JPS59104554A - 螢光偏光技術を用いる不飽和チロキシン結合性蛋白位置の測定法 - Google Patents
螢光偏光技術を用いる不飽和チロキシン結合性蛋白位置の測定法Info
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- JPS59104554A JPS59104554A JP58208440A JP20844083A JPS59104554A JP S59104554 A JPS59104554 A JP S59104554A JP 58208440 A JP58208440 A JP 58208440A JP 20844083 A JP20844083 A JP 20844083A JP S59104554 A JPS59104554 A JP S59104554A
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- C07D311/80—Dibenzopyrans; Hydrogenated dibenzopyrans
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- G—PHYSICS
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
遊離チロキシンは起こりうる甲伏線機能障害の初期診断
にとって一般に受は入れられている指標である。Ｊ、
ＣＩ ｉｎ。
にとって一般に受は入れられている指標である。Ｊ、
ＣＩ ｉｎ。
Ｉｎｖｅｓｔ、、４５：１３３．１９６Ｌ全循環チロキ
シンの約００５％のみが生理学的に活性（すなわち遊離
チロキシン）なので、全チロキシンイ；袈度のみの測定
は完全に満足な指標とはいえない。然しなから、遊離チ
ロキシンは直接に（ｉｌｊ定することが困難な物質であ
る。Ｂｅｒｇｅｒ、 Ｓ、、 ａｎｄＱｕｉｎｎ、
Ｊ、Ｌ、、 Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｃ１
１ｎｉｃａｌＣｈｅｒｎｉｓｔｒｙ、 Ｔｉｅｔｚ、
Ｎ、 Ｗ、、 Ｅｄ； Ｗ、 Ｂ。
シンの約００５％のみが生理学的に活性（すなわち遊離
チロキシン）なので、全チロキシンイ；袈度のみの測定
は完全に満足な指標とはいえない。然しなから、遊離チ
ロキシンは直接に（ｉｌｊ定することが困難な物質であ
る。Ｂｅｒｇｅｒ、 Ｓ、、 ａｎｄＱｕｉｎｎ、
Ｊ、Ｌ、、 Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｃ１
１ｎｉｃａｌＣｈｅｒｎｉｓｔｒｙ、 Ｔｉｅｔｚ、
Ｎ、 Ｗ、、 Ｅｄ； Ｗ、 Ｂ。
５ａｕｎｄｅｒｓ、 Ｃｏ、 ： Ｐｈ１ｌａｄｅｌ
ｐｈｉａ、 １９７６゜Ｃｈａｐｔｅｒ １４及びＲ
ｏｂｂｉｎｓ、 Ｊ、、 ＴｈｙｒｏｉｄＨｏｒｍ
ａｎｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、 Ｈａｒｌｅｒｎ ａ
ｎｄ Ｏｒｒ、 Ｅｄ、。
ｐｈｉａ、 １９７６゜Ｃｈａｐｔｅｒ １４及びＲ
ｏｂｂｉｎｓ、 Ｊ、、 ＴｈｙｒｏｉｄＨｏｒｍ
ａｎｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、 Ｈａｒｌｅｒｎ ａ
ｎｄ Ｏｒｒ、 Ｅｄ、。
１９７５、 Ｃｈａｐｔｅｒ １．残余の循＄ｆｏキ’
ｙンはｌｉ白、主としてチロキシン結合性グロブリン（
ＴＢＧ）に結合シている。Ｒｏｌ）ｂｉｏｓ、 Ｊ、、
ａｎｄ Ｒａ１ｌ、 Ｊ、Ｇ、。
ｙンはｌｉ白、主としてチロキシン結合性グロブリン（
ＴＢＧ）に結合シている。Ｒｏｌ）ｂｉｏｓ、 Ｊ、、
ａｎｄ Ｒａ１ｌ、 Ｊ、Ｇ、。
Ｐｒｏｔｅｌｎｓ ＡＳＳＯＣｌａｊｅｄ Ｎ’／ｌ
ｔｌｌ ＴｌｌｙｒＯｌｄＨｏｒｍｏｎｅｓ、 Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ、 Ｒｅｖ、、 ４０ ＋ ４１５． １９６
０゜従って、全循垢チロキシン？ｌｌｉの及びチロキシ
ン結合性グロブリンｒ度の測定は遊離チロキシンの相対
感度の良好な評価を与える。
ｔｌｌ ＴｌｌｙｒＯｌｄＨｏｒｍｏｎｅｓ、 Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ、 Ｒｅｖ、、 ４０ ＋ ４１５． １９６
０゜従って、全循垢チロキシン？ｌｌｉの及びチロキシ
ン結合性グロブリンｒ度の測定は遊離チロキシンの相対
感度の良好な評価を与える。
チロキシン結合性グロブリン両度の水準を調べるために
神々の方法が使用された。最も古い方法はＴ３同化刀研
究であり、これは不飽和チロキシン、結合性グロブリン
性能を測定するものである。Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌ、、１７ ：３ ：３． Ｊａｎｕａｒｙ
、 １９５７及びＪ、 ＣＩ ｉｎ、 Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌ。
神々の方法が使用された。最も古い方法はＴ３同化刀研
究であり、これは不飽和チロキシン、結合性グロブリン
性能を測定するものである。Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌ、、１７ ：３ ：３． Ｊａｎｕａｒｙ
、 １９５７及びＪ、 ＣＩ ｉｎ、 Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌ。
２５：３９ ５４，１９６５．Ｔ３同化力分析は遊＃Ｔ
ＢＧ位１１“・１お工びりγ２次固体支持体（ブことえ
ば樹脂、木炭など）に競合して結合させるために１２５
１標識リオチロニン（Ｔ３）を使用する。后イー期間お
よび好適な分離技術（たとえば洗浄、遠心分離なと）の
後に、固体支持体上の残金の放射能をカウントする。こ
の放射能は不飽オロチロキシン結合性グロブリン症度に
反比例する。
ＢＧ位１１“・１お工びりγ２次固体支持体（ブことえ
ば樹脂、木炭など）に競合して結合させるために１２５
１標識リオチロニン（Ｔ３）を使用する。后イー期間お
よび好適な分離技術（たとえば洗浄、遠心分離なと）の
後に、固体支持体上の残金の放射能をカウントする。こ
の放射能は不飽オロチロキシン結合性グロブリン症度に
反比例する。
別の方法は放射性免疫分析であり、これはチロキシン結
合性グロブリンに特異的な抗体を使用する。然しなから
、この方法はチロキシン結合性グロブリンの結合能力を
測定しない。Ｃ１１ｎ、 Ｃｈ ｃｍ、八ｃｔａ、、８
７．（１９７８）。
合性グロブリンに特異的な抗体を使用する。然しなから
、この方法はチロキシン結合性グロブリンの結合能力を
測定しない。Ｃ１１ｎ、 Ｃｈ ｃｍ、八ｃｔａ、、８
７．（１９７８）。
３７３−３８１゜
第３の方法は大過剰のチロキシンで平グ１化させて試料
中の内因性チロキシンを置換することによって全チロキ
シン結合性グロブリン量を評価する方法である。米国特
許第３゜９６０．４９２郵（１９７６）。
中の内因性チロキシンを置換することによって全チロキ
シン結合性グロブリン量を評価する方法である。米国特
許第３゜９６０．４９２郵（１９７６）。
別の方法はチロキシン非可逆性酵素抑制剤共役体を使用
する方法である。この共役体はチロキシン結合性グロブ
リンの不足・２和位置のチロキシン部分によって結合し
、非可逆１ｒ１：酔素抑１１距’（’ＪＹｊ’ｌ）分を
不活性化する。従って、不飽オロチロキシン７帖合性グ
ロブリンの量が多いほど、結合される共役体は多くなり
、酵素を抑吊りするのにオリ用される非可逆性酵素抑制
剤の量は減少する。すなわち、チロキシン結合性グロブ
リンの量の増大は大きな酵素活性をもたらす。従って、
Ｔ）そ素および酵素と上記のチロキシン非可逆性１コツ
素抑制削に対する基質を皿稍とｃｎ合すると血清中の不
飽和チロキシン結合性グロブリンの＋ｊ１１］定が可能
Ｋｆ、Ｃる。米区１特許第４，３４１゜８６５号。
する方法である。この共役体はチロキシン結合性グロブ
リンの不足・２和位置のチロキシン部分によって結合し
、非可逆１ｒ１：酔素抑１１距’（’ＪＹｊ’ｌ）分を
不活性化する。従って、不飽オロチロキシン７帖合性グ
ロブリンの量が多いほど、結合される共役体は多くなり
、酵素を抑吊りするのにオリ用される非可逆性酵素抑制
剤の量は減少する。すなわち、チロキシン結合性グロブ
リンの量の増大は大きな酵素活性をもたらす。従って、
Ｔ）そ素および酵素と上記のチロキシン非可逆性１コツ
素抑制削に対する基質を皿稍とｃｎ合すると血清中の不
飽和チロキシン結合性グロブリンの＋ｊ１１］定が可能
Ｋｆ、Ｃる。米区１特許第４，３４１゜８６５号。
別の方法は螢光偏光免疫分析技術を使用してＴ３同化力
を測定する方法である。然しなから、この方法は分離の
諸工程ならび１ＣＴ３に対する抗体の使用を必要とする
。米国特許第４，３４７，０５９号。
を測定する方法である。然しなから、この方法は分離の
諸工程ならび１ＣＴ３に対する抗体の使用を必要とする
。米国特許第４，３４７，０５９号。
チロキシンがチロキシン結合性蛋白以外の結合性蛋白特
にアルブミンおよびｈＩＪ駆アルブミン（て結合し、従
ってこのような蛋白質の介在が遊歴チロヤシンの水＊に
影響を及ぼすととは知られている。Ｆｅ５ｃｏ、ｅｔ
ａｌ、Ｃ１ｊｎ、。
にアルブミンおよびｈＩＪ駆アルブミン（て結合し、従
ってこのような蛋白質の介在が遊歴チロヤシンの水＊に
影響を及ぼすととは知られている。Ｆｅ５ｃｏ、ｅｔ
ａｌ、Ｃ１ｊｎ、。
２８／６．Ｉ）、１３２５ １３２９（１９８２）本発
明は螢光側光技術を使用して不飽和チロキシン結合性生
白位置を判定する方法に関する。特に本発明は、チロキ
シンだ合性蛋白を含む試料を、チロキシン結合性グロブ
リンに対して優先的な結合親和力をもつ螢光標識トレー
サーと接触させ、そしてチロギシン結合性ガ（白に結合
した螢光標識トレーサーの獣を不飽和チロキシン結合性
蛋白位置の尺度として螢光偏光技術を使用して測定する
ことから成ることを特徴とする不飽和チロキシン結合性
蛋白位置の測定方法に関する。
明は螢光側光技術を使用して不飽和チロキシン結合性生
白位置を判定する方法に関する。特に本発明は、チロキ
シンだ合性蛋白を含む試料を、チロキシン結合性グロブ
リンに対して優先的な結合親和力をもつ螢光標識トレー
サーと接触させ、そしてチロギシン結合性ガ（白に結合
した螢光標識トレーサーの獣を不飽和チロキシン結合性
蛋白位置の尺度として螢光偏光技術を使用して測定する
ことから成ることを特徴とする不飽和チロキシン結合性
蛋白位置の測定方法に関する。
不１″９和チロキシン結合性蛋白位１σの測定は全チロ
キシンσ、↓度と計ｔみ合せて使用して、甲状腺機能障
害の初期診断に一カ、夕に受は入れられる指標であると
ころの遊離チロキシン相似を求める。
キシンσ、↓度と計ｔみ合せて使用して、甲状腺機能障
害の初期診断に一カ、夕に受は入れられる指標であると
ころの遊離チロキシン相似を求める。
不１゛ｆ；材［」チロキシン結合性生白位置の抑１定の
７４めに本発明によって分析しうる試料は未知のＴ同化
力をもつ生物学的流体（たとえば患者の試料）または既
知のＴＳ化刀をもつ生物学的流体（すなわち標博物質）
を包含する。代表的な生物学的流体は血漿または血清を
包含するがこれらに限定されない。げ１清は本発明の分
析法に便用する好１ししへ生物学的流体である。
７４めに本発明によって分析しうる試料は未知のＴ同化
力をもつ生物学的流体（たとえば患者の試料）または既
知のＴＳ化刀をもつ生物学的流体（すなわち標博物質）
を包含する。代表的な生物学的流体は血漿または血清を
包含するがこれらに限定されない。げ１清は本発明の分
析法に便用する好１ししへ生物学的流体である。
ととて使用する″゛Ｔ回化力゛なる用語はチロキシンに
結合するのにイ“り用しうる不飽和チロキシン結合は蛋
白位置の相対直すをし４−床する。
結合するのにイ“り用しうる不飽和チロキシン結合は蛋
白位置の相対直すをし４−床する。
木兄りｊの方法に使用する螢光ｇ識トレーサーは他の特
定の光イ〕性蛋白よりもむ１．ろチロキシン結合性グロ
ブリンに優先的に結合する。″チロキシンに対する優先
的縦合親和力゛なる用語はトレーサーがチロキシン結合
性グロブリン、アルブミンおよび前、駆アルブミンに対
してチロキシンと同じ相対結合親和力を実質的にもつ事
実を意味する。すなわち、チロキシン話合性グロブリン
に対するトレーサーの相対分析応答とアルブミンおよび
チロキシン７箇合性前駆アルブミンへのトレーサーの結
合との比は１より犬きく好ましくは３より犬きくあるべ
きである。
定の光イ〕性蛋白よりもむ１．ろチロキシン結合性グロ
ブリンに優先的に結合する。″チロキシンに対する優先
的縦合親和力゛なる用語はトレーサーがチロキシン結合
性グロブリン、アルブミンおよび前、駆アルブミンに対
してチロキシンと同じ相対結合親和力を実質的にもつ事
実を意味する。すなわち、チロキシン話合性グロブリン
に対するトレーサーの相対分析応答とアルブミンおよび
チロキシン７箇合性前駆アルブミンへのトレーサーの結
合との比は１より犬きく好ましくは３より犬きくあるべ
きである。
螢光標識トレーサーは螢光標識に結合したチロキシン部
分またはチロキシン類似物から成る。任意の好適な螢光
標識を使用してチロキシンまたはチロキシン類似体を標
識することができる。螢光標識はフルオレセインおよび
ローダミンおよびそれらの誘導体を包含するが、これら
に限定されない。螢光標識としてフルオレセイン誘導体
を使用するのが好ましい。チロキシン部分またはチロキ
シン類似体がフルオレセインまたはフルオレセインｍ４
体に結合り、 でいる螢光標識トレーサーを以後チロ
キシン−フルオレでイン共役体と呼ぶ。
分またはチロキシン類似物から成る。任意の好適な螢光
標識を使用してチロキシンまたはチロキシン類似体を標
識することができる。螢光標識はフルオレセインおよび
ローダミンおよびそれらの誘導体を包含するが、これら
に限定されない。螢光標識としてフルオレセイン誘導体
を使用するのが好ましい。チロキシン部分またはチロキ
シン類似体がフルオレセインまたはフルオレセインｍ４
体に結合り、 でいる螢光標識トレーサーを以後チロ
キシン−フルオレでイン共役体と呼ぶ。
次の構造式は本発明の方法に関してトレーサーとして有
用な好ましいチロキシン−フルオレセイン共役体を示す
ものである。
用な好ましいチロキシン−フルオレセイン共役体を示す
ものである。
および生物学的に許容しうるその塩。ただし上記式中の
結合カーボニル刈はフルオレセイン部分の５位才たけ６
位に結合している。
結合カーボニル刈はフルオレセイン部分の５位才たけ６
位に結合している。
０ ０１（
および生物学的に許容しうるその塩。ただし上記式中の
ｎは１〜８の整数であり、カルボニル基はフルオレセイ
ン部分の５位ま７には６位に結合している。およびＣＡ
） 、ｐ ｎ および生物学的１て許容しうるその塩。
ｎは１〜８の整数であり、カルボニル基はフルオレセイ
ン部分の５位ま７には６位に結合している。およびＣＡ
） 、ｐ ｎ および生物学的１て許容しうるその塩。
たたし式中のＩｎは１〜８の郵数であり、ｐは０捷たは
１の整茨λであり、Ａは３より低いｐＨをもつ酸塩たと
えば塩酸塩、トリフロロ昨酸塩、トリクロロ酢咳、酢鍍
塩などであり、カルボニル基はフルオレセイン部分の５
泣または６位に結合している。
１の整茨λであり、Ａは３より低いｐＨをもつ酸塩たと
えば塩酸塩、トリフロロ昨酸塩、トリクロロ酢咳、酢鍍
塩などであり、カルボニル基はフルオレセイン部分の５
泣または６位に結合している。
ｎまたはｒｎが２〜４の範囲にある式（■）および式１
１ｉ ）のトレーサーを使用するのが好ましく、１ｎが
２または３である式（ＩＩ）のトレーサーを使用するの
が軒に好丑しい。ｒｎが３である式（ＩＩＪ）のトレー
サーを使用するのが最も好ましい。
１ｉ ）のトレーサーを使用するのが好ましく、１ｎが
２または３である式（ＩＩ）のトレーサーを使用するの
が軒に好丑しい。ｒｎが３である式（ＩＩＪ）のトレー
サーを使用するのが最も好ましい。
本発明の方法に従い、チロキシン結合性蛋白を含む試イ
コＩを螢光標識トレーサーと接触させて螢光標識トレー
サーを試料中の不飽和チロキシン結合性蛋白位置に結合
させて錯体を形成させる。錯体の生成は遊離のトレーサ
ーのみを含むものからのＩ／ｌ液の螢光偏光を増大させ
る。チロキシン結合性蛋白を螢光標識トレーサーと接触
させることによって生せしめた螢光の偏光の増大は終点
法または動力学法のいづれかによる周知の偏光螢光計の
技術によって測定することができる。好捷しくけ、終点
螢光討技術を本発明の分析にイ史用する。
コＩを螢光標識トレーサーと接触させて螢光標識トレー
サーを試料中の不飽和チロキシン結合性蛋白位置に結合
させて錯体を形成させる。錯体の生成は遊離のトレーサ
ーのみを含むものからのＩ／ｌ液の螢光偏光を増大させ
る。チロキシン結合性蛋白を螢光標識トレーサーと接触
させることによって生せしめた螢光の偏光の増大は終点
法または動力学法のいづれかによる周知の偏光螢光計の
技術によって測定することができる。好捷しくけ、終点
螢光討技術を本発明の分析にイ史用する。
非将諏件トレーサー結合性の及び可変背雰の・螢光に同
伴するＴ、ｉｊ１題を克ｊＪ反する／Ｃめに、試料は７
０より大きいｐＨをもつ１ダ備化媒質中の非螢光性表面
活性〈りから成る組成物で処理しなければならない。こ
のような組成物中に使用する非・；ｉト光１４Ｌ表由：
活性１粗ま当業者によって容易に求められるものであり
、たとえばナトリウムドデシルザルフェートがあげられ
る。このような組成物中シで使用する緩衝媒質には溶グ
のｐＨを７より大きく、好ましく（・ゴ７．５〜９．５
の範囲に、最も好才しくは８．０〜９０の範囲に保つに
十分な緩衝液があけられる。代表的緩衝液には重炭酸塩
緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなど
がある。棟だ、ホンフェート緩衝液のよ５な低いｐＫを
もつ緩価孜を使用するときは、トリエチルアミンやトリ
エチレンジアミンのような有機塩茎を緩衝液と組み合せ
て使用して緩イ鮪ｌυ填に所望のｐＨ範囲を与えること
ができる。
伴するＴ、ｉｊ１題を克ｊＪ反する／Ｃめに、試料は７
０より大きいｐＨをもつ１ダ備化媒質中の非螢光性表面
活性〈りから成る組成物で処理しなければならない。こ
のような組成物中に使用する非・；ｉト光１４Ｌ表由：
活性１粗ま当業者によって容易に求められるものであり
、たとえばナトリウムドデシルザルフェートがあげられ
る。このような組成物中シで使用する緩衝媒質には溶グ
のｐＨを７より大きく、好ましく（・ゴ７．５〜９．５
の範囲に、最も好才しくは８．０〜９０の範囲に保つに
十分な緩衝液があけられる。代表的緩衝液には重炭酸塩
緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなど
がある。棟だ、ホンフェート緩衝液のよ５な低いｐＫを
もつ緩価孜を使用するときは、トリエチルアミンやトリ
エチレンジアミンのような有機塩茎を緩衝液と組み合せ
て使用して緩イ鮪ｌυ填に所望のｐＨ範囲を与えること
ができる。
次の′ＫｒＡ１例は本発明を更に具体的に説明するため
のものである。
のものである。
実施例
Ａ、試ｌ１１
１、予備処理ｆＪ 液： ０．１５％−Ｊ−） ＩＪ
’７ムドデシルサルフエート および０．１％アジ化ナトリウムを０．１Ｍナトリウム
ホスフェート１か析液中に含む溶液。
’７ムドデシルサルフエート および０．１％アジ化ナトリウムを０．１Ｍナトリウム
ホスフェート１か析液中に含む溶液。
２ フルオレセイントレーサー二ｍに３の式（ｉｌ＋）
のトレ係ナトリウムドデシルサルフェート、０．１襲牛
ガンマグロブリンおよび０．１Ｍアジ化ナトＩＪウムを
含む緩衝媒質中で２、４Ｘ１０ ｈｉの娘度で使用す
る。
のトレ係ナトリウムドデシルサルフェート、０．１襲牛
ガンマグロブリンおよび０．１Ｍアジ化ナトＩＪウムを
含む緩衝媒質中で２、４Ｘ１０ ｈｉの娘度で使用す
る。
３ Ｔ同化性キャリブレータ：次の同化値すなわち０。
０、５，１０，１．５，２．０，および２５をもつ４係
ヒト血清マドｌ）ツクス中の羊−抗Ｔ抗血清。１０の同
化値は正常血ＵのＴ同化値に寺いへ ４ 希釈用緩衝ｇ： ｏ１％十ガンマグロブリンおよび
Ｏ、１飴アシ化すＦ ｌｊウムを含む０． Ｉ Ｍホス
フェ−ｒｏすべての偏光螢光測定は偏光分光螢光計（ア
ボットＴＤｘＦｌｕｏｒｅｓｃ：ｅｎｃｅ Ｐｏｌａｒ
ｉｚａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を使用して行なっ
た。
ヒト血清マドｌ）ツクス中の羊−抗Ｔ抗血清。１０の同
化値は正常血ＵのＴ同化値に寺いへ ４ 希釈用緩衝ｇ： ｏ１％十ガンマグロブリンおよび
Ｏ、１飴アシ化すＦ ｌｊウムを含む０． Ｉ Ｍホス
フェ−ｒｏすべての偏光螢光測定は偏光分光螢光計（ア
ボットＴＤｘＦｌｕｏｒｅｓｃ：ｅｎｃｅ Ｐｏｌａｒ
ｉｚａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を使用して行なっ
た。
Ｂ．分析法
１ １μＬの分別量の未知試料［２５μｔの予備処理溶
液を加え、えられた混合物を希釈用緩衝液で１ｍｌに希
釈する。
液を加え、えられた混合物を希釈用緩衝液で１ｍｌに希
釈する。
えられた分析、溶液を混合して偏光螢光背景を測定する
。
。
２、ステップ１の分析溶液に第２の１μＬの分別量の未
知試料、２５μｔの予備処理溜液、２５μｔのＴ４フル
オレセイントレーサー、および緩衝液を加えて最終容量
を２ｍＡとする。えられた溶液を混合して偏光螢光を測
定する。
知試料、２５μｔの予備処理溜液、２５μｔのＴ４フル
オレセイントレーサー、および緩衝液を加えて最終容量
を２ｍＡとする。えられた溶液を混合して偏光螢光を測
定する。
３、トレーサー結合による螢光偏光を、混合物の最終の
偏光螢光強度から背景の偏光螢光を差し引くことによっ
て求める。
偏光螢光強度から背景の偏光螢光を差し引くことによっ
て求める。
４ えられた偏光値はそれぞれの試料のＴ同化力に比１
ダｊする。
ダｊする。
５ 試料の螢光偏光を、既知のＴ同化値のキャリブレー
クを使用して作成したｂ％ｐ 立回１線と比較してＴ同
化値を求める。
クを使用して作成したｂ％ｐ 立回１線と比較してＴ同
化値を求める。
実施例
本発明■Ｔ同化性螢光偏光分析の効率を調べるために、
（ｉ） ＴＲＩＯ−ＢＥＡＤ Ｔ３ Ｕｐｔａｋｅ Ｄ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｋｉｔ（米国イリノイ州ソースジ
カゴのアボット ラボラトリーズ製の機器）および（１
１）解素抑制剤Ｔ同化法（米国イリノイ州ノースジカゴ
のアボット ラボラドＩＪ−ズの’ｐｈｙｒｏｚｙｍｅ
Ｕｐｊａｋｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｋｉｔに示され
る方法）を使用して相関イｖ［究を行なった。
（ｉ） ＴＲＩＯ−ＢＥＡＤ Ｔ３ Ｕｐｔａｋｅ Ｄ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｋｉｔ（米国イリノイ州ソースジ
カゴのアボット ラボラトリーズ製の機器）および（１
１）解素抑制剤Ｔ同化法（米国イリノイ州ノースジカゴ
のアボット ラボラドＩＪ−ズの’ｐｈｙｒｏｚｙｍｅ
Ｕｐｊａｋｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｋｉｔに示され
る方法）を使用して相関イｖ［究を行なった。
不発明の螢光１ＲＭ光分析、放射能分析、および酵素抑
制剤分析からえたテークを下記の第１表に示す。
制剤分析からえたテークを下記の第１表に示す。
第１表
Ｔ同１ヒカ
１ １、０８ ０．９６ ２
８．９係２ ０、６９ ０．７８
３４．６％３ １、１５ １．０
１ ２６．Ｓ係４２。２５ １．５
６ １５．６係５ ０、９８
０．６７ ３０．５％■ １０のＴ同化１
１区が正常でめる。
８．９係２ ０、６９ ０．７８
３４．６％３ １、１５ １．０
１ ２６．Ｓ係４２。２５ １．５
６ １５．６係５ ０、９８
０．６７ ３０．５％■ １０のＴ同化１
１区が正常でめる。
■ ３０％Ｔ同化値が正常である。本発明の螢光計測定
は放射能免疫分析法を使用してえられたＴ３同化値に反
比例する。
は放射能免疫分析法を使用してえられたＴ３同化値に反
比例する。
以上の記述と実施例からり」らかなように、本発明の方
法は追加の試剤たとえばチロキシンに対する抗１本を必
要とすることなしに均一分析系中の試料のＴ同化値を測
定する面接法を与える。また、本発明で使用するチロキ
シン−フルオレセイン共役体は製造および精製が比較的
容易でりり、酵素抑制４１技術を使用するＴ同化性分析
で使用する試剤よりも安定性が太きい。その上、これは
螢光分析であるため、試料の大きさは通常の技術を使用
するＴ同化性分析で必要とするものよりも一般に著るし
く小さい。
法は追加の試剤たとえばチロキシンに対する抗１本を必
要とすることなしに均一分析系中の試料のＴ同化値を測
定する面接法を与える。また、本発明で使用するチロキ
シン−フルオレセイン共役体は製造および精製が比較的
容易でりり、酵素抑制４１技術を使用するＴ同化性分析
で使用する試剤よりも安定性が太きい。その上、これは
螢光分析であるため、試料の大きさは通常の技術を使用
するＴ同化性分析で必要とするものよりも一般に著るし
く小さい。
本発明の方法に関連してトレーサーとして有用なチロキ
ン−フルオレセイン共役体は通常の方法に従って一般に
製造することができる。以下に述べる実施例は本発明の
方法に使用しうるチロキシン−フルオレセイン共役体の
製造を酸１明するものである。これらの実施例において
製造される化合物を示す構造式中に現われる［ＣＦ’ｌ
なる符号は次式の基を表わすものである。
ン−フルオレセイン共役体は通常の方法に従って一般に
製造することができる。以下に述べる実施例は本発明の
方法に使用しうるチロキシン−フルオレセイン共役体の
製造を酸１明するものである。これらの実施例において
製造される化合物を示す構造式中に現われる［ＣＦ’ｌ
なる符号は次式の基を表わすものである。
天、四側３
２ｍ＋！のジメチルホルムアミドにとかした８３■（０
，２２ミリモル）の６−カルボキシフルオレセインに２
８■（０２４ミリモル）のＮ−ヒドロキシサクシニミド
および５５”ｎ？４０．２７ミリモル）のＮ、Ｎ’−ジ
シクロへキシルカルボジイミドを加えた。反応混合物を
アルゴンガ囲気下で０℃にお・いて１時間かくはんし、
次いで４℃において１６時間保付して次式のカルボキシ
フルオレセインのＮ−ヒドロギシサクシニミド活性エス
テルをえた。
，２２ミリモル）の６−カルボキシフルオレセインに２
８■（０２４ミリモル）のＮ−ヒドロキシサクシニミド
および５５”ｎ？４０．２７ミリモル）のＮ、Ｎ’−ジ
シクロへキシルカルボジイミドを加えた。反応混合物を
アルゴンガ囲気下で０℃にお・いて１時間かくはんし、
次いで４℃において１６時間保付して次式のカルボキシ
フルオレセインのＮ−ヒドロギシサクシニミド活性エス
テルをえた。
１ｍｅのジメチルポルムアミド中のジーｔ−ブチルジカ
ーボネート（２７ｍＶ、０．０００１２モル）Ｏｆｆｒ
Ｎｌ−を絶えずか＜（コんしながらこれにＤ−チロキシ
ンナトリウム塩（１００ｍ７．０．０００１２モル）を
加える。室温で２時間かくはん仏、ｆＪｊ媒を旨真空下
で除く。残ｌｙをメタノール（てとかし、Ｉ Ｎ −１
（Ｃ１を沈殿が生成する１で部下状に加える。溶媒をデ
カンテーションして除き、残渣を真空下で乾燥して９０
■（８２％収率）のＮ−ｔ−ブトキシカーボニル−Ｄ−
チロキシンを得る。このものは次式を有する。
ーボネート（２７ｍＶ、０．０００１２モル）Ｏｆｆｒ
Ｎｌ−を絶えずか＜（コんしながらこれにＤ−チロキシ
ンナトリウム塩（１００ｍ７．０．０００１２モル）を
加える。室温で２時間かくはん仏、ｆＪｊ媒を旨真空下
で除く。残ｌｙをメタノール（てとかし、Ｉ Ｎ −１
（Ｃ１を沈殿が生成する１で部下状に加える。溶媒をデ
カンテーションして除き、残渣を真空下で乾燥して９０
■（８２％収率）のＮ−ｔ−ブトキシカーボニル−Ｄ−
チロキシンを得る。このものは次式を有する。
Ｈ３Ｃ−Ｃ−ＣＨ３
吉Ｈ３
１ｍｌの７メチルホルムアミドにとかしたＮ−ｔ−ブト
キシカーボニル−ｆ’）−チロキシ：／ （５１”Ｗ、
０．００００６モル）の部分にＮ−ヒドロキシサクシニ
ミド（７ｍ７．０．００００６モル）およヒＮ、Ｎ−ジ
シクロへキシルカルボジイミド（１５ｍ＆、０．０００
０６モル）を加える。反応混合物を室温で３時間かくは
んし、その後に反応混合物を濾過して１ｍｌのジメチル
ホルムアミド中の１，３−ジアミノプロパン（５０μｌ
、００００３モル）の溶液（（絶えずかくに１んｊ−な
がら加える。室温で１５分間かくはんした後、溶液を除
いて残渣を、メタノール／水／酢酸の８０／１９／１で
閉出するＷｈａ ｔ＋ｎａｎ Ｃ１８反転相処方ＴＬＣ
プレート上で精製して次式をもつＮ−１−ブトギシカー
ボニルーＤ−チロキノンプロピレンジアミンの３３１１
１ｉ’（６１％収率）を１４′！る。
キシカーボニル−ｆ’）−チロキシ：／ （５１”Ｗ、
０．００００６モル）の部分にＮ−ヒドロキシサクシニ
ミド（７ｍ７．０．００００６モル）およヒＮ、Ｎ−ジ
シクロへキシルカルボジイミド（１５ｍ＆、０．０００
０６モル）を加える。反応混合物を室温で３時間かくは
んし、その後に反応混合物を濾過して１ｍｌのジメチル
ホルムアミド中の１，３−ジアミノプロパン（５０μｌ
、００００３モル）の溶液（（絶えずかくに１んｊ−な
がら加える。室温で１５分間かくはんした後、溶液を除
いて残渣を、メタノール／水／酢酸の８０／１９／１で
閉出するＷｈａ ｔ＋ｎａｎ Ｃ１８反転相処方ＴＬＣ
プレート上で精製して次式をもつＮ−１−ブトギシカー
ボニルーＤ−チロキノンプロピレンジアミンの３３１１
１ｉ’（６１％収率）を１４′！る。
Ｈ２Ｏ−ＣＣＨ３
さＨ３
１１ｎｅのジメチルホルｌ、アミドにとかしたＮ−１−
ブトキンカーボニルＤ−チロニ［シンプロピレンジアミ
ン（１０ｍｌ、０．００００１モル）の１部に１チーお
よびσ−カルボキシフルオレセインの混合物（５ｍ’ｌ
、０．００００１モル）のＮ−ヒドロキシサクシニミド
活性エステルを加える。反応混合物を室温で３０分間か
くはんし、俗媒を真空下で除く。メチレンクロライド：
メタノールの９：１混合物で溶出するシリカゲル処方Ｔ
ＬＣプレートを使用して残渣を精製し、次式をもつＮ
ｔ−ブトキシカーボニルＤ−チロキシンプロピレンジ
アミンカルボキシフルオレセインの混合１勿を得る。
ブトキンカーボニルＤ−チロニ［シンプロピレンジアミ
ン（１０ｍｌ、０．００００１モル）の１部に１チーお
よびσ−カルボキシフルオレセインの混合物（５ｍ’ｌ
、０．００００１モル）のＮ−ヒドロキシサクシニミド
活性エステルを加える。反応混合物を室温で３０分間か
くはんし、俗媒を真空下で除く。メチレンクロライド：
メタノールの９：１混合物で溶出するシリカゲル処方Ｔ
ＬＣプレートを使用して残渣を精製し、次式をもつＮ
ｔ−ブトキシカーボニルＤ−チロキシンプロピレンジ
アミンカルボキシフルオレセインの混合１勿を得る。
曝
Ｈ２Ｏ−Ｃ−ＣＨ３
晶３
実施例
２％水性Ｎａ ＯＨの１００ｍ６およびジオキサン１０
０ｍＪ中（ｌ（５−アミノバレリア姓（５，８５９、（
１０５モル）を含む諸Ｑ ｊｚこ、ジオキサン４Ｑｍｌ
中にジーｔ−フチルジカーボネ−１１１，ｏ、’ｌ、０
０５モル）を含む溶６（−をが］下伏に加えた。反応混
合物を１８時間かくはんし、次いでＩ Ｎ −Ｉ−ＩＣ
７を使用してｐＨ３に酸性化した。数件化混合物をジク
ロロメタンで３回抽出した。有機相を集めて水で洗い、
仕酸ナトリウム上で乾燥して１０．］ｊ’（９３，５％
収率）の５＝（ｔ−ブトキシカーボニルアミン）バレリ
アり１、を巳色結晶状固体として得た。
０ｍＪ中（ｌ（５−アミノバレリア姓（５，８５９、（
１０５モル）を含む諸Ｑ ｊｚこ、ジオキサン４Ｑｍｌ
中にジーｔ−フチルジカーボネ−１１１，ｏ、’ｌ、０
０５モル）を含む溶６（−をが］下伏に加えた。反応混
合物を１８時間かくはんし、次いでＩ Ｎ −Ｉ−ＩＣ
７を使用してｐＨ３に酸性化した。数件化混合物をジク
ロロメタンで３回抽出した。有機相を集めて水で洗い、
仕酸ナトリウム上で乾燥して１０．］ｊ’（９３，５％
収率）の５＝（ｔ−ブトキシカーボニルアミン）バレリ
アり１、を巳色結晶状固体として得た。
５−（ｔ−ブトキシカーボニルアミノ）バレリア酸の１
部（０，４３１’、０．００２モル）に３ｒｒ＋ｌのジ
ン００メタン中ノＮ、付−ジシクロへキシルカルボジイ
ミド（０，４Ｌ２ｉｉ’、０．００２モル）およびＮ−
ヒに゛ロ斤シサクシニミｌ−”（０２５２，０，００２
２モル）を一定にかくはんしなから那え、反応を１８時
時間桁させて５−（ｔ−ブトキシカーボニルアミノ）バ
レリア敵のＮ−ヒドロキシサクシニミド活性エステルを
油伏残潴として得た。この油伏残直にメタノール３０ｍ
１中のＬ−チロキシンナ） ＩＪウム塩塩水水和物１．
９５７．０．００２２モル）を加えた。
部（０，４３１’、０．００２モル）に３ｒｒ＋ｌのジ
ン００メタン中ノＮ、付−ジシクロへキシルカルボジイ
ミド（０，４Ｌ２ｉｉ’、０．００２モル）およびＮ−
ヒに゛ロ斤シサクシニミｌ−”（０２５２，０，００２
２モル）を一定にかくはんしなから那え、反応を１８時
時間桁させて５−（ｔ−ブトキシカーボニルアミノ）バ
レリア敵のＮ−ヒドロキシサクシニミド活性エステルを
油伏残潴として得た。この油伏残直にメタノール３０ｍ
１中のＬ−チロキシンナ） ＩＪウム塩塩水水和物１．
９５７．０．００２２モル）を加えた。
２）ｊ、応を１８時＋ａ進行させ、その後に反応混合物
を、溶出、・イダとしてメタノールを便用するイ万ン父
侯弼脂カラム〔Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＡＧ ５０〜ｖ−ｘｓ
（Ｈ＋型）〕に通した。
を、溶出、・イダとしてメタノールを便用するイ万ン父
侯弼脂カラム〔Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＡＧ ５０〜ｖ−ｘｓ
（Ｈ＋型）〕に通した。
溶出液を真空下でθ獅して次式の中間体１．９６ｒ（９
０１ヅふ）を得た。
０１ヅふ）を得た。
上記の中間体の１部（０，１２５？、０．０００１５モ
ル）をトリフロロ酢酸（２，０ｍ）で３０分間処理した
。トリフロロ酢酸を減圧下での蒸発により除き、えられ
た残渣を１、５ Ｐｉ ’７） Ｎ、Ｎ−ジメチルホル
ムアミドにとかした。えられた溶・夜をトリエチルアミ
ンにより塩基性ｐＨに調整した。
ル）をトリフロロ酢酸（２，０ｍ）で３０分間処理した
。トリフロロ酢酸を減圧下での蒸発により除き、えられ
た残渣を１、５ Ｐｉ ’７） Ｎ、Ｎ−ジメチルホル
ムアミドにとかした。えられた溶・夜をトリエチルアミ
ンにより塩基性ｐＨに調整した。
この、４Ｌ＠物にカルボキシフルオレセインのＮ−ヒド
ロキンサクシニミド活性エステル（７５１７ｇ、０．０
００１５９モル）を加えた。反応を１８時時間桁させた
。反応混合吻にジエチルエーテルを加えて沈）役物をえ
た。メタノール：水：酢酸（７５：２５：０５）の混合
物を使用する予伽反転相ＴＬＣにより上記の沈殿物を精
製して次式をもつチロキシン−６−カルポキシフルオレ
屯イン共役体の０．０７１９を橙色固体として得た。
ロキンサクシニミド活性エステル（７５１７ｇ、０．０
００１５９モル）を加えた。反応を１８時時間桁させた
。反応混合吻にジエチルエーテルを加えて沈）役物をえ
た。メタノール：水：酢酸（７５：２５：０５）の混合
物を使用する予伽反転相ＴＬＣにより上記の沈殿物を精
製して次式をもつチロキシン−６−カルポキシフルオレ
屯イン共役体の０．０７１９を橙色固体として得た。
ｉ発明を特定の具体例［ｊカして記述したけれども、そ
の詳細は眼定灸件と解釈すべきではない。本発明の精神
および範囲から逸脱することなしに種々の均等な具体例
、変化および変形が行いうろことが明らかであり、この
ような均等な具体例が本発明（ｌこ含まれるように意図
されていることが址だされるからである。
の詳細は眼定灸件と解釈すべきではない。本発明の精神
および範囲から逸脱することなしに種々の均等な具体例
、変化および変形が行いうろことが明らかであり、この
ような均等な具体例が本発明（ｌこ含まれるように意図
されていることが址だされるからである。
手 続 補 正 省 Ｃ方式）
昭牙口５８り巳１２月９日
特許庁長官若杉和夫殿
１、事件の表示
昭和５８年特許和第２０８４４０号
２、発明の名称
螢元偏光技術荀用いる不飽和チロキシン結合性蛋白位置
の測定法 ３、補正ｒする者 事件との関係 牛デ許出願人 名称 アボット ラボラトリーズ 扉板大成ビル（１ｊ：話５８２−７Ｌ６１）乳沈に添付
の手４Ｆき明而香
の測定法 ３、補正ｒする者 事件との関係 牛デ許出願人 名称 アボット ラボラトリーズ 扉板大成ビル（１ｊ：話５８２−７Ｌ６１）乳沈に添付
の手４Ｆき明而香
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、チロキシン結合性蛋白を含む試料中の不飽和チロキ
シン結合性蛋白位置を測定する方法であって、（ａ）
７．０より大きいｐＨをもつ緩衝化媒質中の非蚤元性
表面活性剤から成る組成物で試料を処理し、０）チロキ
シン結合性グロブリンに対して優先的な結合親和力をも
つ螢光標識トレーサーに上記処理試料を接触させてチロ
キシン結合性蛋白と螢光標識トレーサーとの間に錯体を
生成させ、そして （Ｃ） 生成した錯体の量を試料中の不飽和チロキシ
ン結合性蛋白位１１ケの尺度として螢光偏光技術を使用
して測定する、ことから成ることを’ｌとする測定方法
。 ２、非螢光性表面活性Φ撮はナトリウムドデシルサルフ
ェートである９１許該求の範囲第１項記載の方法。 ３、緩衝化媒質のｐＨが８．０〜９０の範囲にある特許
請求の範囲第２項記載の方法。 ４ 緩備剤がＭ炭酸ナトリウムである峙奸開求の範囲第
３項記載の方法。 ５、緩衝化媒質がリン除塩緩衝液中のトリエチレンジア
ミンから成るｑ−！ｆ許拍求の範囲第２項記載の方法。 ６ 螢光ｉ識トレーサーがチロキシンーフルロレセイ
ン共役体から成る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、チロキシン−フルオレセイン共役体が次式の化合物
（ただし式中の【ｎは２〜８の整数）である特許請求の
範囲第６項記載の方法。 り旦 または Ｈ ８ｉｎが２〜４の整数である特許請求の範囲第７項記載
の方法。 ９、【ｎが３である特許請求の範囲第８項記載の方法。 第９項のいづれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US440068 | 1974-02-06 | ||
| US06/440,068 US4476228A (en) | 1982-11-08 | 1982-11-08 | Determination of unsaturated thyroxine binding protein sites using fluorescence polarization techniques |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59104554A true JPS59104554A (ja) | 1984-06-16 |
Family
ID=23747288
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58208440A Pending JPS59104554A (ja) | 1982-11-08 | 1983-11-08 | 螢光偏光技術を用いる不飽和チロキシン結合性蛋白位置の測定法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4476228A (ja) |
| EP (1) | EP0108400B1 (ja) |
| JP (1) | JPS59104554A (ja) |
| CA (1) | CA1210690A (ja) |
| DE (1) | DE3371251D1 (ja) |
| ES (1) | ES8407209A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04500731A (ja) * | 1989-07-11 | 1992-02-06 | ベーリング ダイアグノスティクス インコーポレイテッド | 診断用アッセイ系 |
Families Citing this family (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4591569A (en) * | 1984-04-11 | 1986-05-27 | Becton Dickinson & Company | Homogeneous fluorescent triiodothyronine uptake test |
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| US5221629A (en) * | 1986-05-21 | 1993-06-22 | Abbott Laboratories | Phencyclidine and phencyclidine metabolites assay, tracers, immunogens and antibodies |
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