JPH0551863B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ １，25−ジヒドロキシビタミンＤの定量分析
法であつて、 ビタミンＤ輸送タンパク質を含有する試料に
１，25−ジヒドロキシビタミンＤと特異的に結合
し得る受容体タンパク質、標識付け１，25−ジヒ
ドロキシビタミンＤ及び受容体タンパク質と結合
し得る抗体を添加し、前記ビタミンＤ輸送タンパ
ク質に検定を阻害するビタミンＤ代謝物質を結合
させ検定阻害を防止して、前記受容体タンパク質
に前記標識付けおよび未標識１，25−ジヒドロキ
シビタミンＤを競争的に結合させる段階、及び 前記標識付け１，25−ジヒドロビタミンＤと結
合している前記受容体タンパク質に対する前記抗
体相対的結合度を測定する段階 を有してなることを特徴とする１，25−ジヒドロ
キシビタミンＤの競争結合分析法。

２ 標識付け１，25−ジヒドロキシビタミンＤが
放射性標識付け１，25−ジヒドロキシビタミンＤ
である請求項１記載の分析法。

３ 前記測定段階前に前記抗体と結合した受容体
タンパク質を免疫沈殿させる請求項２記載の分析
法。

４ 試料がヒトの血液、ヒトの血漿又はヒトの血
清である請求項３記載の分析法。

５ 受容体タンパク質がブタの受容体タンパク質
である請求項３記載の分析法。

６ 抗体がブタの受容体タンパク質の抗体である
請求項５記載の分析法。

７ 抗体がA.T.C.C.HB9496のハイブリドーマに
より生成される抗体特性を有する請求項６記載の
分析法。

８ 標識付け１，25−ジヒドロキシビタミンＤ、
１，25−ジヒドロキシビタミンＤと特異的に結合
し得る受容体タンパク質及び該受容体タンパク質
と結合し得る抗体を有してなる競争分析キツト。

９ 標識付け１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ
が放射性標識付けされている請求項８記載のキツ
ト。

１０ 受容体タンパク質がブタの受容体タンパク
質である請求項９記載のキツト。

１１ さらにキツトが未標識１，25−ジヒドロキ
シビタミンＤが含んでなり、抗体がビチオニル化
されている請求項１０記載のキツト。

１２ 抗体がA.T.C.C.HB9496のハイブリドーマ
により生成される抗体特性を有する請求項８項記
載のキツト。

技術分野 この発明は哺乳動物の血液血清又は血漿中の
１，25−ジヒドロキシビタミンＤの準位（レベ
ル）を試験する分析に関する。より詳しくは診断
道具としての免疫分析技術の使用を含む。

背景技術 ビタミンＤは哺乳動物に対して多くの有用な作
用を有するよく知られたビタミンである。ビタミ
ンＤは肝臓中で25位のヒドロキシル化によつて、
続いて腎臓中で１位のヒドロキシル化によつて活
性化される。これは腸のカルシウム輸送、骨から
のカルシウムの移動及び腎臓中でのカルシウムの
再吸収が増大するよう刺激する。ビタミンＤの最
終形態、１，25−ジヒドロキシビタミンＤの生産
はカルシウム及びリンの必要度によつて規制され
る。血清低カルシウム濃度は副甲状腺に甲状腺ホ
ルモンを分泌するよう刺激し、次には腎臓中での
「１，25（OH）₂D」の生産開始の引き金を引く。
次いで１，25（OH）₂Dは腸にカルシウム及びリン
を吸収するよう、かつ骨にカルシウムを移動させ
るようにし、腎臓のカルシウム再吸収を刺激す
る。これらの効果は血液中のカルシウムを正常の
レベルまで上げ、次いで甲状腺分泌を停止させ、
１，25（OH）₂Dのそれ以上の生産を停止させる。
従つて、血液中の１，25−ジヒドロキシビタミン
Ｄのレベルの測定はある疾病（例えば、腎臓欠
陥、骨そしよう症）に関する重要な診断道具であ
る。それはまた将来有用な研究情報を提供するこ
とができる。

血液中の前躯体、25−ヒドロキシビタミンＤの
レベルの測定は過去には高速液体クロマトグラフ
イー及び競争タンパク質結合分析により行われて
きた。ジエー・アイスマンら、80 アナリテイカ
ル・バイオケミストリー298−308（1977）；ジエ
ー・ハツダツドら、33 ジヤーナル・オブ・クリ
ニカル・エンドクリノロジー992−995（1971）。こ
れら文献及びここに掲載するその他全ての文献を
参照することによつてここにその内容を完全に説
明されたものとして取り入れられたものである。
従来技術の競争タンパク質結合分析に用いられる
タンパク質は「DBP」と呼ばれるビタミンＤ輸
送タンパク質である。このタンパク質はビタミン
Ｄ自体又は１，25（OH）₂Dとは区別される25−
OHビタミンＤとの結合に強い選択性を有するも
のである。アール・ボイリオンら、13 ジヤーナ
ル・オブ・ストロイド・・バイオケミストリー
1029−1034（1980）。

その他に１，25（OH）₂ビタミンＤ分析を目途
とする従来技術がある。デイーシゲハルら、116
アナリテカル・バイオケミストリー211−222
（1981）；ジエー・アイスマンら、176 ア−カイ
ブズ・オブ・バイオケミストリー・エンド・バイ
オフイジークス235−243（1976）。これらの方法は
競争タンパク質結合分析技術又はビタミンＤ代謝
産物（例えば、ジヒドロキシコレカリシフエロー
ル）と結合する抗体の発達に依存するものであ
る。エイチ・ペリーら、112 バイオケミカル・
エンド・バイオフイジカル・リサーチ・コミユニ
ケーシヨン431−436（1983）；アール−ボイリオン
ら、41 アナリテイカル・エンドクリノロジー
435−46（1980）；アール・ボイリオン、26 クリ
ニカル・ケミストリー562−567（1980）；アール・
ボイリオン、66 ユーロピアン・ジヤーナル・オ
ブ・バイオケミストリー285−291（1976）参照）。

このような分析方法においては、哺乳動物の血
液血清又は血漿をビタミンＤ及びその代謝産物を
抽出する有機溶媒で処理する。次いで抽出物をカ
ラム上で予備精製する。その半精製１，25−
（OH）₂Dをさらに高速液体クロマトグラフイーで
精製して１，25−（OH）₂Dが得られる。これらの
処理段階において一般に１，25−（OH）₂Dの損失
が生じる。これらの損失を補正するため最初の血
清又血漿抽出物に一定量の放射能標識付け１，25
−（OH）₂Dが添加されている。最終の単離後、結
合分析による実際の測定前に単離物中に残留する
放射能を測定して回収率を算定する。この回収率
は最終計算において精製中での１，25−（OH）₂D
の損失を補正するのに用いられる。

血清から単離した１，25（OH）₂Dは放射能標識
付け１，25−（OH）₂D及び１，25−（OH）₂Dと特
異的に結合するタンパク質である１，25−
（OH）₂D受容体（レセプター）又はビタミンＤ代
謝産物に変えられた抗体のどちらかとの混合物中
へ添加する。血清中の未標識１，25−（OH）₂Dは
放射能標識付け１，25（OH）₂Dと競争する。未標
識１，25−（OH）₂Dによつて減少した放射能標識
付け１，25−（OH）₂Dの結合度が試料中に存在す
る１，25−（OH）₂Dの量を測定するための標準曲
線を求めるのに用いられる。

結合した標識付け１，25−（OH）₂Dのレベルは
遊離ないし未係合の未標識１，25−（OH）₂Dをデ
キストラン塗布木炭に吸収させることによつて求
められる。例えば、ジエー・ハツダツドら、33
ジヤーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロ
ジー992−995（1971）参照。以上のことから判る
ように、これら従来技術の分析は完了するのに数
日を要し、多くの誤差発生源を有している。それ
らはまた不当に経費がかかる。それゆえ、簡単、
迅速、比較的低経費で、しかも正確な１，25−
（OH）₂D分析法に対する要望がある。

発明の開示 本発明の一局面はビタミンＤ輸送タンパク質を
含有する試料中の１，25−ジヒドロキシビタミン
Ｄの存在に関する競争結合分析法を提供すること
にある。この出願において一般に「１，25−ジヒ
ドロキシビタミンＤ」が用いられると理解された
い。すなわち、これは１，25−ジヒドロキシビタ
ミンDx（ここに、ｘ＝２、３、４、５及び／又は
６である）を包含するものである。

この分析法によれば、試料へ１，25−ジヒドロ
キシビタミンＤと結合することができる受容体タ
ンパク質、標識付け１，25−ジヒドロキシビタミ
ンＤ、及び受容体タンパク質と結合することがで
きる抗体を添加する。次いで、抗体の標識付け
１，25−ジヒドロキシビタミンＤと結合している
受容体タンパク質との相対的結合度を測定する。
好ましくは、標識付け１，25−ジヒドロキシビタ
ミンＤは放射線標識付けされたものであり、前記
抗体と結合した受容体は測定段階前に免疫沈殿さ
れる。ブタの受容体はそれの抗体が密接に関連す
るヒトの血液成分と結合しないことが見出されて
いるので好ましい受容体である。この分析方法で
は分析前に血液血漿又は血清からビタミンＤ及び
その代謝産物を抽出する必要を無くし、分析前に
１，25−（OH）₂Dのクロマトグラフイーによる精
製の必要を無くするものである。

このような分析を遂行するための標識付け１，
25−ジヒドロキシビタミンＤ、１，25−ジヒドロ
キシビタミンＤと結合することができる受容体タ
ンパク質及び該受容体タンパク質と結合すること
ができる抗体からなるキツトもまた提供される。

本発明の一つの目的には１，25−ジヒドロキシ
ビタミンＤを分析することができる上記のような
免疫検定法を提供することが含まれる。

もう一つの目的は単純で比較的安価でかつ実施
容易な上記のような検定法を提供することにあ
る。

もう一つの目的は上記のような検定を遂行する
ためのキツトを提供することにある。

本発明のさらにその他の目的及び利点は下記の
記載から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

本発明のより良い理解が図面を参照することに
よつて得られるであろう。しかしながら、図面及
び下記の好ましい形態の説明は本発明の単なる例
であることが理解されるべきである。これらは発
明の全範囲を示すものではない。むしろ、請求の
範囲を発明の全範囲を決めるためのものとみるべ
きである。

第１図は発明の概念を模式図として示す。

発明を実施するための最良の形態 材 料 ブタの受容体（第１図の１）をエム、デイム
ら、25 バイオケミストリー4523−4534（1986）
（先行技術ではない）の記載に準じて調製した。

１，25−（OH）₂［26，27−³H］ビタミンD₃
（160Ci／ｍmol）（第１図の２）をジエー、ナポ
リら、19 バイオケミストリー2515−2521（1980）
に既に記載のようにして調製した。これはまた現
在ニユーイングランド、・ニユークレア／デユポ
ンから入手することができる。

非放射性１，25−（OH）₂D₃（第１図の３）はホ
フマン−ラ・ロシエ社（ナツトレー、ニユージヤ
ージー）から得た。

ブタ受容体１の抗体４XVI・E6E6GIOはエム、
デイムら、25 バイオケミストリー4523−4534
（1986）（先行技術ではない）の記載に準じて生成
させた。

この抗体を製造することができるハイブリドー
マは1987年８月11日A.T.C.C.＃HB9496として米
国メリーランド・ロツクビル・パークローン・ド
ライブ12301のアメリカン・タイプ・カルチヤ
ー・コレクシヨンに寄託され、その寄託物は1988
年７月22日付けの申請によりブダペスト条約寄託
物に格上げされ、本特許の発行によつて入手可能
となるものであり、さもなければ指定国の適用可
能な法律下に提供されるものである。寄託物の入
手はライセンスを必要とするものではない。

抗体４はデイー・ヒユーレツトのウイスコンシ
ン−マジソン大学博士論文「抗体のビオチニル
化」ページ180−204（1984）に記載と類似の方法
を用いてｎ−ヒドロキシスクシンイミド・ビオチ
ン（NHSB、bMAB）によつてビオチニル化５
することができる。使用する抗体の濃度は飽和曲
線によつて求められるレセプター沈殿に必要な量
である。

アビジン−セフアロースはジエー・コーンら、
107 バイオケミカル・エンド・バイオフイジカ
ル・リサーチ・コミニユケーシヨン878−884
（1982）に記載通りにわれわれの研究室で調製し
た。使用容量は飽和曲線によつて求められる全て
の免疫複合物の沈殿に必要とされる量の25％増で
ある。

好ましい緩衝剤は50ｍＭトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン塩酸（トリス−HCl）、1.5ｍ
Ｍエチレジアミン四酢酸（EDTA）、５ｍＭジチ
オスレイトール及び300ｍMKClであり、25℃で
のPH7.4である。

PBS−トリトンは1.5ｍＭ・KH₂PO₄、8.1ｍ
Ｍ・Na₂HPO₄、1.37ｍＭ・NaCl、2.ｍmM・
KCl、５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−100（PH8.0）、
0.02％NaN₃である。

例 １，25−（OH）₂Dとの特異結合タンパク質（例
えば、ブタの腸核抽出物受容体）の試料に
160Ci／ｍmolという非常に高度の特異活性で標
識付けした１，25−（OH）₂Dを添加した。受容体
へ最低50μ、最高200μの試験用ヒト血漿又は
血清６を添加した。これにブタの受容体１に対す
る抗体４を添加した。この抗体は予めビオチニル
化しておいた(5)。室温で１時間連続温置した。

最良の結果は放射線標識付けビタミンＤをブタ
受容体の飽和値の90％以上添加し、ブタ受容体抗
体を10倍以上過剰に使用した場合に得られた。商
品として入手するか、上述の様に調製することが
できるアビジン−セフアロースを添加し、短時間
強攪拌した後エツペンドルフ管ないしウエル（井
戸型容器）中で１時間温置した。それらは次いで
遠心分離にかけ沈殿させた。上澄みを取り出し、
免疫沈殿物をさらにPBS−トリトンで３回追加
洗浄した。

次いで試験管全容及び沈通物をシンチレーシヨ
ン液を有するシンチレーシヨン用ガラスびんへ添
加し、試料中の放射能の量を測定した。標準曲線
を作るために、特異結合タンパク質を放射線標識
付け１，25−（OH）₂D₃(2)及び量を順次増加した
未標識１，25−（OH）₂Dに加えビオチニル化抗体
とともに室温で１時間温置した。アジビン−セフ
アロースを未知の試料と添加し、遠心分離し、免
疫沈殿物を前述のように洗浄した。これらは次い
でまたシンチレーシヨン液を有するシンチレーシ
ヨン用ガラスびんに入れ、カウントした。血液中
の未標識１，25−（OH）₂Dによつて結合タンパク
質から置換された放射線標識の量を算出した。

１つの特定実験では、1.2nMの１，25−（OH）₂
［26，27−³H］D₃、50fmolの1.25−（OH）₂D₃結合
活性を有するブタの腸核抽出物、50−200μの
試料血清、5μのモノクロナール抗体、及びト
リス50ｍＭ、PH7.4のEDTA1.ｍmM、ジチオスイ
トール５ｍＭと塩化カリウム300ｍＭからなる緩
衝液を最終容量を250μで含有するエツペンド
ルフ管（1.5ml、ブリンクマン・インスツルメン
ツ）を室温で１時間温置する。標準曲線はヒトの
試験血清又は血漿の代りに量を順次増加して未標
識１，25−（OH）₂D₃を使用した以外は上記と同
じに一連のエツペンドルフ管により行う。１つの
可能な範囲として10μMから0.001μMがある。上
記の各エツペンドルフ管から３本の50μアリコ
ートを取り出し、50μのアビジン−セフアロー
ス（スラリー）とともに氷上で温置し、イムロン
除去ウエル（ダイナテク）中20分間隔で１時間
渦流処理する。これらのイムロン除去ウエルは８
分間2000rpmで遠心分離する。

上澄みを除去し、免疫沈殿物をPBS−トリト
ンを用い３回洗浄する。次いでウエルを分解し、
その１つづつを４mlの3a70bシンチレーシヨン液
（パツカード・インスツルメンツ、イリノイ、ダ
ウナース・グローブ）とともに計数用ガラス管に
入れ、その放射能をプリアス400CL／Ｄ型シンチ
レーシヨンカウンター（パツカード・インスツル
メンツ）を用いトリチウムに対し40％の近似効率
で測定する。標準曲線は標準曲線は標準曲線管に
存在する放射能から作成し、この標準曲線を原血
液試料中に存在する１，25−（OH）₂Dの量を直接
読むのに使用する。

この定量における重要な点は血清又は又は血漿
試料６中にビタミンＤ輸送タンパク質DBP７が
存在することである。このタンパク質は25−OH
−Ｄ８及び検定を阻害する血液中の他のビタミン
Ｄ代謝物質と結合させるのに必要である。ブタの
受容体タンパク質は１，25−（OH）₂Dに対して高
度の特異親和性があるので、この代謝物質は25−
OH−Ｄなどの他の代謝物質が大部分輸送タンパ
ク質と結合して残存するのに対し受容体タンパク
質によつて輸送タンパク質から除去される。この
ようにビタミンＤ輸送タンパク質７は、試料中に
存在して検定を阻害する25−OH−Ｄ８などの代
謝物質を被検定物質から選択的に除去する「スク
リーニング（screening）」の機能を有する。この
ことが、驚くべきことに、抽出及びクロマトグラ
フイー精製の必要性を解消する。

他の変形形態 標識付けは放射能以外の技術を用いて行うこと
ができる。（例えば、色指示薬を競争ビタミンＤ
化合物に付着結合させることができる。）さらに、
ブタの受容体が１，25−ジヒドロキシビタミンＤ
を認知しビタミンＤ輸送タンパク質と競争するこ
とができる唯一の受容体ではない。また、結合及
び未結合１，25−ジヒドロキシビタミンＤを分離
するビオチン／セフアロース系以外の手段は発明
者の知識範囲にある。したがつて、請求の範囲に
よつて発明者の全意図範囲を評価すべきである。

産業上の利用可能性 したがつて、本分析法は試料入手後短時間内に
利用することができ多数の分析を低コストで確実
に行うことができるものである。