JPH07104348B2 - Ｂ１２酵素イムノアッセイ及びサンプルの予備処理 - Google Patents

Ｂ１２酵素イムノアッセイ及びサンプルの予備処理

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JPH07104348B2
JPH07104348B2 JP4169063A JP16906392A JPH07104348B2 JP H07104348 B2 JPH07104348 B2 JP H07104348B2 JP 4169063 A JP4169063 A JP 4169063A JP 16906392 A JP16906392 A JP 16906392A JP H07104348 B2 JPH07104348 B2 JP H07104348B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はビタミンＢ12のためのア
ッセイの領域に焦点を有する酵素イムノアッセイの分野
に関する。
【０００２】
【従来の技術】ビタミンＢ12は分子量1355.42 の有機−
コバルト化合物である。ビタミンＢ12は人体においては
製造されないが、しかし我々の栄養的要求を満たすため
には摂取されなければならない。食品からのＢ12の吸収
に役立つ体内における複数の内因性輸送タンパク質が存
在する。それらの中には消化の際に遊離されるＢ12と結
合するだ液中のハプトコリン(haptocorrin) が含まれ
る。他の輸送タンパク質は、Ｂ12を腸粘膜を介して血流
へと輸送せしめる、腸管に見い出せる内因子である。更
なる輸送タンパク質はＢ12と結合し、そしてそれを必要
とする体の組織へと運ぶ、血流中におけるトランスコバ
ラミン（transcobalamin) である。血流中において、Ｂ
12はヒドロキシ−、メチル−又はアデノシルコバラミン
として存在する。これらの誘導体はＢ12の中心シアノ基
を対応の官能基と交換せしめることにより形成される。
本明細書で用いる「Ｂ12」及び「ビタミンＢ12」なる語
はこれら全ての誘導体を集約的に包括する。
【０００３】血清中におけるＢ12の一部はトランスコバ
ラミン結合性タンパク質と結合しているため、Ｂ12を測
定するあらゆるアッセイはまずＢ12をこれらのタンパク
質から遊離させるためのサンプルの予備処理を必要とす
る。更なる妨害タンパク質は抗内因子抗体である。この
抗体が存在している場合（それらは悪性貧血のある症状
に苦しむ患者のサンプル中にある）、これは予備処理の
際に変性もされなければならない。その理由はこのよう
な抗体は、内因子をＢ12結合性タンパク質として利用す
るあらゆる競合アッセイに妨害しうるからである。ビタ
ミンＢ12において見い出せるこれらの問題の詳細な説明
は、B.Zagalak と W.Friedrich (Walterde Gruyter & C
o., Berlin, 1979)., B12 第１巻： Chemistry and B
12 第２版： Biocemistry and Medicine, D.Dolphin
(John Wiley & Son, New York, 1982) に見い出せる。
【０００４】今日迄の最も一般的なビタミンＢ12につい
てのアッセイはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）であ
る。これらの方法のほとんどは固相に結合している内因
子及びサンプル中のＢ12と競合する57Ｃo により放射性
標識されたＢ12を利用する。このサンプルは「煮沸」方
法又は「非煮沸」方法のいずれかにより予備処理する。
煮沸方法はチオール化合物の存在下において pＨ９．３
にてサンプルを煮沸し、Ｂ12結合性タンパク質及び抗内
因子抗体を変性せしめることを含んでいる。全ての型の
Ｂ12をシアノコバラミンに変換せしめるためにシアン化
カリウムもこの予備処理溶液に含ませる。非煮沸方法に
おいては、内因性結合性タンパク質及び抗内因子抗体を
変性させるために水酸化ナトリウムとチオール化合物を
加える。煮沸方法と同様に、ここでもシアン化カリウム
を加える。予備処理後、中和剤を加えて pＨを９．３に
下げる。この系は Allenにより、米国特許第４，１８
８，１８９号、第４，３５１，８２２号及び第４，４５
１，５７１号に詳細に調べられており、これらは放射性
希釈アッセイにおいて精製した内因子を必要とし、そし
て非煮沸サンプルの予備処理のためにアルカリ及びチオ
ールの他にコビナミド（cobinamide) の利用を必要とす
ることを示している。
【０００５】酵素イムノアッセイは１９７０年代の初期
頃から知られているが（例えば Engvall, E., と Perlm
ann, P. の Immunochem.８：871 (1971)を参照のこ
と）、この方法の感度は最近になってようやく改善され
て臨床的に有意なレベルに迄Ｂ12を測定することができ
るようになった（即ち、pg/mL)。このような改良は Bac
has, L.G. 、Tsalta, C.D.及び Meyerhoff, M.E らによ
り、Biotechniques ４：42−55 (1986) においてまず公
開された。彼らはプローブとしてのＢ12−グルコース−
６リン酸デヒドロゲナーゼと一緒に、ビーズに結合した
内因子を利用するＢ 12酵素イムノアッセイを詳細してい
る。
【０００６】Bachasらの公開以来、複数の論文がＢ12イ
ムノアッセイに関連して出されている。そのうちの１
つ、Wang C.C., Charlton, R.R. の“An Enzymometric
Assayfor Vitamin B12 Using Magnetic Particles as S
olid Support" Clin. Chem.33 : 963 (1987) には、二
酸化クロムに結合せしめたＢ12、内因子−β−ガラクト
シダーゼ及び基質としてのＯ−ニトロフェニル−β−Ｄ
−ガラクトシダーゼを利用するアッセイが詳細されてい
る。１９８９年５月において、ロサンゼルスのＣＬＡＳ
会場にて Dworschack により、Ｂ12結合性タンパク質と
して内因子及び標識分析物としてＢ12酵素ドナー（酵素
ドナーはＣＥＤＩＡアッセイにおいて利用されるβ−ガ
ラクトシダーゼの遺伝子操作フラグメントである）を伴
うＣＥＤＩＡ技術を利用するアッセイに関するするポス
ターが紹介された（Dworschack,R.T., Rosman、 D.B.,
Shidelman, J.E.、 Lingenfelter, D.S. 及び Khanna,
P.L. の“ＣＥＤＩＡ Ｂ12： A Homogeneous Enzyme-B
ased Ligand Binding Assay for Serum Vitamin B
12 "、Clinical Ligand Assay Society 第１５回国際会
議（1989年５月；ロサンゼルス）。更に１９８９年にお
いて、Klukasらは磁性粒子に結合している内因子及びＢ
12−アクリジニウムエステルトレーサーを利用するケミ
ルミネッセントＢ12イムノアッセイを紹介している（Kl
ukas, C.、Williams, M.、Berg, M.、Kozel, D. 及び H
udson, T. "A Chemiluminescence Receptor Assay for
Vitamin B12," Clin. Chem. 35：1194 (1989))。１９９
０年７月において、Kuemmerle はサンフランシスコのＡ
ＡＣＣ会議にて他の型の、非アイソトープＢ12 ＥＩＡ
を紹介している。このアッセイはポリマーの微球体固相
に結合している内因子及びリポーター酵素に結合せしめ
たＢ12誘導体を利用する（Kuemmerle, S.C. 、Boltingh
ouse, G.L.、Delby, S.M. 、Lane, T.L.、Simondsen,R.
P. の "IMx Assay for Vitamin B12," Clin. Chem. 3
6：969 (1990)。
【０００７】更なる考えられる対象は特許協力条約のも
とで公開された Oh, C.Sら（Beckman Instruments, In
c) の国際特許出願 WO 89/12826号（公開日．1989年12
月28日) 及び Hoyleらの公開したヨーロッパ特許出願 E
P 0378197 A2 (1990年10月１日公開）であり、共にＢ12
非アイソトープアッセイに関する。Ｏh の公開物はビオ
チニル化内因子、アビジン−西洋ワサビペルオキシダー
ゼ及び固相に結合しているＢ12を利用するＢ12 ＥＩＡ
を詳細している。Hoyle の公開物には固相に結合してい
るストレプトアビジン、ビオチニル化モノクローナル抗
−Ｂ12抗体及びＢ 12−西洋ワサビペルオキシダーゼを利
用するＢ12 ＥＩＡが含まれている。
【０００８】更なる考えられる本発明の関連技術は、近
年 Self, C.H. の EP 0027036 B1 (1988年10月) により
報告されている増幅方法であり、これは標識酵素（アル
カリ性ホスファターゼ）のシグナルを約１００倍に増幅
せしめている。
【０００９】更なる考えられる関連文献は、Suter, M.,
Butler, J.E. と Peterman, J.Hにより“The Immunoch
emistry of Sandwich ELISAs-III" において報告されて
いる、ビオチニル化タンパク質に結合しているストレプ
トアビジンをその後マイクロタイタープレートに吸着さ
せるＥＬＩＳＡアッセイに関する固相系の研究である("
The Stoichiometry and Efficacy of the Protein - Av
idin - Biotin Copture (PABC) System," Molecular I
mmunol. 26：221-230 (1980)) 。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】これらの従来の方法の
中で、種々の困難性及び欠点が注目されている。例えば
前記したAllen の「非煮沸」予備処理方法は処理剤であ
ってそのアッセイにおいて利用しうる種々の酵素及び結
合性タンパク質を変性、即ち有害的に改質せしめる能力
を有するものを利用している。このことはこのアッセイ
の精度及び再現性を低めるであろう。更に前記した Sel
f の増幅方法はＢ12アッセイに適用されておらず、なぜ
ならこれは酵素標識化Ｂ12の利用を必要としているが、
これは非標識Ｂ12よりもタンパク質に対するかなり低い
親和力を有するからである。このことは特にＢ12におけ
る競合結合アッセイの開発を妨げてきた。更なる困難性
は、Ｂ12に結合する内因子の能力は内因子におけるコン
ホメーションの変化を含んでおり、従ってこのような変
化を受ける内因子の能力はその操作条件に伴って変化す
る事実により生ずる。最大の結合活性のためにはこの内
因子は溶液中に存在していなければならない。本発明は
従来の技術方法のこれら及びその他の欠点に向けられて
いる。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明の一態様に従い、
ビタミンＢ12の予備処理の非煮沸方法における変性剤
を、利用した後にサンプル混合物の中に残し、そしてこ
れを、該変性剤を不活性化せしめるがそれ自体はアッセ
イを行うのにその後加えられる任意のタンパク質又は酵
素への変性作用を有さない処理剤と混ぜる。これによる
該アッセイは該反応混合物から任意の処理剤を除去する
ことなく行えうる。この変性剤には無機塩基及びチオー
ルが含まれるため、該処理剤はこの塩基の pＨを下げる
ための酸の型における緩衝剤、更にこのチオールのスル
フヒドリル基を不活性な型、例えばジスルフィド又はア
ルキルチオ基へと変換せしめるための試薬を含む。従っ
てこのスルフヒドリル基変換剤は酸化剤又はアルキル化
剤でありうる。
【００１２】本発明の他の態様は本アッセイ自体のプロ
トコールに関する。該アッセイは酵素の存在又は誘導化
Ｂ12の利用に基づく低められたタンパク質結合親和力の
障害に悩むことなく酵素標識化Ｂ12の利用を可能とし、
更に、結合要素としての内因子の利用を可能として、Ｂ
12と内因子の反応が液相中において全体的に生ずること
を伴う。本プロトコールは以下の通りである。
【００１３】(1) サンプル中に含まれるＢ12の全ての内
因性結合タンパク質を遊離せしめたら、該試験サンプル
を過剰量のビチオニル化内因子と反応させ、複合体を形
成せしめる。この反応はこの液相における溶液において
全体的に起きる。
【００１４】(2) 次に酵素標識化ビタミンＢ12を加え、
そしてこの溶液を固相ストレプトアビジンとインキュベ
ートせしめる。このインキュベーションは、段階(1) に
おいて形成される複合体及び未反応ビチオニル化内因子
の両者がストレプトアビジン−ビオチン相互作用によっ
て該固相上に固定化し、そして該試験サンプル由来のＢ
12との複合体を形成せしめなかった固定化されたビオチ
ニル化内因子が酵素標識化Ｂ12と結合することをもたら
す。
【００１５】この段階で、該固相上に固定化された物質
は該サンプル由来のＢ12及び酵素標識化Ｂ12の一部を含
み、更に一定量の酵素標識化Ｂ12は溶液中に残ってい
る。ほとんど又は全てのサンプル由来Ｂ12が段階(1) に
おいて消費され、且つ酵素標識化Ｂ12が段階(2) におい
て残っているビオチニル化内因子を消費しながらも、既
に結合しているサンプル由来Ｂ12を実質的に追い出さな
いように十分なるビオチニル化内因子を用いることに注
意する。
【００１６】(3) 次にこの固相及び液相を分離せしめ、
そしてこの固相又は液相のいずれかの酵素活性のレベル
を測定し、次いでこの試験試料中のビタミンＢ12の濃度
に対する適切な曲線により換算する。
【００１７】本発明の更なる特徴及び利点を以降に詳細
する。
【００１８】試験サンプルを変性せしめた後に用いられ
る処理混合物中の緩衝剤は、アッセイのために pＨを受
け入れられるレベル迄低め、且つ連続するアッセイ反応
の際にその pＨをそのレベルに又はそれに近いレベルに
保持せしめるための酸性型において利用できる任意の緩
衝剤である。このような緩衝剤の例には、リン酸緩衝
剤、ホウ酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤及びト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが含まれる。リ
ン酸緩衝剤、特にナトリウム又はカリウムの第１リン酸
塩が好ましい。この緩衝剤は処理すべき試験サンプルを
約６．５〜約８．０、好ましくは約７．０〜約７．４の
範囲内にするために選び且つ調整する。 pＨを調整する
ための量及び方法は当業者によく理解されている。
【００１９】チオールのスルフヒドリル基を不活性化さ
せるための酸化剤は、スルフヒドリル基の酸化を成し遂
げるために十分な酸化能力及び反応速度を有し、しかし
ながらこのアッセイ工程における逐次の段階において添
加すべきようなタンパク質及び酵素のいかなる実質的な
変性を生じせしめることのない任意の試薬である。この
ような酸化剤の例には、ヨウ素酸塩、硝酸塩、臭素酸
塩、ジチオネート塩及びエルマン試薬が含まれる。ヨウ
素酸塩、特にナトリウム及びカリウムのヨウ素酸塩が好
ましい。
【００２０】チオールのスルフヒドリル基を不活性化さ
せるためのアルキル化試薬は、変性予備処理せしめた後
の試薬サンプルにおける主たるコンディションのもとで
スルフヒドリル基をアルキルチオ基に変換せしめること
ができるような任意の試薬でありうる。このような試薬
の例には、ヨード酢酸、メチルマレイミド、コ−ブロモ
エチルアミン及びＮ−ヨードスクシニミドがある。
【００２１】本発明に関する任意の特定の処理工程にお
いて利用するための緩衝剤及び酸化又はアルキル化試薬
の最適濃度は当業者によって容易に決められるであろ
う。
【００２２】タンパク質変性の非煮沸方法のための予備
処理材料であって、その投与を緩衝剤とスルフヒドリル
不活性剤の組合わせの投与に先行して行うものは、本明
細書に参考文献として組入れている、上記の Allenの特
許に従う周知の方法により構成され且つ適用される。典
型的な予備処理溶液は、無機塩基、例えば水酸化ナトリ
ウム又はカリウム；及びチオール、例えばジチオスレイ
トール、β−メルカプトエタノール、チオグリコール
酸、チオグリセロール又は３−メルカプトプロピオン酸
を含んでいる。水酸化ナトリウムとジチオスレイトール
が最も一般的に利用される。典型的な予備処理溶液は更
に、全ての型のコバラミンをシアノコバラミンへ、同様
にＢ12の類似体であるコビナミドをジシアノコビナミド
の型に変換せしめるシアン化カリウムを含んでいる。こ
れはサンプル中に存在している全てのＲ−バインダータ
ンパク質を飽和せしめ、それらがこの段階及びその後の
段階において再生されることを防ぐ。この無機塩基及び
チオールは一般に別々の溶液として保存される。ここで
一方は塩基とシアン化カリウム及びジシアノコビナミド
を、そして他方はチオールと塩化ナトリウムを含む。
【００２３】本予備処理、中和及び不活性化工程を、主
としてビタミンＢ12に対するアッセイと関連づけて本明
細書に詳細するが、それらは生物学的なサンプル中に存
在している場合に内因性タンパク質と結合している傾向
にある広範囲にわたる物質に関する。アッセイに関し
て、類似の手段において利用されうる。本発明の観点に
おいて、このアッセイによって検出すべき物質は本発明
にとって重要ではない。
【００２４】ビタミンＢ12に関するアッセイへの本発明
の適用のため、このようなアッセイはビタミンＢ12を含
むことが予測され、且つビタミンＢ12含有量を測定する
ことを要求する任意の生物学的流体において行われう
る。このようなアッセイは典型的には、ヒト血漿又は血
清において行われる。
【００２５】検出方法においてラベルとして働くことが
できる酸素を含む、広範囲にわたる種類の酵素が酵素標
識化ビタミンＢ12のために利用されうる。多数のこのよ
うな酵素及びその検出のための基質がイムノアッセイ業
界における当業者に知られている。好ましい酵素はアル
カリ性ホスファターゼであり、そして好ましい検出方法
は前記した、そして本明細書に参考文献として組入れる
Self の酵素増幅方法である。
【００２６】アルカリ性ホスファターゼを包含する典型
的な方法は、基質としてβ−ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドリン酸の還元型（β−ＮＡＤＰＨ）を利用
する。アルカリ性ホスファターゼはリン酸基を切断せし
め、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元
型（β−ＮＡＤＨ）を生成せしめる。その後、ジアホラ
ーゼ、ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット（ＩＮ
Ｔ）、エタノール及びアルコールデヒドロゲナーゼより
成る発色剤を添加する。基質インキュベーション段階の
際に生成された切断化生成物、β−ＮＡＤＨのみがこの
増幅サイクルを開始させることができる。このβ−ＮＡ
ＤＨはジアホラーゼによってＮＡＤに酸化され、ＩＮＴ
の着色生成物（４９０nmで測定可能）への還元が伴う。
このサイクルは再度開始され、そして発色する速度は存
在しているβ−ＮＡＤＨの量に依存する。
【００２７】前記した通り、本検出方法は固相又は液相
のいずれかにて行うことができる。固相工程に関して、
この固相は基質及びその他の検出試薬の溶液と接触する
ように置かれ、そしてその溶液中における色調変化を観
察して定量する。液相工程に関しては、この液相を基質
及びその他の検出試薬の溶液と混ぜ合わせ、そして同様
の方法において色調変化を観察して定量する。
【００２８】この固相は本アッセイに含まれる方法に適
切且つ適当な任意の形態でありうる。例としてビーズ、
試験管及びマイクロタイタープレートがある。
【００２９】アッセイに利用されるその他の試薬の生成
は論文に報告されている常用の手段により成し遂げられ
る。アルカリ性ホスファターゼ標識化Ｂ12の生成のた
め、例えばＢ12のコリン環上のプロピオンアミド基にお
いて酸加水分解を行う。その後、無水の非プロトン性溶
媒系におけるジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下
においてＢ12モノカルボン酸とＮ−ヒドロスクシニミド
（ＮＨＳ）とを反応させる。その結果、Ｂ12モノカルボ
ン酸のＮＨＳエステルが形成され、次にこれを水性媒体
中でアルカリ性ホスファターゼのアミン基と反応せしめ
る。
【００３０】ビオチニル化内因子も既知の方法により同
様に調製し、その１つの方法はビオチニル化試薬として
スルホスクシニミジル６−（ビオチンアミド）ヘキサノ
エートの利用を含む。本アッセイに利用するビオチニル
化内因子の濃度は、本アッセイの期待する診断範囲にお
ける最大の感度を有する投与応答曲線を提供するように
調整されうる。このような調整はイムノアッセイ技術者
によく理解され、そして日常の実験によって容易に決め
られる。内因子はＢ12に特異的なものであってコビナミ
ド又はその他のＢ12類似体と交差反応しないものであ
る。
【００３１】固相、例えばマイクロタイタープレート上
のストレプトアビジンの固定化は、マイクロタイタープ
レートにビオチニル化キャリアータンパク質を吸着さ
せ、その後ストレプトアビジンをこのビオチン−タンパ
ク質プレートに結合させることにより好適に行われる。
【００３２】本アッセイに必要な全ての成分を含むキッ
トは、典型的に以下のものを含むであろう。
【００３３】 １．標準品 シアノコバラミン pg/mLの範囲 ヒト血清アルブミン ７％ 塩化ナトリウム ０．９％ アジ化ナトリウム ０．１％
【００３４】 ２．酵素コンジュゲート溶液 Ｂ12アルカリ性ホスファターゼコンジュゲート トリエタノールアミン塩酸塩 １０ mＭ アジ化ナトリウム ０．１％ 塩化ナトリウム ０．８５％ 塩化マグネシウム １ mＭ 硫酸塩・６水和物 ０．１ mＭ ヒト血清アルブミン １％ ポリエチレングリコール 8000 ５％ ツイーン 2０ ０．０５％
【００３５】 ３．結合性タンパク質コンジュゲート溶液 ビオチン−内因子コンジュゲート トリエタノールアミン塩酸塩 １０ mＭ アジ化ナトリウム ０．１％ 塩化ナトリウム ０．８５％ 塩化マグネシウム １ mＭ 硫酸塩・６水和物 ０．１ mＭ ヒト血清アルブミン １％ ポリエチレングリコール 8000 ５％ ツイーン 2０ ０．０５％
【００３６】 ４．中和剤 ヨウ素酸カリウム １００ mＭ 第１リン酸カリウム・１水和物 ２６０ mＭ
【００３７】 ５．予備処理溶液 Ａ 水酸化ナトリウム １ mＭ シアン化カリウム １００μg/mL ジシアノコビナミド １μg/mL
【００３８】 ６．予備処理溶液 Ｂ ジチオスレイトール ２０ mg/mL 塩化ナトリウム １０ mＭ
【００３９】 ７．洗浄液、 pＨ 7．4 トリエタノールアミン塩酸塩 １０ mＭ 塩化ナトリウム ０．８８％ ツイーン 2０ ０．０５％ キャソン（Kathon) ＣＧ ０．０６％
【００４０】８．予備処理マイクロタイタープレート ブランクポリスチレンマイクロタイタープレート
【００４１】９．アッセイマイクロタイタープレート ストレプトアビジンの結合したビオチンウシ血清 アルブミンにより被覆されたポリスチレンマイクロタイ
タープレート
【００４２】10. 凍結乾燥基質 β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド リン酸（還元型）
【００４３】 11. 基質希釈液、 pＨ 9．5 ジエタノールアミン ５０ mＭ エタノール ４％ 塩化マグネシウム １ mＭ アジ化ナトリウム ０．０２％ ツイーン 2０ ０．１％
【００４４】12. 凍結乾燥増幅剤 アルコールデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ
【００４５】 13. 増幅剤希釈剤 第１リン酸ナトリウム・１水和物 １ mＭ アジ化ナトリウム ０．０２％ エチレングリコール ８％（容量ベース） ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット ２ mＭ
【００４６】
【実施例】例１ 内因子のビオチニル化 反応フラスコに０．５mg/mL の内因子２００μL 、脱イ
オン水１６６μL 及び１Ｍの重炭酸ナトリウム５０μL
を入れた。これとは別に、５mgのスルホスクシニミジル
６−（ビオチンアミド）−ヘキサノエートを１mLの脱イ
オン水に溶かすことによって溶液を作った。これを作っ
たら直ちにこのビオチン溶液の一部（５６μL)を前記の
内因子溶液に攪拌しながら加えた。得られる反応混合物
を４℃で１６時間反応させた。
【００４７】その後、１％のヒト血清アルブミン、１０
mＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタン、０．８５
％の塩化ナトリウム及び０．１％のアジ化ナトリウム p
Ｈ７．4 を含む溶液（１０ mＭのＴＢＳ／アジド）１０
０μL を加えた。得られる溶液を Cenricon ３0 マイク
ロコンセントレーターを用いて、１０ mＭのＴＢＳ／ア
シドで６回洗浄した。この洗浄液は１０ mＭのトリエタ
ノールアミン、０．８８％の塩化ナトリウム、０．０５
％のツイーン２0 及び０．０６％のキャソンＣＧ（pH
7.4) を含む。洗浄後、この溶液の容量を１mLに増量せ
しめ、そして等容量のコンジュゲート希釈液を加えた。
このコンジュゲート希釈液は１０ mＭのトリエタノール
アミン、０．１％のアジ化ナトリウム、０．８５％の塩
化ナトリウム、１ mＭの塩化マグネシウム、０．１ mＭ
の硫酸鉛・６水和物、１％のヒト血清アルブミン、５％
のポリエチレングリコール及び０．０５％のツイーン 2
０（pH 7.4) を含む。
【００４８】例２ Ｂ12のアルカリ性ホスファターゼへの結合 Ｂ12がアルカリ性ホスファターゼに結合できるようにす
るためには、そのコリン環のプロピオンアミド基の酸加
水分解によってまずそれを誘導化せしめなければならな
い。これはまず６００mgのＢ12を０．１Ｍの換算１２μ
L に加えることにより行われる。この溶液を暗室におい
て周囲温度で７２時間にわたり攪拌する。この後、その
pＨを水酸化ナトリウムによって４．０に調整する。
【００４９】次にこの混合物をアルミナカラムに適用
し、そして水によって溶出させる。加水分解していない
物質はカラムを素通りし、その間モノ−、ジ−及びトリ
−ガルボン酸は保持され続ける。モノカルボン酸は０．
１Ｍの水酸化アンモニウムにより溶出する。Ｂ12−モノ
カルボン酸のｂ，ｄ及び異性体の所望の混合物を含む画
分をプールし、濃縮し、そして pＨ 4. 0 に酸性化せし
めた。次いでこの生成物を９０％のフェノール中で抽出
せしめた。エーテルをこのフェノール抽出物に加えた。
次にこのフェノール／エーテル層を脱イオン水で抽出
し、生成物は水性層に存在していた。この組合わせ水性
抽出物をエーテルで洗浄した。この最終層を凍結乾燥
し、Ｂ12のモノカルボン酸のｂ，ｄ及び異性体の混合物
６５mgが得られた。
【００５０】次いでＢ12のＮ−ヒドロキシスクシニミド
活性エステルを生成せしめ、そしてアルカリ性ホスファ
ターゼと反応させた。これを行うため、Ｂ12モノカルボ
ン酸（２０mg）、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（２２m
g）及び１, 3 ジシクロヘキシルカルボジイミド（４０m
g）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（７００μL)
中に溶解させた。得られる溶液を暗室において４℃で１
６時間にわたり攪拌した。次にこの溶液を遠心し、そし
てペレットを廃棄した。
【００５１】０．１Ｍのリン酸緩衝液、０．１Ｍの塩化
ナトリウム pＨ 7．4 中の１．２７mgの仔牛小腸アルカ
リ性ホスファターゼに、Ｂ12活性化エステルを含む前記
の溶液の上清液１４０μL （４．６９mg）を加えた。こ
の混合物を暗室で４℃にて１６時間攪拌した。この後、
この反応混合物を５０ mＭのトリス、０．１％のアジ化
ナトリウム、０．１Ｍの塩化ナトリウム、１ mＭの塩化
マグネシウム及び０．１ mＭの塩化鉛、 pＨ 7．6 、
０．１％の Norit A（チャーコール）に対して透析し
た。このコンジュゲートをＨＰＬＣにより、サイズ排除
カラムを用いて精製した。
【００５２】例３ ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートの調
製 ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートの調
製はビオチニル化キャリアータンパク質を必要とする。
この実施例に関して、このキャリアータンパク質は牛血
清アルブミン（ＢＳＡ）である。１Ｍの重炭酸ナトリウ
ム１０mL及び脱イオン水９mLの混合物に１００mgのＢＳ
Ａを溶解せしめることによって溶液を作った。次にビオ
チン溶液を、７９．５mgのスルホスクシニミジル６−
（ビオチンアミド）ヘキサノエートを１mLの脱イオン水
に溶かすことによって調製した。これを生成せしめた直
後に、このビオチン溶液をこのＢＳＡ溶液に攪拌しなが
ら加えた。得られる溶液を４℃で１６時間放置し、次い
で Centricon 3０マイクロコンセントレーター及び１０
mＭのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、０．１％のアジ化
ナトリウム pＨ 7. 4 を用いて洗浄した。
【００５３】このビオチン−ＢＳＡ溶液を１０ mＭのＰ
ＢＳ、 pＨ 7. 4 を用いて２．５μg/mLに希釈した。マ
イクロタイタープレートのウエルにこの溶液を１００mL
／ウエルで入れ、そしてこのプレートを室温でオーバー
ナイトインキュベートした。翌日、このプレートを洗浄
液で洗浄した。ストレプトアビジンを１％のＢＳＡ、１
０ mＭのＰＢＳの溶液に希釈して最終濃度を４μg/mLと
した。その後、この溶液をこのマイクロタイタープレー
トに１００μL/ウエルにて加えた。次にこのプレートを
室温でオーバーナイトインキュベーションした。翌日、
このプレートを洗浄液で洗浄し、そして１００μL/ウエ
ルにて１０ mＭのＰＢＳ、 pＨ 7. 4 を加えた。次いで
このプレートを室温でオーバーナイトインキュベーショ
ンした。翌日、この溶液を捨て、そして吸い取り乾燥
（ブロットドライ）させた。このプレートを乾燥剤と一
緒にプラスチック袋の中で４℃にて保存した。
【００５４】例４ Ｂ12アッセイプロトコール及び結果 被覆されていないマイクロタイタープレートの各ウエル
の中に３０mLの標準品、コントロール又はサンプルを入
れ、その後予備処理溶液Ａと予備処理溶液Ｂの１：１の
混合物６０μL を加えた。これらの予備処理溶液は以下
の通りである。
【００５５】予備処理溶液Ａ： １Ｍの水酸化ナトリウ
ム、１００μg/mLのシアン化カリウム及び１μg/mLのジ
シアノコビナミド。 予備処理溶液Ｂ： ２０mg/mL のジチオスレイトール及
び１０ mＭの塩化ナトリウム。
【００５６】このプレートを次に軽く振り、カバーを付
け、そして３７℃のインキュベーターに２０分間入れ
た。次に１００ mＭのヨウ素酸カリウム及び２６０ mＭ
の第１リン酸カリウムより成る中和剤（１５０μL)を加
え、その後３０μL の結合性タンパク質を加えた。次に
このプレートを再び軽く振り、カバーを付け、そして３
７℃のインキュベーターに３０分間入れた。
【００５７】スプレプトアビジン／ビオチン−ＢＳＡ被
覆マイクロタイタープレートの各ウエルの中に、マルチ
チャンネルプペットを用いて酵素コンジュゲート３５μ
L を加え、その後７０μL の予備処理せしめた標準品、
コントロール又はサンプルを加えた。次いでこのプレー
トを軽く振り、カバーを付け、そして３７℃のインキュ
ベーターに３０分間入れた。このプレートを次に洗浄
し、そして吸い取り乾燥し、そして基質溶液（１００μ
L/ウエル) を加えた。再びこのプレートを軽く振り、カ
バーを付け、そして３７℃のインキュベーターに３０分
間入れた。最後に１００μL の増幅溶液を各ウエルに加
えた。次に４９０nmでの吸光度における変化のレートを
マイクロタイタープレートリーダーにおいて測定した。
その結果を図１に示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】本プロトコールを用いることにより得られた投
与量−応答曲線のプロットである。縦軸は１分間当りの
ミリ吸光度単位における発色のレートを表し、そして横
軸は１ミリリッター当りのピコグラムにおけるＢ12の濃
度を表わす。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エドワード トゥン−ウー リアン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94547, ハーキュリーズ，フェーザント ドライブ 1861 (72)発明者 ジョン エム．ポスキー アメリカ合衆国，カリフォルニア 94550, ナパ，ギナ ドライブ 2526 (72)発明者 マーク エー．スタプレス アメリカ合衆国，カリフォルニア 94806, リッチモンド，スウィート 3522，リッチ モンド パークウェイ 3400 (56)参考文献 米国特許4188189（ＵＳ，Ａ) 米国特許4351822（ＵＳ，Ａ) 米国特許4451571（ＵＳ，Ａ)

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 試験サンプル中の生物学的物質の存在を
    検出する酵素イムノアッセイのための該試験サンプルの
    準備のための方法（ここで該試験サンプル中に該生物学
    的物質がもし存在しているならば、少なくともその一部
    は、該酵素イムノアッセイを妨害することができる内因
    性結合性タンパク質と結合している）であって、以下の
    段階： (a) 前記の試験サンプルを無機塩基及びチオールと混合
    せしめて第１混合物を作り； (b) 前記の第１混合物をインキュベートせしめて、前記
    の無機塩基及び前記のチオールが前記の試験サンプル中
    に存在している任意の前記の内因性結合性タンパク質を
    変性せしめ、そしてこれによって該試験サンプル中に存
    在している任意の前記の生物学的物質が該内因性結合性
    タンパク質から遊離することを引き起こさせ、これによ
    って第２の混合物を作り；そして (c) 前記の第２混合物を、 (i) 酸性の緩衝剤、並びに (ii)スルフヒドリル基変換剤であって、 1) 前記の第１
    混合物中に存在する任意のスルフヒドリル化合物をジス
    ルフィドに酸化せしめるが、変性していない更なるタン
    パク質の変性は実質的に回避できるように選ばれた電気
    化学的ポテンシャルを有する酸化剤、及び 2) アルキル
    化剤より成る群から選ばれるもの、と混合せしめ、前記
    の第２混合物の pＨを約６．５〜約８．０の範囲の値に
    低め、そしてその中に残っている任意のチオール基をジ
    スルフィド基へと変換せしめること、を含んで成る方
    法。
  2. 【請求項２】 前記の段階(c) が、前記の pＨを約７．
    ０〜約７．４の範囲内の値に迄低めることを含んで成
    る、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記の緩衝剤が、リン酸緩衝剤、ホウ酸
    緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤及びトリス（ヒド
    ロキシメチル）アミノメタンより成る群から選ばれる、
    請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記のスルフヒドリル基変換剤が、ヨウ
    素酸塩、硝酸塩、ジチオネート塩及びエルマン（Ellma
    n) 試薬より成る群から選ばれる、請求項１に記載の方
    法。
  5. 【請求項５】 前記の無機塩基が、水酸化ナトリウム及
    び水酸化カリウムより成る群から選ばれる構成員であ
    り、そして前記のチオールがジチオスレイトール、β−
    メルカプトエタノール、ジチオグリコール酸塩、ジチオ
    グリセロール及び３−メルカプトプロピオン酸より成る
    群から選ばれる構成員である、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記の無機塩基が水酸化ナトリウムであ
    り、そして前記のチオールがジチオスレイトールであ
    り、前記の緩衝剤がリン酸二水素緩衝剤であり、そして
    前記のスルフヒドリル基変換剤がヨウ素酸塩である、請
    求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 予備決定せしめた濃度の範囲内のビタミ
    ンＢ12を含む試験サンプル中におけるビタミンＢ12の量
    を測定するための方法であって、以下の段階： (a) 前記の試験サンプル中の全てのビタミンＢ12をそれ
    に結合している任意のタンパク質から解離させ； (b) 第１溶液中において前記の試験サンプルをビオチニ
    ル化内因子と混合せしめ（ここで該ビオチニル化内因子
    は前記の予備決定範囲の最大値よりも過剰量にする）、
    そして該第１溶液をインキュベートしてその中の実質的
    に全てのビタミンＢ12を該ビオチニル化内因子と結合さ
    せて複合体を形成させ； (c) 前記の第１溶液を、固相上に固定化されているスト
    レプトアビジンの存在下で第２溶液における酵素標識化
    ビタミンＢ12と混合せしめ（ここで該酵素標識化ビタミ
    ンＢ12及び該ストレプトアビジンのそれぞれは段階(b)
    の前記のビオチニル化内因子よりも過剰量にある）、そ
    して該第２溶液と該ストレプトアビジンをインキュベー
    トして、該第２溶液中における前記の複合体及びビタミ
    ンＢ12を有さないビオチニル化外因性因子を該ストレプ
    トアビジンと結合させ、且つ該第２溶液中におけるビタ
    ミンＢ12を有さない該ビオチニル化外因性因子を該酵素
    標識化ビタミンＢ12と複合させ； (d) 前記の第２溶液から前記の固相を分離せしめ；そし
    て (e) 前記の固相又は前記の第２溶液のいずれかの酵素活
    性のレベルを測定すること、を含んで成る方法。
  8. 【請求項８】 前記の段階(b) 及び (c)を約７．０〜約
    ８．０の pＨで行う、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記の酵素標識化ビタミンＢ12の酵素が
    アルカリ性ホスファターゼである、請求項７に記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】 請求項７に記載の方法であって、前記
    の段階(a) が； (i) 前記の試験サンプルを無機塩基及びチオールと混合
    せしめ、そしてこれにより得られる混合物をインキュベ
    ートして、該無機塩基及び該チオールが該試験サンプル
    中に存在している任意の内因性結合性タンパク質を変性
    せしめてそれに結合している全てのビタミンＢ12をそれ
    より遊離させ；そして、 (ii) 段階(i) より得られる混合物を、 (1)酸性の緩衝剤、並びに (2)スルフヒドリル基変換剤であって、 a) 前記の第１
    混合物中に存在する任意のスルフヒドリル化合物をジス
    ルフィドに酸化せしめるが、変性していない更なるタン
    パク質の変性は実質的に回避できるように選ばれた電気
    化学的ポテンシャルを有する酸化剤、及び b) アルキル
    化剤より成る群から選ばれるもの、と混合せしめ、前記
    の第２混合物の pＨを約６．５〜約８．０の範囲の値に
    低め、そしてその中に残っている任意のチオール基をジ
    スルフィド基へと変換せしめること、を含んで成る方
    法。
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