DE3875619T2 - Test fuer 1,25-dihydroxy-vitamin d. - Google Patents

Test fuer 1,25-dihydroxy-vitamin d.

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Description

    Erfindungsgebiet
  • Die Erfindung bezieht sich auf einen Assay zur Bestimmung des 1,25-Dihydroxyvitamin D Spiegels im Blutserum oder - plasma von Säugern. Insbesondere schließt sie den Einsatz von Immunoassay-Techniken als diagnostisches Mittel ein.
    • Der zugrundeliegende Stand der Technik
  • Bei Vitamin D handelt es sich um ein sehr bekanntes Vitamin, das in Säugern viele nützliche Funktionen ausübt. Es wird durch eine 25-Hydroxylierung in der Leber und anschließend durch 1-Hydroxylierung in den Nieren aktiviert. Dies stimuliert den intenstinalen Calciumtransport, die Mobilisierung des Calciums aus den Knochen und eine erhöhte Reabsorption des Calciums in den Nieren. Die Erzeugung der Endform des Vitamins D, 1,25- Dihydroxyvitamin D, wird durch den Bedarf an Calcium und Phosphor reguliert. Eine niedrige Claciumkonzentration im Serum stimuliert die Parathyreoidea-Drüse zur Ausschüttung von Parathyreoidea-Hormon, was seinerseits die Erzeugung von "1,25-(OH)&sub2;D" in der Niere auslöst. 1,25-(OH)&sub2;D weist das Intestinum an, Calcium und Phosphor zu absorbieren und die Knochen, Calcium zu mobilisieren, und es stimuliert die renale Reabsorption von Calcium. Diese Wirkungen erhöhen das Blutcalcium auf normale Werte, was hiernach zur Abstellung der Parathyreoidea-Sekretion führt und zur Abstellung der weiteren Erzeugung von 1,25-(OH)&sub2;D. Die Messung des 1,25-Dihydroxyvitamins D im Blut stellt deshalb ein wichtiges diagnostisches Mittel im Zusammenhang mit gewissen Krankheiten (z. B. Nierenversagen, Osteoporose) dar. Sie könnte in der Zukunft auch wertvolle Informationen für die Forschung liefern.
  • Die Messung des Blutspiegels des Precursors, 25- Hydroxyvitamin D, wurde in der Vergangenheit vermittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie und durch kompetitiven Proteinbindungsassay durchgeführt. J. Eisman et al., 80 Anal. Biochem. 298-305 (1977); J. Haddad et al., 33 J. Clin. Endocr. 992-995 (1971). Im Stand der Technik wurde als Protein für den kompetitiven Bindungsassay das Vitamin B Transportprotein, "DBP" genannt, verwendet. Dieses Protein hat eine starke Präferenz zur Bindung von 25-OH Vitamin D im Unterschied zu dem eigentlichen Vitamin D oder 1,25 (OH)&sub2;D. R. Bouillon et al., 13 J. Steroid Biochem. 1029-1034 (1980).
  • Es gibt auch Versuche im Stand der Technik für einen Assay zur Bestimmung von 1,25 (OH)&sub2; Vitamin D. D. Shigeharu et al., 116 Anal. Biochem. 211-222 (1981); J. Eisman et al., 176 Arch. Biochem. Biophys. 235-243 (1976). Diese Methoden beruhen auf kompetitiven Bindungsassay-Techniken oder der Entwicklung eines Antikörpers, der Vitamin D Metabolite (z. B. Dihydroxycholecalciferol) bindet. Vgl. ganz allgemein H. Perry et al., 112 Biochem. Biophys. Res. Commun. 431-436 (1983); R. Bouillon et al., 41 Ann. Endocrin. 435-36 (1980); R. Bouillon, 26 Clin. Chem. 562-567 (1980); R. Bouillon, 66 Eur. J. Biochem., 285-291 (1976).
  • Bei solchen Assays wird das Blutserum oder -plasma von Säugern mit einem organischen Lösungsmittel behandelt, das Vitamin D und seine Metabolite extrahiert. Der Extrakt wird dann auf einer Säule vorgereinigt. Das halbgereinigte 1,25- (OH)&sub2;D wird dann weiter vermittels Hochleistungs- Flüssigchromatographie gereinigt, was gereinigtes 1,25- (OH)&sub2;D ergibt. Während dieser Stufen entstehen im allgemeinen Verluste an 1,25-(OH)&sub2;D. Um diese Verluste zu korrigieren, wird dem ursprünglichen Plasma- oder Serumextrakt eine bestimmte Menge an radiomarkiertem 1,25- (OH)&sub2;D zugesetzt. Nach der endgültigen Isolierung und vor der tatsächlichen Messung vermittels des Bindungsassays wird die in dem isolierten Material zurückbleibende Radioaktivität bestimmt, was die Berechnung der Wiedergewinnung gestattet. Diese Wiedergewinnung wird dann bei der Endberechnung verwendet, um die Verluste an 1,25- (OH)&sub2;D während der Reinigung zu korrigieren.
  • Das aus dem Serum isolierte 1,25-(OH)&sub2;D wird dann einer Mischung von radiomarkiertem 1,25-(OH)&sub2;D zugesetzt und entweder einem 1,25-(OH)&sub2;D Rezeptor, bei dem es sich um ein Protein handelt, welches speziell 1,25-(OH)&sub2;D bindet, oder einem auf Vitamin D Metabolite ausgerichteten Antikörper. Das nicht-markierte 1,25-(OH)&sub2;D im Serum konkurriert mit dem radiomarkierten 1,25-(OH)&sub2;D. Das Ausmaß, um welches die Bindung des markierten 1,25-(OH)&sub2;D durch das nichtmarkierte 1,25-(OH)&sub2;D verringert wird, wird dazu benutzt, eine Standardkurve aufzustellen, um den Anteil an 1,25- (OH)&sub2;D in der Probe zu bestimmen.
  • Der Level an gebundenem, markiertem 1,25-(OH)&sub2;D wird durch Absorption des freien oder nicht-markierten 1,25-(OH)&sub2;D auf mit Dextran überzogener Holzkohle bestimmt. Vgl. z. B. J. Haddad et al., 33 J. Clin. Endocr. 992-995 (1971). Wie ohne weiteres ersichtlich benötigen die Assays nach dem Stand der Technik verschiedene Tage bis sie zum Ende kommen und sie weisen viele Quellen für mögliche Irrtümer auf. Sie sind auch übermäßig kostspielig. Es besteht deshalb das Bedürfnis nach einem einfachen, schnellen, verhältnismäßig preiswerten und genauen Assay zur Bestimmung von 1,25- (OH)&sub2;D.
  • Die US-A 45 85 741 beschreibt eine Methode zur Bestimmung von Vitamin D Metaboliten, welche den Einsatz der Hochdruck-Flüssigchromatographie in einem Radiorezeptorassay zur Bestimmung von Calcitriol dadurch vermeidet, daß Calcitroilsäure verwendet wird.
    • Beschreibung der Erfindung
  • Nach einem Aspekt der Erfindung wird ein kompetitiver Bindungsassay für das Vorhandensein von 1,25- Dihydroxyvitamin D in einer Vitamin D Transportprotein enthaltenden Probe zur Verfügung gestellt. Es versteht sich, daß "1,25-Dihydroxyvitamin D" in der vorliegenden Erfindung als Gattungsbegriff verwendet wird. Folglich soll hiermit auch 1,25-Dihydroxyvitamin Dx, worin x = 2, 3, 4, 5 und/oder 6 bedeutet, erfaßt werden.
  • Gemäß dem erfindungsgemäßen Assay setzt man der Probe ein Rezeptorprotein zu, welches sich an das 1,25- Dihydroxyvitamin D zu binden vermag, sowie markiertes 1,25- Dihydroxyvitamin D und einen Antikörper, der sich an das Rezeptorprotein zu binden vermag. Man mit dann das relative Ausmaß der Bindung des Antikörpers an das Rezeptorprotein, das an dem markierten 1,25- Dihydroxyvitamin D gebunden ist. Vorzugsweise handelt es sich bei dem markierten 1,25-Dihydroxyvitamin D um ein radiomarkiertes Material und vor der Messung wird das an dem erwähnten Antikörper gebundene Rezeptorprotein einer Immunofällung unterworfen. Ein Schweinerezeptor wird bevorzugt, nachdem ein Antikörper hierfür aufgefunden wurde, welcher sich nicht mit den nahe verwandten Bestandteilen des menschlichen Blutes verbindet. Dieser Assay macht die Extraktion von Vitamin D und seiner Metabolite aus dem Blutplasma oder -serum vor Durchführung des Assays überflüssig und auch die chromatographische Reinigung von 1,25-(OH)&sub2;D vor dem Assay.
  • Es wird auch ein Arbeitssatz zur Durchführung dieser Assays zur Verfügung gestellt, welcher markiertes 1,25- Dihydroxyvitamin D, ein Rezeptorprotein, das sich an 1,25- Dihydroxyvitamin D zu binden vermag, und einen Antikörper,der sich an den erwähnten Rezeptor zu binden vermag, enthält, wobei der Antikörper einer Ankerungsverbindung angefügt ist.
    • Kurzbeschreibung der Zeichnung
  • Ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung lädt sich durch Bezugnahme auf die Zeichnung erreichen. Es versteht sich jedoch, daß die Zeichnung und die Beschreibung der nachfolgenden bevorzugten Ausführungsbeispiele lediglich beispielhaft für die Erfindung sind.
  • Fig. 1 stellt das Konzept der Erfindung in schematischer Form dar.
    • Beste Ausführungsarten der Erfindung Materialien
  • Schweinerezeptor (1 in Fig. 1) wurde wie in M. Dame et al., 25 Biochemistry 4523-4534 (1986) beschrieben hergestellt, wo dieses in Kombination mit Antikörper und markiertem 1,25-Dihydroxyvitamin D&sub3; offenbart ist.
  • 1,25-(OH)&sub2;-[26,27-³H] Vitamin D&sub3; (160 Ci/mmol) (2 in Fig. 1) wurde, wie früher in J. Napoli et al., 19 Biochemistry 2515-2521 (1980) beschrieben, hergestellt. Es ist jetzt auch von New England Nuclear/Dupont erhältlich.
  • Nichtradioaktives 1,25-(OH)&sub2;D&sub3; (3 in Fig. 1) wurde von Hoffman-La Roche Company (Nutley, NJ) erhalten.
  • Der Antikörper (4) XVI E6E6GIO für den Schweinerezeptor (1) wurde wie bei M. Dame et al., 25 Biochemistry 4523-4534 (1986) beschrieben hergestellt.
  • Hybridomen, die diesen Antikörper zu erzeugen vermögen, wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, U.S.A. unter A.T.C.C. # HB9496 am 11. August 1987 hinterlegt; die Hinterlegung in eine solche nach dem Budapester Vertrag durch ein Ersuchen vom 22. Juli 1988 erweitert; sie wird nach Ausgabe dieses Patents und wie anderweitig nach dem anzuwendenden Recht der Bestimmungsländer vorgesehen zugänglich gemacht.
  • Die Zugänglichkeit der Hinterlegung ist nicht als eine Lizenz zu betrachten.
  • Der Antikörper (4) kann mit n-Hydroxysuccinimidobiotin (NHSB, bMAB) biotinyliert werden, wobei Techniken analog denen in D. Hullet, Ph. D. Thesis, "Biotinylation of Antibodies", U. Wisconsin-Madison, pp. 180-204 (1984) angewendet werden. Die Konzentration des verwendeten Antikörpers entspricht der Menge, die für die Ausfällung des Rezeptors benötigt wird und wie sie durch Sättigungskurven bestimmt wird.
  • Avidin-Sepharose wurde in unserem Laboratorium hergestellt wie bei J. Kohl et al., 107 Biochem. Biophys. Res. Commun. 878-884 (1982) beschrieben. Das verwendete Volumen liegt 25% über dem benötigten, um alle Immunkomplexe auszufällen wie durch Sättigungskurven festgelegt ist.
  • Der bevorzugte Puffer ist 50 mM Tris (Hydroxymethyl) aminomethanhydrochorid (Tris-HCl), 1.5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 5 mM Dithiothreit und 300 mM KCl, PH 7.4 bei 25ºC.
  • PBS-Triton ist 1.5 mM KH&sub2;PO&sub4;, 8.1 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 1.37 mM NaCl, 2.7 mM KC1, .5% (v/v) Triton X-100 (pH 8.0), .02% NaN&sub3;.
    • Beispiel
  • Einer Probe von spezifischem Bindungsprotein für 1,25- (OH)&sub2;D (i. e., Schweine-Intestinal-Kernextrakt-Rezeptor) wird 1,25-(OH)&sub2;D zugesetzt, das mit einer sehr hohen spezifischen Aktivität von 160 Ci/mmol markiert war. Mindestens 50 ul und höchstens 200 ul menschliches Testplasma oder -serum (6) wurde dem Rezeptor zugesetzt. Hierzu wurde der auf den Schweinerezeptor (1) ausgerichtete Antikörper (4) zugegeben. Der Antikörper war vorher biotinyliert worden (5). Die Inkubation konnte während einer Stunde bei Raumtemperatur ablaufen.
  • Die besten Resultate werden erhalten, wenn das radiomarkierte Vitamin D (2) entsprechend einer 90 %-igen oder darüberliegenden Sättigung des Schweinerezeptors zugesetzt und ein zehnfacher oder darüberliegender Überschuß an Antikörper zu Schweinerezeptor verwendet wird. Avidin-Sepharose, die auf dem Markt erhalten oder, wie oben beschrieben, hergestellt werden kann, wird zugegeben, während eines kurzen Zeitraums durchgeschüttelt und die Inkubation während einer Stunde in Eppendorf-Röhren oder - schalen ablaufen gelassen. Es wird dann zentrifugiert um das Präcipitat zum Absetzen zu bringen. Die überstehende Flüssigkeit wird abgegossen und das Immunopräcipitat nochmals dreimal mit pBS-Triton gewaschen.
  • Die gesamte Röhre und das Präcipitat wird dann in eine Szintillationsflüssigkeit enthaltende Szintillationsampulle eingebracht und der Betrag der Radioaktivität in der Probe bestimmt. Um eine Standardkurve zu erhalten wird das spezifische Bindungsprotein mit dem radiomarkierten 1,25- (OH)&sub2;D&sub3; (2) und zunehmenden Mengen an nicht-markiertem 1,25-(OH)&sub2;D während einer Stunde bei Raumtemperatur zusammen mit dem biotinylierten Antikörper inkubiert. Avidin-Sepharose wird wie bei der unbekannten Probe zugesetzt, zentrifugiert und das Immunopräcipitat wie oben gewaschen. Dies alles wird dann wieder in eine Szintillationsampulle mit Szintillationsflüssigkeit gebracht und die Zählung durchgeführt. Die Menge des vom Bindungsprotein durch das im Blut vorhandene nichtmarkierte 1,25-(OH)&sub2;D verdrängte Radiomarkierte wird errechnet.
  • Bei einem speziellen Versuch wird eine Eppendorf-Röhre (1.5 ml, Brinkman Instruments) enthaltend 1.2 nM, 1,25-(OH)&sub2; [26,27-³H] D&sub3;, Schweine-Intestinal-Kernextrakt mit einer Bindungsaktivität für 50 fmol an 1,25-(OH)&sub2;D&sub3;, 50-200ul Testserum, 5ul monoclonaler Antikörper und einem Puffer aus Tris 50 mM, pH 7.4 EDTA 1.5 mM, Dithiothreitol 5mM und Kaliumchlorid 3 mM bis auf ein Endvolumen von 250 ul während einer Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Eine Standardkurve wird mit einer Serie von Eppendorf-Röhren wie oben beschrieben aufgestellt, wobei jedoch das menschliche Testserum oder -plasma durch ansteigende Mengen an nichtmarkiertem 1,25-(OH)&sub2;D3 ersetzt wurde. Ein möglicher Bereich erstreckt sich von 10uM bis .001uM. Drei 50ul aliquote Mengen werden von jeder der vorerwähnten Eppendorf-Röhren herausgenommen und auf Eis mit 50ul Avidin-Sepharose (Aufschlämmung) inkubiert und in 20- minütigen Intervallen während einer Stunde in Immulon II- Entnahmegefäßen (Dynatech) durchgeschüttelt.
  • Diese Immunlon-Entnahmegefäße werden bei 2000 Rpm während acht Minuten zentrifugiert.
  • Die überstehende Flüssigkeit wird entfernt und das Immunopräcipitat dreimal mit PBS-Triton gewaschen. Die Gefäße werden dann voneinander getrennt und jeweils in eine Zählampulle eingesetzt mit 4 ml an 3a70b Szintillationsflüssigkeit (Packard Instruments, Downers Grove, IL) und die Radioaktivität mit einem PRIAS-Modell 400 CL/D-Szintillationszähler (Packard Instruments) mit einer annähernden Wirksamkeit von 40 % für Tritium gemessen. Es wurden Standardkurven aus der in den Standardkurvenröhren vorhandenen Radioaktivität aufgestellt und diese Standardkurve wird dann dazu benutzt, um die in der ursprünglichen Blutprobe vorhandene Menge an 1,25- (OH)&sub2;D abzulesen.
  • Ein wichtiger Gesichtspunkt dieser Bestimmung ist die Anwesenheit des Vitamin D-Transportproteins DBP (7) in der Serum- oder Plasmaprobe (6). Dieses Protein wird für die Bindung des 25-OH-D (8) und anderer Metabolite von Vitamin D im Blut benötigt, welche den Assay stören würden. Wegen der hohen und spezifischen Affinität des Schweinerezeptorproteins für 1,25-(OH)&sub2;D wird dieser Metabolit von dem Transportprotein durch das Rezeptorprotein entfernt, während die anderen Metabolite weitgehend an dem Transportprotein gebunden bleiben. Dadurch entfällt überraschenderweise die Notwendigkeit zur Extraktion und chromatographischen Reinigung.
    • Andere Varianten
  • Die Markierung kann auch vermittels anderer Techniken als die der Radioaktivität erfolgen (z. B. ein Farbindikator kann an die kompetitive Vitamin D-Verbindung angebunden werden). Weiterhin stellt der Schweinerezeptor nicht den einzigen Rezeptor dar, der 1,25-Dihydroxyvitamin D zu binden und mit dem Vitamin D Transportprotein zu konkurrieren vermag. Folglich liegen auch andere Maßnahmen all das Biotin/Sepharosesystem zur Trennung von gebundenen und ungebundenem 1,25-Dihydroxyvitamin D im Bereich der Erfindung.
    • Industrielle Anwendbarkeit
  • Dieser Assay ermöglicht somit Ergebnisse, die innerhalb kurzer Zeit nach Erhalt der Probe zur Verfügung stehen und ermöglicht eine grobe Zahl von Assays, die zuverlässig mit geringen Kosten durchgeführt werden können.

Claims (12)

1. Ein kompetitiver Bindungsassay zur Bestimmung der Anwesenheit von 1,25 Dihydroxyvitamin D in einer Vitamin D Transportprotein enthaltenden Probe, der folgende Stufen einschließt:
Zugabe zu der Probe von einem Rezeptorprotein, welches sich an das 1,25-Dihydroxyvitamin D zu binden vermag, einem markierten 1,25-Dihydroxyvitamin D und einem Antikörper, der sich an das Rezeptorprotein zu binden vermag; und
Messung des relativen Ausmaßes der Bindung des Antikörpers an dem Rezeptorprotein, das an das markierte 1,25-Dihydroxyvitamin D gebunden ist.
2. Assay nach Anspruch 1, wobei das markierte 1,25- Dihydroxyvitamin D ein radiomarkiertes 1,25- Dihydroxyvitamin D ist.
3. Assay nach Anspruch 1 oder 2, wobei vor der Meßstufe das an dem erwähnten Antikörper gebundene Rezeptorprotein einer Immunoausfällung unterworfen wird.
4. Assay nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Probe menschliches Blut, menschliches Plasma oder menschliches Blutserum ist.
5. Assay nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Rezeptorprotein ein Schweinerezeptor ist.
6. Assay nach Anspruch 5, wobei der Antikörper ein Antikörper zum Schweinerezeptorprotein ist.
7. Assay nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Antikörper die Eigenschaften des Antikörpers aufweist, der durch das Hybridoma A.T.C.C. HB9496 erzeugt wird.
8. Ein kompetitiver Assay-Satz umfassend markiertes 1,25-Dihydroxyvitamin D, ein Rezeptorprotein, das sich an 1,25-Hydroxyvitamin D zu binden vermag, und einen Antikörper, der sich an das erwähnte Rezeptorprotein zu binden vermag, wobei der Antikörper an eine Ankerverbindung angefügt ist.
9. Satz nach Anspruch 8, wobei das markierte 1,25- Dihydroxyvitamin D radiomarkiert ist.
10. Satz nach Anspruch 8 oder 9, wobei das Rezeptorprotein ein Schweinerezeptorprotein ist.
11. Satz nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei der Satz weiterhin nicht-markiertes 1, 25-Dihydroxyvitamin D umfaßt und der Antikörper biotyniliert ist.
12. Satz nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei der Antikörper die Eigenschaften des Antikörpers aufweist, der durch das Hybridoma A.T.C.C. HB9496 erzeugt wird.
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