JP5944931B2 - 細胞培養用製品及びその製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞培養用製品に関し、特に、親水性共重合体層を具備する細胞培養用製品に関する。
通常の細胞培養用製品は、一般的に、基板と、ポリメタクリレート（polymethacrylate）層と、所定のペプチド鎖とを具備する。ポリメタクリレート層は、基板に設けられ、所定のペプチド鎖は、ポリメタクリレート層の表面に結合される。
上記通常の細胞培養用製品は、ポリメタクリレート層に結合されたペプチド鎖と、培養しようとする細胞表面の受容体（receptor）とを結合することによって、細胞をポリメタクリレート層の表面に接着させることができるため、細胞培養液の中に浮遊しにくくなり、培養しようとする細胞を死亡させる可能性は低い。しかしながら、ポリメタクリレート層そのものの親水性は低く、細胞がポリメタクリレート層の表面に接着しにくいので、細胞が細胞培養液の中に浮遊し、延いては死亡させることになる。
一方、自然環境では、未分化幹細胞と組織との間に一定範囲の弾性応力があるため、この弾性応力により、未分化幹細胞の特定細胞への分化を誘導することができる。しかしながら、通常の細胞培養用製品では、幹細胞の特定細胞種への分化を誘導するには、細胞成長因子及び細胞分化因子を別途追加しなければならない。細胞成長因子及び細胞分化因子の添加により、幹細胞分化を誘導できるが、幹細胞分化の特異性を正確に調整・制御しにくく、同時に上記特定細胞の増殖も促進しにくい。
従って、現在、例えば細胞の増殖効率が好ましくなく、幹細胞分化を調整・制御しにくいという通常の細胞培養用製品における問題を解決した新規の細胞培養用製品及びその製造方法が望まれている。
本発明は、通常の細胞培養用製品における問題を解決し、幹細胞及び分化細胞の増殖を向上させ、幹細胞分化の特異性を向上させるための細胞培養用製品及びその製造方法を提供する。
本発明の一態様は、細胞培養用製品を提供する。この細胞培養用製品は、基板と、親水性共重合体層と、複数のペプチド鎖とを具備する。
基板は、表面を有し、親水性共重合体層は、基板の表面に設けられる。親水性共重合体層は、複数のポリビニルアルコール単位、複数のポリビニルアルコール誘導体単位及び複数のカルボン酸基（carboxylic group）含有単位によって共重合されたものである。ペプチド鎖は、それぞれ親水性共重合体層の表面に結合される。
本発明の実施例によると、上記ポリビニルアルコール誘導体単位は、ポリビニルアセテート（polyvinyl acetate）、ポリビニルメチルエーテル（polyvinyl methyl ether）又はポリビニルエチルエーテル（polyvinyl ethyl ether）を含む。
本発明の実施例によると、上記カルボン酸基含有単位は、イタコン酸（itaconic acid）を含む。
本発明の実施例によると、上記親水性共重合体層において、ポリビニルアルコール単位、ポリビニルアルコール誘導体単位及びカルボン酸基含有単位の含有量は、それぞれ約６５〜９８．７％、０〜３０％および１．３〜５％である。
本発明の実施例によると、上記親水性共重合体層において、ポリビニルアルコール単位、ポリビニルアルコール誘導体単位及びカルボン酸基含有単位の含有量は、それぞれ約８５％、１０％および５％である。
本発明の実施例によると、上記親水性共重合体層は、弾性係数を有する。本発明の実施例によると、上記弾性係数は、約１ｋＰａ〜１００ｋＰａの範囲内にある。
本発明の実施例によると、上記ペプチド鎖は、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質又はこれらの組み合わせを含む。本発明の実施例によると、上記オリゴペプチドは、フィブロネクチン（fibronectin；ＦＮ）のＣＳ‐１断片又はビトロネクチン（vitronectin；ＶＮ）の断片を含む。本発明の実施例によると、上記タンパク質は、フィブロネクチン又はビトロネクチンを含む。
本発明の実施例によると、上記ペプチド鎖のアミノ酸は、アミド結合によって、それぞれカルボン酸基含有単位に結合される。
本発明の別の態様は、細胞培養用製品の製造方法を提供する。この製造方法は、表面を有する基板を提供する工程と、共重合反応によって複数のポリビニルアルコール単位、複数のポリビニルアルコール誘導体単位及び複数のカルボン酸基含有単位を共重合させた親水性共重合体層を基板に形成する工程と、親水性共重合体層における複数のポリビニルアルコール単位同士を架橋させる架橋反応を行う工程と、それぞれ複数のペプチド鎖を親水性共重合体層の表面に結合する工程を含む。
本発明の実施例によると、上記親水性共重合体層を形成する工程は、親水性共重合体溶液を調製し、該親水性共重合体溶液を基板の表面に塗布する工程を含む。
本発明の実施例によると、上記親水性共重合体溶液は、親水性共重合体を含み、濃度が約０．０５〜０．２ｗｔ％である。
本発明の実施例によると、上記ポリビニルアルコール誘導体単位は、ポリビニルアセテート、ポリビニルメチルエーテル又はポリビニルエチルエーテルを含む。
本発明の実施例によると、上記カルボン酸基含有単位は、イタコン酸を含む。
本発明の実施例によると、上記ペプチド鎖は、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質又はこれらの組み合わせを含む。
本発明の実施例によると、上記オリゴペプチドは、フィブロネクチンの断片（ＣＳ‐１）又はビトロネクチンの断片を含む。
本発明の実施例によると、上記タンパク質は、フィブロネクチン又はビトロネクチンを含む。
本発明の実施例によると、架橋反応を行う工程は、硫酸の存在下で、親水性共重合体層におけるポリビニルアルコール単位をグルタルアルデヒド（glutaraldehyde）で架橋する。本発明の実施例によると、架橋反応を行う工程は、架橋反応の架橋反応時間を制御して、親水性共重合体層の弾性係数を調整・制御する工程を更に含む。本発明の実施例によると、上記架橋反応時間は、約０．５時間〜４８時間である。本発明の実施例によると、上記弾性係数は、約１ｋＰａ〜１００ｋＰａの範囲内にある。
本発明のさらに他の態様は、未分化幹細胞を培養する方法を提供する。この培養方法は、基板と、基板に位置する親水性共重合体層と、それぞれ親水性共重合体層に結合された複数のペプチド鎖と、を具備する細胞培養用製品を提供する工程を含む。そのうち、親水性共重合体層は、共重合反応によって、複数のポリビニルアルコール単位、複数のポリビニルアルコール誘導体単位及び複数のカルボン酸基含有単位を共重合させたものである。細胞培養用製品上のペプチド鎖に結合される複数の未分化幹細胞を、細胞培養用製品上及び化学成分が明確な細胞培養液の中で培養する。化学成分が明確な細胞培養液で、未分化幹細胞を少なくとも５代継代（passages）培養し続ける。
本発明の実施例によると、上記幹細胞は、ヒト成体幹細胞（human adult stem cells）、ヒト胎児幹細胞（ｈＦＳＣｓ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）及びヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣｓ）を含む。
本発明の実施例によると、上記ペプチド鎖は、フィブロネクチンのＣＳ‐１断片又はビトロネクチンを含む。
本発明の実施例によると、上記親水性共重合体層において、ポリビニルアルコール単位、ポリビニルアルコール誘導体単位及びカルボン酸基含有単位の含有量は、それぞれ約６５〜９８．７％、０〜３０％、１．３〜５％である。
本発明の実施例によると、上記化学成分が明確な細胞培養液は、細胞成長因子及び形質転換成長因子を更に含む。
本発明の実施例によると、上記化学成分が明確な細胞培養液で、未分化幹細胞を少なくとも１０代継代培養し続けることが可能である。
本発明のさらにもう１つの態様は、幹細胞分化を調整・制御する方法を提供する。この調整・制御する方法は、基板と、基板に位置する親水性共重合体層と、それぞれ親水性共重合体層に結合された複数のペプチド鎖と、を具備する細胞培養用製品を提供する工程を含む。親水性共重合体層は、共重合反応によって、複数のポリビニルアルコール単位、複数のポリビニルアルコール誘導体単位及び複数のカルボン酸基含有単位を共重合させたものである。親水性共重合体層の架橋反応時間を調整・制御して、親水性共重合体層に所定の弾性係数を持たせる。細胞培養用製品上のペプチド鎖に結合される複数の未分化幹細胞を、細胞培養用製品上及び化学成分が明確な細胞培養液の中で培養する。所定の弾性係数範囲を有する親水性共重合体層によって、未分化幹細胞の分化作用を誘導して、未分化幹細胞を所望の細胞株に分化させる。
本発明の実施例によると、上記インテグリンは、α６β１インテグリン、αＶβ３インテグリン、αＶβ５インテグリン又はこれらの組み合わせを含む。
本発明の実施例によると、上記幹細胞は、ヒト成体幹細胞、ヒト胎児幹細胞、ヒト胚性幹細胞及びヒト誘導多能性幹細胞を含む。
本発明の実施例によると、上記ペプチド鎖は、フィブロネクチンのＣＳ‐１断片又はビトロネクチンを含む。
本発明の実施例によると、上記化学成分が明確な細胞培養液は、細胞成長因子及び形質転換成長因子を更に含む。
本発明の実施例によると、上記所定の弾性係数は、約１ｋＰａ〜１００ｋＰａの範囲内にある。
本発明の実施例によると、上記所望の細胞株（cell line）は、神経細胞（neural cell）、筋細胞（muscle cell）又は骨芽細胞（osteoblast）を含む。
次に、実施例で図面に合わせて本発明を詳しく説明する。図面又は記載において、類似又は同じ部分については、同じ符号又は番号を用いる。図面において、簡略化し又は示しやすくするためには、実施例の形状又は厚さが拡大される可能性がある。図面における素子の一部は、文字で記載される。理解すべきなのは、示されていない又は記載されていない素子は、当業者の知っている様々な様式であってよい。
本明細書で用いられる術語は、ただ所定の実施例を記載するためのものであり、本発明を制限するものではない。本明細書で用いるように、単数形である「一」（a、an）及び「前記」は、本明細書で別に明らかに指示しない限り、複数形の意味も含まれている。更に理解すべきなのは、本明細書で用いられる場合、術語「含む」（comprises及び／又はcomprising）は、述べられた特徴、整数、工程、動作、素子及び／又は組成の存在を指定するが、１つ又は複数の他の特徴、整数、工程、動作、素子、組成及び／又はその群の存在又は添加を排除しない。本明細書は、本発明の理想的な実施例（及び中間構造）の断面図を参照して、本発明の実施例を記載する。また、前記の断面図は模式的な説明である。このように、私たちは、これらの説明された形状から外れたものが、（例えば）製造技術及び／又は製造の許容範囲による改変を予想する。従って、本発明の実施例が本明細書で説明される特定の領域の形状に制限されるものではなく、（例えば）製造による形状の変化もあると理解すべきであり、且つ、これらの図で説明される範囲は、本質的に模式的なものであり、その形状が、設備の範囲の実際の形状を説明することではなく、また、本発明を制限するものではない。
図１Ａ〜図１Ｃは、本発明の実施例によって示される細胞培養用製品１００ａ〜１００ｃの断面図である。
図１Ａにおいて、細胞培養用製品１００ａは、基板１１０と、親水性共重合体層１２０ａと、ペプチド鎖１３０とを具備する。基板１１０は、表面１１１を有し、親水性共重合体層１２０ａは、基材１１０の表面１１１に設けられる。親水性共重合体層１２０ａは、ポリビニルアルコール単位、ポリビニルアルコール誘導体単位及びカルボン酸基含有単位によって共重合されたものである。ペプチド鎖１３０は、それぞれ親水性の共重合体層１２０ａの表面１２１に結合される。
本発明の実施例において、ポリビニルアルコール誘導体単位は、ポリビニルアセテート、ポリビニルメチルエーテル又はポリビニルエチルエーテルを含み、カルボン酸基含有単位は、イタコン酸を含む。
本発明の実施例において、親水性共重合体層１２０ａの材料は、組成式１に示す一般式を有する。
そのうち、Ｒは、メチル（methyl group）、エチル（ethyl group）又はアセチル（acetyl group）であり、ｘ、ｙ、ｚは、それぞれポリビニルアルコール単位、ポリビニルアルコール誘導体単位及びカルボン酸基含有単位の含有量の割合を示す。
本発明の実施例において、親水性共重合体層１２０ａにおけるポリビニルアルコール単位、ポリビニルアルコール誘導体単位及びカルボン酸基含有単位の含有量は、それぞれ約６５〜９８．７％、０〜３０％、１．３〜５％である。本発明の実施例において、親水性共重合体層１２０ａにおけるポリビニルアルコール単位、ポリビニルアルコール誘導体単位及びカルボン酸基含有単位の含有量は、それぞれ約８５％、１０％、５％である。
本発明の実施例において、親水性共重合体層１２０ａの弾性係数は１ｋＰａ〜１００ｋＰａの範囲内にある。
ペプチド鎖１３０は、それぞれ親水性の共重合体層１２０ａの表面１２１に結合される。ペプチド鎖１３０は、アミノ酸により構成され、数多くのアミノ基を有するため、ペプチド鎖１３０上のアミノ基は、カルボン酸基含有単位上のカルボン酸基と反応してアミド結合を形成することができる。上記ペプチド鎖１３０は、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質又はこれらの組み合わせを備える。オリゴペプチドは、フィブロネクチンのＣＳ‐１断片又はビトロネクチンの断片を含む。タンパク質は、フィブロネクチン又はビトロネクチンを含む。
図１Ｂの細胞培養用製品１００ｂは、図１Ａと類似する。図１Ｂにおいて、細胞培養用製品１００ｂは、基板１１０と、親水性共重合体層１２０ｂと、ペプチド鎖１３０とを具備する。基板１１０は、表面１１１を有し、親水性共重合体層１２０ｂは、基材１１０の表面１１１に設けられる。親水性共重合体層１２０ｂは、ポリビニルアルコール単位、ポリビニルアルコール誘導体単位及びカルボン酸基含有単位によって共重合されたものである。ペプチド鎖１３０は、それぞれ親水性の共重合体層１２０ｂの表面１２５に結合される。
本発明の実施例において、ポリビニルアルコール誘導体単位は、ポリビニルアセテート、ポリビニルメチルエーテル又はポリビニルエチルエーテルを含み、カルボン酸基含有単位は、イタコン酸を含む。
本発明の実施例において、親水性共重合体層１２０ｂの材料は、組成式１に示す一般式を有する。
そのうち、Ｒは、メチル、エチル又はアセチルであり、ｘ、ｙ、ｚは、それぞれポリビニルアルコール単位、ポリビニルアルコール誘導体単位及びカルボン酸基含有単位の含有量の割合を示す。
本発明の実施例において、親水性共重合体層１２０ｂにおけるポリビニルアルコール単位、ポリビニルアルコール誘導体単位及びカルボン酸基含有単位の含有量は、それぞれ約６５〜９８．７％、０〜３０％、１．３〜５％である。本発明の実施例において、親水性共重合体層１２０ｂにおけるポリビニルアルコール単位、ポリビニルアルコール誘導体単位及びカルボン酸基含有単位の含有量は、それぞれ約８５％、１０％、５％である。
図１Ｂは、親水性共重合体層１２０ｂが第１弾性層１２２及び第２弾性層１２４により構成されることで、図１Ａと異なっている。第１弾性層１２２及び第２弾性層１２４は、何れもポリビニルアルコール単位、ポリビニルアルコール誘導体単位及びカルボン酸基含有単位によって共重合されたものであるが、第１弾性層１２２及び第２弾性層１２４は弾性係数がそれぞれ異なっている。第１弾性層１２２及び第２弾性層１２４が異なる弾性係数を有するため、これにより、親水性共重合体層１２０ｂの弾性係数を制御することができる。本発明の実施例において、親水性共重合体層１２０ｂの弾性係数は、約１ｋＰａ〜１００ｋＰａの範囲内にある。
ペプチド鎖１３０は、それぞれ親水性の共重合体層１２０ｂの表面１２５に結合される。ペプチド鎖１３０は、アミノ酸により構成され、数多くのアミノ基を有するため、ペプチド鎖１３０上のアミノ基は、カルボン酸基含有単位上のカルボン酸基と反応してアミド結合を形成することができる。上記ペプチド鎖１３０は、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質又はこれらの組み合わせを含む。オリゴペプチドは、フィブロネクチンのＣＳ‐１断片又はビトロネクチンの断片を含む。タンパク質は、フィブロネクチン又はビトロネクチンを含む。
図１Ｃの細胞培養用製品１００ｃは、図１Ｂのものと類似する。図１Ｃにおいて、細胞培養用製品１００ｃは、基板１１０と、親水性共重合体層１２０ｃと、ペプチド鎖１３０とを具備する。基板１１０は、表面１１１を有し、親水性共重合体層１２０ｃは、基材１１０の表面１１１に設けられる。親水性共重合体層１２０ｃは、ポリビニルアルコール単位、ポリビニルアルコール誘導体単位及びカルボン酸基含有単位によって共重合されたものである。ペプチド鎖１３０は、それぞれ親水性の共重合体層１２０ｃの表面１２７に結合される。
本発明の実施例において、ポリビニルアルコール誘導体単位は、ポリビニルアセテート、ポリビニルメチルエーテル又はポリビニルエチルエーテルを含み、カルボン酸基含有単位は、イタコン酸を含む。
本発明の実施例において、親水性共重合体層１２０ｃの材料は、組成式１に示す一般式を有する。
そのうち、Ｒは、メチル、エチル又はアセチルであり、ｘ、ｙ、ｚは、それぞれポリビニルアルコール単位、ポリビニルアルコール誘導体単位及びカルボン酸基含有単位の含有量の割合を示す。
本発明の実施例において、親水性共重合体層１２０ｃにおけるポリビニルアルコール単位、ポリビニルアルコール誘導体単位及びカルボン酸基含有単位の含有量は、それぞれ約６５〜９８．７％、０〜３０％、１．３〜５％である。本発明の実施例において、親水性共重合体層１２０ｃにおけるポリビニルアルコール単位、ポリビニルアルコール誘導体単位及びカルボン酸基含有単位の含有量は、それぞれ約８５％、１０％、５％である。
図１Ｃは、親水性共重合体層１２０ｃが第１弾性層１２２、第２弾性層１２４及び第３弾性層１２６により構成されることで、図１Ｂと異なっている。第１弾性層１２２、第２弾性層１２４及び第３弾性層１２６は、何れもポリビニルアルコール単位、ポリビニルアルコール誘導体単位及びカルボン酸基含有単位によって共重合されたものであるが、第１弾性層１２２、第２弾性層１２４及び第３弾性層１２６は弾性係数がそれぞれ異なっている。第１弾性層１２２、第２弾性層１２４及び第３弾性層１２６が異なる弾性係数を有するため、これにより、親水性共重合体層１２０ｃの弾性係数を制御することができる。本発明の実施例において、親水性共重合体層１２０ｃの弾性係数は、約１ｋＰａ〜１００ｋＰａの範囲内にある。
ペプチド鎖１３０は、それぞれ親水性の共重合体層１２０ｃの表面１２７に結合される。ペプチド鎖１３０は、アミノ酸により構成され、数多くのアミノ基を有するため、ペプチド鎖１３０上のアミノ基は、カルボン酸基含有単位上のカルボン酸基と反応してアミド結合を形成することができる。上記ペプチド鎖１３０は、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質又はこれらの組み合わせを備える。オリゴペプチドは、フィブロネクチンのＣＳ‐１断片又はビトロネクチンの断片を含む。タンパク質は、フィブロネクチン又はビトロネクチンを含む。
図２は、本発明の実施例によって示される細胞培養用製品を製造するプロセスを断面図で表した図である。
図２（ａ）において、表面２１１を有する基板２１０を提供し、基板２１０の表面２１１に親水性共重合体層２２０ａを形成する。親水性共重合体層２２０ａは、共重合反応によって、複数のポリビニルアルコール単位、複数のポリビニルアルコール誘導体単位及び複数のカルボン酸基含有単位を共重合させたものである。本発明の実施例において、ポリビニルアルコール誘導体単位は、ポリビニルアセテート、ポリビニルメチルエーテル又はポリビニルエチルエーテルを含み、カルボン酸基含有単位は、イタコン酸を含む。
本発明の実施例において、先に親水性共重合体溶液を調製し、親水性共重合体溶液を基板２１０の表面２１１に塗布して、親水性共重合体層２２０ａを形成する工程を含む。この親水性共重合体溶液は、約０．０５〜０．２ｗｔ％の濃度で親水性共重合体を含む。図２（ａ）において、親水性共重合体層２２０ａは、９μｍより大きい厚さ（Ｄ１）を有する。
図２（ｂ）において、図２（ａ）の親水性共重合体層２２０ａにおけるポリビニルアルコール単位同士を架橋させて、親水性共重合体層２２０ｂを形成する架橋反応を行う。本発明の実施例において、硫酸の存在下で、親水性共重合体層におけるポリビニルアルコール単位をグルタルアルデヒドで架橋する。架橋反応を行い、架橋反応時間を制御することで、親水性共重合体層２２０ｂの弾性係数を調整・制御することができる。本発明の実施例において、架橋反応時間は、約０．５時間〜４８時間であり、親水性共重合体層２２０ｂの弾性係数は、約１ｋＰａ〜１００ｋＰａの範囲内にある。本発明の実施例において、親水性共重合体層２２０ｂは、約２．０〜９．０μｍの範囲にある厚さ（Ｄ２）を有する。
架橋反応において、図３に示すように、まず、図２（ａ）の構造を架橋反応液３１０に浸して、図２（ａ）の親水性共重合体層２２０ａが親水性共重合体層２２０ｂとなるように反応させる。本発明の実施例において、架橋反応液３１０には、０．１ｗｔ％のグルタルアルデヒド、１．０ｗｔ％の硫酸（Ｈ２ＳＯ４）及び２０．０ｗｔ％の硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）が含まれる。上記架橋反応は、反応スキーム（Scheme）１に示す通りである。
反応スキーム１において、親水性共重合体におけるポリビニルアルコール単位は、硫酸の作用で、グルタルアルデヒドと反応して、アセタール基（acetal group）の架橋を有する親水性共重合体を形成する。架橋反応の時間が長くなるにつれて、親水性共重合体層の架橋程度が高くなり、弾性係数もこれに伴って向上する。表１を参照されたい。架橋反応の時間が長くなるにつれて、親水性共重合体層の含水量が少なくなる。親水性共重合体層を乾燥させた後更に浸潤させると、架橋反応時間が長いほど、親水性共重合体層の厚さの差が小さくなる。
図２（ｃ）において、それぞれのペプチド鎖２３０を親水性共重合体層２２０ｃの表面２２１に結合する。ペプチド鎖２３０は、アミノ酸が重合されたものであり、骨格の一端にアミノ基（‐ＮＨ２）を有し、また、一部のアミノ酸は、側鎖として、アミノ基（‐ＮＨ２）を有する。ペプチド鎖２３０が一次構造である場合、ペプチド鎖２３０上のアミノ基は、親水性共重合体層２２０ｃにおけるカルボン酸基と反応して、アミド結合を形成する。ペプチド鎖２３０上のアミノ基は、ペプチド鎖２３０の一端、又はアミノ酸の側鎖であってよい。複数のペプチド鎖２３０は、それぞれ親水性共重合体層２２０ｃの表面２２１に結合される。
ペプチド鎖２３０が二次以上の構造である場合、ペプチド鎖２３０の一部のアミノ基は、二次以上の構造であるペプチド鎖２３０の表面に露出する可能性がある。これらのペプチド鎖２３０の表面に露出するアミノ基は、親水性共重合体層２２０ｃにおけるカルボン酸基と反応して、アミド結合を形成する。ペプチド鎖２３０上のアミノ基は、ペプチド鎖２３０の一端、又はアミノ酸の側鎖であってよい。複数のペプチド鎖２３０は、それぞれ親水性共重合体層２２０ｃの表面２２１に結合される。
本発明の実施例において、ペプチド鎖２３０は、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質又はこれらの組み合わせを含む。オリゴペプチドは、フィブロネクチンの断片（ＣＳ‐１）又はビトロネクチンの断片を含む。タンパク質は、フィブロネクチン又はビトロネクチンを含む。
上記それぞれのペプチド鎖を親水性共重合体層の表面に結合する場合は、反応スキーム２に示す通りである。
反応スキーム２において、親水性共重合体層の表面に単に一つのカルボン酸基が簡単に示される。しかしながら、親水性共重合体層の実際の構造において、親水性共重合体層の表面に、数多くのカルボン酸基を含む。また、これらのカルボン酸基は、何れも反応スキーム２に示す反応を行って、数多くのペプチド鎖をそれぞれ親水性共重合体層の表面に結合できる。ペプチド鎖上のアミノ基は、親水性共重合体層におけるカルボン酸基と反応して、アミド結合を形成する。ペプチド鎖上のアミノ基は、ペプチド鎖の一端、又はアミノ酸の側鎖であってよい。ペプチド鎖のそれぞれは、親水性共重合体層の表面に結合される。
図４は、本発明の実施例によって示される細胞培養用製品を製造するプロセスのフロー図である。図４の工程４１０〜４４０について、図２の細胞培養用製品を製造するプロセスを断面図で表した図に合わせて、細胞培養用製品を製造する各工程を説明する。
工程４１０において、表面２１１を有する基板２１０を提供する。次に、親水性共重合体層２２０ａを基板２１０の表面２１１に形成する。そのうち、工程４２０に説明されるように、親水性共重合体層２２０ａは、共重合反応によって、複数のポリビニルアルコール単位、複数のポリビニルアルコール誘導体単位及び複数のカルボン酸基含有単位を共重合させたものである。本発明の実施例において、ポリビニルアルコール誘導体単位は、ポリビニルアセテート、ポリビニルメチルエーテル又はポリビニルエチルエーテルを含む。カルボン酸基含有単位は、イタコン酸を含む。図２（ａ）を参照されたい。親水性共重合体層２２０ａは、９μｍより大きい厚さ（Ｄ１）を有する。
本発明の実施例において、先に親水性共重合体溶液を調製し、親水性共重合体溶液を基板の表面に塗布して、親水性共重合体層２２０ａを形成する工程を含む。この親水性共重合体溶液は、約０．０５〜０．２ｗｔ％の濃度で親水性共重合体を含む。
工程４３０において、親水性共重合体層２２０ａにおけるポリビニルアルコール単位同士を架橋させて、親水性共重合体層２００ｂを形成する架橋反応を行う。本発明の実施例において、硫酸の存在下で、親水性共重合体におけるポリビニルアルコール単位をグルタルアルデヒドで架橋する。架橋反応を行い、架橋反応時間を制御することで、親水性共重合体層２００ｂの弾性係数を調整・制御することができる。本発明の実施例において、架橋反応時間は、約０．５時間〜４８時間であり、親水性共重合体層２００ｂの弾性係数は、約１ｋＰａ〜１００ｋＰａの範囲内にある。図２（ｂ）を参照されたい。親水性共重合体層２００ｂは、約２．０〜９．０μｍの範囲にある厚さ（Ｄ２）を有する。
工程４４０は、それぞれのペプチド鎖２３０を親水性共重合体層２２０ｃの表面２２１に結合する。本発明の実施例において、ペプチド鎖２３０は、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質又はこれらの組み合わせを備える。オリゴペプチドは、フィブロネクチンの断片（ＣＳ‐１）又はビトロネクチンの断片を含む。タンパク質は、フィブロネクチン又はビトロネクチンを含む。
図５は、本発明の実施例によって示される未分化幹細胞を培養する段階のフロー図である。図５の工程５１０〜５３０において、図１Ａの細胞培養用製品１００ａによって細胞の培養を行う場合の各工程について説明する。
工程５１０において、まず、基板１１０と、基板１１０に位置する親水性共重合体層１２０ａと、それぞれ親水性共重合体層１２０ａに結合されるペプチド鎖１３０とを具備する細胞培養用製品１００ａを提供する。そのうち、親水性共重合体層１２０ａは、共重合反応によって、ポリビニルアルコール単位、ポリビニルアルコール誘導体単位及びカルボン酸基含有単位を共重合させたものである。本発明の一実施形態において、親水性共重合体層１２０ａにおけるポリビニルアルコール単位、ポリビニルアルコール誘導体単位及びカルボン酸基含有単位の含有量は、それぞれ約６５〜９８．７％、０〜３０％、１．３〜５％である。本発明の一実施形態において、ペプチド鎖は、フィブロネクチンのＣＳ‐１断片又はビトロネクチンを含む。
工程５２０において、細胞培養用製品１００ａ上のペプチド鎖１３０に結合される未分化幹細胞を、細胞培養用製品１００ａ上及び化学成分が明確な細胞培養液の中で培養する。本発明の一実施形態において、幹細胞は、ヒト成体幹細胞、ヒト胎児幹細胞（ｈＦＳＣｓ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）及びヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣｓ）を含む。本発明の一実施形態において、化学成分が明確な細胞培養液は細胞成長因子及び形質転換成長因子を更に含む。
工程５３０において、化学成分が明確な細胞培養液中で、未分化幹細胞を少なくとも５代継代培養し続ける。本発明の一実施形態において、化学成分が明確な細胞培養液中で、未分化幹細胞を少なくとも１０継代培養し続ける。
図６は、本発明の実施例によって示される幹細胞分化を調整・制御する段階のフロー図である。図６の工程６１０〜６４０において、図１Ａの細胞培養用製品１００ａによって幹細胞分化を調整・制御する場合の各工程について説明する。
工程６１０において、基板１１０と、基板１１０に位置する親水性共重合体層１２０ａと、それぞれ親水性共重合体層１２０ａに結合されるペプチド鎖１３０とを具備する細胞培養用製品１００ａを提供する。親水性共重合体層１２０ａは、共重合反応によって、ポリビニルアルコール単位、ポリビニルアルコール誘導体単位及びカルボン酸基含有単位を共重合させたものである。本発明の実施例において、親水性共重合体層１２０ａにおけるポリビニルアルコール単位、ポリビニルアルコール誘導体単位及びカルボン酸基含有単位の含有量は、それぞれ約６５〜９８．７％、０〜３０％、１．３〜５％である。本発明の実施例において、ペプチド鎖は、フィブロネクチンのＣＳ‐１断片又はビトロネクチンを含む。
工程６２０において、親水性共重合体層１２０ａの架橋反応時間を調整・制御することにより、親水性共重合体層１２０ａに所定の弾性係数を持たせる。架橋反応時間を制御することで、親水性共重合体層１２０ａの弾性係数を調整・制御することができる。本発明の実施例において、架橋反応時間は、約０．５時間〜４８時間であり、また、親水性共重合体層１２０ａの弾性係数は、約１ｋＰａ〜１００ｋＰａの範囲内にある。
工程６３０において、細胞培養用製品１００ａ上のペプチド鎖１３０に結合される未分化幹細胞を、細胞培養用製品１００ａ上及び化学成分が明確な細胞培養液の中で培養する。本発明の実施例において、幹細胞は、ヒト成体幹細胞、ヒト胎児幹細胞（ｈＦＳＣｓ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）及び誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）を含む。
工程６４０において、インテグリンを加え、所定の弾性係数範囲を有する親水性共重合体層１２０ａによって、未分化幹細胞の分化作用を誘導して、未分化幹細胞を所望の細胞株に分化させる。本発明の実施例において、化学成分が明確な細胞培養液は細胞成長因子及び形質転換成長因子を更に含む。本発明の実施例において、所望の細胞株は、神経細胞、筋細胞又は骨芽細胞を含む。
本発明の実施例において、親水性共重合体層の弾性係数が約１ｋＰａである場合、未分化幹細胞の神経細胞への分化を誘導することができる。親水性共重合体層の弾性係数が約１０ｋＰａである場合、未分化幹細胞の筋細胞への分化を誘導することができる。親水性共重合体層の弾性係数が約１００ｋＰａである場合、未分化幹細胞の骨芽細胞への分化を誘導することができる。
本発明の実施例において、架橋反応時間を制御することで、親水性共重合体層の弾性係数を調整・制御することができる。表２には実施例１〜５及び比較例１の弾性係数が示される。
表２から分かるように、架橋反応時間が長くなるにつれて、親水性共重合体層の弾性係数が大きくなる。実施例１は、架橋反応時間が０．５時間であり、親水性共重合体層の弾性係数が最小（１１．１）である。実施例５は、架橋反応時間が４８時間であり、親水性共重合体層の弾性係数が最大（９１．２）である。比較例１の疎水性材料（ＴＣＰＳ）に比べて、本発明の実施例１〜５は、乾燥時間を制御することで、親水性共重合体層の弾性係数を調整・制御することができる。
表３を参照されたい。一方、親水性共重合体層の架橋反応時間が長いほど、弾性係数が高く、親水性共重合体層上に培養される幹細胞分化率もこれに伴って向上する。表３には、実施例６〜１１及び比較例２の幹細胞分化率（differentiation ratio）が示される。
表３から分かるように、親水性共重合体層の架橋反応時間が長くなるにつれて、親水性共重合体層の弾性係数が大きくなり、この親水性共重合体層上に培養される幹細胞分化率も大きくなる。実施例６は、架橋反応時間が１時間であり、幹細胞分化率が最低である。実施例１１は、架橋反応時間が４８時間であり、幹細胞分化率が最高（６０％）である。比較例２に比べて、本発明の実施例は、架橋反応時間を制御することで、親水性共重合体層の弾性係数を調整・制御することができ、幹細胞の分化効率を明らかに向上させることができる。
図７Ａは、図１Ａの細胞培養用製品１００ａによって細胞を培養する平面図である。細胞培養用製品は、基板１１０と、親水性共重合体層１２０ａと、を具備し、数多くの細胞コロニー７１０は、親水性共重合体層１２０上で培養される。本発明の実施例において、細胞コロニー７１０は、ヒト成体幹細胞、ヒト胎児幹細胞（ｈＦＳＣｓ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）及びヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣｓ）を含む。
本発明の実施例において、親水性共重合体層１２０ａは、共重合反応によって、ポリビニルアルコール単位、ポリビニルアルコール誘導体単位及びカルボン酸基含有単位を共重合させたものである。ポリビニルアルコール誘導体単位は、ポリビニルアセテート、ポリビニルメチルエーテル又はポリビニルエチルエーテルを含み、カルボン酸基含有単位は、イタコン酸を含む。
図７Ｂは、図１Ａの細胞培養用製品１００ａによって細胞を培養する様子を表す断面図である。図７Ｂにおいて、細胞培養用製品１００ａは、基板１１０と、親水性共重合体層１２０ａと、ペプチド鎖１３０と、を具備する。親水性共重合体層１２０ａは、基板１１０に位置し、ペプチド鎖１３０は、それぞれ親水性の共重合体層１２０ａの表面に結合される。
細胞７２０は、親水性共重合体層１２０ａ上で培養される。細胞７２０は、受容体７２１を数多く有し、受容体７２１は、特異的相互作用力によって親水性共重合体層１２０ａの表面上のペプチド鎖１３０と結合して、親水性共重合体層１２０ａの表面に固定されることができる。
本発明の実施例において、細胞７２０は、ヒト成体幹細胞、ヒト胎児幹細胞（ｈＦＳＣｓ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）及びヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣｓ）を含む。本発明の実施例において、ペプチド鎖１３０は、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質又はこれらの組み合わせを備える。オリゴペプチドは、フィブロネクチンのＣＳ‐１断片又はビトロネクチンの断片を含む。タンパク質は、フィブロネクチン又はビトロネクチンを含む。
本発明の実施例において、親水性共重合体層１２０ａは、共重合反応によって、ポリビニルアルコール単位、ポリビニルアルコール誘導体単位及びカルボン酸基含有単位を共重合させたものである。ポリビニルアルコール誘導体単位は、ポリビニルアセテート、ポリビニルメチルエーテル又はポリビニルエチルエーテルを含み、カルボン酸基含有単位は、イタコン酸を含む。
図８（ａ）は、比較例２の細胞培養用製品による細胞培養の様子を表す画像である。比較例２の細胞培養用製品は、Corningから購入され、型番がCorning Synthemaxである。図８（ａ）において、比較例２の細胞培養用製品によって細胞を培養する場合は、細胞コロニー（矢印）の密度が低い。
図８（ｂ）は、実施例７の細胞培養用製品による細胞培養の様子を表す画像である。実施例７において、親水性共重合体層の架橋反応時間は４時間である。図８（ａ）に比べて、実施例７の細胞培養用製品によって細胞を培養する場合は、細胞コロニー（矢印）の密度が高い。
本発明の実施例において、細胞培養用製品は、それぞれ親水性共重合体層上に結合されるペプチド鎖と、培養しようとする細胞表面の受容体が結合されることによって、細胞が親水性共重合体層の表面に接着され、細胞培養液中に浮遊しにくくなり、培養しようとする細胞の死亡を引き起こさない。親水性共重合体層は、好適な親水性を有するため、細胞が細胞培養液に浮遊しにくくなり、培養細胞の生存率を向上させる。
一方、自然環境では、未分化幹細胞と組織との間に一定範囲の弾性応力があり、この弾性応力により、未分化幹細胞の所定細胞への分化を誘導することができる。本発明の実施例により提供される細胞培養用製品は、親水性共重合体層の弾性係数を調整・制御することで、幹細胞の特定細胞種への分化を誘導し、幹細胞分化率を向上させることができる。
本発明では実施形態を前述の通り開示したが、これは本発明を限定するものではなく、当業者であれば、本発明の精神と領域から逸脱しない限り、多様の変更や修正を加えることができる。従って、本発明の保護範囲は、特許請求の範囲で指定した内容を基準とする。
１００ａ、１００ｂ、１００ｃ 細胞培養用製品
１１０、２１０ 基板
１１１、１２１、１２５、１２７、２１１、２２１ 表面
１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ、２２０ａ、２２０ｂ、２２０ｃ 親水性共重合体層
１２２ 第１弾性層
１２４ 第２弾性層
１２６ 第３弾性層
１３０、２３０ ペプチド鎖
３１０ 架橋反応液
４１０、４２０、４３０、４４０、５１０、５２０、５３０、６１０、６２０、６３０、６４０ 工程
７１０ 細胞コロニー
７２０ 細胞
７２１ 受容体
Ｄ１、Ｄ２ 厚さ
１１０、２１０ 基板
１１１、１２１、１２５、１２７、２１１、２２１ 表面
１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ、２２０ａ、２２０ｂ、２２０ｃ 親水性共重合体層
１２２ 第１弾性層
１２４ 第２弾性層
１２６ 第３弾性層
１３０、２３０ ペプチド鎖
３１０ 架橋反応液
４１０、４２０、４３０、４４０、５１０、５２０、５３０、６１０、６２０、６３０、６４０ 工程
７１０ 細胞コロニー
７２０ 細胞
７２１ 受容体
Ｄ１、Ｄ２ 厚さ
Claims (18)
- 表面を有する基板、
前記基板の前記表面に設けられ、複数のポリビニルアルコール単位、複数のポリビニルアルコール誘導体単位及び複数のカルボン酸基含有単位によって共重合された親水性共重合体層、並びに
前記親水性共重合体層の表面にそれぞれに結合される複数のペプチド鎖、
を具備し、前記親水性共重合体層が、１ｋＰａ〜１００ｋＰａの範囲内にある弾性係数を有する細胞培養用製品。 - ポリビニルアルコール誘導体単位が、ポリビニルアセテート、ポリビニルメチルエーテル又はポリビニルエチルエーテルを含む、請求項１に記載の細胞培養用製品。
- カルボン酸基含有単位が、イタコン酸を含む、請求項１または２に記載の細胞培養用製品。
- 親水性共重合体層において、前記ポリビニルアルコール単位、前記ポリビニルアルコール誘導体単位及び前記カルボン酸基含有単位の含有量が、それぞれ約６５〜９８．７％、０〜３０％および１．３〜５％である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養用製品。
- 親水性共重合体層において、前記ポリビニルアルコール単位、前記ポリビニルアルコール誘導体単位及び前記カルボン酸基含有単位の含有量が、それぞれ約８５％、１０％および５％である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞培養用製品。
- ペプチド鎖が、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質又はこれらの組み合わせを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞培養用製品。
- オリゴペプチドが、フィブロネクチンのＣＳ‐１断片又はビトロネクチンの断片を含む、請求項６に記載の細胞培養用製品。
- タンパク質が、フィブロネクチン又はビトロネクチンを含む、請求項６に記載の細胞培養用製品。
- ペプチド鎖のアミノ酸が、アミド結合によって、カルボン酸基含有単位にそれぞれに結合される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞培養用製品。
- 表面を有する基板を提供する工程と、
共重合反応によって、複数のポリビニルアルコール単位、複数のポリビニルアルコール誘導体単位及び複数のカルボン酸基含有単位を共重合させた親水性共重合体層を、前記基板に形成する工程と、
前記親水性共重合体層における前記ポリエチレングリコール単位同士を架橋させる架橋反応を行う工程と、
複数のペプチド鎖をそれぞれに前記親水性共重合体層の表面に結合する工程と
を含み、前記架橋反応を行う工程が、前記架橋反応の架橋反応時間を制御することにより、１ｋＰａ〜１００ｋＰａの範囲内にある親水性共重合体層の弾性係数を調整・制御する工程を含む、細胞培養用製品の製造方法。 - 親水性共重合体層を形成する工程が、親水性共重合体溶液を調製し、前記親水性共重合体溶液を前記基板の前記表面に塗布することを含む、請求項１０に記載の製造方法。
- 親水性共重合体溶液が、約０．０５〜０．２ｗｔ％の濃度で親水性共重合体を含む、請求項１１に記載の製造方法。
- ポリビニルアルコール誘導体単位が、ポリビニルアセテート、ポリビニルメチルエーテル又はポリビニルエチルエーテルを含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の製造方法。
- カルボン酸基含有単位が、イタコン酸を含む、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の製造方法。
- ペプチド鎖が、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質又はこれらの組み合わせを含む、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の製造方法。
- オリゴペプチドが、フィブロネクチンの断片（ＣＳ‐１）又はビトロネクチンの断片を含む、請求項１５に記載の製造方法。
- タンパク質が、フィブロネクチン又はビトロネクチンを含む、請求項１５に記載の製造方法。
- 架橋反応を行う工程が、硫酸の存在下で、親水性共重合体層におけるポリビニルアルコール単位をグルタルアルデヒドで架橋することを含む、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の製造方法。
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