KR940009957B1 - 1,25-디하이드록시 비타민 d의 분석방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]
1, 25-디하이드록시 비타민 D의 분석방법
[도면의 간단한 설명]
본 발명의 더 깊은 이해는 도면을 참조로 할 수 있다. 그러나, 하기의 바람직한 양태의 도면 및 설명은 단지 본 발명의 예라는 것을 알아야 한다. 본 발명의 전 범주를 나타내려는 것은 아니다. 오히려, 특허청구범위가 본 발명의 전 범주를 결정하기 위한 것으로 생각되어야 한다.
제 1 도는 도식형태로 본 발명의 개념을 도시한 것이다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 국립 보건 연구소(NIH) 인가번호 제DK 14881호하에 미합중국 정부의 지원으로 이루어졌다. 미합중국 정부는 본 발명의 특정권리를 가진다.
[기술분야]
본 발명은 포유동물의 혈청 또는 혈장중의 1,25-디하이드록시 비타민 D의 수준을 시험하기 위한 분석방법에 관한 것이다. 더욱 특히는, 진단목적에 이용하기 위한 면역 분석 기술의 용도에 관한 것이다.
[종래기술]
비타민 D는 포유동물에서 많은 유용한 기능을 가지는 공지된 비타민이다. 이것은 간에서 25-하이드록실화에 의해 및 신장에서 1-하이드록실화에 의해 활성화된다. 이것은 장의 칼슘 운반, 뼈로부터 칼슘의 이동 및 신장에서 칼슘 및 인에 대한 필요에 의해 조절된다. 저 혈청 칼슘 농도는 부갑상선을 자극하여 부갑상선 홀몬을 분비하고, 이것은 신장에서 "1,25-(OH2)D"의 생성을 개시시킨다. 1,25-(OH2)D는 장에서 칼슘 및 인을 흡수하고 뼈에서 칼슘을 이동시켜 신장에서 칼슘의 재흡수를 자극한다. 이러한 효과는 혈액 칼슘을 정상치까지 증가시킨 다음 부갑상선 분비를 감소시켜 1,285(OH2)D의 추가 생성도 감소된다. 따라서, 혈액중 1,25-디하이드록시 비타민 D의 수준 측정은 어떤 질환(예를 들어, 신장 쇠약, 골다공증)에 대해서 중요한 진단 도구가 된다. 앞으로 유용한 연구 정보를 제공할 수 있다.
혈액중 전구체, 25-하이드록시 비타민 D의 수준 측정은 과거에는 고성능 액체 크로마토그래피 및 경쟁적 단백질 결합 분석에 의해 수행되어 왔다[참조 ; J. Eisman et al, 80 Anal . Biochem. 298-305(1977) ; J. Haddad et al., 33 J. Clin. Endocr. 992-995(1971)]. 본원에 인용된 이러한 문헌 및 다른 모든 문헌들의 내용은 본원에 완전히 설명된 것과 같이 참조문헌으로 인용된다. 선행기술의 경쟁적 결합 분석에 사용된 단백질은 "DEP"라 불리는 비타민 D운반 단백질이다. 이 단백질은 비타민 D 그 자체 또는 1,25-(OH3)2D와 구별되는 것으로 25-OH 비타민 D의 결합에 더 강한 선호도를 가진다.[참조 ; R. Bouillion et al., 13 J. Steroid Biochem. 1029-1034(1980)].
1,25-(OH)2비타민 D에 대한 분석을 위한 선행 기술의 시도도 있었다[참조 ; D. Shigeharu et al., 116 Anal. Biochem. 211-222(1981) ; J. Eisman et al., 176 Arch. Bicohem. Biophys. 235-243(1976)]. 이러한 방법들은 경쟁적 결합 분석 기술 또는 비타민 D 대사물질(예를 들어, 디하이드록시클레칼리시페롤)에 결합하는 항체의 개발에 좌우된다. [참조 ; H. Perry et al., 112 Biochem. Biophys. Res. Commun. 431-436(1983) ; R. Bouillion et al., 41 Ann. Endocrin. 435-36(1980) ; R. Bouillion, 26 Clin. Chem. 562-567(1980) ; R. Rouillon, 66 Eur. J. Biochem. 285-291(1976)].
이러한 분석에 있어서, 포유동물의 혈청 또는 혈장을 비타민 D 및 이의 대사물질을 추출하는 유기용매로 처리한다. 추출물을 컬럼상에서 예비정제한다. 반-정제된 1,25-(OH)2D를 추가로 고성능 액체 크로마토그래피하여 정제하고, 정제된 1,25-(OH)2D를 수득한다. 이러한 단계동안에 일반적으로 1,25-(OH)2D가 손실된다. 이러한 손실을 보정하기 위하여, 원래의 혈장 또는 혈청 추출물을 방사능 표지된 1,25-(OH)2D의 측정량으로 가한다. 최종 분리후 및 결합 분석에 의한 실제 측정 전에 분리된 물질에 남아있는 방사능을 측정하여 회수율을 계산한다. 이 회수율을 최종 계산에 사용하여 정제 동안 1,25-(OH)2D의 손실에 대해 보정한다.
혈청으로부터의 분리된 1,25-(OH)2D를 방사능표지된 1,25-(OH)2D 및 특이적으로 1,25-(OH)2D에 결합하는 단백질인 1,25-(OH)2D 수용체 또는 비타민 D 대사 물질에 대해 생긴 항체의 혼합물에 가한다. 혈청중의 비표지된 1,25-(OH)2D는 방사능표지된 1,25-(OH)2D와 경쟁하게 된다. 표지된 1,25-(OH)2D의 결합이 비표지된 1,25-(OH)2D에 의해 감소되는 정도는 샘플중 존재하는 1,25-(OH)2D의 양을 측정하기 위한 표준 곡선을 만드는데 사용한다.
결합된, 표지된, 1,25-(OH)2D의 수지는 덱스트란-피복된 목탄상에 유리 또는 결합되지 않은 표지된 1,25-(OH)2D를 흡착시킴으로써 측정한다[참조 ; 예를 들어, J. Haddad et al., 33 J. Clin. Endocr. 992-995(1971)]. 평가되는 바와 같이, 이러한 선행 기술 분석법은 완료하기 까지 몇일을 필요로하고 착오의 가능성이 많다. 이것은 또한 부적당하게는 비용이 비싸다. 따라서, 1,25-(OH)2D에 대한 간단하고 신속하고 비교적 값이 싸고 정확한 분석의 필요성이 있다.
[본 발명의 개요]
본 발명의 한가지 양상은 비타민 D 운반 단백질을 함유하는 샘플중 1,25-디하이드록시 비타민 D의 존재에 대한 경쟁적 결합 분석을 제공한다. "1,25-디하이드록시 비타민 D"를 본원에 일반적으로 사용하는 것은 이해되어야 한다. 따라서, X=2, 3, 4, 5 및/또는 6인 1,25-디하이드록시 비타민 Dx를 포함하고자 한다. 이 분석에 따라, 샘플에 1,25-디하이드록시 비타민 D에 결합할 수 있는 수용체 단백질, 표지된 1,25-디하이드록시 비타민 D 및 수용체 단백질에 결합할 수 있는 항체를 가한다. 그 다음 표지된 1,25-디하이드록시 비타민 D에 결합되는 수용체 단백질에 대한 항체의 결합 상태도를 측정한다. 바람직하게는, 표지된 1,25-디하이드록시 비타민 D를 방사능표지하고, 측정 단계전에 상기 항체에 결합된 수용체를 면역 침전시킨다. 피그(pig) 수용체는, 이에 대한 항체가 밀접한 살마의 혈액 성분과 결합하지 않는다고 밝혀졌기 때문에 바람직하다. 이 분석은 분석전 혈장 또는 혈청으로부터의 비타민 D 및 이의 대사물질을 추출할 필요가 없고 또한 분석 전에 1,25-(OH)2D의 크로마토그래피 정제가 필요하지 않다.
이러한 분석을 수행하기 위한 키트(kit)도 표지된 1,25-디하이드록시 비타민D, 1,25-디하이드록시 비타민 D에 결합할 수 있는 수용체 단백질 및 상기 수용체에 결합할 수 있는 항체를 함유함을 특징으로 하여 제공된다.
본 발명의 목적은 1,25-디하이드록시 비타민 D를 분석할 수 있는 상기 종류의 면역분석을 제공하는 것을 포함한다.
또 다른 목적은 간단하고, 비교적 싸고 수행하기 용이한 상기 종류의 분석을 제공하는 것이다.
또 하나의 목적은 상기 종류의 분석을 수행하기 위한 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 장점은 하기 설명으로부터 명확해질 것이다.
[본 발명을 수행하기 위한 가장 좋은 방식 재료]
피그 수용체(제 1 도의 1)은 문헌[참조 ; M. Dame et al., 25 Biochemistry 4523-4534(1986), 선행 기술이 아님]에 따라 제조한다.
1,25-(OH)2D-126,27-3H비타민 D3(160Ci/mmol)(제 1 도의 2)는 문헌 [참조 : J. Napoli et al., 19 Biochemistry 2515-2521(1980)]에 이미 설명되어 있는 바와 같이 제조한다. 이것은 또한 뉴 잉글랜드 뉴클레오/듀퐁(New England Nuclear/Dupont)사로부터 구입할 수 있다.
비방사능의 1,25-(OH)2D3(제 1 도의 3)는 호프만-라 로슈 캄파니(Hoffman-La Roche Company, Nutley, NJ)로 부터 얻는다.
피그 수용체(1)에 대한 항체(A) XVI E6E6GIO는 문헌[참조 ; M. Dame et al., 25 Biochemistry 4523-4534(1986), (선행 기술이 아님)]에 설명된 것과 같이 제조한다. 이 항체를 제조할 수 있는 하이브리도마는 기탁기관[American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, U.S.A.]에 1987년 8월 11자 ATCC #HB9496로 기탁되어 있고, 이 기탁물은 1988년 7월 22일자 신청에 의해 부다페스트조약 기탁물로 승격되어 이 특허의 허여에 따라 이용가능할 것이고 그렇지 않으면 지명국의 적용법하에 제공된다. 기탁물의 입수용이성은 면허로서 생각되어지는 것은 아니다.
항체(4)는 문헌 [참보 : D. Hullet. 박사논문, "Bio-tinylation of Antibodies", D. Wisconsion-Madison. pp.(1984)] 에서와 유사한 기술을 사용하여 n-하이드록시-숙신이미도 바이오틴(NHSB, nMAB)으로 바이오틸닐화한다. 사용된 항체의 농도는 포화 곡선에 의해 측정된 것과 같이 수용체를 침전시키는데 필요한 양이다.
아비딘-세과로즈는 본 발명자의 실험실에서 제조한다[참조 ; J. Kohn et al., 107 Biochem. Biophys, Res. Commun, 878-884(1982)]. 사용된 용적은 포화 곡선에 의해 측정된 것과 같이 모든 면역 복합체를 침전시키는데 필요한 것보다 그 이상인 25%이다.
바람직한 완충액은 25℃에서 50mM트리스(히이드록시 메틸)아미노메탄 하이드로클로라이드(트리스-HCl), 1.5mM 에틸렌디아인테트라아세트산(EDTA), 5mM디티오트레이톨 및 300mM KCl(pH 7.4)이다.
PBS-트리톤은 1.5mM KH2PO4, 7.1mM Na2HPO4, 1.37mM NaCl, 2.7mM KCl, 0.5%(V/V) 트리톤 X-100(pH 8.0), 0.02% NaN3이다.
[실시예]
1,25-(OH)2D(즉, 피그 장의 핵 추출물 수용체)에 대한 특이적 결합 단백질의 샘플에 160ci/mmol의 매우 높은 특이적 활성을 가진 표지된 1,25-(OH)2D를 가한다. 적게는 50㎕ 및 많게는 200㎕의 시험 사람의 혈장 또는 혈청(6)을 수용체에 가한다. 이에 피그 수용체(1)에 직접적인 항체(4)를 가한다. 항체는 이미 바이오티닐화된것(5)이다. 실온에서 1시간동안 계속 배양한다.
좋은 결과는 방사능표지된 비타민 D(2)를 90% 또는 그 이상 포화도의 피그수용체에 가하고 피그 수용체에 대한 10배 또는 그 이상 과량의 항체를 사용하여 얻는다. 시판용으로 구입하거나 상술한 바와 같이 제조할 수 있는 아비딘-세파로즈를 가하고, 짧은 시간동안 보텍싱(vortexing)하고 에펜도르프 튜브 또는 웰에서 1시간동안 배양한다. 그 다음 원심분리하여 침전물을 떨어트린다. 상등액은 버리고 면역 침전물을 PBC-트리톤으로 추가로 3회 세척한다.
모든 튜브 및 침전물을 신틸레이션 용액을 함유하는 신틸레리션 바이알에 가하고 샘플중 방사능을 측정한다. 표준 곡선을 만들기 위하여, 특이적 결합 단백질을 비표지된 1,25-(OH)2D의 양을 증가시키면서 바이오티닐화된 항체와 함께 실온에서 1시간동안 방사능표지된, 1,25-(OH)2D3와 배양한다. 아비딘-세파로즈는 비공지된 샘플과 함께로서 가하고 원심시켜 면역침전물을 상기와 같이 세척한다. 이것들을 또한 신틸릴레이션 용액이 있는 신틸레이션 바이알에 넣고 측정한다. 혈액중 비표지된 1,25-(OH)2D에 의한 결합 단백질로부터 방사능 표지의 치환량을 게산한다.
한가지 특정 양태에 있어서, 1.2nM 1,25-(OH)2D[26,27-3H]D3, 1,25-(OH)2D3결합 활성 50fmoles을 가지는 피그 장의 핵 추출물, 시험 혈청 50 내지 200㎕, 모노클로날 항체 5㎕ 및 완충액(트리스 50mM, pH 7.4EDTA 1.5mM, 디티오트레이톨 5mM 및 염화칼륨 300mM을 함유)을 최종 용적 250㎕까지 함유하는 에펜도르프 튜브(1.5㎖, Brinkman Instruments)를 실온에서 1시간동안 배양한다. 표준 곡선은 상술한 것과 같지만 사람의 시험 혈청 또는 혈장을 비표지된 1,25-(OH)2D3의 증가량으로 대체시킨 일련의 에펜도르프 튜브로 수행한 것이다. 한가지 가능한 범위는 10μM 내지 0.001μM이다. 50㎕의 세분취량을 상기 에펜도르프 튜브 각각으로부터 취하여 50㎕ 아비딘-세파로즈(슬러리)와 함께 빙상에서 배양하고 20분 간격으로 1시간동안 임뮬론(Immulon) II이동웰(Dynatech)에서 보텍싱한다. 이러한 이동웰을 2000rpm에서 8분동안 원심분리한다.
상등액을 제거하고 면역침전물을 PBS-트리톤으로 3회 세척한다. 웰을 분리시켜 각각을 3a70b 신틸레이션 용액 4ml가 있는 측정 바이알(Packard Instruments. Downers Grove, IL)에 넣고 트리튬에 대한 약 40% 효율을 가진 PRIAS모델 400 CL/D 신틸레이션 계수기(Prckard Instruments)를 사용하여 방사능을 측정한다. 표준 곡선은 표준 곡선 튜브에 존재하는 방사능으로부터 만들고 이 표준 곡선을 사용하여 원 혈액 샘플에 존재하는 1,25-(OH)2D의 양을 직접 측정한다.
이러한 측정의 중요한 일면은 혈청 또는 혈장 샘플(6)중 비타민 D 운반 단백질 DBP(7)의 존재이다. 이 단백질은 분석을 방해하는 혈액중 25-OH-D(8) 및 다른 비타민D의 다른 대사물질에 결합될 필요가 있다. 피그 수용체 단백질의 1,25-(OH)2D에 대한 높고 특이적인 친화성 때문에, 이 대사물질은, 다른 대사물질이 운반 단백질에 주로 결합되어 있는 반면, 수용체 단백질에 의해 운반 단백질로부터 제거된다. 이것으로 놀랍게도 추출 및 크로마토그래피 정제의 필요가 없어진다.
[다른 변형법]
표지화는 방사능법 이외에 다른 기술(예를 들어, 색지시제가 경쟁하는 비타민 D 화합물에 부착될 수 있다)을 사용하여 수행할 수 있다. 또한, 피그 수용체는 1,25-디하이드록시 비타민 D를 인식하고 비타민 D운반 단백질과 경쟁할 수 있는 유일한 수용체는 아니다. 또한, 바이오틴/세파로즈 시스템이외의 , 비결합된 1,25-디하이드록시 비타민D로부터 결합된 것을 분리하는 다른 수단도 본 발명의 범주에 속한다. 따라서 특허청구의 범위는 본 발명의 완전한 범위를 평가하도록 나타내어야 한다.
[산업적 적용성]
따라서, 본 분석법은 샘플의 수용후 짧은 시간내에 결과를 이용할 수 있고, 많은 분석이 확실하게 저비용으로 수행될 수 있다.

Claims (12)

  1. 샘플에 1,25-디하이드록시 비타민 D와 결합할 수 있는 수용체 단백질, 표지된 1,25-디히드록시 비타민 D, 및 수용체 단백질과 결합할 수 있는 항체를 가하고, 표지된 1,25-디하이드록시 비타민 D에 결합된 수용체 단백질에 대한 항체의 상대적 결합 정도를 측정하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 비타민 D 운반 단백질을 함유하는 샘플중의 1,25-디하이드록시 비타민 D의 존재를 측정하는 경쟁적 결합분석 방법.
  2. 제 1 항에있어서, 표지된 1,25-디하이드록시 비타민 D가 방사능표지된 1,25-디하이드록시 비타민 D인 분석방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 측정 단계전에 상기 항체에 결합된 수용체 단백질이 면역침전되는 분석방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 샘플이 사람의 혈액, 사람의 혈장 또는 사람의 혈청인 분석방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 수용체 단백질이 피그(pig) 수용체인 분석방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 항체가 피그 수용체 단백질에 대한 항체인 분석방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 항체가 A.T.C.C. HB9496의 하이브리도마에 의해 생성된 항체의 특징을 갖는 분석방법.
  8. 표지된 1,25-디하이드록시 비타민D, 1,25-디하이드록시 비타민 D와 결합할 수 있는 수용체 단백질 및 수용체 단백질과 결합할 수 있는 함체를 포함함을 특징으로하는 경쟁적 분석 키트(kit).
  9. 제 8 항에있어서, 표지된 1,25-디하이드록시 비타민 D가 방사능 표지된 키트.
  10. 제 9 항에 있어서, 수용체 단백질이 피그 수용체 단백질인 키트.
  11. 제 10 항에 있어서, 추가로 비표지된 1,25-디하이드록시 비타민 D를 함유하고 항체가 바이오티닐화된 키트.
  12. 제 8 항에 있어서, 항체가 A.T.C.C. HB9496의 하이브리도마에 의해 생성된 항체의 특징을 갖는 키트.
KR1019890700617A 1987-08-14 1988-08-08 1,25-디하이드록시 비타민 d의 분석방법 KR940009957B1 (ko)

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US86,413 1987-08-14
US?86,413? 1987-08-14
PCT/US1988/002693 WO1989001631A1 (en) 1987-08-14 1988-08-08 Assay for 1,25-dihydroxy vitamin d

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