FR2678387A1 - Procede de dosage immuno-enzymatique de la vitamine b12 et de preparation d'un echantillon pour ce dosage. - Google Patents

Abstract

Procédé de dosage immuno-enzymatique de la vitamine B1 2 et procédé de préparation d'un échantillon pour ce dosage. Pour déceler une espèce biologique (vitamine B1 2 ), présente dans un échantillon d'essai sous forme liée à des protéines endogènes de liaison, on fait agir une base minérale et un thiol pour dénaturer les protéines et dégager l'espèce biologique, on ajoute un agent tampon et un agent de conversion des groupes sulfhydryles pour convertir en des groupes disulfures les groupes thiols éventuellement restants. On effectue ensuite une liaison séquentielle plutôt que compétitive de la vitamine B1 2 avec un excès de facteur intrinsèque puis la liaison de l'excès de vitamine B1 2 marquée par l'enzyme sur le reste de facteur intrinsèque et l'on immobilise ce facteur sur phase solide. On réalise ensuite une détermination optique du niveau d'activité enzymatique, de phase solide ou de solution.

Description

La présente invention se situe dans le domaines des

dosages immuno-enzymatiques et elle concerne plus particu-

lièrement les dosages de la vitamine B 12 En particulier, l'invention propose un procédé pour préparer un échantillon d'essai en vue d'un dosage immuno-enzymatique destiné à

déceler la présence d'une espèce biologique dans l'échan-

tillon, une partie au moins de cette espèce biologique étant fixée, si elle est présente dans l'échantillon d'essai, sur des protéines endogènes capables de réaliser

cette fixation et d'inhiber ledit dosage immuno-enzyma-

tique L'invention concerne également un procédé pour déterminer la quantité de vitamine B 12 présente dans un échantillon d'essai contenant cette vitamine en une gamme prédéterminée de concentration La vitamine B 12 est un composé organique du cobalt ayant un poids moléculaire de 1355,42 La vitamine B 12 n'est pas synthétisée dans le corps humain et elle doit être ingérée pour répondre aux besoins nutritionnels Il existe dans le corps plusieurs protéines endogènes à rôle de transport, qui contribuent à l'absorption de la vitamine B 12 à partir d'un aliment Parmi ces protéines, on peut citer les haptocorrines de la salive, qui fixent B 12 à mesure du dégagement de cette vitamine B 12 pendant la

digestion Une autre protéine à rôle de transport est cons-

tituée par du facteur intrinsèque, que l'on trouve dans le tube intestinal et qui transporte B 12, à travers la muqueuse intestinale, jusque dans le courant sanguin D'autres

protéines de transport sont constituées par des transcobal-

amines présentes dans le courant sanguin, qui fixent la vitamine B 12 et la délivrent aux tissus du corps qui en ont besoin Dans le courant sanguin, la vitamine B 12 est

présente sous forme d'hydroxy-, méthyl ou adénosyl cobal-

amine Ces dérivés se forment par remplacement du groupe cyano axial de la vitamine B 12 par le groupe fonctionnel respectif Les termes "B 12 " et "vitamine B 12 " tels qu'on les utilise ici, sont destinés à englober collectivement

l'ensemble de ces dérivés.

s Puisqu'une partie de la vitamine B 12 du sérum est fixée sur des protéines de liaison de fixation de type transcobalamine, tout dosage qui mesure la vitamine B 12 doit tout d'abord prétraiter l'échantillon pour obtenir la5 séparation de la vitamine B 12 d'avec ces protéines Une autre protéine gênante ou inhibante est constituée par de

l'anticorps de facteur anti-intrinsèque Quand il est présent, comme dans le cas d'échantillons provenant de patients souffrant de certains états d'anémie pernicieuse,10 cet anticorps doit également être dénaturé pendant un pré- traitement, puisqu'il va gêner ou inhiber tout dosage com-

pétitif éventuel utilisant le facteur intrinsèque comme protéine de liaison et de fixation de la vitamine B 12 ' Une étude détaillée de ces problèmes se trouve dans "Vitamin B 12 ", ouvrage édité sous la coordination de B Zagalak et W Friedrich chez Walter de Gruyter et Co, Berlin, 1979; '"B 12 Volume 1: Chemistry" et '"B 12 Volume 2 Biochemistry and Medicine" lB 12, volume 1: Chimie; et B 12 volume 2: Biochimie et aspect médicall,20 ouvrages édités sous la coordination de D Dolphin chez

John Wiley & Sons, New York, 1982.

Jusqu'à présent, les dosages les plus courants réa-

lisés pour la détermination des quantités de vitamine B 12 sont les dosages radio-immunologiques La plupart de ces méthodes utilisent du facteur intrinsèque fixé sur une phase solide et la compétition entre B 12, radiomarqué par

57 Co et la vitamine B 12 présente dans l'échantillon.

L'échantillon est prétraité par une méthode dite

"d'ébullition" ou par une méthode dite, "sans ébullition".

La méthode dite à ébullition comporte le chauffage à l'ébullition de l'échantillon en présence d'un thiol à p H 9,3 pour dénaturer les protéines liant par fixation la vitamine B 12 et les anticorps anti(facteur intrinsèque) Du cyanure de potassium est également inclus dans la solution de prétraitement pour convertir toutes les formes de la vitamine B 12 en de la cyanocobalamine Dans la méthode sans ébullition, on ajoute de l'hydroxyde de sodium et un thiol pour dénaturer les protéines endogènes de liaison et les anticorps anti(facteur intrinsèque) Du cyanure de potas- sium est ajouté également, comme dans le cas de la méthode appliquant un chauffage à l'ébullition Après un prétraite- 5 ment, on ajoute un agent de neutralisation pour abaisser le p H à 9,3 Ce système a été étudié en détail par Allen dans

les brevets US-A-4 188 189, US-A-4 351 822 et US-A-

4 451 571, qui notent la nécessité d'utiliser du facteur intrinsèque purifié dans un dosage par dilution de l'espèce

radiomarquée et du cobinamide en plus de la substance alca-

line et du thiol pour le prétraitement de l'échantillon

sans le soumettre à une ébullition.

Si les dosages immuno-enzymatiques sont connus depuis le début des années 1970 -voir, par exemple, E Engvall et P Perlmann, Immunochem 8:871 ( 1971) la sensibilité de la méthode n'a été suffisamment améliorée que récemment pour permettre de mesurer la vitamine B 12 à

des taux ou niveaux cliniquement significatifs (c'est-à-

dire en des quantités de l'ordre de picogrammes par mil-

lilitre/ pg/ml) Une telle amélioration a tout d'abord été publiée par L G Bachas, C D Tsalta et M E Meyerhoff dans Biotechniques 4:42-55 ( 1986), ces auteurs décrivant un dosage immunoenzymatique de la vitamine B 12 qui utilise du

facteur intrinsèque fixé sur des perles, avec de la B 12-

gluco-6-phosphate déshydrogénase comme sonde.

Depuis la publication de Bachas et ses collabora-

teurs, plusieurs condensés ont paru à propos des dosages immunologiques de la vitamine B 12 L'un de ces rapports, de C.C Wang, R R Charlton "An Enzymometric Assay for Vitamin

B 12 Using Magnetic Particles as Solid Support lDosage enzy-

mométrique de la vitamine B 12, avec utilisation de parti-

cules magnétiques comme support solidel, Clin Chem. 33:1963 ( 1987) décrit un dosage utilisant de la vitamine

B 12 couplée à du bioxyde de chrome, de la (facteur intrin-

sèque) galactosidase et de l'o-nitrophényl-f-D-galatoside comme substrat En mai 1989, une affiche a été présentée par Dworschack et collaborateurs a une réunion CLAS à Los Angeles, concernant un dosage utilisant la technologie "CEDIA"(R) du facteur intrinsèque comme protéine à rôle de liaison de la vitamine B 12 et un donneur de B 12- enzyme (un

donneur d'enzyme est un fragment, traité par génie géné-

tique, de P-galactosidase servant dans les dosages de type (R) CEDIA) comme analyte marqué R T Dworschack, D B Rosman, J.E Shindelman, D S Lingenfelter et P L Khanna "CEDIA B 12: A Homogeneous Enzyme-Based Ligand Binding Assay for Serum Vitamin B 12 lDosage avec liaison de fixation de

ligand à base d'enzyme, en milieu homogène, pour la déter-

mination de la vitamine B 12 dans du séruml, 15 ème rencontre nationale de la Clinical Ligand Assay Societyl (Los

Angelès; mai 1989) En 1989 également, Klukas et ses col-

laborateurs ont présenté un dosage immunologique de la vitamine B 12 avec chimioluminescence, utilisant du facteur intrinsèque lié à des particules magnétiques et à un

traceur ou marqueur de type B 12-ester d'acridinium.

C Klukas, M Williams, M Berg, P Kozel et T Hudson "A Chemiluminescence Receptor Assay for Vitamin B 12 " lDosage par chimioluminescence d'un récepteur de la vitamine B 12 l, Clin Chem 35:1194 ( 1989) En juillet 1990, Kuemmerle a présenté une autre version d'un dosage immuno-enzymatique

non isotopique de B 12 à une rencontre AACC à San Francisco.

Le dosage utilise les facteurs intrinsèques fixés sur une phase solide microsphérique polymère et un dérivé de la vitamine B 12 couplé ou relié à une enzyme permettant la détection S C Kuemmerle, G L Boltinghouse, S M Delby, T.L Lane, R P Simondsen "I Mx Assay for Vitamin B 12 lDosage "I Mx" de la vitamine B 12 l, Clin Chem 36:969

( 1990).

Peuvent éventuellement encore présenter de l'intérêt une demande de brevet internationale, publiée dans le cadre du traité de coopération sur les brevets (PCT), Oh, C S et collaborateurs(Beckman Instruments, Inc), W 089/12826, date de publication: 28 décembre 1989; et une demande de

brevet européen déposée par Hoyle et collaborateurs, EP-A 2-

0378197, publiée le ler octobre 1990, tous deux concernant des essais de dosage non isotopiques de la vitamine B 12 Le document Oh décrit un dosage immuno-enzymatique utilisant

du facteur intrinsèque traité par de la biotine (bioti-

nylé), de l'avidine-péroxydase de raifort et de la vitamine B 12 fixée sur une phase solide Le document Hoyle contient un dosage immunoenzymatique de la vitamine B 12 utilisant de

la streptavidine fixée sur une phase solide, de l'anti-

(vitamine B 12) monoclonale biotinylée et de la (vitamine

B 12)-peroxydase de raifort.

On peut également considérer que, dans le même cadre ou centre général d'intérêt de la présente invention, il existe un procédé d'amplification, récemment cité par C.H Self, dans le brevet EP-B 1-0 027 036, octobre 1988,qui

amplifie d'environ 100 fois le signal de l'enzyme de mar-

quage (phosphatase alcaline).

Un autre document se rapportant éventuellement au même sujet est constitué par une étude d'un système en phase solide pour des dosages de type "ELISA", dans laquelle de la streptavidine est fixée sur une protéine biotinylée qui, à son tour est adsorbée sur une plaque pour des microtitrages, comme décrit par M Suter,, J E Butler et J H Peterman, dans "The Immunochemistry of Sandwich

ELISAS-III The Stoichiometry and Efficacy of the Protein-

Avidin-Biotin Capture (PABC) System" lImmunochimie d'un

dosage ELISA-III en sandwich La stoéchiométrie et l'effi-

cacité du système de capture protéine-avidine-biotinel,

Molecular Immunol, 26:221-230 ( 1989).

Parmi ces procédés de l'art antérieur, on note

diverses difficultés et défauts Le procédé de prétrai-

tement "sans ébullition" de Allen, auquel on se réfère ci-

dessus, par exemple, utilise pour le traitement des réactifs qui sont potentiellement capables de dénaturer et de modifier d'une autre façon, de manière nuisible, les diverses enzymes et les protéines liantes pouvant servir

dans le dosage Cela va diminuer la précision et la repro-

ductibilité du dosage De même, la méthode d'amplification de Self, précitée, n'a pas été appliquée à des dosages de * -. la vitamine B 12, puisqu'elle exige l'utilisation d'une

vitamine B 12 marquée par de l'enzyme, laquelle a une affi-

nité de liaison bien inférieure à l'égard de protéines que

de la vitamine B 12 non marquée Cela a gêné le dévelop-

pement de dosage avec compétitivité pour une liaison, en particulier pour des dosages de la vitamine B 12 ' Une autre

difficulté encore provient du fait que l'aptitude du fac-

teur intrinsèque à se fixer sur la vitamine B 12 implique une modification de conformation du facteur intrinsèque, et

l'aptitude du facteur intrinsèque à subir une telle modifi-

cation varie avec les conditions opératoires Pour présenter le maximum d'activité de liaison, le facteur intrinsèque doit être en solution La présente invention vise à éliminer ces inconvénients et d'autres encore des

procédés de l'art antérieur.

Pour résumer l'invention, on pourrait indiquer que, selon un de ses aspects, les agents dénaturants dans la méthode de prétraitement sans ébullition de la vitamine B 12 sont retenus dans le mélange comportant l'échantillon après

utilisation, et ils sont combinés avec un agent de traite-

ment qui désactive les agents dénaturants sans avoir par lui-même un effet de dénaturation sur des protéines ou enzymes éventuellement ajoutées par la suite pour effectuer le dosage Le dosage peut ainsi être effectué sans que l'on doive enlever du mélange réactionnel l'un quelconque des

agents de traitement Puisque les agents dénaturants com-

prennent une base minérale ("inorganique") et un thiol, l'agent de traitement comprend un agent à rôle de tampon sous forme acide pour abaisser le p H de la base, et un agent pour convertir les groupes sulfhydryles du thiol et les faire passer à une forme non active comme des groupes disulfure ou alkylthio L'agent destiné à convertir les groupes sulfhydryles peut donc être un agent oxydant ou

bien un agent dralkylation.

Un autre aspect de la présente invention réside dans un protocole pour la réalisation du dosage lui-même, ce qui permet d'utiliser de la vitamine B 12 marqué par une enzyme sans subir l'inconvénient de la diminution de l'affinité de liaison avec une protéine par suite de la présence de l'enzyme ou de l'utilisation d'un dérivé de la vitamine B 12, et ce qui permet d'utiliser le facteur intrinsèque comme facteur de liaison, la réaction entre la vitamine B 12 et le facteur intrinsèque se déroulant entièrement en phase liquide Voici le déroulement de ce protocole: ( 1) Une fois que la vitamine B 12 contenue dans

l'échantillon a été débarrassée de la totalité des proté-

ines liantes endogènes, on fait réagir l'échantillon d'essai avec un excès de facteur intrinsèque biotinylé,

afin de former un complexe Cette réaction se passe entiè-

rement en solution dans la phase liquide.

( 2) On ajoute ensuite de la vitamine B 12 marquée par de l'enzyme, et l'on fait incuber la solution avec de la streptavidine en phase solide Le résultat de ce maintien ou de cette incubation est que le complexe formé dans l'étape ( 1), ainsi que le facteur intrinsèque biotinylé n'ayant pas réagi, deviennent tous deux immobilisés sur la phase solide par une interaction streptavidine-biotine, et le facteur intrinsèque biotinylé, immobilisé, qui n'a pas formé de complexe avec la vitamine B 12 provenant de l'échantillon d'essai se lie ou se fixe sur la vitamine B 12

marquée par de l'enzyme.

A ce stade, l'espèce immobilisée sur la phase solide comprend la vitamine B 12 provenant de l'échantillon plus une partie de la vitamine B 12 marquée par de l'enzyme,

cependant qu'une certaine quantité de la vitamine B 12 mar-

quée par de l'enzyme reste en solution On note que l'on

utilise une quantité de facteur intrinsèque biotinylé suf-

fisante pour que la majeure partie, sinon la totalité, de la vitamine B 12 de l'échantillon soit consommée à l'étape

( 1) et que la vitamine B 12 marquée par de l'enzyme con-

somme, dans l'étape ( 2), le reste du facteur intrinsèque biotinylé en ne déplaçant cependant sensiblement pas la

vitamine B 12 de l'échantillon qui est déjà liée ou fixée.

( 3) On sépare ensuite la phase solide et la phase

liquide, puis l'on détermine le niveau d'activité enzyma-

tique dans la phase solide ou bien dans la phase liquide et l'on relie ce résultat, à l'aide de courbes appropriées d'étalonnage, à la concentration de la vitamine B 12 dans

l'échantillon d'essai.

D'autres caractéristiques et avantages de l'inven-

tion apparaîtront à l'étude de la description qui va

suivre. La figure annexée est un graphique montrant une courbe de dose/réponse pour la détermination de la vitamine B 12 ' typique des résultats obtenus quand on utilise l'essai

de dosage selon la présente invention.

L'agent tampon servant dans le mélange soumis à traitement après dénaturation de l'échantillon d'essai peut être n'importe quel tampon pouvant être appliqué sous forme acide pour abaisser le p H jusqu'à un niveau acceptable pour le dosage, et qui va ensuite maintenir le p H à ce niveau ou à une valeur voisine de ce niveau pendant les réactions qui se succèdent pour le dosage Des exemples de tels tampons sont des tampons du type phosphates, des tampons du type borates, des tampons du type acétates, des tampons du type succinates et du tris(hydroxyméthyl)-aminométhane On préfère les tampons de type phosphates, en particulier du phosphate monobasique de sodium ou de potassium Le tampon sera choisi et ajusté selon les nécessités, et si cela s'avère nécessaire, pour donner à l'échantillon d'essai que l'on traite un p H se situant dans l'intervalle compris

entre environ 6,5 et environ 8,0, de préférence entre envi-

ron 7,0 et environ 7,4 Des quantités et méthodes pour

ajuster le p H sont bien connues de l'homme du métier.

Des oxydants destinés à désactiver le groupe sulfhy-

dryle du thiol seront constitués par n'importe quels agents oxydants de ce genrequi ont un potentiel d'oxydation et une vitesse de réaction suffisamment élevés pour réaliser l'oxydation des groupes sulfhydryles, mais ne suffisant pas pour que ces agents produisent par eux-mêmes une forte dénaturation quelconque de protéines et d'enzymes telles que celles devant être ajoutées au cours des étapes subsé- quentes du mode opératoire de dosage Des exemples de tels oxydants sont constitués par des sels du type iodates, 5 nitrites, bromates, dithionates et le réactif d'Ellman On préfère les sels du type iodates, en particulier l'iodate

de sodium et l'iodate de potassium.

Les agents d'alkylation destinés à désactiver le groupe sulfhydryle du thiol sont constitués par n'importe quels agents de ce genre capables de convertir les groupes sulfhydryles en des groupes alkylthio dans les conditions régnant dans l'échantillon d'essai après le prétraitement

de dénaturation Des exemples de tels agents sont consti-

tués par de l'acide iodoacétique, le méthylmaléimide, la

2-bromoéthylamine et le N-iodosuccinimide.

Les valeurs optimales de la concentration du tampon et de la concentration de l'agent oxydant ou de l'agent

d'alkylation devant servir dans n'importe quel mode opéra-

toire particulier de traitement selon la présente invention se situent bien dans le cadre de l'expérience du technicien expérimenté ou de l'homme du métier, et ces valeurs peuvent être facilement déterminées par une expérimentation de routine. Les matières destinées à servir à un prétraitement

dans le procédé sans ébullition de dénaturation des pro-

téines, et dont l'administration précède l'administration

de la combinaison d'un tampon et d'un agent de désactiva-

tion du groupe sulfhydryle, peuvent tre constitue et appliquées selon des méthodes connues, par exemple selon les brevets Allen précités des Etats-Unis d'Amérique, auxquels on pourra se référer pour plus de détails Des solutions typiques pour un prétraitement contiennent une base minérale comme l'hydroxyde de sodium ou de potassium, et un thiol comme le dithiothréitol, le P-mercaptoéthanol,

du thioglycolate, du thioglycérol ou l'acide 3-mercaptopro-

pionique Les agents le plus couramment utilisés sont l'hydroxyde de sodium et le dithiothréitol Des solutions typiques pour un prétraitement contiennent en outre du cyanure de potassium pour convertir toutes les formes de cobalamine en cyanocobalamine, ainsi que du cobinamide, qui

est un analogue de la vitamine B 12 ' sous forme de dicyano-

cobinamide, servant à saturer toutes les protéines capables de lier R. présentes dans l'échantillon, pour les empêcher de réaliser une réaction de remise en état ou de "renaturation" dans

cette étape et dans des étapes subséquentes La base miné-

rale et le thiol sont généralement conservés sous forme de solutions individuelles, l'une contenant la base plus le cyanure de potassium et le dicyanocobinamide, et l'autre

contenant le thiol et le chlorure de sodium.

Si les modes opératoires de prêtraitement, de neu-

tralisation et de désactivation sont décrits ici principa-

lement à propos de dosages de la vitamine B 12, ces opéra-

tions sont applicables de façon similaire à des dosages de détermination d'une large gamme d'espèces tendant à se lier ou se fixer sur des protéines endogènes quand elles sont présentes dans un échantillon biologique Dans cet aspect

de l'invention, l'espèce à détecter par l'essai de détermi-

nation qualitative ou quantitative (par le dosage) n'est

pas f ondamentale pour l'invention.

Pour une application de la présente invention à des essais de détermination et notamment à des dosages de la vitamine B 12, de tels dosages peuvent être effectués sur n'importe quel échantillon biologique fluide soupçonné de contenir de la vitamine B 12 et dont on cherche à déterminer la teneur en vitamine B 12 De tels dosages sont typiquement

effectués sur du plasma ou du sérum humain.

On peut utiliser des enzymes très diverses pour marquer la vitamine B 12 par une enzyme, ce qui comprend n'importe quelle enzyme pouvant servir de marqueur dans un procédé de détection L'homme du métier, familier des dosages immunologiques, connaît de nombreuses enzymes de ce genre et des substrats pour leur détection Une enzyme préférée est de la phosphatase alcaline, et un procédé préféré de détection consiste en la méthode de Self pour il amplifier un signal d'enzyme, ce qui est décrit dans la demande de brevet européen précitée à laquelle on pourra se référer. Un procédé typique impliquant de la phosphatase alcaline utilise comme substrat du P-nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (P-NADPH) sous forme réduite La phosphatase alcaline clive le groupe phosphate pour former du P-nicotinamide adénine dinucléotide, (P-NADH) sous forme réduite Cela est suivi par l'addition d'un réactif de développement de couleur composé de diaphorase, de violet

d' iodonitrotétrazolium (INT), d'éthanol et d'alcool déshy-

drogénase Seul le produit clivé, le Y-NADH, formé au cours de l'étape d'incubation du substrat, peut amorcer le cycle d'amplification de signal Le A-NADH est oxydé en A-NAD par la diaphorase avec réduction simultanée de INT en un produit coloré (mesurable à 490 nm) Pour achever le cycle, l'alcool déshydrogénase réduit simultanément 3- NAD en

C-NADH et oxyde l'éthanol en acétaldéhyde Le cycle com-

mence alors à nouveau, et la vitesse à laquelle la couleur est engendrée dépend de la quantité de A-NADH présente à l'origine. Comme indiqué ci-dessus, ce mode opératoire de détection peut être effectué sur la phase solide ou la phase liquide Pour des modes opératoires appliqués à de la phase solide, on place la phase solide en contact avec des

solutions liquides du substrat et d'autres agents de détec-

tion, et l'on observe et quantifie les variations de cou-

leur se produisant dans ces solutions Pour des modes opé-

ratoires appliqués à des phases liquides, on combine la phase liquide avec des solutions liquides du substrat et d'autres agents de détection, et l'on observe et quantifie

d'une manière similaire les variations de la couleur.

La phase solide peut avoir n'importe quelle configu-

ration qui est convenable et appropriée pour les modes opératoires impliqués dans le dosage Des exemples sont représentés par des perles, des tubes à essai et des

plaques pour microtitrages.

La formation des autres réactifs utilisés dans le dosage est réalisée par des moyens traditionnels décrits dans la littérature Pour former une vitamine B 12 marquée

par de la phosphatase alcaline, par exemple, on effectue une hydro-

lyse acide des groupes propionamides du noyau corrine de la vitamine B 12 Cela est suivi de la réaction de l'acide B 12 - monocarboxylique avec le N-hydroxysuccinimide (NHS) en présence de dicyclohexylcarbodiimide dans un système anhydre de solvants aprotiques Cela aboutit à la formation10 d'un ester de NHS de l'acide B 12 -monocarboxylique, qu'on

laisse ensuite réagir avec les groupes amines de la phos-

phatase alcaline en milieu aqueux.

On prépare de façon analogue, par des modes opéra-

toires connus, du facteur intrinsèque biotinylé, un tel procédé impliquant l'utilisation de 6-(biotinamido)

hexanoate de sulfosuccinimidyle comme agent de biotinyla-

tion On peut ajuster la concentration du facteur intrin-

sèque biotinylé utilisé dans le dosage de façon à obtenir une courbe dose/réponse ayant la plus grande sensibilité dans la gamme, intéressante pour un diagnostic, prévue pour l'essai de dosage Un tel ajustement se situe bien dans le cadre des connaissances du technicien expérimenté dans le domaine des dosages immunologiques, et cela est facilement déterminable par une expérimentation de routine Le facteur intrinsèque est spécifique pour une réaction avec B 12, et

il ne participe pas à une réaction croisée avec du cobi-

namide ou avec d'autres analogues de la vitamine B 12.

On réalise commodément l'immobilisation de la strep-

tavidine sur une phase solide, comme une plaque pour microti-

trage, en provoquant l'adsorption d'une protéine de support, biotinylée, sur une plaque pour microtitrages,puis en laissant la streptavidine se lier ou se fixer à la

plaque comportant la protéine biotinylée.

Un "kit" ou une trousse pour un tel dosage, compre-

nant tous les constituants nécessaires pour le dosage, va typiquement inclure les produits suivants: 1 Produits de base Cyanocobalamine Sérum albumine humaine Chlorure de sodium Azoture de sodium 2 Solution de conjugué d'enzyme Conjugué B 12-phosphatase alcaline Chlorhydrate de triéthanolamine Azoture de sodium Chlorure de sodium Chlorure de magnésium Sulfate de zinc heptahydraté Sérum albumine humaine Polyéthylèneglycol 8000 "Tween 20 " 3 Solution de conjugué de protéine liante Conjugué biotine/facteur intrinsèque Chlorhydrate de triéthanolamine Azoture de sodium Chlorure de sodium Chlorure de magnésium Sulfate de zinc heptahydraté Sérum albumine humaine Polyéthylèneglycol 8000 "Tween 20 " 4 Agent de neutralisation Iodate de potassium Phosphate monobasique de potassium monohydraté Solution pour prétraitement, partie A Hydroxyde de sodium Cyanure de potassium Dicyanocobinamide 6 Solution pour prétraitement, partie B Dithiothréitol Chlorure de sodium gamme en pg/ml 7 % 0,9 % 0,1 % m M 0,1 %

0,85 %

1 m M 0,1 m M 1 % %

0,05 %

m M 0,1 %

0,85 %

1 m M 0,1 m M 1 % %

0,05 %

m M 260 m M 1 M vg/ml 1 pg/ml mg/ml m M 7 Tampon de lavage, p H 7,4 Chlorhydrate de triéthanolamine 10 m M Chlorure de sodium 0,88 % "Tween 20 " 0,05 % "Kathon CG" ou "Pro Clin 150 " 0, 06 % 8 Plaques pour microtitrages, pour prétraitement

Plaques en polystyrène pour des microti-

trages à blanc 9 Plaques pour microtitrages de dosage

Plaques en polystyrène pour des microti-

trages, revêtues par de la sérum albumine

de bovin/biotine avec fixation de strepta-

vidine Substrat lyophilisé

nicotinamide adénine dinucléotide phos-

phate (forme réduite) 11 Diluant du substrat, p H 9,5 Diéthanolamine 50 m M Ethanol 4 % Chlorure de magnésium 1 m M Azoture de sodium 0,02 % "Tween 20 " 0,1 % 12 Amplificateur lyophilisé Alcool déshydrogénase Diaphorase 13 Diluant pour amplificateur

Phosphate de sodium monobasique, monohy-

draté 1 m M Azoture de sodium 0,02 % Ethylèneglycol (sur base volumétrique) 8 % Violet d'iodonitrotétrazolium 2 m M On voit donc que, pour préparer un échantillon d'essai en vue d'un dosage immunoenzymatique pour déceler la présence éventuelle d'une espèce biologique dans

l'échantillon, une partie au moins de ladite espèce biolo gique étant, si elle est présente dans l'échantillon, liée à des protéines

endogènes de fixation, capables de gêner ou d'inhiber ce dosage immunoenzymatique,l'invention propose un procédé comprenant: (a) la combinaison dudit échantillon d'essai avec une base minérale et avec un thiol pour former un premier mélange; (b) le maintien "en incubation" de ce premier mélange pour que la base organique et le thiol dénaturent les protéines endogènes de liaison éventuellement présentes dans l'échantillon d'essai et pour provoquer ainsi le déga-10 gement de l'espèce biologique,éventuellement présente dans l'échantillon d'essai, pour séparer cette espèce des protéines endogènes de liaison, ce qui forme un second mélange; et (c) la combinaison de ce second mélange avec (i) un agent à rôle de tampon, sous forme acide, et

(ii) un agent de conversion des groupes sulfhy-

dryles, choisi dans l'ensemble consistant en des oxydants ayant un potentiel électrochimique d'un niveau choisi pour oxyder les composés sulfhydryliques éventuellement présents dans le premier mélange et donner les disulfures tout en

évitant quasi-totalement une dénaturation d'autres proté-

ines qui ne sont pas déjà dénaturées, et des agents d'alky-

lation, pour abaisser le p H du second mélange et le porter à une valeur comprise entre 6,5 et 8,0, et pour convertir les groupes thiols éventuellement présents et qui demeurent

dans ce mélange en des groupes disulfures.

Pour déterminer la quantité de vitamine B 12 présente dans un échantillon d'essai contenant cette vitamine B 12 en une gamme prédéterminée de concentrations, l'invention propose donc un procédé comprenant: (a) la dissociation, par le procédé de préparation ci-dessus notamment, de la totalité de la vitamine B 12 ' présente dans ledit échantillon d'essai, pour la séparer de toutes les protéines qui y sont éventuellement liées; (b) la combinaison de l'échantillon d'essai avec du facteur intrinsèque biotinylé dans une première solution, ce facteur intrinsèque biotinylé étant présent en excès par rapport à la valeur maximale de la gamme prédéterminée précitée, et l'incubation de cette première solution pour obliger la quasi-totalité de la vitamine B 12 présente dans l'échantillon à se combiner avec du facteur intrinsèque biotinylé, pour former un complexe; (c) la combinaison de cette première solution avec de la vitamine B 12, marquée par une enzyme, dans une seconde solution, en présence de streptavidine immobilisée sur un phase solide, ladite vitamine B 12 marquée par une

enzyme et la streptavidine étant chacune en excès par rap-

port au facteur intrinsèque biotinylé de l'étape (b), et le maintien en incubation de cette seconde solution et de la streptavidine pour obliger le complexe et le facteur intrinsèque biotinylé, dépourvu de vitamine B 12, dans cette seconde solution à se lier à la streptavidine et pour obliger le facteur intrinsèque biotinylé, dépourvu de vitamine B 12 dans la seconde solution, à se complexer par fixation sur la vitamine B 12 marquée par une enzyme; (d) la séparation de ladite phase solide d'avec la seconde solution; et (e) la détermination du niveau d'activité d'enzyme

de la phase solide ou de la seconde solution.

Les exemples qui suivent sont présentés à titre

illustratif et nullement limitatif.

EXEMPLE l Biotinylation du facteur intrinsèque Dans un ballon pour réaction, on a placé 200 pl d'une solution contenant 0,5 mg de facteur intrinsèque par millilitre, 166 pl d'eau désionisée et 50 1 l de bicarbonate

de sodium 1 M Séparément, on a formé une solution en dis-

solvant 5 mg de 6-(biotinamido)-hexanoate de sulfosuccini-

midyle dans 1 ml d'eau désionisée Immédiatement après formation de cette solution, on a ajouté tout en agitant une partie ( 56 pl) de la solution de biotine à la solution du facteur intrinsèque On a laissé le mélange réactionnel obtenu réagir à 4 'C durant 16 h. Au bout de cette période, on a ajouté 100 pl d'une solution contenant 1 % de sérum albumine humaine, 10 m M TBS/ azoture, c'est-à-dire l 10 m M de trishydroxyméthylaminométhane, 0,85 % de

chlorure de sodiumi et 0,1 O d'azoture de sodium à p H 7,4.

On a lavé la solution résultante six fois en utilisant un microconcentrateur "Centricon 30 " et 10 m M de TBS/azoture Le tampon pour lavage contenait 10 m M de triéthanolamine, 0,88 % de chlorure de sodium, 0,05 % de "Tween 20 " et 0,06 % de Kathon CG, p H 7,4 Après le lavage, le volume de la solution avait augmenté pour atteindre 1 ml et l'on a ajouté un égal volume de diluant du conjugué Le diluant de

conjugué contenait 10 m M de triéthanolamine, 0,1 % d'azo-

ture de sodium, 0,85 % de chlorure de sodium, 1 m M de chlo-

rure de magnésium, 0,1 m M de sulfate de zinc heptahydraté, 1 % de sérum albumine humaine, 5 % de polyéthylèneglycol et

0,05 % de "Tween 20 ", p H 7,4.

EXEMPLE 2

Couplage de la vitamine B 12 sur de la phosphatase alcaline Avant de pouvoir coupler la vitamine B 12 à de la phosphatase alcaline, il faut tout d'abord obtenir un dérivé de cette vitamine, par hydrolyse acide des groupes propionamides fixés sur le noyau corrine On y est parvenu en ajoutant tout d'abord 600 mg de vitamine B 12 à 12 ml

d'acide chlorhydrique 0,1 M On a agité la solution à l'obs-

curité à la température ambiante durant 72 h Au bout de ce temps, on a ajusté le p H à 4,0 à l'aide d'hydroxyde de sodium 1 M. On a ensuite appliqué le mélange réactionnel à une

colonne d'alumine, que l'on a éluée ensuite avec de l'eau.

La matière non hydrolysée a traversé la colonne, cependant

que les acides monocarboxylique, dicarboxylique et tricar-

boxylique étaient retenus On a élué l'acide monocarboxy-

lique à l'aide d'hydroxyde d'ammonium 0,l M On a regroupé les fractions contenant le mélange voulu des isomères b, d et e de l'acide B 12monocarboxylique, on a concentré et acidifié jusqu'à p H 4,0 On a ensuite soumis le produit à une extraction faisant passer ce produit dans du phénol à % On a ajouté de l'éther aux extraits phénoliques Puis l'on a soumis la couche phénol/éther à de l'extraction effectuée avec de l'eau désionisée, le produit demeurant dans la couche aqueuse On a lavé à l'éther l'extrait aqueux combiné On a soumis la couche aqueuse finale à

lyophilisation, ce qui a donné 65 mg d'un mélange des iso-

mères b, d et e de l'acide monocarboxylique de la vitamine B 12-

On a ensuite formé l'ester actif de N-hydroxysucci-

nimide de la vitamine B 12 que l'on a fait réagir avec de la phosphatase alcaline Pour y parvenir, on a dissous 20 mg d'acide B 12monocarboxylique, 22 mg de N-hydroxysuccinimide et 40 mg de 1,3dicyclohexylcarbodiimide dans 700 pl de N,N-diméthylformamide anhydre On a soumis la solution résultante à 16 h d'agitation à l'obscurité à 4 C Puis l'on a centrifugé la solution et l'on a jeté le culot de centrifugation. A 1,27 mg de phosphatase alcaline d'intestin de veau, dans 5,86 ml d'un tampon de phosphate 0,l M, contenant 0,l M de chlorure de sodium, à p H 7,4, on a ajouté 140 pl ( 4,69 mg) de la partie surnageante de la solution contenant l'ester actif dérivé de la vitamine B 12 On a soumis le mélange à 16 h d'agitation à l'obscurité à 4 C Au bout de cette période de temps, on a dialysé le mélange réactionnel contre 50 m M de tris, 0,1 % d'azoture de sodium, 0,1 M de chlorure de sodium, 1 m M de chlorure de magnésium et 0,1 m M de chlorure de zinc, p H 7,6, comportant 0,1 % de "Norit A"

(charbon actif) On a purifié le conjugué par chromatogra-

phie de liquide sous haute pression, en utilisant une

colonne réalisant une exclusion en fonction de la taille.

EXEMPLE 3

Préparation de plaques pour microtitrages revêtues de streptavidine

La préparation de plaques pour microtitrages, revê-

tues de streptavidine, exige l'utilisation d'une protéine de support biotinylée Pour cet exemple, la protéine de support ou de substrat a été de la sérum albumine de bovin (SAB) On a préparé une solution en dissolvant 100 mg de SAB dans un mélange formé de 10 ml de bicarbonate de sodium

1 M et 9 ml d'eau désionisée On a ensuite préparé une solu-

* tion de biotine en dissolvant 79,5 mg de 6-(biotinamido) hexanoate de sulfosuccinimidyle dans 1 ml d'eau désionisée. Immédiatement après sa formation, on a ajouté la solution de biotine, en agitant, à la solution de SAB On a laissé la solution résultante reposer durant 16 h à 4 O C, puis on l'a lavée en utilisant un microconcentrateur "Centricon 30 " et une solution saline tamponnée par du phosphate 10 m M,

contenant 0,1 % d'azoture de sodium à p H 7,4.

On a dilué la solution de biotine/sérum-

albumine de bovin à 2,5 pg/ml en utilisant une

solution saline tamponnée par du phosphate 10 m M, p H 7,4.

On a ensuite placé dans les creux d'une plaque pour micro-

titrages 100 pil, par creux, de cette solution, et l'on a fait incuber la plaque en la maintenant durant la nuit à la température ambiante Le jour suivant, on a lavé la plaque avec du tampon de lavage On a dissous la streptavidine dans une solution contenant 1 % de sérum albumine de bovin, m M de solution saline tamponnée par du phosphate, ce qui

a donné une concentration finale de 4 pg/ml Cette opéra-

tion a été suivie de l'addition de cette solution dans les creux de la plaque pour microtitrages, à raison de 100 pl

par creux On a ensuite fait incuber la plaque en la con-

servant durant la nuit à la température ambiante Le jour suivant, on a lavé la plaque avec du tampon pour lavage, et l'on a ajouté une solution à 5 % de saccharose dans de la solution saline tamponnée par du phosphate, 10 m M, l'addition étant effectuée à raison de 100 pul par creux, à p H 7,4 On a ensuite fait incuber la plaque en la conservant durant la nuit à la température ambiante Le jour suivant, on a

décanté la solution et l'on a soumis la plaque à du tampon-

nement pour la sécher La plaque a été conservée dans un

sachet en matière plastique comportant un agent de dessic-

cation à 4 OC.

EXEMPLE 4 Protocole de dosage de la vitamine B 12 et résultats obtenus Dans chaque creux d'une plaque pour microtitrages, non revêtue, on a placé 30 p Il de solution de produit de base ou solution titrée, de produit témoin ou d'échantil- lon, puis l'on a ajouté 60 pl d'un mélange à 1:1 de la

solution A de prétraitement et de la solution B de prétraite-

ment Voici en quoi consistait ces solutions de prétraitement: Solution A de prétraitement: 1 n M d'hydroxyde de sodium, 100 pg/ml de cyanure de potassium et 1 pg/ml de dicyanocobinamide

Solution B de prétraitement: 20 mg/ml de dithio-

thréitol et 10 m M de chlorure de sodium.

On a ensuite secoué brièvement la plaque, on l'a recouverte et placée dans un incubateur de maintien à 37 'C durant 20 min Puis l'on a ajouté 150 p l d'une solution d'agent de neutralisation, consistant en 100 m M d'iodate de potassium et 260 m M de phosphate de potassium monobasique, puis l'on a ajouté 30 pll de protéine liante On a ensuite secoué brièvement à nouveau la plaque, on l'a recouverte et placée dans un incubateur de maintien à 37 'C durant min. Dans chaque creux d'une plaque pour microtitrages, revêtue de streptavidine/biotine- sêrum albumine de bovin, on a placé 35 pul du conjugué d'enzyme, en utilisant une pipette à canaux multiples, puis l'on a placé 70 pi de la solution titrée ou de base, de la solution témoin ou d'un échantillon ayant subi du prétraitement On a ensuite secoué la plaque brièvement, on l'a recouverte et placée dans un incubateur de maintien à 37 'C durant 30 min Puis l'on a lavé la plaque et on l'a tamponnée pour la sécher,

et l'on a ajouté de la solution de substrat ( 100 pl/creux).

On a de nouveau secoué la plaque brièvement, on l'a recou-

verte et placée dans un incubateur de maintien à 37 'C durant 30 min Enfin, on a ajouté 100 pl de la solution d'amplificateur dans chaque creux On a lu ensuite, sur un lecteur de plaque pour microtitrages, la vitesse ou le taux

de variation de densité optique à 490 nm.

La figure annexée est un graphique de la courbe de réponse à une dose, que l'on obtient en mettant en pratique ce protocole de dosage L'axe vertical, ou axe des ordonnées, représente la vitesse de développement de la couleur, en des milli-unités de densité optique par minute (MDO/minute), cependant que l'axe horizontal (axe des abscisses) représente la concentration en vitamine B 12 ' en

picogrammes par millilitre (pg/ml).

Il va de soi que l'invention n'a été décrite ci-

dessus qu'à titre illustratif et nullement limitatif et qu'elle est susceptible de recevoir diverses variantes

entrant dans son cadre et dans son esprit.

On notera que la technologie "CEDIA"t (, utilisée par Microgenies Corporation pour des dosages immunologiques, a

été décrite par R T Devorschack à la 15 e rencontre nationa-

le de la Clinical Ligand Assay Society en 1989 Cette tech-

nologie utilise deux protéines recombinantes qui ressemblent

à des fragments de l'enzyme (>-galactosidase Le gros frag-

ment E-A (enzyme-accepteur) et le petit fragment E-D (enzyme-

donneur) peuvent se recombiner spontanément pour former un

complexe La fixation covalente d'un dérivé de cyanoco-

balamine sur ED n'a pas d'effets adverses sur la liaison EK et ED-B 12, ou sur l'affinité du facteur intrinsèque (FI) pour l'antigène La liaison de complément avec EA est bloquée

quand ED-B 12 est fixe sur FI L'activité d'enzyme est ain-

si proportionnelle au taux de B 12 dans le sérum.

"Kathon Cg"R est un conservateur, également appelé "Pro Clin 150 ", (R), développé par Rohm & Haas pour maîtriser et éviter une croissance microbienne dans des milieux et

réactifs pour dosages biologiques.

Claims (6)

REVENDICATIONS

1 Procédé pour préparer un échantillon d'essai en vue d'un dosage immunoenzymatique permettant de déceler la présence d'une espèce biologique, procédé dans lequel au5 moins une partie de cette espèce biologique est, si elle

est présente dans cet échantillon d'essai, liée par fixa-

tion sur des protéines endogènes à rôle de liaison capables d'intervenir dans ce dosage immunoenzymatique, procédé caractérisé en ce qu'il comprend: (a) la combinaison de l'échantillon d'essai avec une base minérale et avec un thiol pour former un premier mélange; (b) le maintien en incubation de ce premier mélange pour obliger la base organique et le thiol à dénaturer des

protéines endogènes, à rôle de liaison, qui seraient éven-

tuellement présentes dans l'échantillon d'essai et à dégager ou libérer ainsi l'espèce biologique éventuellement présente dans l'échantillon d'essai pour la séparer des protéines endogènes à rôle de liaison, en formant ainsi un second mélange; et (c) la combinaison de ce second mélange avec (i) un agent à rôle de tampon chimique, sous forme acide, et (ii) un agent de conversion de groupe sulfhydryle, cet agent étant choisi dans l'ensemble consistant en ( 1) des agents oxydants ayant un potentiel électrochimique d'un

niveau choisi permettant d'oxyder tous les composés sulfhy-

drylés éventuellement présents dans le premier mélange pour donner des disulfures tout en évitant quasi-totalement de

dénaturer d'autres protéines qui n'étaient pas déjà déna-

turées, et ( 2) des agents d'alkylation, pour abaisser le p H de ce second mélange et le porter à une valeur comprise entre environ 6,5 et environ 8,0, et pour convertir,en des groupes disulfures, tous les groupes thiols éventuellement demeurés dans le second mélange. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape (c) comprend l'abaissement du p H à une

valeur comprise entre environ 7,0 et environ 7,4.

3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent de tamponnement chimique ou agent tampon est choisi parmi un tampon du type phosphate, un tampon du type

borate, un tampon du type acétate, un tampon de type succi-

nate et du tris(hydroxyméthyl)aminométhane.

4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent destiné à convertir les groupes sulfhydryles est un agent oxydant choisi parmi un iodate, un nitrite, un

bromate, un dithionate et le réactif d'Ellman.

Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la base minérale est choisie parmi de l'hydroxyde de sodium et de l'hydroxyde de potassium, et en ce que ledit

thiol est choisi parmi le dithiothréitol, le p-mercapto-

éthanol, du thioglycolate, du thioglycérol et l'acide 3mercaptopropionique. 6 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la base minérale est l'hydroxyde de sodium, le thiol est le dithiothréitol, l'agent formant tampon chimique est

un tampon de type dihydrogénophosphate (phosphate monoba-

sique) et l'agent destiné à convertir des groupes sulfhy-

dryles est un iodate.

7 Procédé pour déterminer la quantité de vitamine B 12 présente dans un échantillon témoin contenant de la

vitamine B 12, en une gamme prédéterminée de la concentra-

tion, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend: (a) la dissociation de la totalité de la vitamine B 12, présente dans l'échantillon d'essai, pour la séparer de toutes les protéines qui lui sont éventuellement liées; (b) la combinaison de cet échantillon d'essai avec

du facteur intrinsèque biotinylé, dans une première solu-

tion, ce facteur intrinsèque biotinylé étant présent en une quantité excédant le maximum de ladite gamme prédéterminée, et le maintien en incubation de cette première solution pour provoquer la combinaison de la quasi-totalité de la vitamine B 12 présente dans la première solution avec du facteur intrinsèque biotinylé, pour former un complexe; (c) la combinaison de la première solution avec de la vitamine B 12, marquée par de l'enzyme, dans une seconde solution, en présence de streptavidine immobilisée sur une phase solide, ladite vitamine B 12 marquée par de l'enzyme et la streptavidine étant chacune présentes en une quantité excédant celle du facteur intrinsèque biotinylé de l'étape (b), et le maintien en incubation de cette seconde solution

et de la streptavidine pour provoquer la liaison par fixa-

tion du complexe et du facteur intrinsèque biotinylé, dépourvu de vitamine B 12 ' de la seconde solution sur la streptavidine et pour provoquer la complexation du facteur intrinsèque biotinylé, dépourvu de vitamine B 12, de la seconde solution sur la vitamine B 12 marquée par de l'enzyme; (d) la séparation de la phase solide d'avec la seconde solution; et

(e) la détermination du niveau d'activité enzyma-

tique de la phase solide ou bien de la seconde solution.

8 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'on effectue les étapes (b) et (c) à un p H compris

entre environ 7,0 et environ 8,0.

9 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'enzyme de la vitamine B 12 marquée par une enzyme

est de la phosphatase alcaline.

Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'étape (a) comprend: (i) la combinaison de l'échantillon d'essai avec une base minérale et un thiol et le maintien en incubation du mélange résultant, pour obliger la base organique et le thiol à dénaturer toutes les protéines endogènes de liaison éventuellement présentes dans l'échantillon d'essai et pour dégager ainsi toute la vitamine B 12 qui y serait liée; et (ii) la combinaison du mélange résultant de l'étape (i) avec 1) un agent formant tampon chimique, sous forme acide, et 2) un agent de conversion de groupe sulfhydryle, choisi parmi (a) des agents oxydants ayant un potentiel électrochimique d'un niveau choisi pour oxyder tous les composés sulfhydrylés éventuellement présents dans le premier mélange et donner des disulfures tout en évitant quasi-totalement de dénaturer d'autres protéines qui ne sont pas déjà dénaturées, et (b) des agents d'alkylation, pour abaisser le p H de ce second mélange et le porter à une valeur comprise entre environ 6,5 et environ 8,0 et pour convertir en des groupes disulfures tous les groupes thiols demeurant éventuellement dans le second mélange.