JPH02503355A - １，２５‐ジヒドロキシビタミンｄの分析 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １．２５−ジヒドロキシビタミンＤの分析この発明はナショナル・インスチチュ ート・オブ・ヘルス（ＮＩＨ）補助金Ｎｏ、ＤＫ１４８８１の授与による米国政 府の援助により行われた。米国政府はこの発明に所定の権利を有している。

技術分野 この発明は哨乳動物の血液血清又は血漿中の１．２５−ジヒドロキシビタミンＤ の準位（レベル）を試験する分析に関する。より詳しくは診断道具としての免疫 分析技術の使用を含む。

背景技術 ビタミンＤは晴乳動物に対し多くの有用な作用を有するよ（知られたビタミンで ある。ビタミンＤは肝臓中で２５位のヒドロキシル化によって、続いて腎臓中で １位のヒドロキシル化によって活性化される。これは腸のカルシウム輸送、骨か らのカルシウムの移動及び腎臓中でのカルシウムの再吸収が増大するよう刺激す る。ビタミンＤの最終形態、１．２５−ジヒドロキシビタミンＤの生産はカルシ ウム及びリンの必要度によって規制される。血清低カルシウム濃度は副甲状腺に 甲状腺ホルモンを分泌するよう刺激し、次には腎臓中でのｒｌ、２５　（ＯＨ） 、ＤＪの生産開始の引き金を引（。次いう、かつ骨にカルシウムを移動させるよ うにし、腎臓のカルシウム再吸収を刺激する。これらの効果は血液中のカルシウ ムを正常のレベルまで上げ、次いで甲状腺分泌を停止させ、１．２５　（ＯＨ） ＊Ｄのそれ以上の生産を停止させる。従って、血液中の１．２５−ジヒドロキシ ビタミンＤのレベルの測定はある疾病（例えば、腎臓欠陥、骨そしよう症）に関 する重要な診断道具である。それはまた将来有用な研究情報を提供することがで きる。

血液中の前躯体、２５−ヒドロキシビタミンＤのレベルの測定は過去には高速液 体クロマトグラフィー及び競争タンパク質結合分析により行われてきた。ジェー ・アイスマンら、８０　アナリティカル・バイオケミストリー２９８−３０５　 （１９７７）；ジェー・ハッダッドら、３３　ジャーナル・オブ・クリニカル・ エンドクリノロジー９９２−９９５　（１９７１）、これら文献及びここに掲載 するその地金ての文献は参照することによってここにその内容を完全に説明され たものとして取り入れられるものである。従来技術の競争タンパク質結合分析に 用いられるタンパク質はｒＤＢＰＪと呼ばれるビタミンＤ移送タンパク質である 。このタンパク質はビタミンＤ自体又はｌ、２５　（ＯＨ）、Ｄとは区別される ２５−ＯＨビタミンＤとの結合に強い選択性を有するものである。アール・ボイ リオンら、１３　ジャーナル・オブ・ステロイド・バイオケミストリー１０２９ −１０３４　（１９８０）。

その他に１．２５　（ＯＨ）、ビタミンＤ分析を目途とする従来技術がある。デ ィー・シゲハルら、１１６　アナリティカル・バイオケミストリー２１１−２２ ２　（１９８１）：ジェー・アイスマンら、１７６　アーカイブズ・オブ・バイ オケミストリー・エンド・バイオフィジカルス２３５−２４３　（１９７６）、 これらの方法は競争タンパク質結合分析技術又はビタミンＤ代謝産物（例えば、 ジヒドロキシコレカリシフェロール）と結合する抗体の発達に依存するものであ る。エイチ・ベリーら、１１２　バイオケミカル・エンド・バイオフィジカル・ リサーチ・コミュニケーション４３１−４３６　（１９８３）；アール・ボイリ オンら、４１　アナリティカル・エンドクリノロジー４３５−４６　（１９８０ ）；アール・ボイリオン、２６　クリニカル・ケミストリー５６２−５６７　（ １９８０）；アール・ボイリオン、６６　ユーロビアン・ジャーナル・オブ・バ イオケミストリー２８５−２９１　（１９７６）参照。

このような分析法においては、哨乳動物の血液血清又は血漿をビタミンＤ及びそ の代謝産物を抽出する有機溶媒で処理する０次いで抽出物をカラム上で予備精製 する。その手積製１　、２５−　（ＯＨ）２Ｄをさらに高速液体クロマトグラフ ィーで精製して精製１．２５−（ＯＨ）Ｉ　Ｄが得られる。これらの処理段階に おいて一般に１゜２５−（ＯＨ）、Ｄの損失が生じる。これらの損失を補正する ため最初の血清又は血漿抽出物に一定量の放射能標識付け１．２５−（ＯＨ）、 Ｄが添加されている。最終の単離後、結合分析による実際の測定前に単離物中に 残留する放射能を測定して回収率を算定する。この回収率は最終計算において精 製中での１．２５−　（ＯＨ）２Ｄの損失を補正するのに用いられる。

血清から単離した１、２５−　（ＯＨ）！　Ｄは放射能標識付け１．２５−　（ ＯＨ）！　Ｄ及び１．２５−　（ＯＨ）ｔ　Ｄと特異的に結合するタンパク質で ある１、２５−　（ＯＨ）Ｉ　Ｄ受容体（レセプター）又はビタミンＤ代謝産物 に変えられた抗体のどちらかとの混合物中へ添加する。血清中の未標識１．２５ −　（ＯＨ）ｔ　Ｄは放射能標識付け１．２５−　（ＯＨ）２　Ｄと競争する。

未標識１．２５−（ＯＨ）＊　Ｄによって減少した放射能標識付け１．２５−（ ＯＨ）！Ｄの結合度が試料中に存在するｌ、２５−　（ＯＨ）ｌ　Ｄの量を測定 するための標準曲線を求めるのに用いられる。

結合した標識付け１．２５−（ＯＨ）＊　Ｄのレベルは遊離ないし未結合の未標 識１．２５−　（ＯＨ）＊　Ｄをデキストラン塗布木炭に吸収させることによっ て求められる０例えば、ジェー・ハッダッドら、３３　ジャーナル・オブ・クリ ニカル・エンドクリノロジー９９２−９９５　（１９７１）参照。以上のことか ら判るように、これら従来技術の分析は完了するのに数日を要し、多くの誤差発 生源を有している。それらはまた不当に経費がかかる。それゆえ、簡単、迅速、 比較的低経費で、しかも正確な１．２５−　（ＯＨ）＊　Ｄ分析法に対する要望 がある。

発明の開示 本発明の一局面はビタミンＤ輸送タンパク質を含有する試料中の１．２５−ジヒ ドロキシビタミンＤの存在に関する競争結合分析法を提供することにある。この 出願において一般にｒｌ、２５−ジヒドロキシビタミンＤＪが用いられると理解 されたい、すなわち、これは１．２５−ジヒドロキシビタミンＤｘ（ここに、ｘ ＝２．３．４．５及び／又は６である）を包含するものである。

この分析法によれば、試料へ１．２５−ジヒドロキシビタミンＤと結合すること ができる受容体タンパク質、標識付け１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、及び 受容体タンパク質と結合することができる抗体を添加する。次いで、抗体の標識 付け１，２５−ジヒドロキシビタミンＤと結合している受容体タンパク質との相 対的結合度を測定する。好ましくは、標識付け１．２５−ジヒドロキシビタミン Ｄは放射線標識付けされたものであり、前記抗体と結合した受容体は測定段階前 に免疫沈殿させる。ブタの受容体はそれの抗体が密接に関連するヒトの血液成分 と結合しないことが見出されているので好ましい受容体である。この分析法では 分析前に血液血漿又は血清からビタミンＤ及びその代謝産物を抽出する必要を無 くし、分析前に１．２５−　（ＯＨ）、Ｄのクロマトグラフィーによる精製の必 要を無くするものである。

このような分析を遂行するための標識付け１．２５−ジヒドロキシビタミンＤ、 １．２５−ジヒドロキシビタミンＤと結合することができる受容体タンパク質及 び該受容体タンパク質と結合することができる抗体からなるキットもまた提供さ れる。

本発明の一つの目的には１．２５−ジヒドロキシビタミンＤを分析することがで きる上記のような免疫検定法を提供することが含まれる。

もう一つの目的は単純で比較的安価でかつ実施容易な上記のような検定法を提供 することにある。

もう一つの目的は上記のような検定を遂行するためのキットを提供することにあ る。

本発明のさらにその他の目的及び利点は下記の記載から明らかになるであろう。

図面の簡単な説明 本発明のより良い理解が図面を参照することによって得られるであろう、しかし ながら、図面及び下記の好ましい形態の説明は本発明の単なる例であることが理 解されるべきである。これらは発明の全範囲を示すものではない。むしろ、請求 の範囲を発明の全範囲を決めるためのものとみるべきである。

第１図は発明の概念を模式図として示す。

発明を実施するための最良の形態 材料 ブタの受容体（第１図の１）をエム、デイムら、２５　バイオケミストリー４５ ２３−４５３４　（１９８６）（先行技術ではない）の記載に準じて調製した。

１．２５−　（ＯＨ）、［２６，２７−”Ｈ］　ビタミンＤｓ　　（１６０Ｃｉ ／ｍｍｏｌ）（第１図の２）をジエー、ナポリら、１９　バイオケミストリー２ ５１５−２５２１　（１９８０）に既に記載のようにして調製した。これはまた 現在ニューイングランド・ニューフレア／デュポンから入手することができる。

非放射性１．２５−　（ＯＨ）Ｉ　Ｄｓ　　（第１図の３）はホフマンーラ・ロ シェ社（ナラトレー、ニューシャーシー）から得た。

ブタの受容体（１）（７）抗体（４）ＸＶＩ−Ｅ６Ｅ６ＧＩＯはエム、デイムら 、２５　バイオケミストリー４５２３−４５３４　（１９８６）（先行技術では ない）の記載に準じて生成させた。

この抗体を製造することができるハイブリドーマは１９８７年８月１１日Ａ、Ｔ 、Ｃ，Ｃ，＃ＨＢ９４９６として米国メリーランド・ロックビル・バークローン ・ドライブ１２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託 され、その寄託物は１９８８年７月２２日付けの申請によりブダペスト条約寄託 物に格上げされ、本特許の発行によって入手可能となるものであり、さもなけれ ば指定国の適用可能な法律下に提供されるものである。寄託物の入手はライセン スを必要とするものではない。

抗体（４）はディー・ヒユーレットのウイスコンシンーマジソン大学博士論文「 抗体のビオチニル化」ページ１８０−２０４　（１９８４）に記載と類似の方法 を用いてｎ−ヒドロキシスクシンイミド・ビオチン（Ｎ　ＨＳ　Ｂ％ｂＭＡＢ） によってビオチニル化（５）することができる。使用する抗体の濃度は飽和曲線 によって求められるレセプター沈殿に必要な量である。

アビジン−セファロースはジエー・コーンら、１０７　バイオケミカル・エンド ・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション８７８−８８４　（１９８ ２）に記載通りにわれわれの研究室で調製した。使用容量は飽和曲線によって求 められる全ての免疫複合物の沈殿に必要とされる量の２５％増である。

好ましい緩衝剤は５０ｍＭ）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸（トリ ス−ＨＣｌ２）　、１．５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）　、５ｍＭ ジチオスレイトール及び３００ｍＭＫＣｌ２であり、２５℃でのＰｈ７．４であ る。

ＰＢＳ−トリトンは１．５ｍＭ−ＫＨｚ　ＰＯ４，８，１ｍＭ　・Ｎａｇ　ＨＰ Ｏ４，１，３７ｍＭ−ＮａＣｇ、２．７ｍＭ−ＫＣｎ、５％（ｖ／ｖ）トリトン Ｘ−１００（ｐＨ８，０）　、０．０２％Ｎ　ａ　Ｎ　ｓである。

伝 １．２５　　（ＯＨ）＊Ｄ（例えば、ブタの脱核抽出物受容体）との特異結合タ ンパク質試料に１６０Ｃｉ／ｍｍｏｌという非常に高度の特異活性で標識付けし た１、２５−　（ＯＨ）２　Ｄを添加した。

受容体へ最低５０μβ、最高２００μρの試験用ヒト血漿又は血清（６）を添加 した。これにブタの受容体（１）に対する抗体（４）を添加した。この抗体は予 めビオチニル化しておいた（５）。室温で１時間連続温置した。

最良の結果は放射線標識付はビタミンＤをブタ受容体の飽和値の９０％以上添加 し、ブタ受容体抗体を１０倍以上過剰に使用した場合に得られた。商品として入 手するか、上述の様に調製することができるアビジン−セファロースを添加し、 短時間強撹拌した後エッペンドルフ管ないしウェル（井戸型容器）中で１時間温 置した。それらは次いで遠心分離にかけ沈殿させた。上澄みを取り出し、免疫沈 殿物をさらにＰＢＳ−）−リドンで３回追加洗浄した。

次いで試験管全容及び沈殿物をシンチレーション液を有するシンチレーション用 ガラスびんへ添加し、試料中の放射能の量を測定した。標準曲線を作るために、 特異結合タンパク質を放射線標識付け１．２５−　（ＯＨ）＊　Ｄｓ　　（２） 及び量を順次増加シタ未標識１゜２５−　（ＯＨ）２　Ｄに加えビオチニル化抗 体とともに室温で１時間温室した。アジピン−セファロースを未知の試料と添加 し、遠心分離し、免疫沈殿物を前述のように洗浄した。これらは次いでまたシン チレーション液を有するシンチレーション用ガラスびんに入れ、カウントした。

血液中の未標識１．２５−　（ＯＨ）、Ｄによって結合タンパク質から置換され た放射線標識の量を算出した。

１つの特定実験では、１．２ｎＭの１．２５　　（ＯＨ）ｉ［２６，２７−”Ｈ ］　Ｄ、　、５０ｆｍｏｌの１，２５−　（ＯＨ）。

Ｄ、結合活性を有するブタの脱核抽出物、５Ｏ−２００ＬＬｎの試料血清、５μ ２のモノクロナール抗体、及びトリス５０ｍＭ％ｐＨ７，４のＥＤＴＡｌ、５ｍ Ｍ、ジチオスレイトール５ｍＭと塩化カリウム３００ｍＭからなる緩衝液を最終 容量２５０μ℃で含有するエッペンドルフ管（１，５＋ｎｊ２、ブリンクマン・ インスツルメンツ）を室温で１時間温室する。標準曲線はヒトの試験血清又は血 漿の代りに量を順次増加して米櫃ｉｌｌ、２５−　（ＯＨ）−Ｄｓを使用した以 外は上記と同じに一連のエッペンドルフ管により行う。１つの可能な範囲として １０ＬＬＭから０．００１μＭがある。上記の各エッペンドルフ管から３本の５ ０μβアリコートを取り出し、５０ｕ２のアビジン−セファロース（スラリー） とともに氷上で温室し、イムロン除去ウェル（ダイナチク）中２０分間隔で１時 間渦流処理する。これらのイムロン除去ウェルは８分間２００Ｏｒｐｍで遠心分 離する。

上澄みを除去し、免疫沈殿物をＰＢＳ−）−リドンを用い３回洗浄する。次いで ウェルを分解し、その１つづつを４ｍβの３ａ７０ｂシンチレーシヨン液（バラ カード・インスツルメンツ、イリノイ、ダウナース・グローブ）とともに計数用 ガラス管に入れ、その放射能をブリアス４００　ＣＬ／Ｄ型シンチレーションカ ウンター（バラカード・インスツルメンツ）を用いトリチウムに対し４０％の近 似効率で測定する。標準曲線は標準曲線管に存在する放射能から作成し、この標 準曲線を原血液試料中に存在する１、２５−　（ＯＨ）。

Ｄの量を直接読むのに使用する。

この定量における重要な点は血清又は血漿試料（６）中にビタミンＤ輸送タンパ ク質（７）が存在することである。このタンパク質は２５−０Ｈ−Ｄ　（８）を 検定を阻害する血液中の他のビタミンＤ代謝物質と結合させるのに必要である。

ブタの受容体は１．２５−（ＯＨ）、Ｄに対し高度の特異親和性があるので、こ の代謝物質は他の代謝物質が大部分輸送タンパク質と結合して残存するのに対し 受容体タンパク質によって輸送タンパク質から除去される。このことが、驚（べ きことに、抽出及びクロマトグラフィー精製の必要性を解消する。

他の変形形態 標識付けは放射能以外の技術を用いて行うことができる。（例えば、色指示薬を 競争ビタミンＤ化合物に付着結合させることができる。）さらに、ブタの受容体 が１．２５−ジヒドロキシビタミンＤを認知しビタミンＤ輸送タンパク質と競争 することかもきる唯一の受容体ではない。また、結合及び未結合１．２５−ジヒ ドロキシビタミンＤを分離するビオチン／セファロース系以外の手段は発明者の 知識範囲にある。したがって、請求の範囲によって発明者の全意図範囲を評価す べきである。

産業上の利用可能性 したがって、本分析法は試料人手後短時間内に利用することができ多数の分析を 低コストで確実に行うことができるものである。

ＦＩＧ、　１ 国際調査報告 ｍ−−＾−””””？Ｃ’：／’：ＳεＢ１０２ε９３国際調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．ビタミンＤ輸送タンパク質を含有する試料中の１，２５−ジヒドロキシビタ ミンＤの存在を定量するにあたり試料に１，２５−ジヒドロキシビタミンＤと結 合し得る受容体タンパク質、標識付け１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ及び受 容体タンパク質と結合し得る抗体を添加する段階、及び抗体の標識付け１，２５ −ジヒドロキシビタミンＤと結合している受容体タンパク質の相対的結合度を測 定する段階を有してなる競争結合分析法。
2. ２．標識付け１，２５−ジヒドロキシビタミンＤが放射性標識付け１，２５−ジ ヒドロキシビタミンＤである請求項１記載の分析法。
3. ３．前記測定段階前に前記抗体と結合した受容体タンパク質を免疫沈殿させる請 求項２記載の分析法。
4. ４．試料がヒトの血液、ヒトの血漿又はヒトの血清である請求項３記載の分析法 。
5. ５．受容体タンパク質がブタの受容体である請求項３記載の分析法。
6. ６．抗体がブタの受容体タンパク質の抗体である請求項５記載の分析法。
7. ７．抗体がＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．ＨＢ９４９６のハイブリドーマにより生成される抗 体特性を有する請求項６記載の分析法。
8. ８．標識付け１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、１，２５−ジヒドロキシビタ ミンＤと結合し得る受容体タンパク質及び該受容体タンパク質と結合し得る抗体 からなる競争分析キット。
9. ９．標識付け１，２５−ジヒドロキシビタミンＤが放射性標識付けされている請 求項８記載のキット。
10. １０．受容体タンパク質がブタの受容体である請求項９記載のキット。
11. １１．さらにキットが未標識１，２５−ジヒドロキシビタミンＤを含んでなり、 抗体がビオチニル化されている請求項１０記載のキット。
12. １２．抗体がＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．ＨＢ９４９６のハイブリドーマにより生成される 抗体特性を有する請求項８記載のキット。