KR20190124021A - 고병원성 바이러스의 고감도 검출 키트 및 이를 이용한 고병원성 바이러스의 고감도 검출 방법 - Google Patents

고병원성 바이러스의 고감도 검출 키트 및 이를 이용한 고병원성 바이러스의 고감도 검출 방법 Download PDF

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pathogenic virus
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virus
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Abstract

본 발명은 고병원성 바이러스의 고감도 검출 키트 및 이를 이용한 고병원성 바이러스의 고감도 검출 방법에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 별도의 증폭 과정을 이용하지 않고도 현장에서 고병원성 바이러스의 존재 여부를 간단하고 신속하게검출하기 위한 고병원성 바이러스의 고감도 검출 키트 및 이를 이용한 고병원성 바이러스의 고감도 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 간단한 검출 키트를 이용하여 표적 바이러스의 유무를 간단하고 신속하게 확인함으로써 단시간 내에 여러 장소의 고병원성 바이러스 확산 여부를 확인할 수 있는 장점이 있다. 본 발명은 현장에서 시료를 직접 채취하여 바이러스 감염 여부를 단시간 내에 확인하므로 고병원성 바이러스로 인한 질병의 발병 전 대기의 오염 여부를 확인할 수 있어 신속한 대처가 가능한 장점이 있다. 또한, 검출 키트와 방법이 간단하므로 시간과 비용이 절약되고, 사용자에게 편리성을 제공할 수 있다.

Description

고병원성 바이러스의 고감도 검출 키트 및 이를 이용한 고병원성 바이러스의 고감도 검출 방법{Detection kit for high pathogenic virus and process for detecting high pathogenic virus with the kit}
본 발명은 고병원성 바이러스의 고감도 검출 키트 및 이를 이용한 고병원성 바이러스의 고감도 검출 방법에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 별도의 증폭 과정을 이용하지 않고도 현장에서 고병원성 바이러스의 존재 여부를 간단하고 신속하게검출하기 위한 고병원성 바이러스의 고감도 검출 키트 및 이를 이용한 고병원성 바이러스의 고감도 검출 방법에 관한 것이다.
최근 인체 또는 가축 등을 통해 전염되는 고병원성 바이러스가 다양하게 나타남에 따라, 이러한 고병원성 바이러스의 전파를 예방하기 위한 방법, 장치 등이 다양하게 연구되고 있다. 이러한 고병원성 바이러스는 크게는 동물에게 질병을 일으키는 조류 독감, 또는 구제역 등의 전염성 바이러스 뿐만 아니라, 인체에 질병을 일으키는 메르스, 사스 또는 신종 플루 등의 전염성 바이러스가 있을 수 있다. 이러한 전염성 바이러스는 인구의 밀집화 및 집단 사육의 증가로 단시간 내에 다수의 개체에 전파되어 많은 피해를 입히므로, 이러한 바이러스의 출현 시 가능한 신속한 대응을 통해 더 이상의 확산을 예방하는 것이 바람직하다.
이러한 고병원성 바이러스의 발병을 조기에 감지하기 위하여 다양한 연구들이 수행되고 있다. 구체적으로, 키트 등을 이용하여 개체의 감염 여부를 확인하는 경우가 많으나, 이러한 경우 검출하고자 하는 개체로부터 혈액 등이 샘플을 직접 채취하여 하여 넓은 면적에 대하여 동시다발적 검출이 어려운 문제점이 있다. 나아가, 이러한 개체로부터 채취하는 경우, 개체가 해당 질병에 감염되어 발병 이후에 검출할 수 있는 경우가 대부분으로, 이러한 경우 공기를 통해 전파되는 고병원성 바이러스에 대해서는 발빠른 대응이 불가능한 문제점이 있다.
대한민국 등록특허 10-1680375호에서도, 질병의 감염 여부를 조기에 감지하기위한 방역 시스템에 대해 개시하고 있으며, 이러한 시스템에서는 바이러스의 감염시 나타날 수 있는 발열, 구토 또는 재채기 등의 증상을 통해 고병원성 바이러스의 발병여부를 확인하기 위한 것으로, 고병원성 바이러스가 잠복기 등을 가지는 경우 빠른 대응이 불가능한 문제점이 있다.
현재 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 진단은 바이러스의 분리 및 혈청학적 검사가 있다. 이 중 혈청학적 검사법으로는 혈구응집억제반응(HI), 한천내침강반응 (AGP), 효소면역측정법(ELISA) 등이 있다.
그 중 ELISA(효소면역측정법)법은 분광광도계와 같은 실험실 장비를 갖추어야 하는 단점이 있다. 매우 민감도가 높지만(highly sensitive), 특이도(specificity)가 떨어지는 단점이 있다. 대부분 현재 상용화되어 있는 조류인플루엔자 항체 검출용 ELISA 키트는 간접효소면역측정법(indirect ELISA)으로서, 이 경우 검사하고자 하는 동물 종에 따라 2차항체(second antibody conjugate)를 각기 다르게 사용해야 하므로 기존 상용화된 제품으로 닭과 돼지 이외의 다른 동물의 혈청검사는 할 수 없다.
따라서, 이러한 분석법은 고병원성 바이러스의 현장 검출에는 일정 부분의 제한이 있다.
대한민국 등록특허 10-1680375호
본 발명자들은 위와 같은 종래의 기술들의 문제점들이 개선되고, 고병원성 바이러스를 신속히 검출하고 인체 또는 동물의 감염 전에 공기의 오염 여부를 확인함으로써 고병원성 바이러스의 전파에 대해 빠른 대응이 가능한 고병원성 바이러스의 고감도 검출 키트를 개발하기 위하여 오랜 기간 연구를 수행한 결과, 후술하는 바와 같이 고병원성 바이러스의 현장 검출 키트를 이용하여 별도의 증폭 과정이나 종전의 ELISA 판독기와 같은 의한 추가의 분석을 위한 시약 및 처리 과정 없이도 바이러스의 존재 유무를 현장에서 신속하게 확인할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 목적은 별도의 증폭 과정이나 종전의 ELISA에 의한 추가의 분석을 위한 시약 및 처리 과정 없이도 바이러스의 존재 유무를 현장에서 신속하게 확인할 수 있는 고병원성 바이러스의 현장 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법를 제공하는 것에 있다.
이와 같은 본 발명의 목적은, 일면에 있어서,
표면에 시알릴락토오스가 고정된 고상 지지체(110);
검출하고자 하는 시료를 수용하기 위한 시료 튜브(120);
금나노입자와 표지물질이 결합된 면역컨쥬게이트 용액(130);
완충액으로 이루어진 세척액; 및
발색 시약(140);을 포함하고,
상기 면역컨쥬게이트는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정하기 위한 금나노입자 및 표지 물질이 결합된 항체이고, 상기 항체는 고병원성 바이러스와 결합하기 위한 헤마글루티닌 결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 고병원성 바이러스의 현장 검출용 고감도 검출 키트(100)에 의해 달성될 수 있다.
본 발명에 따르면 간단한 검출 키트를 이용하여 표적 바이러스의 유무를 간단하고 신속하게 확인함으로써 단시간 내에 여러 장소의 고병원성 바이러스 확산 여부를 확인할 수 있는 장점이 있다. 본 발명은 현장에서 시료를 직접 채취하여 바이러스 감염 여부를 단시간 내에 확인하므로 고병원성 바이러스로 인한 질병의 발병 전 대기의 오염 여부를 확인할 수 있어 신속한 대처가 가능한 장점이 있다. 또한, 검출 키트와 방법이 간단하므로 시간과 비용이 절약되고, 사용자에게 편리성을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 고병원성 바이러스의 현장 검출용 고감도 검출 키트를 설명하는 도면이다.
도 2는 고상 지지체 상에 시알릴락토오스를 고정화하는 스킴이다.
도 3은 본 발명의 고병원성 바이러스의 현장 검출용 고감도 검출 키트를 이용한 바이러스의 검출 과정을 설명하는 도면이다.
본 발명은, 일면에 있어서,
표면에 시알릴락토오스가 고정된 고상 지지체(110);
검출하고자 하는 시료를 수용하기 위한 시료 튜브(120);
금나노입자와 표지물질이 결합된 면역컨쥬게이트 용액(130);
완충액으로 이루어진 세척액; 및
발색 시약(140);을 포함하고,
상기 면역컨쥬게이트는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정하기 위한 금나노입자 및 표지 물질이 결합된 항체이고, 상기 항체는 고병원성 바이러스와 결합하기 위한 헤마글루티닌 결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 고병원성 바이러스의 현장 검출용 고감도 검출 키트(100)를 제공한다.
이하 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명에 따른 고병원성 바이러스의 현장 검출용 고감도 검출 키트(100) 및 이를 이용한 고병원성 바이러스의 고감도 검출 방법에 대하여 상세히 설명한다.
첨부한 도면들은 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명은 이하 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 이하 제시되는 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다. 이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
종래 고병원성 바이러스를 감지하기 위한 방법으로, 인체 또는 동물에서 샘플을 채취하여 감염 여부를 확인하는 방법을 주로 이용하였으나, 이는 고병원성 바이러스의 추적에 많은 시간 및 인력이 소요되는 문제점이 있었다. 즉, 공기를 통해 전파되는 고병원성 바이러스의 경우 빠른 검출 및 이에 따른 대응이 필수적이나, 개체에서 혈액 등과 같은 샘플을 채취하여 바이러스의 전파 여부를 파악하는 방식은 고병원성 바이러스에 대한 대응을 느리게 만드는 가장 큰 요인 중 하나였다.
이에, 본 발명자들은 공기를 통해 전파되는 고병원성 바이러스를 현장에서 간단하고 신속하게 검출하고자 후술하는 바의 고병원성 바이러스의 현장 검출용 고감도 검출 키트(100) 및 이를 이용한 고병원성 바이러스의 고감도 검출 방법을 개발하기에 이르렀고 이 장치 및 방법은 현장에서 채취한 조류 분변 등의 시료를 채취하여 본 발명의 검출 키트를 활용하여 고병원성 바이러스의 존재 유무를 신속히 검출하고, 필요에 따라 사용자 단말 장치로 전송함으로써, 고병원성 바이러스의 전파에 대하여 신속하게 대처할 수 있는 것을 기술적 특징으로 한다.
본 발명의 구성 상의 특징은 금나노입자와 표지 물질이 결합된 면역컨쥬게이트를 이용하여 별도의 증폭 과정이나 종전의 ELISA에 의한 추가의 분석을 위한 시약 및 처리 과정 없이도 바이러스의 존재 유무를 현장에서 신속하게 확인할 수 있다는 것에 있다.
도 1은 본 발명의 고병원성 바이러스의 현장 검출용 고감도 검출 키트를 설명하는 도면이고, 도 2는 고상 지지체 상에 시알릴락토오스를 고정화하는 스킴이며, 도 3은 본 발명의 고병원성 바이러스의 현장 검출용 고감도 검출 키트를 이용한 바이러스의 검출 과정을 설명하는 도면이다.
도 1 내지 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 고병원성 바이러스의 현장 검출용 고감도 검출 키트(100)는 크게 고상 지지체(110), 시료 튜브(120), 세척액, 금나노입자가 결합된 면역컨쥬게이트 용액(130) 및 발색 시약을 포함하여 이루어질 수 있다. 이하, 개별 구성 요소들에 대하여 상세히 설명한다.
고상 지지체(110)
시알릴락토오스가 표면에 고정된 다양한 고상 지지체가 본 발명의 검출 키트 및 이를 이용한 검출 방법에 사용될 수 있다.
상기 고상 지지체로서 적합한 물질들은, 이에 제한되지 않고, 스티렌 또는 스티렌 유도체들, 디비닐벤젠, 아크릴아미드들, 아크릴레이트 에스테르류, 메타크릴레이트 에스테르류, 비닐 에스테르류, 비닐 아미드류를 포함하는 교차-연결된 합성 폴리머들; 아가로오스, 알기네이트, 카라기난(carrageenan), 젤라틴, 셀룰로오스 같은 천연 폴리머; 또는 셀룰로오스 아세테이트 또는 니트로셀룰로오스 및 실리카, 유리, 특히 유리 섬유들 같은 유도체화된 천연 폴리머;를 포함할 수 있다.
상기 천연 폴리머들은 냉각 또는 2가의 금속 이온들의 첨가 하에서 물리적으로 교차-연결된 네트워크를 자발적으로 형성하는 것으로 알려져 있고, 필요에 따라 화학적 교차-연결자들이 첨가될 수 있다.
상기 지지체는 스트립, 스피어, 막대, 튜브 및 마이크로에세이 또는 마이크로타이터 플레이트의 형태를 취할 수 있다. 페이퍼 스트립, 작은 플레이트 및 막 같은 시트-형 구조들도 마찬가지로 적합하다. 지지체의 표면은 수용성 용액에 대해 투과 가능할 수 있고 통과가능하지 않을 수 있다.
따라서, 요약하면, 상기 지지체 물질은 원칙적으로 본 발명의 시알릴락토오스 분자에 공유결합적 커플링을 허용하는 어떠한 물질일 수 있다[참조문헌: Lee M, Shin I, et al. 2005 Facile preparation of carbohydrate microarrays by site-specific, covalent immobilization of unmodified carbohydrates on hydrazide-coated glass slides. Org. Lett. 7: 4269-4272; Fukui S, Feizi T, Galustian C, Lawson AM, Chai WG, et al. 2002 Oligosaccharide microarrays for highthroughput detection and specificity assignments of carbohydrate-protein interactions. Nat. Biotechnol. 20: 1011-1017)].
시알릴락토오스
상기 고상 지지체 상에 고정될 수 있는 "시알릴락토오스(sialyllactose)"는 시알산 모이어티에 결합된 락토오스 모이어티(β-D-갈락토피라노실-(1→4)-D-글루코오스)를 포함하는 분자를 포함할 수 있다. 상기 시알산은 시알산 내 어떠한 가능한 위치에 의해 락토오스와 커플링되고 상기 락토오스 분자 내 어떤 가능한 위치에 커플링될 수 있다. 좀 더 바람직한 형태에 있어서, 상기 시알산은 시알산의 2번째 위치의 하이드록시기를 통해 상기 락토오스에 결합된다(상기 시알산 구조의 넘버링은 하이드록시기를 가지는 탄소에서 시작하여 상기 체인을 둘러서 지속된다). 다른 바람직한 형태에 있어서, 상기 시알산은 상기 락토오스 분자 내 3번째 또는 6번째 위치의 하이드록시기에 의해 상기 락토오스에 결합된다. 보다 바람직한 형태에 있어서, 상기 "시알릴락토오스"는 α2,3-시알릴-락토오스 또는 α2,6-시알릴-락토오스이다. 시알릴락토오스는 진핵세포 또는 원핵세포 기원일 수 있다. 바람직하게는 시알릴락토오스는 진핵세포 기원이다. 상기 진핵세포 또는 원핵세포는 병원성이거나 또는 비-병원성일 수 있다. 예를 들어, NeuAca2-3Galb1-3GalNAc, NeuAca2-3Galb1-3(4)GlcNAc, 또는 NeuAca2-6Galb1-4GlcNAc) 내에 시알산을 포함하도록 유도체화 되었던 인간 적혈구들에 결합하는 고정화된 시알로어드히신의 능력에 기반된 고체상(solid phase) 분석에 의해 동정될 수 있다[참조문헌: Vinson M, et al, J. Biol. Chem. 1996; 271:9267-9272].
상기 시알릴락토오스의 더욱 바람직한 예로는, 이에 제한되지 않고, 시알릴올리고당(sialyloligosaccharide), 3'-시알릴락토스(3'-Sialyllactose), 6'-시알릴락토스(6'-Sialyllactose), 시알릴락토-N-테트라오스(sialyl lacto-N-tetraose), 디시알릴락토-N-테트라오스(disialyl lacto-N-tetraose) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물일 수 있다.
시알릴락토오스 분자의 고정
시알릴락토오스 분자를 웰에 고정시키는 방법은 통상의 표면화학 방법 (surface chemistry)을 통하여 수행할 수 있다. 예를 들면 Hartnell A, et al, Blood 2001;97:288-296에 기재된 방법을 이용할 수 있거나 또는 한국특허 제10-1101375호(2011년12월26일)에 기재된 방법을 이용하여도 좋다.
보다 바람직하게는 유리 슬라이드와 같은 고체 기판 상에 다양한 종류의 탄수화물들을 공유결합으로 특정한 위치에 고정화시키는 효율적인 고정화 방법이 사용될 수 있다.
유리기판, 실리콘, 금속기판, 플라스틱 등의 기판 표면에 생체물질을 효율적으로 고정화하기 위한 여러 방법들이 제시되어 왔고 이 중에서도 자기조립 단분자층(self assembled monolayer)을 사용하여 생체분자를 고정화하는 방법이 가장 잘 알려져 있다(참조문헌: Love, J. C. Estroff, L. A. Kriebel, J. K. Nuzzo, R. G. and Whitesides, G. M. Chem. Rev. 2005, 105, 1103).
본 발명의 실시예에서는 대표적인 예로서 시알릴락토오스 분자를 플레이트 상에 고정한 것을 예들 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되지 않는다.
시료 튜브(120)
시료 튜브(120)는 검출하고자 하는 시료를 수용하기 위한 일정 용적을 가진 용기로서, 그 재질에는 특별한 제한이 없고, 통상적인 것들을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 시료는 유체인 생물학적 시료들(예컨대, 혈청, 혈액, 소변, 타액, 췌장 쥬스, 뇌척수액, 정액)을 포함할 뿐 아니라, 어떠한 액상의 생물학적 시료들(예를 들어, 조직 또는 생검 추출물, 배설물의 추출물, 객담)이 본 발명의 장치 및 방법에 이용될 수 있다. 가장 바람직하게는, 어세이될 생물학적 시료는 녹인 조류의 분변, 혈청 또는 혈장일 수 있다.
이와 같은 시료는 필요에 따라 정제수 등의 용액이나 완충액에 녹여 농도를 조절하거나 액상으로 되게 하여 검출이 용이하도록 전처리하는 것이 바람직할 수 있다.
세척액
고병원성 바이러스의 검출을 위하여 검출하고자 하는 시료를 고상 지지체(110) 상에 반응시킨 후, 상기 지지체는 어떠한 비결합 항체 등을 실질적으로 제거하기 위해 광범위하게 세척 등의 처리를 하게 된다. 이 때 사용되는 세척액으로는 정제수 또는 PBS 등의 통상의 완충액이 바람직하게 이용될 수 있다
상기 세척액은 더욱 바람직하게는 폴리소르베이트 20이 0.2% 첨가된 인산염생리식염 완충액(pH 7.2)으로 제조할 수 있다.
면역컨쥬게이트 용액(130)
본 발명에 사용될 수 있는 면역컨쥬게이트 용액은 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정하기 위한 금나노입자 및 표지 물질이 결합된 항체이고, 상기 항체는 고병원성 바이러스와 결합하기 위한 헤마글루티닌 결합 부위를 포함할 수 있다.
면역컨쥬게이트의 나노입자는 ELIZA 판독기를 사용하지 않고, 육안으로도 검출가능한 표지로서 작용하는 나노입자를 의미한다.
고병원성 바이러스가 시험 시료 내에 존재한다면, 상기 항체와 바이러스가 면역 복합체를 형성할 것이다. 그러한 에세이에서, 상기 지지체에 결합된 항체의 검출은 시험 시료 내에 고병원성 바이러스의 존재를 나타낸다[참조문헌: Schuurs A, 등, US 4,016,043 및 Pankratz T, 등, US 5,876,935].
상기 면역컨쥬게이트는 고병원성 바이러스의 헤마글루티닌과 결합하기 위한 부위가 표면에 존재하는 항체가 제한없이 본 발명에 사용될 수 있고, 비인간 종들로부터 분리된 천연 면역글로블린(예를 들어, 항-인간 IgG 마우스 항체, 항인간 IgG 염소 항체, 항-인간IgM 염소 항체)일 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체는 온전한 면역글로블린 또는 면역글로블린 단편(예를 들어, FAb, F(Ab)2)일 수 있다.
상기 검출항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 모노클로날 항체를 사용한다. 면역컨쥬게이트를 항체를 포함하는 용액은 상기한 바의 세척액을 사용할 수 있다.
상기 HA 단백질에 결합하는 표지자를 포함한 항체는 바람직하게는 anti-his tag antibody를 들 수 있다. 마찬가지로, 간단하게 합성하거나 상업적으로 구입하거나 이를 변경하여 사용할 수 있다.
표지 물질
면역컨쥬게이트에 결합되는 표지 물질은 항원항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하도록 하기 위한 표지물질로서, 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 호스 래디쉬 퍼록시다제를 사용할 수 있다.
효소로서 퍼록시다제와 함께 항체들을 표지하는 경우에, 페리오데이트 기술 또는 이종이작용성(heterobifunctional) 시약을 이용하는 것이 가능하다[참조문헌: Nakane P, 등, J. Histochem. Cytochem. 1974; 22:1084-1090 및 Ishikawa E, 등, J. Immunoassay. 1983; 49(3):209-327].
금나노입자 및 표지 물질의 결합
상기 항체에 금나노입자와 표지 물질을 접합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 상기 금나노입자와 검출항체의 결합은 예컨대 이온결합, 공유결합, 금속결합, 배위결합, 수소결합, 및 반데르발스결합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 단클론 항체에 HRP(horseradish peroxidase)를 공지된 Nakane 법으로 접합시켜 효소표지항체를 제조할 수 있다.
발색 시약(140)
상기 전처리는 예를 들면 TMB 발색 반응을 포함할 수 있다. 특히 발색성 기질인 3,3', 5, 5'-테트라메틸벤지딘(TMB), OPD, 또는 ABTS와 함께 이용하는 것이 더욱 바람직할 수 있다.
추가의 시약들
본 발명의 진단 키트는 필요에 따라 효소면역측정법(ELISA)에 사용되는 당 업계에 공지된 시약을 추가로 포함할 수 있다.
이러한 시약의 예로서는 음성대조혈청, 양성대조혈청, 효소활성을 측정할 수 있는 기질액 및 반응 정지액을 포함할 수 있다.
상기 음성대조혈청 인플루엔자 항원, 항체가 음성인 정상 닭 혈청을 선별하고 칼슘을 첨가하여 피브린을 형성시켜 제거하여 제조할 수 있다.
상기 양성대조혈청은 인플루엔자 항체가 양성인 닭 혈청을 선별하고 칼슘을 첨가하여 피브린을 형성시켜 제거한다. 포화 암모늄설페이트를 처리하여 농축한 후 칼슘 처리된 정상 닭 혈장으로 적당히 희석하여 제조할 수 있다.
상기 기질액은 사용한 효소의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 HRPO에 대한 기질액으로서 테트라메칠벤지딘(8mg/ml)과 과산화수소수(20~32%, 0.331ml)를 혼합하여 제조할 수 있다.
상기 반응정지액은 0.5~1N 염산 또는 황산일 수 있다. /]
본 발명은 또한 추가의 일면에 있어서 상술한 검출 키트를 이용한 고병원성 바이러스의 현장 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 고병원성 바이러스의 고감도 현장 검출 방법은 전처리된 시료를 시알릴락토오스가 표면에 부착된 복수의 웰을 포함하는 고상 지지체에 반응시키는 단계(S110); 반응이 완료된 고상 지지체를 세척하는 단계(S120); 세척된 고상 지지체의 웰에 금나노 입자와 표지물질이 결합된 면역 항체를 반응시키는 단계(S130); 및 표지물질이 반응된 고상 지지체의 웰에 발색시약(140)을 첨가하는 단계;를 포함한다.
이를 좀 더 구체적으로 설명하자면, 먼저 조류 분변 등의 시료를 현장에서 채취하여 적절한 처리 용액에 가하여 전처리한 후, 시료 튜브에 넣은 후 전처리된 시료가 포함된 시험 용액을 예를 들면 복수의 웰을 포함하는 고상 지지체에 반응시킨다(S110).
이어서, 반응이 완료된 고상 지지체(110)를 세척(S120)하여 미결합 항원 등을 제거하면 고상 지지체 표면 상에 고정된 시알릴락토오스와 항원인 고병원성 바이러스는 존재하는 경우 결합된다.
그 다음, 고병원성 바이러스의 존재를 확인하기 위하여 금나노 입자와 표지물질이 결합된 면역컨쥬게이트 용액을 세척된 고상 지지체의 웰에 가하여 항체를 반응시킨다(S130). 이 때, 항원이 존재하는 경우 상기 면역컨쥬게이트는 무수히 많은 항원의 HA 결합부위에 결합되게 된다.
마지막으로 고상 지지체의 웰에 발색시약(140)을 첨가(S140)하여 고병원성 바이러스의 존재여부를 육안으로도 간단히 확인할 수 있다.
한편, 필요에 따라 음성대조군, 양성대조군, 기질 용액, 반응정지액 등을 검출 방법에 이용할 수도 있다.
본 발명의 일 실시예에 의한 고병원성 바이러스 현장 검출 방법에서 상기 고병원성 바이러스는 공기를 통해 전파 가능한 병원체일 수 있다. 나아가, 상기 고병원성 바이러스는 사람뿐만 아니라 동물에 감염증을 일으키는 병원체일 수 있으며, 구체적이고 비한정적인 일예로 상기 고병원성 바이러스는 조류독감, 구제역 또는 신형 인플루엔자 바이러스 등일 수 있으나 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
이러한 고병원성 바이러스를 별도의 증폭 과정을 위한 처리나 분석을 위한 시약 그리고 이러한 시약의 후처리 및 물리적 분석 기기가 없이도 간단하고 고감도로 현장에서 고병원성 바이러스의 존재 여부를 검출함으로써 바이러스의 출현, 전파 경로 및 이에 따른 후속 대처가 신속하게 이루어질 수 있다.
<실시예>
이하, 본 발명은 다음의 대표적인 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명되나, 본 발명이 이들 실시예에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 플레이트 웰 표면에 대한 시알릴락토오스 분자 고정화
도 2, 3에 나타낸 바와 같이, 96 well plate(110)를 02 plasma 발생기(100w)에 넣고 5분 동안 처리하여 수산기(-OH)를 형성시켰다(2). 수산기(-OH)가 형성된 well plate(110)에 0.1% APTES(3-aminopropyltriethoxysilane) 에탄올을 넣고 1시간 동안 실온에서 incubation하고 염산(1M HCl)으로 pH 3~4 맞추어, amino-well plate(3)를 제작하였다. 제작된 amino-well plate(3)에 0.1mM sialyllactose(acetic acid)[6'-sialyllactose sodium salt: tokyo chemical industry, S0886]를 제조하여 60℃에서 90분 동안 incubation하여 sialyllactose가 코팅된 96 well plate(3, 4)를 제작하였다.
실시예 2: HRP-컨쥬게이트의 제조
anti-his tag antibody를 HRP(horseradish peroxidase)와 공지된 Nakane 법으로 접합시켜 효소접합체를 제조하였다.
구체적으로, HRP 5mg을 1.2ml의 증류수에 용해하고, 0.1M의 소디움-엠-페리오데이트(sodium m-periodate, Sigma, S-1878)가 용해되어 있는 소디움 포스페이트 (sodium phosphate,pH 7.0) 0.3ml를 첨가하였다. 이것을 실온에서 20분간 반응시키고 1mM 소디움 아세테이트(sodium acetate, pH4.0)로 하룻밤 투석하였다. anti-his tag antibody을 20mM 카보네이트(carbonate, pH9.5)에 10mg/ml 농도로 준비하여 상기에서 투석된 HRP 용액에 0.5ml 첨가한 후 2시간 실온에서 반응시켰다. 이후 100ul의 소디움 보로하이드라이드(sodium borohydride, 4mg/ml in water)를 첨가하고 4℃에서 2시간 반응시켰다. 이것을 다시 PBS(pH7.2)로 투석하였다.
실시예 3: 면역컨쥬게이트의 제조
면역컨쥬게이트를 제조하기 위해, 실시예 2의 HRP conjugated anti-his tag antibody를 포함한 PBS(1 mg/mL 농도) 1ml를 1 mL의 20 nm AuNP 콜로이드와 보레이트 완충액 (0.1 M, pH 8.5)의 혼합물에 첨가하였다. 상온에서 30분간 인큐베이션한 후에 10 mg/mL의 BSA를 포함하는 PBS 0.1 mL를 AuNP 표면을 블로킹하기 위해 용액에 첨가하였다. 4℃에서 60분간 인큐베이션한 후에 혼합물을 microcentrifuge를 사용하여 12,000 rpm으로 10℃에서 15분간 원심분리를 행하였다. 상층액을 버리고, 10 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4)를 AuNP 컨쥬게이트에 가하여 재현탁하였다. 원심분리 및 현탁 과정을 2회 반복하여 최종 현탁 용액으로서, 0.1％ BSA, 0.05％ NaN3, 1％ 수크로오스를 포함하는 10 mM Tris-HCl 완충액을 제조하였다.
실시예 4: 본 발명에 따른 키트를 이용한 바이러스의 검출
상기 실시예 1에서 제조된 표면에 시알릴락토오스가 고정된 고상 지지체(110); 상기 실시예 3에서 제조된 금나노입자가 결합된 면역컨쥬게이트 용액(130); 시료 튜브(120); 세척액으로써 폴리소르베이트 20이 0.2% 첨가된 인산염생리식염 완충액 (pH 7.2) 세척액; 및 TMB를 포함하는 발색 시약(140);으로 이루어진 키트를 준비하였다.
조류인플루엔자 항체의 존재유무를 다음의 방법으로 진단할 수 있다.
1) 검사를 시작하기 약 30분 전에 검출 키트를 상온에 방치시켜, 사용 전 가볍게 흔들어 잘 섞어준 후 사용하고, 플레이트는 상온이 된 후에 개봉하여 사용한다.
2) 시료의 분주-플레이트의 각 웰에 검사 하고자 하는 시료 각각 50㎕씩을 분주하고, 플레이트를 37℃에서 30분 동안 반응시킨다.
3) 반응 후 각 웰의 내용물을 흡입하고 세척액으로 다음과 같은 방법으로 3회 세척하였다. 우선 웰 내의 내용물을 흡입장치로 제거한 후, 세척액을 웰에 완전히 채우고 (웰 당 약 350㎕씩) 용액을 흡입하는 방법으로 6회 반복한 다음, 휴지에 대고 살짝 털어 잔여 용액을 제거한다.
4) 이어서, 실시예 3에서 조제한 면역컨쥬게이트 액을 각 웰에 50㎕ 씩 분주한 후 마찬가지로 반응시킨다.
이상, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예에는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
100: 고병원성 바이러스 검출 키트
110: 고상 지지체
120: 시료 튜브
130: 면역 컨쥬게이트 용액
140: 발색 시약

Claims (4)

  1. 표면에 시알릴락토오스가 고정된 고상 지지체(110);
    검출하고자 하는 시료를 수용하기 위한 시료 튜브(120);
    금나노입자와 표지물질이 결합된 면역컨쥬게이트 용액(130);
    완충액으로 이루어진 세척액; 및
    발색 시약(140);을 포함하고,
    상기 면역컨쥬게이트는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정하기 위한 금나노입자 및 표지 물질이 결합된 항체이고, 상기 항체는 고병원성 바이러스와 결합하기 위한 헤마글루티닌 결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 고병원성 바이러스의 현장 검출용 고감도 검출 키트(100).
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 면역컨쥬게이트는 Au 및 HRP conjugated anti-his tag antibody이고, 상기 표지물질은 HRP이며, 상기 발색시약은 TMB인 것을 특징으로 하는 고병원성 바이러스의 현장 검출용 고감도 검출 키트(100).
  3. 전처리된 시료를 시알릴락토오스가 표면에 부착된 복수의 웰을 포함하는 고상 지지체에 반응시키는 단계(S110);
    반응이 완료된 고상 지지체를 세척하는 단계(S120);
    세척된 고상 지지체의 웰에 금나노 입자와 표지물질이 결합된 면역 항체를 반응시키는 단계(S130); 및
    표지물질이 반응된 고상 지지체의 웰에 발색시약(140)을 첨가하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 고병원성 바이러스의 고감도 현장 검출 방법.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 면역컨쥬게이트는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정하기 위한 금나노입자 및 표지 물질이 결합된 항체이고, 상기 항체는 고병원성 바이러스와 결합하기 위한 헤마글루티닌 결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 고병원성 바이러스의 고감도 현장 검출 방법.
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