、二次抗体はポリクローナル西洋ワサビペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ヘリコバクターピロリ抗体である。しかしながら、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、ネズミ、マウスまたは他の動物の他の免疫グロブリンもまた、用いることができる。特に、ヒト免疫グロブリン用の第2の一次抗体は、唾液または便試料中の病原体抗原に対する二次抗体に結合しないことが確実にされるべきである。原則として、抗体はモノクローナルであってもよく、特に、第2の一次抗体はヒトIgA2に対するモノクローナル抗体であってもよい。病原体またはヒト免疫グロブリンの異なるエピトープ(抗原決定基)を認識する複数のモノクローナル抗体を用いた方がよいとみなされる。アッセイの特異性を広げるために、複数のモノクローナル抗体とモノクローナル一次抗体の混合物を用いた方がよいとみなされる。
【0012】
二次抗体は好適にはビオチン、蛍光性物質、ルテニウム、ユウロピウム、金粒子、アルカリ性ホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼのような1またはそれ以上の標識と複合している。しかしながら、他の適した標識または検出系を用いてもよい。
【0013】
【発明の実施の形態】
本発明およびその利点を好適な実施形態、実施例および図面を参照して、以下に説明する。
【0014】
ELISAにより例示される試験原理
本発明によるELISA(酵素結合イムノソルベント検定法)は、便および唾液試料および生検材料中のヘリコバクターピロリ抗原の定性的および定量的検出法を提供する。ヘリコバクターピロリ抗原は、最初の段階で試料から分離され、好適には、従来の方法によってマイクロタイタープレートまたは何か他の固相に結合されたポリクローナル抗ヘリコバクターピロリ抗体に結合する。固相に固定されたさらに別の第2の一次抗体があり、それはヒト免疫グロブリンおよび好適にはヒト分泌型IgAを認識する。便または唾液試料中のヘリコバクターピロリ抗原は生体自身のヒト免疫系と接触しているため、いくらかまたはすべてのヘリコバクターピロリエピトープは免疫グロブリンとすでに結合しており、病原体に対する第1の一次抗体による結合のための接近がすでに不可能である。しかしながら、これにも関わらず、便または唾液試料および生検材料中の病原体抗原は、これらに対する免疫反応がすでに存在していても、ヒト免疫グロブリンに対する第2の一次抗体によって濃縮され、固相に結合する。したがって、ヘリコバクターピロリ抗原は一方では直接結合し、他方では、唾液または腸管中の分泌型ヒト免疫グロブリンへのそれらの結合を介して間接的に結合する。次に第2段階では、結合したヘリコバクターピロリ抗原が抗ヘリコバクターピロリ二次抗体によってそのとき直接検出される。それから、適切な系によって、結合した二次抗体の量が定量される。
【0015】
ヘリコバクターピロリ抗原に対する二次抗体の高い特異性を通して、偽の陽性結果は排除される。二抗体アッセイの全体での特異性はすなわち、二次抗体の特異性により実質的に決定される。最初の結合の段階でヒト分泌型抗体が病原体抗原とも結合しているという事実は、ヘリコバクターピロリの場合、感度だけでなく試験の帯域幅も増加させる。明らかにかなり多くの場合に、ヘリコバクターピロリのすべての免疫原性のエピトープが、存在するヒト免疫反応によって認識されることは、特に驚きである。明らかに、ヘリコバクター生物の場合、免疫原性エピトープの数は限られているため、二抗体結合アッセイのヒト免疫系によって認識される病原体エピトープと、動物の一次および二次抗体によって認識される病原体エピトープはしばしば同じである。これは、口腔のヘリコバクターピロリのコロニー形成や、もう減少したが便または唾液試料中にまだ存在するヘリコバクターピロリエピトープの量をヒト免疫反応が隠す、除菌処理の後期に特に当てはまる。本発明による試験原理により、小さくかつ隠されてさえいる量のヘリコバクターピロリ抗原を検出できる。
【0016】
ヘリコバクターピロリの唾液中の存在は、現在まで、この疑わしい伝染態様に関する学術的な興味だけの主題であった(Namavar F他、Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 1995, 14 (3), pp. 234-7; Shimada T他、Lancet, 1994, 343 (8913), pp. 1636-7)。本発明による方法によって現在は、ヘリコバクターピロリの検出の下限が、唾液の試験でさえヘリコバクターピロリ感染の診断を可能とするほど、引き下げられている。特に、一連の治療のモニターには患者の唾液のヘリコバクターピロリ抗原の試験を行うことが重要である。応募者によって行われた実験は、ヘリコバクターピロリへの感染の病巣であって、従来の薬による除菌治療に対して耐性があり、治療の終了後、胃粘膜の新たな感染を招くような病巣は口腔内、おそらく金属の詰め物や義歯などの下部で見出されることを示した。したがって除菌治療は、便と唾液試料中のどちらにもヘリコバクターピロリ抗原が全く検出されないときのみ、終了したとみなされる。
【0017】
ヒト免疫グロブリンに対する、特にヒト分泌型IgAに対する第2の一次抗体を用いる本発明によるサンドイッチ試験法の原理は、マイクロタイタープレートを用いることに限定されない。被覆(コート)されたビーズまたは粒子とともに作動する、全自動化されたプロセスに適合させることができる。分泌型ヒトIgAに対する第2の一次抗体を用いる本発明による原理は、口腔または腸管内で発生して大量の免疫反応を引き起こす病原体の診断に、一般に適している。
【0018】
一般に、第1の一次抗体が様々なヘリコバクターピロリのタイプに対するポリクローナル抗体の集まりであれば好ましい。これにより試験の信頼性が向上するため、このことは二次抗体にも当てはまる。
【0019】
実施例1−便および唾液中のヘリコバクターピロリ抗原の検出
便試料の調製:
約100mgの便を測量し、0.1% トリトンX−100を含有する5mlのPBS洗浄用緩衝液(8mM Na2HPO4,15mM M K2H2PO4,3mM KCl,12.5mM NaCl,0.1% トリトンX−100,0.02% チメロサール,pH7.4)に、室温で分散させた。便試料の注入とホモジナイゼーションは、好適には独マンハイムのロシュ・ディアグノスティック,マンハイム,独国による試料調製システム(オーダー番号745804)を用いて行われた。均質化された懸濁液(ホモジネート)は卓上遠心分離機において10分間、3000rpmで遠心分離され、1mlの上清がエッペンドルフバイアルに移され、エッペンドルフ遠心分離機において5分間、13000rpmで遠心分離された。上清は直接、ELISA法に用いられた。
【0020】
唾液試料の調製:
唾液試料は粘度に応じてアッセイ用緩衝液に1:4または1:5で希釈され、結合アッセイに直接用いられた。唾液試料の場合、アッセイ用緩衝液が例えば5mM PMSFのようなタンパク質分解酵素阻害剤を含んでいれば有利である。また、Pefabloc SC(ロシュ・ディアグノスティック)のような市販のタンパク質分解酵素阻害剤を用いることもできる。
【0021】
マイクロタイタープレートのコーティング:
マイクロタイタープレートのウェルをヘリコバクターピロリ抗原およびヒト免疫グロブリンAに対するポリクローナル抗体でコーティングした。この目的には、200μlの60mM NaCO3,pH9.6に溶解させた100μgの市販の入手可能なポリクローナルウサギ抗ヘリコバクターピロリ抗体(ダコ,ハンブルグ)を各ウェルに注入し、プレートを一晩4℃でインキュベートした。ウェル中のウサギ抗ヘリコバクターピロリ抗体溶液を除去し、各ウェルを200μlの洗浄用緩衝液(0.1% トリトンX−100を含むPBS,pH7.4)で洗浄した。それから、200μlの60mM NaCO3,pH9.6に溶解させた100gのウサギ抗ヒトsIgA抗体(ダコ、ハンブルグ)を各ウェルに注入し、プレートを1時間室温でインキュベートした。ウェル中の抗ヒトIgA抗体溶液を除去し、各ウェルを再び、1回につき125μlの洗浄用緩衝液で5回洗浄した。最後の洗浄処理の後、マイクロタイタープレートのウェルを吸収紙の上に叩いて落とした。
【0022】
結合アッセイ:
試験はすべて2回ずつ行われた。100μlの標準および試料を2つずつ、抗体でコートされたマイクロタイタープレートのウェルの中にピペットで採り、室温で1時間、振とうさせながらインキュベートした。溶液を除去し、プレートのウェルを各回の場合に250μlの洗浄用緩衝液で、5回洗浄した。最後の洗浄処理の後、マイクロタイタープレートを吸収紙上に叩き出して乾燥させた。
【0023】
結合の検出:
洗浄用緩衝液で1:1000に希釈されたビオチン複合ポリクローナルウサギ抗ヘリコバクターピロリ抗体(1:10000;ダコ,ハンブルグ)または西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)複合ポリクローナルヤギ抗ヘリコバクターピロリ抗体(KPL,キルケガードアンドペリーラボラトリーズ,ガイタースブルク,MD;ATCC 43504,43526,43579のタイプのヘリコバクターピロリに対するポリクローナル抗体の混合物)のそれぞれ100μlをウェル中に注入し、室温で1時間、振とうさせながらインキュベートした。溶液をウェルから除去し、200μlの洗浄用緩衝液で各ウェルを5回洗浄した。
【0024】
定量:
呈色反応のため、西洋ワサビペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ヘリコバクターピロリ抗体の場合には、100μlのテトラメチルベンジジン(TMB)−基質溶液(使用可能に調製済みのもの、ノヴァム・ディアグノスティカ GmbH,ディーツェンバッハ,独国)をウェルに注入し、約20分後に50μlの0.4M H2SO4を添加することで発色を停止させた。ビオチン結合ウサギ抗ヘリコバクターピロリ抗体の場合には、100μlの西洋ワサビペルオキシダーゼ複合ストレプトアビジン(ダコ)でコートし、洗浄用緩衝液で1:10000に希釈し、振とうさせながら1時間、室温でインキュベートして、洗浄用緩衝液で5回洗浄し、その後のみ発色性物質を添加した。発色は各場合に、450nmでの吸光度(光学濃度)の測定により定量された。以下の表1および2は、本発明による定量が異なる日に繰り返された、健康の人とヘリコバクターピロリに感染した患者からの典型的な結果を示す。定量は示されているように、異なる検出システムおよび/または二次抗体で行われた。
【0025】
比較例2
ヒト免疫グロブリンAに対する二次抗体なしのイムノアッセイ
便および唾液試料の調製と結合アッセイは、マイクロタイタープレートのウェルがアフィニティーで精製された抗ヘリコバクターピロリポリクローナルウサギ免疫グロブリンまたは抗ヒトsIgA抗体でコートされなかったことを除き、実施例1の通りに行われた。すべての洗浄、コーティングおよび結合工程と発色は同一のマイクロタイタープレート上で同様に行われた。
【0026】
【表1】
【0027】
【表2】
【0028】
考察
表1および2は何人かの患者で、便試料中に存在するヘリコバクターピロリ抗原が、生体自身の免疫系によって完全に隠され、したがって、病原体に対する分析用の一次抗体と結合できなかったことを示す。そのような抗原の遮蔽(マスク)の場合、従来の二抗体イムノアッセイは、ヘリコバクターピロリが全く存在しないか、もう存在しなくなったという偽の結果を招く。本発明による方法では対照的に、すでに結合しているか、またはヒト免疫系で隠されているヘリコバクターピロリ抗原は、第2の抗ヒトsIgA一次抗体によって、固相に結合された(表2の値に下線を付した欄参照)。マスクの効果は用いられる二次抗体に依存せず、試料が唾液試料か便試料かにも依存しない。さらに、多くの場合、抗ヒトsIgA抗体および抗ヘリコバクターピロリ抗体を介した、ヘリコバクターピロリの固相への一次結合は互いに排除し、結合に関してはいずれか一方(either/or)という状況が明らかに存在したことが、結果から明らかである。ヘリコバクターピロリ抗原の固相へのヒト免疫グロブリンAを介した可能な一次結合は、したがって、本発明による診断の本質的な特徴である。
【0029】
実施例3−唾液の大量(マス)スクリーニング
唾液試料はヘリコバクターピロリ感染が疑われる、または除菌治療が終了した後の150人の患者から採取され、ヘリコバクターピロリ抗原の存在が検査された。分析は、アッセイ用緩衝液がさらにタンパク質分解酵素阻害剤を含んだことを除き、実施例1に示すように行われた。上記の試験(HRP−複合ヤギ抗ヘリコバクターピロリ抗体とテトラメチルベンジジンを用いる)での唾液中のヘリコバクター抗原の検出限界は、1ミリリットルのアッセイ用緩衝液中に約2pgのヘリコバクターピロリ抗原である。病原体抗原に対する二次抗体を最適化し、発光の検出システムを選択することにより、検出限界を1ミリリットル当たり0.2pg以下に到達させることが可能のはずである。
【0030】
マススクリーニングの結果を図3の棒グラフに示す。棒グラフは、唾液中にヘリコバクターピロリ感染が示される患者は、一般に60ng/mlより多いヘリコバクターピロリ抗原を有することを示す。したがって、唾液の検査はヘリコバクターピロリ感染の存在の検出に適している。一方、唾液1mlあたり25ng未満のヘリコバクターピロリ抗原の濃度は、他の病原体との非特異的な交差反応を示す。
【0031】
したがって、実施が比較的容易である免疫学的な唾液の検査によって、ヘリコバクターピロリ感染が検出できることが、初めて証明された。したがって、除菌治療の成功が比較的容易にモニターできる。それに対し、従来のヘリコバクターピロリ用の唾液の分析は、可能な伝染の様式の学術的な研究に基づいていたが、腸管のヘリコバクターピロリ感染の診断ができなかった。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、本発明によるヘリコバクターピロリ抗原のイムノアッセイの原理の模式図である。
【図2】 図2は、本発明によるイムノアッセイの他の典型的な形式である。
【図3】 図3は、本発明により除菌治療の前後に定量された、唾液中のヘリコバクターピロリ抗原の濃度をグラフで示したものである。
Claims (11)
- 病原体抗原を含む試料を、緩衝液中に採取するか分散させ、緩衝液を少なくとも2つの一次抗体であって、1つは病原体抗原に特異的に結合し、他の1つはヒト免疫グロブリンA(ヒトIgA)に特異的に結合する2つの一次抗体が結合した固相と一緒にし、
タンパク質が非特異的に結合した固相を洗浄し、病原体抗原に特異的に結合する二次抗体と固相を一緒にし、特異的に結合した二次抗体の量を定量することを特徴とする、
便、唾液および分泌性の試料中の病原性生物の二抗体サンドイッチ結合アッセイによる検出方法。 - 前記第2の一次抗体は分泌型ヒトIgAに結合する
請求項1記載の方法。 - 前記第2の一次抗体は分泌型ヒトIgA2に結合する
請求項2記載の方法。 - 前記二次抗体はビオチン、蛍光性物質、ルテニウム、ユウロピウム、金粒子、アルカリ性ホスファターゼ、ガラクトシダーゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼから選択される原子団と複合している
請求項1〜3のいずれかに記載の方法。 - 前記第1の一次抗体および前記二次抗体はHelicobacter Pylori(ヘリコバクターピロリ)抗原に結合する
請求項1〜4のいずれかに記載の方法。 - 前記第1の一次抗体は、様々なヘリコバクターピロリのタイプに対するポリクローナルおよび/またはモノクローナル抗体の混合物である
請求項1〜5のいずれかに記載の方法。 - 前記二次抗体は、様々なヘリコバクターピロリのタイプに対するポリクローナルおよび/またはモノクローナル抗体の混合物である
請求項1〜6のいずれかに記載の方法。 - 前記病原体はカンピロバクターであることを特徴とする
請求項1〜4のいずれかに記載の方法。 - 前記病原体はHelicobacter heilmanii(ヘリコバクターハイルマニ)であることを特徴とする
請求項1〜4のいずれかに記載の方法。 - 前記病原体は人体で大量の免疫反応を引き起こすことを特徴とする
請求項1〜4のいずれかに記載の方法。 - 医学的な除菌治療の後に口腔内に残存する病原体の診断に用いられる
請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
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