JP2001504114A

JP2001504114A - ビタミンｄイムノアッセイシステム

Info

Publication number: JP2001504114A
Application number: JP52230998A
Authority: JP
Inventors: ロウリー，デイビッド; カークリーバーンズ，アレキサンダー
Original assignee: イムノダイアグノスティックシステムズリミティッド
Priority date: 1996-11-13
Filing date: 1997-11-12
Publication date: 2001-03-27
Also published as: EP0944591B1; ATE218542T1; DE69713138D1; WO1998021580A3; GB9623569D0; EP0944591A2; DE69713138T2; WO1998021580A2

Abstract

(57)【要約】Ｃ²⁰位置(position)において変性された１，２５ジヒドロキシビタミンＤの類似物を含む化合物は、少なくとも存在するまたは既に生成された抗体に結合させるため用いられ、前記類似物は定量検出用に用いられた置換基を含み、好ましくはラジオアクティブな置換基を含み、より好ましくはヨウ素１２５、またはルミニッセントまたはフルオッレッセント強度決定のために用いられた化学ルミニッセントまたはフルオッレッセント置換基を含み、それの製造過程とその過程において製造されたその中間物新規中間物（intermediates thereof novel intermediates)、化合物を含む組成物とイムノアッセイ法におけるその使用、好ましくはイムノアッセイキットを含み、組成物に含まれる禁止剤の新規使用と１，２５ジヒドロキシビタミンＤの濃度決定のための方法。

Description

【発明の詳細な説明】ビタミンＤイムノアッセイシステム技術分野本発明は、新規ビタミンＤ誘導体、前記誘導体の製造のための方法、トレイサーとしての適用、そして前記トレイサーを使用するアッセイ法とキットに関する。さらに詳しくは、本発明は２０−位置(position)で変性(modified)された新規ビタミンＤ類似物と、トレイサーとして定量検出ができる置換された誘導体に関する。背景ビタミンＤは、自然に存在する７−デヒドロコレステロール（プロ−ビタミンＤ）から誘導される、密接な関わりを持つ一般的に使用される分子の集合的用語である。プロ−ビタミンＤは、本来飲食物が起源だが、太陽光線に曝されると皮膚の中で光分解変換を経て原(parent)ビタミンＤ₃（コレカルシフェロール：cho lecalciferol)になる。この化合物は生化学的に不活性であるが、しかし循環系に入り、そして肝臓でヒドロキシル化されて活性２５−ヒドロキシビタミンＤになる。この少量の割合はさらに腎臓でヒドロキシル化され、かなり有効な向カルシウム性(calciotropic)ホルモン１，２５−ジヒドロキシビタミンＤになる。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、腸のカルシウムの吸収を刺激し、また骨の再吸収を増加させる、カルシウム（とリン酸塩）新陳代謝の主な調整物の一つである。それはまた副甲状腺への直接的な作用と、セラム(serum)のカルシウムレベルを上げる間接的作用とにより、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の生成をも妨げる。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの生成はそれ自身ＰＴＨにより刺激され、従って効果的なコントロールループを生成する。ビタミンＤ減少症（Hypovitaminosis Ｄ）は、一般的にビタミンＤの飲食物不足と関連し、大抵菜食主義者に起こる。それはまた太陽光線にあまり曝されなかったり（特に年配者や施設に収容された人々）、皮膚色素沈着(skin pigmmentat ion)にも関わる。末期段階の腎臓の損傷では、１α−ヒドロキシレーションにより、結果的に１，２５−ジヒドロキシビタミンＤが低レベルになる。ビタミンＤがあってもくる病になる遺伝性の病は、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤに対し末端器官(end-organ)の抵抗があり、結果的に２５−ジヒドロキシビタミンＤレベルは上げられる。くる病は子供の病であり、カルシウム付着不足により起こる軟骨化により特徴づけられる。従って、これは体の重みによる骨の曲がりを引き起こし、奇形へと導く。くる病は生後６ヶ月後から始まり、またその強度は身体的発育の速度に直接的に関わる。この病は本質的にビタミンＤの欠乏によるものだという決定的な証拠がある。くる病に関する病は骨軟化症(Osteomalacia)である。骨軟化症は成人に、特に多数の妊娠を経験した東洋の女性に起こる。この病は、骨の軟化また変形をもたらし、くる病に類似した様式のものにセラムカルシウムと無機リン酸塩レベルの低下と、そしてアルカリ性ホスファターゼ(alkaline phosphatase)の上昇がある。両方の病の場合、ビタミンＤを投与することなく通常の量の飲食用のカルシウムとリン酸塩を投与することは効果的でない。しかしながら、もしビタミンＤがカルシウムと３価のリン(phosphorus)とともに投与された場合、骨軟化症からの回復は速い。ビタミンＤ、１，２５ジヒドロキシビタミンＤのホルモン的に活性な新陳代謝を正確に測定することは、腎臓と副甲状腺病をモニターするに当たり、臨床上重要性があり、そして悪性のハイパーカルカミア(hypercalcaemia)やビタミンＤ中毒(intoxication)のような、他のカルシウム新陳代謝の妨げを理解するのに有効である。さらには、ビタミンＤレセプターの存在が、骨、腸や腎臓といった一般的なターゲットとなる組織でない多くの場所において証明された。特に、レセプターは皮膚、胸、結腸、脳、内分泌腺、筋肉と血液細胞の中で確認された。さらに、全ての器官における多数のガン細胞は、増殖期から分化期への移行を決定するビタミンＤ、１，２５ジヒドロキシビタミンＤを持っている。従って、それは免疫調節物質(immunomodulatory substance)として働き、また正常な細胞とガン細胞の発育と分化を規制する。これは免疫欠乏を患うくる病の子供、あるいはカルシウムとビタミンＤ不足と関わりのある結腸のガンに高い確率でかかりやすいこと、あるいはビタミンＤレセプターが表出した胸部のガン患者が生き延びるといった疫学的観察(epidemiological observation)を説明する。ビタミンＤと関わりのあるその他の病気は骨多孔症（osteoporosis）である。４０歳代から通常最終的には老衰性骨多孔症を引き起こす、骨格質量の減少の進行(loss of skeletal mass)がある。女性の場合、骨多孔症は特に月経閉止の後で起こる。老衰性骨多孔症を避ける簡単な方法は無いが、肉体的な努力とカルシウムとビタミンＤが豊富な食事は老化現象の速度を遅らせる。背景技術体内の流体中の１，２５ジヒドロキシビタミンＤの循環レベルを決定することは、医療分野、特に研究開発において大変重要性があるので、評価される。体内血液中の１，２５ジヒドロキシビタミンＤのアッセイは、体内中におけるビタミンＤの新陳代謝効力の優れた指標となる。主に、血液循環の中の極めて低濃度の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤにより、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤのレベル決定のためのアッセイ方法の発展は進んでいない。現在まで、セラム中の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの主なアッセイ方法は競争的(competitive)な蛋白質結合アッセイである。発展している第１アッセイ方法のうちの一つは、困難を経て得られた、また不安定なくる病のひな(rachitic chick)の腸の結合蛋白質¹を利用している。さらにはこの細胞基質ゾルの(cytosolic)レセプターの特性の相対的な欠乏により、各サンプルは使用される前に集中的なクロマトグラフィーが必要とされた。従って、アッセイ方法はわずかな臨床試験で行われるだけである。次に、本発明の発明の特徴であるアッセイの中でのトレイサーの使用をみる。典型的に、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤのアッセイ方法は、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤのラベル付けした誘導体の製造を必要とする。一般的に、そのような誘導体は放射性のあるアイソトープか、または酵素としてラベル付けされる。さらに、それらは１，２５−ジヒドロキシビタミンＤを結合する抗体(antibody)のために高い類似性と高い特殊性を持たなくてはならない。多くのそのようなトレイサーが報告されている。英国特許出願ＧＢ１，５８９，９２１とＧＢ１，５９２、１７０に記載されているトレイサーは、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの３−または２５−が置換されたヘミ珪皮酸エステルから得られたポリクロナール抗体と共に使用されるトリチュームを含む(tritiated)、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤを請求している。さらに、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの濃度決定のために最も広く使用されるラジオイムノアッセイキットのうちの２つは、トリチュームを含む１，２５−ジヒドロキシビタミンＤをトレイサーとして利用した。ニコルスとインクスター(ＮｉｃｈｏｌｓａｎｄＩｎｃｓｔａｒ)により製造されたこれらのキットは、トリチュームを含む１，２５−ジヒドロキシビタミンＤを、結合体としての胸腺レセプター蛋白質と共に使用する。しかしながら、ラジオイムノアッセイキット中のトリチュームを含むトレイサーの使用は、数々の欠点をもつ。ラジオイムノアッセイ方法におけるトリチュームトレイサー使用の主な欠点は、結合トレーサーの濃度の決定に必要な長々しい液体シンチレーションカウント（ＬＳＣ）段階である。典型的に、この方法では６０個のアッセイチューブ（tubes）を完成させるために１０時間を要する。さらに、ＬＳＣによるトリチウムの濃度決定前のサンプルの製造に時間がかかり、複雑な混合過程を含むものである。その上、トリチューム化された誘導体に基づくトレイサーに関するさらなる問題は、正確な結果を補償するために、アッセイ化方法において欠かせない工程である回復決定法（Recovery Determination）を必要とすることである。典型的には、これによりＬＳＣ段階での３．３時間を含めて、４５分の製造時間が遅延する結果となる。ニコルスアッセイは回復決定法のために以下の方法を使用する。ニコルスアッセイにおいて、各サンプルは少量のトリチウムを含む１，２５−ジヒドロキシビタミンＤとＣ₁₈／溶媒方法により抽出されたサンプルによりスパイク（spiked w ith）される。各サンプル抽出物の一部分は、抽出されトリチウムを含む１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの測定のためにカウントされ、そして典型的に５０ −７０％である抽出物の回復が計算される。残りの抽出物サンプルは子牛の胸腺 (calf thymus)レセプターを用いてトリチウムラジオレセプターアッセイを行い、活性炭による分離、続いて液体シンチレーションカウントを行う。患者のサンプル価値は、抽出回復(cxtraction recovery)のために各アッセイ結果を修正することにより得られる。上記より、トリチウムトレーサーに基づくキットは、サンプルの製造とカウントを含む長々しい時間のために比較的低い成績のサンプル成果しか達成し得ないおそれがある。典型的に３日目の終わりまでに得られる結果と共に、一人によりたった１２から２４個のサンプルが分析できるだけである。さらに、トリチュームを含む誘導体に基づく方法は、マニュアルによる結果の計算を必要とし、それは回復決定法のための修正が必要である。米国特許出願ＵＳ５，２３２，８３６において提案されているトレーサーは、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの新規な１１−置換ヨウ素１２５誘導体に基づく。この特許文書は、これら１１−置換ヨウ素トレイサー及び、これもまた１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの１１−置換誘導体より誘導された抗体と共に使用することも説明している。この特許文書は、トリチュームを含むトレイサーを使用するアッセイに比べ、ヨウ素化されたトレイサーを使用するアッセイが優れた結果をもたらすことを見いだしたという、アッセイを比較した試みが記載されている。この優位性は、特に１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの非常に低い濃度の測定時に適用した際、顕著である。さらには、比較結果によるとヨウ素化されたトレーサーを用いた際、さらに背景の変化が小さいこと（lowe r background variation）が分かった。ヨウ素化されたトレーサーはビタミンＤアッセイに用いられた際、トリチュームを含むトレーサーより性能において優れた特性を持つという点において評価される。しかしながら、ＵＳ５，２３２，８３６記載の１１−置換ヨウ素１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ誘導体の欠点は、１１−置換誘導体と合性の良い（compat ible）抗体が、内因性形態(endogenous form)のビタミンＤ、ビタミンＤ３及びセミ合成体(semi-synthetic form)であるビタミンＤ２の違いを識別するということである。ビタミンＤ２は製薬に使用され、またビタミンＤ２は活性のある新陳代謝物として１，２５ジヒドロキシビタミンＤ２を生成する内因的形態(endog enous form)と同様のメカニズムにより新陳代謝され、１，２５ジヒドロキシビタミンＤのアッセイは、Ｄ２形態により初めて有効に測定できるようになった。１１−位置ビタミンＤ３類似物に対して生じさせた抗体はＤ２形態と相互に反応しないので、患者のビタミンＤの状態の真の状況を提供できない。ＧＢ１，５９２，１７０は、２５−位置により免疫原(immunogen)蛋白質に結合した類似物を開示するものであり、また１，２５ジヒドロキシビタミンＤ２とＤ３と似た相互に反応するかどうかを調査する。モウワーら（Ｍａｗｅｒｅｔａｌ）（Ｃｌｉｎｉｃａ．ＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ，１９９０，１９０２，１９９−２１０）の「エルカリシトリオール(ercalcitriol)とカルシトリオール (calcitriol)と効力の等しいモノクロナル抗体を使用した感度の強いラジオイムノアッセイ」は、Ｄ２とＤ３との相互の反応が可能な抗体が存在することを開示する。それらの合成が、研究の便に供し得ず、またはそれについての製造に適用されないということは、２５−位置による免疫原蛋白質に連結した類似物のさらなる欠点である。例えばＵＳ５，２３２，８３６に記載の１１−位置の誘導体は、長く入り組んだ化学合成を経てのみ生成されうる。この文書に記載の化学合成は、２分したビタミンＤ誘導体の製造と、その２分したものをビタミンＤの７，８位置において二重結合を生じさせるために、ウイット反応(Witting reaction)を使ってカップリングさせることを含む。したがって、この長々しくまた複雑な合成はラジオ− イムノアッセイ法における１１−置換ヨウ素化誘導体の使用の普及を妨げる。従来技術における問題従来技術において、トリチウムを含むトレーサーが、検出困難であり、正確な測定には(６０アッセイ管で１０時間までの）長時間の検出を要し、比較的早く崩壊するような低エネルギーβ−放射線を放射するという問題がある。さらには、従来技術において労力と時間を費やすＬＳＣ方法が、結合したトリチウムを含むトレーサーの濃度を測定するために必要であるという問題がある。また、従来技術においてトリチウムを含む誘導体に基づいたキッドには、必須工程として回復決定法(Recovery Determination)が必要であり、その結果、製造時間に４５分、カウント（測定）時間に３．３時間の遅れがでるという問題もある。また、従来技術においてトリチウムを含む誘導体に基づいたキッドには手動による結果の計算が必要であり、その計算は回復決定法で正確にする必要性があるという問題もある。従来技術においてトリチウムを含む誘導体に基づいたキッドは実際的に、得られるもの(throughputs)が少量に限られ、その入手に長期間を要す結果になるという問題がある。典型的には、結果は３日目の最後に得られることとなるであろう。また従来技術において、存在しているか、ないしは容易に製造されるような抗体に結合でき、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤのＤ２・Ｄ３両方の形態(for m)を検出できるようなビタミンＤ類似物のヨウ素誘導体はないという問題がある。我々は驚くべきことに、上記問題点は本発明に従った見事な方法で解決できることを発見した。最も広い観点においては、本発明に従い、少なくとも存在しているかないしは容易に製造されるような抗体と結合するであろうＣ²⁰の位置が変性された１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ類似物を提供する。抗体内では、前記類似物は定量検出用に用いる置換基を含んでいる。好ましくは放射性の(radioactive)置換基、より好ましくはヨウ素１２５、ないしは、従来技術で記載したようにルミニッセント(luminescent)又はフルオッレッセント(fluorescent)の強度の決定用に採用された化学ルミニッセント(luminescent)又はフルオッレッセント(fluorescen t)置換基を含んでいる。本発明のさらなる観点においては、そのような類似物と新規な中間化合物の製造方法である。本発明のさらなる観点においては、前記に定義された類似物を含むトレーサーからなるビタミンＤのイムノアッセイ方法(methodology)におけるトレーサーの使用がある。本発明のさらなる観点においては、希釈剤、キャリヤー、溶剤、添加剤(adjuv ant)、安定保護剤(stabiliser preservative)、分散剤などと任意に混合するトレーサーとして前記に定義された一般式Ｉの化合物からなる組成物である。本発明のさらなる観点においては、前記に定義された類似物の使用に用いられる１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの濃度を決定する方法である。好ましくは、そのような方法には、セラムやプラズマサンプルなどのサンプルの免疫抽出(i mmunoextraction)や前記に定義されたトレーサーとサンプルのアッセイ混合物の製造、及び定量検出によるアッセイが含まれている。また、その方法には好ましくは放射(radiation)、ルミニツセント(luminescent)又はフルオッレッセント(f luorescent)の検出も用いる。本発明のさらなる観点においては、前記に定義された類似物を含むラジオイムノアッセイ(radioimmunoassay)キットがある。キットを用いて得られたラジオアッセイ(radioassay)結果には回復決定法を必要としないという利点があるため、それゆえ、より迅速なラジオイムノアッセイ手順、例えばガンマカウンターといった放射線検出から直接得られて計算にほとんど時間がかからないということが可能となる。本発明のラジオイムノアッセイキットには１００以上のサンプルで得られるもの(throughputs)が多くあり、結果は、標準的なトリチウムを含むラジオイムノアッセイキッドで典型的に達せられるより短い時間内で入手することができる。好ましくは前記に定義されたような類似物は、一般式Ｉの化合物を含む。Ａ²⁰ＣＲＲ¹ ここでＡはＲはラジオアクティブな置換基であり、またＲ¹は水素とアルキルから選択される。好ましくはＲは−ＣＲ²Ｒ³ＮＲ⁴Ｒ⁵のグループを表し、ここで、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は水素、アルキルまたはＲ⁴と不飽和結合しているＲ²Ｒ³の１つから選択され、Ｒ⁵は随意に部分的に不飽和、そして随意に１つ又はそれ以上の環状、芳香族、ハロ、酸素、窒素及び／又は硫黄ユニットまたは部分、およびそれらの混合物であるＣ_1-20のヨウ素１２５を含むグループであり、そしてＲ¹は水素またはＣＨ₃である。さらに好ましくはＲ⁵はＹＸ（ＣＨ₂）_nＱのグループを表し、ここで、各ＹとＸは次の単結合から独立に選択され、 −Ｏ−，−Ｃ（＝Ｏ）−，−ＮＨ−，−Ｏ（ＣＨ₂）_mＣ（＝Ｏ）Ｎ−， −Ｏ（ＣＨ₂）_mＣ（＝Ｏ）−および−Ｏ（ＣＨ₂）_mＮ−；ｎは独立に０から１５の間で、例えば１から６の間で選択される整数であり、Ｑは、随意に置換されるベンゼン、ナフタレン、ヒスタミンなどのイミダゾール、ピロール、ピラゾール、ビリジン、ビリミジン、（イソ）キノリン、ピュリン、オキサゾール、チアゾール、チオフェンなどから選択され、ここで随意に置換基は、ヒドロキシ、ハロ、メチルなどのアルキル、アミノ、シアノなどを含む。さらに好ましくはＲは−ＣＨ＝Ｎ−または−ＣＨ₂ＮＨ−、Ｙは単結合と−ＯＣＨ₂Ｃ（＝Ｏ）−、Ｘは−Ｃ（＝Ｏ）−と−ＮＨ−から選択され、ｎは１または２、そしてＱはヒドロキシヨードベンジルまたはヨードイミダゾールである。本発明の類似物は、短時間で高収率の製造過程により入手されるというさらなる利点がある。好ましくは前記に定義された一般式の化合物の製造方法があり、それには構造式II ＡＣ²⁰ＨＲ¹ＣＲ²Ｒ³ＮＲ⁴ＹＬの化合物と構造式III Ｌ¹Ｘ（ＣＨ₂）_nＱここでＬとＬ¹は遊離するグループであるの化合物の反応が含まれている。本発明における特別な利点は、構造式IIとIIIの化合物の反応が、例えば−ＹＬとＬ¹Ｘ−のうちの一つはアミノ含有グループであり、一つはカルボニル含有グループである、Ｈ⁺とＯＨ^-を除く求核的置換反応であるということである。この反応は従来知られた技術に従いまた条件下で実行される。構造式IIやIIIはこの技術分野で知られるいかなる手段により入手される。好ましくは、構造式IVの化合物ＡＣ²⁰ＨＲ¹ＣＨＯと、この技術分野で知られる適切な条件下における、構造式Ｖの化合物ＨＮＲ⁴Ｙとの反応を含む構造式IIの化合物の製造方法が用いられる。構造式IIIの化合物は既知の反応技術を使用して入手される。好ましくは、構造式VIの化合物、１α−ヒドロキシシクロビタミンＤ₂、をオゾン化された酸素とトリフェノールフォスフィンおよび塩基性溶液を順次酸化することを含んだ、構造式IVの化合物の製造方法がある。本発明のさらなる観点においては、前記に定義された構造式II、III、IV、ＶおよびVIの中間化合物がある。本発明のさらなる観点においては、前記一般式Ｉの化合物を製造する、前記に定義された中間化合物の使用がある。本発明のいかなる化合物に対するここでの参照は、以下に示したような構造を持つ化合物、前駆体(precursor)、新陳代謝物(metabolite)、もしくは他の誘導体、もしくはそれらと機能的に同等のものである。前記に定義された本発明の組成物は、前記に定義されたイムノアッセイ方法に使用するために用いられた適切な形式で、そして好ましくは前記に定義されたイムノアッセイキットにおいて含有するために用いられた形式内にある。前記に定義されたラジオイムノアッセイキットは全ての適切な付加的成分を含み、好ましくはイムノアッセイに使用されるサンプルの中で分析される全ての物質を実質上分離するために用いられた禁止剤(inhibitor)を含む。好ましくはアッセイ化(assayed)されるサンプルはプラズマかまたはセラムであり、また禁止剤は例えば、米国特許出願ＵＳ３，９１１，０９６やＵＳ３，９２８，５５３で開示されているように、チロキシンアッセイの単離で知られる成分を含む。イムノ抽出(immunoextraction)は既知の方法、固定化(immobilisation)、すなわち、液体相抽出やそれに続いて行われる適切な手段による沈殿により行われる。禁止剤(inhibitor)、特に好ましくは定義された禁止剤を使用すると、改良された確実さと正確性でもって本発明のイムノアッセイ技術を提供するという、特別な利点がある。キットは、各々のテストサンプルの証明と正確性の目的(verification and ac curacy purposes)のために複写(duplication)することを可能にする適切な複写成分(duplicating components)を含む。本発明の時間効率の良い方法を用いると便利な方法で複写(duplication)が可能になるという特別な利点がある。本発明は、以下の実施例と対応するスキームを参照して説明するが、これに限定されるものではない。実施例１−中間化合物IIとIVの製造（スキーム１）１α−ヒドロキシシクロビタミンＤ₂−１−アセテート（化合物１）を、パレン他(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1978,75,2080-1)の方法によって、ビタミンＤ₂（エグロカルシフェロール）から製造した。化合物２（中間化合物IV）ジクロロメタンメタノール中の化合物１（５．０g、１１ｍモル）を、−６０ ℃未満に冷却し、出発物質がＴＬＣにより示されたように反応してなくなるまで、オゾン化された酸素で処理をした。反応容器は窒素ガスで置換し、トリフェニルフォスフィンが（４．３ｇ）加えられ、それらの混合物は室温まで暖められた。溶液は飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し、溶剤は蒸発した。残留物は１，４−ジオキサン（２０ｍＬ）で再度溶解し、トルエンスルフォン酸の水溶液（０．２ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ）が加えられ、それらの混合物は１５分間５０℃に熱せられた。反応は飽和ＮａＨＣＯ₃溶液で抑制され、ジエチルエーテルで３回に分けて抽出された。有機相を飽和ＮａＨＣＯ₃溶液、飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、そして溶剤は真空下で取り除かれた。その残留物は、ジクロロメタン中の２％メタノールで平衡しているシリカカラム（５０ｇ）に入れられた。溶剤組成物は５％のメタノールに変えて、最初の５０ｍＬは集められ、溶剤を留去させて化合物２を得た。化合物３（中間化合物II）化合物２（１．８ｇ）を室温で２４時間、５％のトリエチルアミンを含むエタノール（５０ｍＬ）中のメチルカルボキシメトキシアミン（１．０ｇ）で処理をした。溶剤は留去し、残留物は化合物３を得るため、シリカ（エチルアセテート／エーテル＝７：３）でクロマトグラフィされた。化合物３には以下のようなものが挙げられる。ＮＭＲ、δｐｐｍ、０．５２（３Ｈ,ｓ,１８−Ｈ３）、１．１７（３Ｈ,ｄ,Ｊ＝７Ｈｚ、２１−Ｈ３）、２．０３（３Ｈ,ｓ,１−ＯＣＯＣＨ３）、３．８０（３Ｈ,ｓ,−ＣＯ２ＣＨ３）、４．３０（１Ｈ,ｍ,３α−Ｈ）、４．４９（１Ｈ,ｍ,１−βＨ）、４．５８（２Ｈ,ｓ,−ＯＣＨ２ＣＯ２ＣＨ３）、５．０２（１Ｈ,ｍ（ｓｈａｒｐ）,１９（Ｚ）−Ｈ、５．３６（１Ｈ,ｍ（ｓｈａｒｐ）,１９（Ｅ）−Ｈ、６．０２（１Ｈ,ｄ,Ｊ＝１１Ｈｚ、７−Ｈ）、６．３８（１Ｈ,ｄ,Ｊ＝１１Ｈｚ、６−Ｈ）、７．４０（１Ｈ,ｄ,Ｊ＝７Ｈｚ、２２−Ｈ）。化合物４（中間化合物II）化合物３（０．６５ｇ、１．４ｍモル）を窒素大気の下でメタノール中で分解し、１Ｍの水素ナトリウム（２．０ｍＬ）を加え、それらの混合物は３時間室温で攪拌した。溶剤は真空下で蒸発し、その残留物は０．５Ｍのリン酸ナトリウムバッファー液でｐＨ６になるように処理されて、ジエチルエーテルで３回に分けて抽出した。有機相は飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、無水のＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。溶剤は蒸発して、その残留物は化合物４（０．３８ｇ、０．９ｍモル）を得るため、シリカ（エチルアセテート／メタノール＝１０：１）でクロマトグラフィされた。化合物４には以下のようなものが挙げられる。ＮＭＲ、δｐｐｍ、０．５１（３Ｈ,ｓ,１８−Ｈ３）、１．１８（３Ｈ,ｄ,Ｊ＝７Ｈｚ、２１−Ｈ３）、４．２６（１Ｈ,ｍ,３α−Ｈ）、４．４８（１Ｈ,ｍ,１β−Ｈ）、４．６３（２Ｈ,ｓ,−ＯＣＨ２ＣＯ２Ｈ、５．０３（１Ｈ,ｍ（ｓｈａｒｐ）,１９（Ｚ）− Ｈ）、５．３８（１Ｈ,ｍ（ｓｈａｒｐ），１９（Ｅ）−Ｈ）、６．０５（１Ｈ, ｄ,Ｊ＝１０Ｈｚ、７−Ｈ）、６．４０（１Ｈ,ｄ,Ｊ＝１０Ｈｚ、６−Ｈ）、７．４３（１Ｈ,ｄ,Ｊ＝７Ｈｚ、２２−Ｈ）。Ｍ／ｚ４１６（Ｍ−Ｈ＋、グリセロール中ＦＡＢ）。実施例２−構造式（Ｉ）の化合物の製造（スキーム２）１，４ジオキサン９０μＬ中の９０μｇの化合物４は、１部のトリブチルアミンと２０部の１，４ジオキサンの溶液６．０μＬと、５分間８〜１０℃で反応させた。１部のイソブチルクロロホルメートと４０部の１，４ジオキサンの溶液６．０μＬを反応混合物に加えて、３０分間６〜１２℃でインキュベートさせた。これは化合物４の（イソブチル）ホルメート無水物を主成分として含んだ混合物１であった。ｐＨ７．５の５μＬの０．５Ｍのリン酸ナトリウムバッファー液中のヒスタミンジヒドロクロライド３μｇの溶液を、２．５ｍＣｉヨウ素１２５（参考日(ref erence date)：１００ｍＣｉ／ｍＬでｐＨ７−１１の希釈溶液中のヨウ素ナトリウム）が存在する５．０μＬの水中で、１８〜２４℃で５分間クロラミンＴ５０ μｇと反応させた。５μＬの水中でメタビサルファイトナトリウム２５０μｇの溶液を加え、その後０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液２．５μＬを加えた。これはヒスタミンおよびヨウ素１２５−ヨードヒスタミンを含む混合物２であった。混合物１（６８μＬ）を混合物２全量に加えて、０〜５℃で９０分間反応させた。飽和重炭酸ソーダ溶液１ｍＬを加えて、生成物はエチルアセテート１ｍＬで３回に分けて抽出された。有機相は飽和重炭酸ソーダ１．５ｍＬで２回洗浄した。ヘキサン（０．５ｍＬ）を加え、溶液は水１．５ｍＬで洗浄した。有機相をガラス試験管に加え、溶剤は窒素ガスの穏やかな流れの下で３７℃で蒸発した。その残留物をメタノール中で再度溶解し、水で５０％のメタノールに希釈して、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ−ＯＤＳ（Ｃ１８、４．６×１５０ｍｍ、３μ微粒子サイズ）高圧液体クロマトグラフィカラムに入れた。生成物は０．０４％のトリフルオル酢酸を含む水とメタノールの比率が５０：５０となっているものから、１００％のメタノールへと濃度こう配を付けて溶出された。ラジオアクティブピークを含むものに対応する溶出分（フラクション）は化合物５をプールしたら３７０μＣｉが得られた。化合物５はＣｈｉａｎｇ（Clinical Chemistry,1987,33,1245）の方法により、１．８×１０⁶Ｃｉ／モルという明確な活性を有することが分かった。実施例３−中間化合物IIの製造（スキーム３）化合物６（中間化合物II）化合物２（０．５ｇ）を窒素大気の下でメタノール中で再度溶解した。塩化アンモニウム（０．２ｇ）が加えられ、それから５Ｍ水酸化ナトリウム中のシアノボロハイドライドナトリウム溶液０．２ｍＬが加えられた。混合物は２時間室温で攪拌され、それから５Ｍの水酸化ナトリウムを１．０ｍＬ加え、さらに３時間攪拌を続けた。溶剤は真空下で蒸発し、残留物は０．５Ｍのリン酸ナトリウムバッファー液ｐＨ８．０を２０ｍＬで処理し、混合物はジエチルエーテルで３回に分けて抽出した。有機相は飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、無水のＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。溶剤は蒸発して、その残留物はシリカ（メタノール／クロロホルム／トリエチルアミン＝５０：１０：１）でクロマトグラフィされて、化合物６（０．１２ｇ）が得られた。スキーム４で構造式（Ｉ）の化合物７の製造について説明する。実施例４−セラム及びプラズマサンプルにおけるビタミンＤの濃度決定方法サンプル製造−セラムおよびプラズマサンプルは、硫酸デキストラン／塩化マグネシウム試薬で処理することにより脱脂肪(delipidated)され、遠心分離により脱脂肪(delipidated)したサンプルを得た。脱脂肪(delipidated)して表面上に浮かんだものは絶対にクリアでなければならない。全体的にlipaemicなサンプル、ないしは４回以上の解凍サイクルになりやすいサンプルはクリアな表面浮上成分がないかもしれない。クリアな脱脂肪(delipidated)をして表面浮上成分が得られないサンプルは、免疫抽出(immunoextraction)には適さない。そういった困難なサンプルはしばしば、より高いｇ−フォースで、又はより長い時間遠心分離することにより浄化され得る。８−アニリノ−１−ナフタレンスルフォン酸を含んだビタミンＤと結合しているたん白質結合禁止剤(vitamin D binding protein inhibitor)は、サンプル中に存在する全ての分析物(analyte)すなわちビタミンＤに有効である。免疫抽出(immunoextraction)−免疫抽出装置は、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤに対して特異性の高いモノクロナール抗体が付着した固体相懸濁液を含んだカプセルからなっている。脱脂肪(delipidated)したサンプルをカプセルに加え、３時間くるくる回転させ、それからカラムを洗浄した。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、溶出試薬を３回に分けてガラスアッセイ管に直接溶出させた。溶出試薬はそれから窒素ガス下で蒸発した。使用された溶剤が少量であるため、蒸発に要する時間はたった１５〜２０分である。残留物はアッセイバッファー内で再度溶解した。これらの管はアッセイで直接使用された。ヨウ素１２５ラジオイムノアッセイ(radioimmunoassay)−主要抗体をカリブレーター（calibrator）や抽出物を含む管に加えた。管を２〜８℃で一晩インキュベートさせた。次の日に化合物５からなるトレーサーを加え、室温でさらに２時間インキュベートさせてＳａｃＣｅｌ固体相第２抗体を加えた。３０分後、アッセイ混合物を希釈させるために洗浄溶液４ｍＬ加えて、管を遠心分離させた。液体をデカントさせ、管はドレンし、ペレットに残っているヨウ素１２５活性をカウントした。カリブレートカーブ(calibration curve)により、直接、未知物質のセラム１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ価を得た。化合物５はＷｉｌｄｅｒｍｕｔｈ他(Clinica Chimica Acta 1993,220,61)に記載されているようなＡＳ７などの抗体やＭａｗｅｒ他(Steriods，1985，46，741 )に記載されているような５Ｆ２などのモノクロナール抗体に結合するものである。各々の場合において、結合は１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３や１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２によって禁止された。この実施例の方法は便利で簡単な方法で行われ、正確性が高く再現可能な結果が出ることが判明した。本発明のさらなる利点は前述からも明らかである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年１月２３日（１９９９．１．２３）【補正内容】請求の範囲１．構造式Ａ²⁰ＣＲＲ¹ ここで、ＡはＲ¹は水素またはアルキルそしてＲはＣＲ²Ｒ³ＮＲ⁴Ｒ⁵のグループを表し、ここで、Ｒ²、Ｒ³とＲ⁴は水素、アルキル又はＲ⁴と不飽和結合しているＲ² とＲ³の１つから選択され、Ｒ⁵はＤ２とＤ３フォームの両方を検出する１，２５−ジヒドロキシビタミンＤのイムノアッセイシステムで定量検出用に用いる置換基を含む、飽和又は部分不飽和のＣ_1-20グループの化合物。２．Ｒ¹は水素とメチルから選択され、そしてＲ⁵は１つ又はそれ以上の環状、芳香族、ハロ、酸素、窒素及び／又は硫黄ユニット（units）又は部分(moieti es)、及びそれらの混合物である請求項１記載の化合物。３．ラジオアクティブな置換基、より好ましくは、ヨウ素１２５を含むか、又はルミニッセント又はフルオッレッセントの強度の決定用に用いられる化学ルミニッセント又はフルオッレッセント置換基を含む請求項１又は２記載の化合物。４．Ｒ⁵はＹＸ（ＣＨ₂）_nＱのグループを表し、各のＹとＸは次の単結合から独立に選択され、 −Ｏ−，−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−，−Ｏ（ＣＨ₂）_mＣ（＝Ｏ）Ｎ−、 −Ｏ（ＣＨ₂）_mＣ（＝Ｏ）−及び−Ｏ（ＣＨ₂）_mＮ−；ｎとｍは独立に０〜１５から選択される整数であり、Ｑはヨウ素１２５を含有するベンゼン、ナプタレン、イミダゾール、ヒスタミン、ピロール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、（イソ）キノリン、ピュリン、オキサゾール、チアゾール及びチオフェンから選ばれるホモ−、ヘテロ−、モノ−、ポリ−芳香族又は脂環式含有グループ含有ヨウ素１２５である請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。５．Ｑはヒドロキシ、ハロ、アルキル、メチル、アミノ及びシアノから選択される置換基を含む芳香族又は脂環式含有グループである請求項４記載の化合物。６．Ｒは−ＣＨ＝Ｎ−又は−ＣＨ₂ＮＨ−、Ｙは単結合と−Ｏ（ＣＨ₂）Ｃ（＝Ｏ）−から選択され、Ｘは−Ｃ（＝Ｏ）−と−ＮＨ−から選択され、ｎは１又は２、そしてＱはヒドロキシヨードベンジル又はヨードイミダゾリールである請求項４又は５記載の化合物。７．構造式II ＡＣ²⁰ＨＲ¹ＣＲ²Ｒ³ＮＲ⁴Ｌと構造式III Ｌ¹Ｒ⁵ ここで、ＬとＬ¹は遊離するグループであるの化合物との反応を含む請求項１〜６のいずれかに記載の一般式Ｉの化合物の製造方法。８．構造式II ＡＣ²⁰ＨＲ¹ＣＲ²Ｒ³ＮＲ⁴ＹＬと構造式III Ｌ¹Ｘ（ＣＨ₂）_nＱここで、ＬとＬ¹は遊離するグループであるの化合物との反応を含む請求項１〜６のいずれかに記載の一般式Ｉの化合物の製造方法。９． II又はＹＬの一つ及びＬ¹Ｘ−はアミノ含有グループであり、Ｒ⁵又はＹＬとＬ¹Ｘの一つはカルボニル含有グループである、Ｈ⁺とＯＨ^-を除く求核的置換反応である請求項７又は８記載の方法。１０．構造式IVの化合物ＡＣ²⁰ＨＲ¹ＣＨＯと化合物ＶＨＮＲ⁴ＹＨをこの技術分野で良く知られた適当な条件で反応させる構造式IIの化合物の製造方法。１１．構造式VI、１−ヒドロキサイクロビタミンＤ２をオゾン化された酸素、トリフェノールフォスフィン及び塩基性溶液で順次酸化されることからなる構造式IVの化合物の製造方法。１２．請求項７から１１のいずれかに定義された構造式II、III、IV、Ｖ及びV Iの新規中間化合物。１３．請求項１から６のいずれかに記載された一般式Ｉの化合物を製造する請求項７から１１のいずれかの中間化合物の使用。１４．請求項１から６のいずれかに定義された化合物を含むトレイサーからなるビタミンＤのイムノアッセイ方法(methodology)。１５．希釈剤、キャリヤ、溶剤、添加剤（adjuvant）と安定剤保護剤(preserv ative)、分散剤（dispersant）と混合する請求項１から６のいずれかに記載された一般式Ｉの化合物からなる組成物。１６．請求項１がトレイサーであるイムノアッセイキットを含むイムノアッセイ方法（method）の使用に用いられる請求項１５記載の組成物。１７．付加的に禁止剤が含む請求項１５又は１６記載の組成物。１８．アッセイされるサンプルはプラズマであり、又はセラムであり、禁止剤はチロキシンアッセイの単離に効果的な化合物からなる請求項１５から１７記載の組成物。１９．請求項１から６記載のいずれかの化合物またはそれらの組成物を使用する１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの濃度の決定のためのプラズマまたはセラムのイムノアッセイに使用する請求項１８に定義された禁止剤。２０．請求項１から６または１５から１９に定義された化合物、組成物または禁止剤の使用による１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの濃度の決定方法。２１．セラムとプラズマサンプルなどのサンプルのイムノ抽出(immunoextract ion)、前述のように定義されたトレイサーのアッセイと請求項１で定義された化合物の混合物の製法、及び定量検出によるそれらのアッセイを含む請求項２０記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者バーンズ，アレキサンダーカークリー英国ＮＥ35 ９ＰＤタインアンドウェアボルドンボルドンビジネスパーク，10 ディドゥコットウェイＩＤＳリミティッド

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも存在するかまたは既に生成された抗体に結合させるため用いられるＣ²⁰位置において変性(modified)された１，２５ジヒドロキシビタミンＤの類似物を含む、前記類似物は定量検出用に用いられた置換基を含む化合物。２．ラジオアクティブな置換基を、より好ましくはヨウ素１２５、またはルミニッセントまたはフルオッレッセント強度決定のために用いられた化学ルミニッセントまたはフルオッレッセント置換基を含む、請求項１記載の化合物。３．一般式１の化合物を含み、Ａ²⁰ＣＲＲ¹ ここでＡはここで、Ｒはラジオアクティブな置換基であり、またＲ¹は水素とアルキルから選択される、請求項１と２のいずれかに記載の化合物。４．Ｒは−ＣＲ²Ｒ³ＮＲ⁴Ｒ⁵のグループを表し、ここで、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は水素、アルキルまたはＲ⁴と不飽和結合しているＲ²とＲ³の１つから選択され、Ｒ⁵は随意に部分的に不飽和、そして随意に１つ又はそれ以上の環状、芳香族、ハロ、酸素、窒素及び／又は硫黄ユニットまたは部分、およびそれらの混合物であるＣ_1-20のヨウ素１２５を含むグループであり、そしてＲ¹は水素またはＣＨ₃である、請求項３記載の化合物。５．Ｒ⁵はＹＸ（ＣＨ₂）_nＱのグループを表し、各ＹとＸは次の単結合から独立に選択され、 −Ｏ−，−Ｃ（＝Ｏ）−，−ＮＨ−，−Ｏ（ＣＨ₂）_mＣ（＝Ｏ）Ｎ−， −Ｏ（ＣＨ₂）_mＣ（＝Ｏ）−及び−Ｏ（ＣＨ₂）_mＮ−；ｎは独立に０から１５の間で、例えば１から６の間で選択される整数であり、Ｑは、随意に置換されるベンゼン、ナフタレン、ヒスタミンなどのイミダゾール、ピロール、ピラゾール、ビリジン、ビリミジン、（イソ）キノリン、ピュリン、オキサゾール、チアゾール、チオフェンなどから選択され、ここで随意に置換基は、ヒドロキシ、ハロ、メチルなどのアルキル、アミノ、シアノなどを含む、請求項４記載の化合物。６．Ｒは−ＣＨ＝Ｎ−または−ＣＨ₂ＮＨ−、Ｙは単結合と−ＯＣＨ₂Ｃ（＝Ｏ）−、Ｘは−Ｃ（＝Ｏ）−と−ＮＨ−から選択され、ｎは１または２、そしてＱはヒドロキシヨードベンジルまたはヨードイミダゾールである請求項５記載の化合物。７．構造式II ＡＣ²⁰ＨＲ¹ＣＲ²Ｒ³ＮＲ⁴ＹＬの化合物と構造式III Ｌ¹Ｘ（ＣＨ₂）_nＱここでＬとＬ¹は遊離するグループであるの化合物の反応を含む請求項１から６いずれかに記載の一般式Ｉの化合物の製造方法。８．例えば−ＹＬとＬ¹Ｘ−のうちの一つはアミノ含有グループであり、一つはカルボニル含有グループである、Ｈ⁺とＯＨ^-を除く求核的置換反応である、請求項７記載の製造過程。９．この技術分野で知られる適切な条件下における、構造式IVの化合物ＡＣ²⁰ＨＲ¹ＣＨＯと、構造式Ｖの化合物ＨＮＲ⁴Ｙとの反応を含む構造式IIの化合物の製造方法。１０．構造式VIの化合物、オゾン化された酸素による１α−ヒドロキシシクロビタミンＤ₂、トリフェノールフォスフィンおよび塩基性溶液を順次酸化することを含んだ、構造式IVの化合物の製造方法。１１．請求項７から１０のいずれかに定義された構造式II、III、IV、ＶおよびVIの新規中間化合物。１２．請求項１から６のいずれかに記載された、一般式Ｉの化合物を製造する請求項７から１１のいずれかに記載の中間化合物の使用。１３．トレイサーが請求項１から６のいずれかに定義された、化合物を含むビタミンＤイムノアッセイ法に使用するトイサー。１４．随意に希釈剤、キャアリヤ、溶剤、添加剤(adjuvant)、安定剤保護剤(p reservative)、分散剤(dispersant)などと混合した、請求項１から６のいずれかに定義された一般式Ｉの化合物からなる組成物。１５．構造式Ｉの化合物がトレイサーである、イムノアッセイ法で使用に用いられ、好ましくはイムノアッセイキットを含む、請求項１４記載の組成物。１６．全ての適切な付加的成分を含み、好ましくはイムノアッセイに使用されるサンプルの中で分析される全ての物質を実質上分離するために用いられた禁止剤(inhibitor)を含む、請求項１４から１５記載の組成物。１７．アッセイ化(assayed)されるサンプルはプラズマかまたはセラムであり、また禁止剤(inhibitor)はチロキシンのアッセイの単離に用いられる成分を含む、請求項１４から１６記載の組成物。１８．１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの濃度決定のために、プラズマまたはセラムのイムノアッセイにおいて使用される、請求項１７で定義された禁止剤 (inhibitor)。１９．請求項１から６、または１４から１８のいずれかに定義された、化合物、組成物あるいは禁止剤を使用して１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの濃度を決定する方法。２０．セラムやプラズマのサンプルのようなイムノ抽出(immunoextraction)サンプル、前述のように定義されたトレイサーのアッセイ混合物とサンプルの製造、そして定量検出によるアッセイ、好ましくは放射(radiation)、ルミニッセントまたはフルオッレッセントの検出を使用する方法からなる、請求項１９記載の方法。