TW201912781A

TW201912781A - 細胞層片形成構件、細胞層片形成構件的製造方法、及細胞層片的製造方法

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Publication number: TW201912781A
Application number: TW107129194A
Authority: TW
Inventors: 得能壽子; 本鄉弘毅; 篠塚啓
Original assignee: 日商王子控股股份有限公司
Priority date: 2017-08-23
Filing date: 2018-08-22
Publication date: 2019-04-01
Also published as: JP7000896B2; JP2019037220A; EP3674390A4; TWI810202B; CN111051492A; US20210130762A1; EP3674390A1; CN111051492B

Abstract

一種細胞層片形成構件，其具備用以形成細胞層片的表面，表面具備多個平坦部與多個凹凸部。各平坦部具有往第1方向延伸的形狀，且多個平坦部排列在表面的整體中與第1方向交叉的第2方向。凸部與凹部的任一者為段差構造，各凹凸部包含填充在相鄰的平坦部之間的多個段差構造，段差構造的節距為100nm以上10μm以下。

Description

細胞層片形成構件、細胞層片形成構件的製造方法、及細胞層片的製造方法

本發明是關於一種用以形成細胞層片的細胞層片形成構件、細胞層片形成構件的製造方法、及細胞層片的製造方法。

以往已提出各種用以培養細胞的方法。例如專利文獻1記載的細胞培養方法，是使用設有經過細微的側壁區隔的多個空間構造的細胞培養用基材，以使得空間構造相互連通的方向與細胞的伸長方向一致的方式控制細胞的配向性。

先前技術文獻　　專利文獻　　專利文獻1：日本特開2006-191809號公報

發明所欲解決之課題　　上述細胞培養用基材中，側壁所具備的側壁面或上表面等平坦面會發揮細胞培養中類似基底的功能，如此一來，能夠使細胞培養用基材培養的細胞的伸長方向集中在平坦面的延伸方向。另一方面，除了側壁面或上表面之外，空間構造的底面也是平坦面，而且空間構造的底面為與側壁面相連的面，也會往與側壁面的延伸方向或上表面的延伸方向不同的方向擴展。因此，上述細胞培養用基材中，細胞的伸長方向容易集中在各平坦面的連接方向或各平坦面的擴展方向，也就是側壁面的延伸方向以外的其他方向，結果從集中細胞的伸長方向的觀點而言，依然有課題尚待解決。

本發明是有鑑於上述實情而完成者，其目的在於提供一種能夠提高細胞層片中細胞的配向性的細胞層片形成構件、細胞層片形成構件的製造方法、及細胞層片的製造方法。

用以解決課題之手段

用以解決上述課題的細胞層片形成構件，其具備用以形成細胞層片的表面，前述表面具備多個平坦部與多個凹凸部。各平坦部具有往第1方向延伸的形狀，且前述多個平坦部排列在前述表面的整體中與前述第1方向交叉的第2方向。此外，凸部與凹部的任一者為段差構造，各凹凸部包含填充在相鄰的前述平坦部之間的多個前述段差構造，前述段差構造的節距為100nm以上10μm以下。

用以解決上述課題的細胞層片形成構件的製造方法包含如下步驟：形成凹版的步驟；及藉由前述凹版的轉印，形成用以形成細胞層片的細胞層片形成構件的表面的步驟。前述凹版具備多個平坦部與凹凸部，該平坦部具有往第1方向延伸的形狀，且排列在前述表面的整體中與前述第1方向交叉的第2方向，凸部與凹部的任一者為段差構造，該凹凸部包含填充在相鄰的前述平坦部之間的多個前述段差構造，前述段差構造的節距為100nm以上10μm以下。此外，前述形成凹版的步驟包含使用光蝕刻法、膠體蝕刻法、陽極氧化法、及干涉曝光法之至少1種來形成前述凹凸部。

用以解決上述課題的細胞層片的製造方法包含如下步驟：使細胞黏接在前述細胞層片形成構件的表面，於前述細胞層片形成構件的表面形成細胞層片的步驟，該細胞對於前述平坦部及前述凹凸部中任一者的黏接較對於另一者的黏接具有優勢；及從前述細胞層片形成構件的表面剝離細胞層片的步驟。

上述各構成中，平坦部與凹凸部構成用以形成細胞層片的表面，且具有一者受到另一者區隔的關係。因此，對於平坦部的黏接具有優勢的細胞也好，或對於凹凸部的黏接具有優勢的細胞也好，只要細胞優先對一者的構造體黏接，即對另一者的構造體的黏接形成劣勢。因此，在一者的構造體區隔另一者的構造體的細胞層片形成構件的構造上，配合平坦部與凹凸部之間黏接性不同之細胞的性質，細胞的伸長方向會集中在雙方的構造體的延伸方向之第1方向上。結果往二維方向擴展的細胞層片中，能夠將細胞的伸長方向集中在一維方向，也就是說能夠使細胞的配向性提高。其中，由於細胞層片形成構件的表面具備平坦部與凹凸部，對於平坦部的黏接具有優勢的細胞和對於凹凸部的黏接具有優勢的細胞這兩者能夠適用共通的細胞層片形成構件，也就是說能夠提高細胞層片形成構件的泛用性。

上述細胞層片形成構件中，前述段差構造為凸部，前述凹凸部在相鄰的前述平坦部所包夾的凹部的底面具備多個前述凸部，各凸部的前端面也能夠與前述平坦部齊平。或者，在前述細胞層片形成構件的厚度方向中，前述凹凸部的前端面的高度與前述平坦部的高度間的差能夠為0.5μm以下，較佳為0.3μm以下。根據這種構成，由於凹凸部的頂面與平坦部成為齊平，或者凹凸部的前端面與平坦部之間的高低差為0.5μm以下，較佳為0.3μm以下，以此方式覆蓋凹凸部與平坦部所形成的細胞層片中，能夠提高其平坦性。

上述細胞層片形成構件中，從與前述表面對向的方向觀看，前述段差構造具有圓形狀，且前述段差構造的直徑為前述節距的50％以上100％以下，前述段差構造的長寬比也能夠為0.1以上10以下。根據這種構成，對於平坦部的黏接的優勢性和對於凹凸部的黏接的優勢性將視細胞所具有的黏接性而容易適當地顯現。因此，能夠進一步輕易地獲得使細胞的配向性提高的上述效果。

上述細胞層片形成構件中所培養的細胞並無特別限定，以生體内特別是具有配向性而存在之肌母細胞、纖維母細胞、及心肌細胞之至少1種為宜。前述平坦部的短邊方向的長度為10μm以上50μm以下，相鄰的前述平坦部之間的前述短邊方向的長度也能夠為10μm以上50μm以下。根據這種構成，平坦部的短邊方向的長度及凹凸部的短邊方向的長度具有適合肌母細胞、纖維母細胞、及心肌細胞的配向控制的尺寸。因此，在肌母細胞的層片、纖維母細胞的層片、及心肌細胞的層片中能夠提高各別的配向性。

上述細胞層片形成構件的表面也能夠具有親水性或疏水性。

上述細胞層片形成構件的表面也能夠由金屬或有機物構成。

以下針對細胞層片形成構件、細胞層片形成構件的製造方法、及細胞層片的製造方法之一實施形態進行說明。首先說明細胞層片形成構件的構成，接著再說明細胞層片形成構件的製造方法、細胞層片的製造方法。

［細胞層片形成構件］

如圖1（a）所示，細胞層片形成構件100例如為載置於培養盤之培養皿110中的片材。培養盤將細胞懸浮液保持在由培養皿110和蓋120所包圍的空間。細胞懸浮液所包含的細胞之一例為肌母細胞、纖維母細胞、心肌細胞。

如圖1（b）所示，細胞層片形成構件100的表面111具備多個平坦部130與多個凹凸部140。凹凸部140的構成包含多個段差構造，多個段差構造填充在相鄰的平坦部130之間。段差構造為凸部或凹部。其中，本實施形態中段差構造為凸部141。凹凸部140具備被相鄰的平坦部130所包夾的凹部與位於凹部的底面的多個凸部141。換句話說，多個凸部141在細胞層片形成構件100中被設置於相當於被相鄰的平坦部130所包夾的部分的凹部的底面。

如圖1（c）所示，各平坦部130為往1個方向之第1方向（圖1（c）的上下方向）延伸的平坦面。多個平坦部130在表面111的整體中排列在與第1方向垂直的第2方向（圖1（c）的左右方向）。各凹凸部140也是往第1方向延伸。此外，多個凹凸部140在表面111的整體中排列在第2方向。此構成如圖8及圖9所示，也能夠藉由掃描式電子顯微鏡拍攝細胞層片形成構件100的表面的影像而得知。

凹凸部140的構成要素之各凸部141從與表面111對向的方向觀看，例如位於三角柵格的各頂點。各凹凸部140在第1方向及第2方向反覆著凸部141此種的配列。只要是凸部141位於三角柵格的各頂點的凹凸部140，能夠藉由將用以形成凸部141的母版作為適用於形成微小的反覆構造的遮罩，例如藉由將單粒子膜作為遮罩的蝕刻法來形成。

從與表面111對向的方向觀看，各凸部141具有例如圓形狀。相鄰的凸部141的中心間的距離的眾數為凸部141的節距。此外，凸部141的俯視形狀中凸部的最大寬度為凸部141的直徑。

從動物細胞，特別是上述肌母細胞、纖維母細胞、及心肌細胞的伸長方向集中在第1方向的觀點而言，較佳為凸部141的節距滿足下述（A）、（B）之構成。也就是說，從平坦部130及凹凸部140對於動物細胞、特別是上述肌母細胞、纖維母細胞、及心肌細胞等的黏接的優劣在平坦部130與凹凸部140之間被明確地區隔的觀點而言，較佳為凸部141的節距滿足下述（A）、（B）之構成。

（A）凸部141的節距：100nm以上10μm以下

（B）凸部141的直徑：凸部141的節距的50％以上100％以下

各平坦部130的第2方向（短邊方向）的長度為平坦部130的寬度。此外，相鄰的平坦部130間的第2方向（短邊方向）的長度為凹凸部140的寬度。

平坦部130的寬度及凹凸部140的寬度例如為培養對象的細胞的大小（5μm以上100μm以下）的1／10倍以上10倍以下。從動物細胞、特別是上述肌母細胞、纖維母細胞、及心肌細胞的伸長方向容易集中在第1方向的觀點而言，較佳為平坦部130的寬度及凹凸部140的寬度滿足下述（C）、（D）之構成。

（C）平坦部130的寬度：10μm以上50μm以下

（D）凹凸部140的寬度：10μm以上50μm以下

如圖1（d）所示，凹凸部140在相鄰的凸部141之間，及平坦部130與其相鄰的凸部141之間也能夠具備凹部142。由於多個凸部141散置在凹凸部140中，故凸部141間的空間之凹部142在凹凸部140中於第1方向及第2方向相連。

在細胞層片形成構件100的厚度方向中，凹部142的底面與平坦部130之間的長度為平坦部130的高度。此外，在細胞層片形成構件100的厚度方向中，各凸部141的前端面與平坦部130之間的高低差為邊界段差。凹部142的底面與各凸部141的前端面的高低差為凸部141的高度。各凸部141的前端面與平坦部130齊平的構成中，平坦部130的高度與凸部141的高度彼此相同。凸部141的節距相對於凸部141的高度之比為凸部141的長寬比。

從提高細胞層片的平坦性的觀點而言，較佳為邊界段差滿足下述（E）之構成。從提高在凹凸部140的構造上的穩定性的觀點而言，又從容易形成凹凸部140的觀點而言，較佳為凸部141的高度滿足下述（F）之構成，又凸部141的長寬比滿足下述（G）之構成。

（E）邊界段差：0.5μm以下，較佳為0.3μm以下

（F）凸部141的高度：50nm以上5μm以下

（G）凸部141的長寬比：0.1以上10以下

平坦部130與凹凸部140構成用以形成細胞層片的表面，且具有一者被另一者區隔的關係。此外，只要滿足上述（A）、（B）之構成，對於平坦部130的黏接具有優勢的細胞也好，或對於凹凸部140的黏接具有優勢的細胞也好，只要該細胞優先對一者的構造體黏接，即對另一者的構造體的黏接形成劣勢。因此，配合此種細胞的特徴，細胞的伸長方向會集中在雙方的構造體的延伸方向之第1方向上。結果往沿著表面111的二維方向擴展的細胞層片中，能夠將細胞的伸長方向集中在一維方向，也就是說能夠使細胞的配向性提高。

此外，滿足上述（E）之構成，特別是各凸部141的前端面與平坦部130齊平的構成，在以覆蓋凹凸部140與平坦部130的方式形成的細胞層片中，能夠提高其平坦性。進而，滿足上述（F）之構成能夠更進一步提高細胞層片的平坦性。

其中，由於細胞層片形成構件100的表面111具備平坦部130與凹凸部140，對於平坦部130的黏接具有優勢的細胞和對於凹凸部140的黏接具有優勢的細胞這兩者能夠適用共通的細胞層片形成構件100。也就是說，能夠提高細胞層片形成構件100的泛用性。

此外，從提高細胞的黏接性的目的而言，細胞層片形成構件100的表面111也能夠塗布包含例如細胞外基質、聚合物、及凝膠等黏接因子的有機物，或者為由金屬構成的面。細胞外基質之例能夠列舉層連結蛋白（laminin）、膠原蛋白、明膠、纖網蛋白（fibronectin）、聚離胺酸（PDL或PLL）、及玻尿酸等，但不限於此。此外，從提高細胞的黏接性或細胞層片的平坦性的目的而言，細胞層片形成構件100的表面111也能夠具有親水性或疏水性。

此外，為了在細胞層片形成後細胞層片的剝離、回收容易進行，也能夠塗布刺激回應性材料。刺激回應性材料較佳為隨著溫度變化水親和性跟著變化的溫度回應性聚合物。具體而言較佳為聚-N-異丙基丙烯醯胺（PIPAAm）。刺激回應性材料能夠使用慣用的塗布方法來塗布基材，也能夠對刺激回應性材料處理過的基材使用如下所述的方法來加工構造。

［細胞層片形成構件的製造方法］

接著，針對細胞層片形成構件的製造方法之一例進行說明。其中，以下的說明中是使用奈米壓印法藉由凹版150的轉印而形成細胞層片形成構件的表面111。

如圖2所示，細胞層片形成構件的製造方法包含形成凹版150的步驟、及藉由凹版150的轉印而形成細胞層片形成構件100的表面111的步驟。

凹版150的下表面具有往第1方向（與紙面垂直的方向）延伸的形狀，且具備多個平坦部與凹凸部，該平坦部排列在與第1方向交叉的第2方向（紙面的左右方向），該凹凸部由填充在相鄰的平坦部之間的多個段差構造構成。凹版150的平坦部為藉由轉印而用以形成細胞層片形成構件100的平坦部130的部分。凹版150的凹凸部為藉由轉印而用以形成細胞層片形成構件100的凹凸部140的部分。

凹版150的段差構造為凸部或凹部。其中，本實施形態中凹版150的段差構造為用以形成凸部141的凹部151，凹部151的節距為100nm以上10μm以下。在形成凹版150的步驟中，例如對用以形成凹版150的矽基板使用光蝕刻法、膠體蝕刻法、陽極氧化法、及干涉曝光法之至少1種進行蝕刻來形成凹凸部。此外，凹版150本身也能夠藉由從母版盤轉印1次或者多次而獲得。母版是被製作成凹版150的表面形狀所對應的形狀，其係例如對矽基板使用光蝕刻法、膠體蝕刻法、陽極氧化法、及干涉曝光法之至少1種進行蝕刻而得。

接著，使用以形成細胞層片形成構件100的基材160的表面111與凹版150的下表面對置。基材160的形成材料例如為熱塑性樹脂或光硬化性樹脂。然後，在基材160具有流動性的狀態下將凹版150的下表面往基材160的表面111進行擠壓。接著，在基材160的流動性被抑制的狀態下將凹版150從基材160的表面111脫模。以此方式，在基材160的表面111轉印有凹版150的凹部151，而形成平坦部130與凹凸部140。

從提高細胞的黏接性的目的而言，基材160的形成材料的熱塑性樹脂或光硬化性樹脂的表面也能夠塗布包含例如細胞外基質、聚合物、凝膠等黏接因子的有機物。細胞外基質之例能夠列舉層連結蛋白、膠原蛋白、明膠、纖網蛋白、聚離胺酸（PDL或PLL）、及玻尿酸等，但不限於此。此外，基材160的形成材料也能夠使用多醣類或蛋白質等生體材料。

［細胞層片的製造方法］

接著針對使用細胞層片形成構件100所製造的細胞層片進行說明。

如圖3（a）所示，位於細胞層片形成構件100的表面111上的細胞懸浮液包含例如與平坦部130黏接的細胞S1。此時，各平坦部130往凹凸部140的長邊方向（第1方向）延伸，各平坦部130的寬度為一般細胞大小的數倍程度。因此，如圖3（b）所示，細胞S1的位置會優先分布在平坦部130的範圍内，細胞S1其細胞的長軸方向配置在第1方向並連接成直線狀。也就是說，細胞S1的伸長方向被控制成集中在平坦部130的長邊方向。圖6表示使用細胞層片形成構件100所培養的肌母細胞的一例，同圖6所示之例中，肌母細胞的伸長方向被控制集中在同一方向。

其中，如圖3（c）所示，未滿足上述（A）的細胞層片形成基材中，由於細胞S1的配向性未受控制，故細胞S1的長軸方向呈隨機方向配置。圖7表示作為參考例之使用市售細胞培養盤培養的肌母細胞的一例，同圖7所示之例中，肌母細胞的伸長方向呈隨機配置。

如圖4（a）所示，位於細胞層片形成構件100的表面111上的細胞懸浮液包含例如與凹凸部140黏接的細胞S2。此時，各凹凸部140往凹凸部140的長邊方向（第1方向）延伸，各凹凸部140的寬度為一般細胞大小的數倍程度。因此，如圖4（b）所示，細胞S2的位置優先分布在凹凸部140的範圍内，細胞S2其細胞的長軸方向配置在第1方向並連接成直線狀。也就是說，細胞S2的伸長方向被控制集中在凹凸部140的長邊方向。

其中，如圖4（c）所示，未滿足上述（A）的細胞層片形成基材中，由於細胞S2的配向性未受控制，故細胞S2的長軸方向呈隨機方向存在。

另一方面，滿足上述（A）的細胞層片形成基材中，如圖5（a）所示，細胞層片形成構件100所保持的細胞懸浮液的細胞有優先黏接平坦部130的細胞S1，也有雖然黏接平坦部130較為劣勢，但被容許黏接凹凸部140的細胞S2。或者，細胞層片形成構件100所保持的細胞懸浮液的細胞有優先黏接凹凸部140的細胞S2，也有雖然黏接凹凸部140較為劣勢，但被容許黏接平坦部130的細胞S1。

此時，如圖5（b）所示，平坦部130及凹凸部140往第1方向延伸，並在第2方向交互地配置。因此，在細胞層片形成構件的表面111，例如優先黏接平坦部130的細胞S1的配向性受到平坦部130的構造及將其區隔的凹凸部140的構造所控制。

然後，在相鄰的平坦部130所包夾的凹凸部140中，藉由黏接平坦部130較為劣勢但黏接於凹凸部140的細胞S2，反映出平坦部130所造成的配向性的控制。結果如圖5（c）所示，配向性被控制在第1方向的細胞S1、S2形成在表面111的整體擴展的細胞層片SA。

或者，優先黏接凹凸部140的細胞S2的配向性受到凹凸部140的構造及將其區隔的平坦部130的構造所控制。然後，在相鄰的凹凸部140所包夾的平坦部130中，藉由黏接凹凸部140較為劣勢，而黏接於平坦部130的細胞S1，反映出凹凸部140所造成的配向性的控制。結果如圖5（c）所示，配向性被控制在第1方向的細胞S1、S2形成在表面111的整體擴展的細胞層片SA。

以下說明上述實施形態所記載的細胞層片形成構件、細胞層片形成構件的製造方法、及細胞層片的製造方法中的實施例。

＜實施例1＞

＜細胞層片形成構件的製作＞

首先，製作用來藉由轉印而形成細胞層片形成構件100的凹凸部140的鎳製凹版。接著，使用鎳製凹版作為壓模，利用奈米壓印法於聚苯乙烯片上加工凹凸部140，藉此製作實施例1的細胞層片形成構件100。實施例1的細胞層片形成構件100中的平坦部130具有往第1方向延伸的形狀，且在細胞層片形成構件100表面的整體中排列於與第1方向交叉的第2方向。各平坦部130的寬度（於第2方向的長度）為10μm。各凹凸部140是由填充在相鄰的平坦部130之間的多個段差構造所構成，相鄰的平坦部130間於第2方向的長度為10μm，凹凸部140中凸部141的節距為300nm。凹凸部140中各凸部的高度使用AFM來測定，結果從凹部的底面至凸部的前端為止的高度的平均為446nm。此外，從凹部的底面至平坦部為止的高度的平均為455nm。然後，將實施例1的細胞層片形成構件100裁切成10mm正方形，並將裁切後的細胞層片形成構件100進行UV照射，進行此種滅菌處理之後，用於細胞培養試驗。

＜細胞培養試驗＞

首先，將源自小鼠的肌母細胞（C2C12細胞，DS Pharma Biomedical公司製）培養在細胞培養用瓶（25cm² ）。使用添加FBS（小牛血清）10％的DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium），並於37℃、5％CO² 環境下進行培養。細胞的回收使用胰蛋白酶，並依照常規方法實施。回收的細胞使用血球計數器計測細胞數，然後調製成3.8×10⁴ 細胞／ml濃度的細胞懸浮液。

接著，於細胞培養用多孔盤（24孔）的底面設置裁切成10mm正方形的實施例1的細胞層片形成構件100。對多孔盤分別注入0.5ml的磷酸緩衝生理食鹽水，然後再去除磷酸緩衝生理食鹽水，以清洗實施例1的細胞層片形成構件100。接著，分別注入0.5ml預先調製的細胞懸浮液，播種細胞。將已播種細胞的多孔盤於37℃、5％CO² 環境下培養，每2天進行培養基的更換，直到長滿為止。確認長滿後，更換成肌管誘導培養基（DMEM培養基，不含FBS），進行肌管分化的誘導。結果在肌管分化誘導的2天後確認出肌管形成。

接著，在肌管形成後的細胞黏接在細胞層片形成構件100的狀態下，使用4％多聚甲醛（磷酸緩衝生理食鹽水）於室溫固定10分鐘，並在去除用來固定的溶液之後，以磷酸緩衝生理食鹽水洗淨。接著，使用包含0.5％Triton X-100的磷酸緩衝生理食鹽水於室溫處理5分鐘，進行穿透處理。在磷酸緩衝生理食鹽水洗淨之後，將其浸漬於稀釋成100nM的acti-stain488 Phalloidin（Cytoskeleton公司製）溶液30分鐘，進行染色。將染色後的細胞層片形成構件100以磷酸緩衝食鹽水洗淨後，將其貼合在滴加有包埋劑（Antifade　mounting　medium，Fluka公司製）的載玻片上，製作觀察用的載玻片。然後，使用共焦點雷射顯微鏡（Olympus公司製）觀察細胞的配向性。結果確認出在實施例1的細胞層片形成構件100中，細胞的伸長方向為集中在一維方向的狀態。

＜實施例2＞

使用與實施例1的鎳製凹版不同的鎳製凹版，並以與實施例1相同的方式製作實施例2的細胞層片形成構件100。實施例2的細胞層片形成構件100中各平坦部130的寬度為30μm，相鄰的平坦部130間於第2方向的長度為30μm，凹凸部140中凸部141的節距為600nm。凹凸部140中各凸部的高度使用AFM測定的結果，從凹部的底面至凸部的前端為止的高度的平均為724nm。此外，從凹部的底面至平坦部為止的高度的平均為900nm。

使用實施例2的細胞層片形成構件100，並以與實施例1相同的方法進行肌母細胞的培養，確認肌管細胞形成之後，將細胞固定，製作觀察用的載玻片。然後，使用螢光顯微鏡觀察細胞的配向性。結果確認出在實施例2的細胞層片形成構件100中，細胞的伸長方向為集中在一維方向的狀態。

＜實施例3＞

使用與實施例1、2的鎳製凹版不同的鎳製凹版，並以與實施例1相同的方式製作實施例3的細胞層片形成構件100。實施例3的細胞層片形成構件100中各平坦部130的寬度為50μm，相鄰的平坦部130間於第2方向的長度為50μm，凹凸部140中凸部141的節距為600nm。凹凸部140中各凸部的高度使用AFM測定的結果，從凹部的底面至凸部的前端為止的高度的平均為717nm。此外，從凹部的底面至平坦部為止的高度的平均為900nm。

使用實施例3的細胞層片形成構件100，並以與實施例1相同的方法進行肌母細胞的培養，確認肌管細胞形成之後，將細胞固定，製作觀察用的載玻片。然後，使用螢光顯微鏡觀察細胞的配向性。結果確認出在實施例3的細胞層片形成構件100中，細胞的伸長方向為集中在一維方向的狀態。

＜比較例1＞

將聚苯乙烯片裁切成10mm正方形，獲得具有無凹凸部140的平坦表面的片材之比較例的細胞層片形成構件。接著，以與實施例1相同方式對比較例1的細胞層片形成構件進行UV照射之滅菌處理之後，用於細胞培養試驗。

也就是說，使用比較例1的細胞層片形成構件，並以與實施例1相同的方法進行肌母細胞的培養，確認肌管細胞形成之後，將細胞固定，製作觀察用的載玻片。然後，使用螢光顯微鏡觀察細胞的配向性。結果確認出在比較例1的細胞層片形成構件中，細胞伸長的方向為隨機。

＜實施例4＞

首先，將實施例1的細胞層片形成構件100裁切成10mm正方形，並進行UV照射之滅菌處理。接著，將細胞層片形成構件100設置於細胞培養用多孔盤（24孔）的底面，並進一步進行纖網蛋白塗布。此時，將其浸漬於規定量的纖網蛋白塗布溶液中，37℃靜置1夜，然後以蒸餾水將細胞層片形成構件100洗淨2次，將其作為實施例4的細胞層片形成構件100，用於細胞的培養。

接著，將源自小鼠的心肌細胞使用心肌細胞培養套組（Cosmo Bio公司製），調製2×10⁵ 細胞／ml濃度的細胞懸浮液，並將調製的細胞懸浮液分別注入0.5ml，播種細胞。將已播種細胞的多孔盤於37℃、5％CO² 環境下培養，每2天進行培養基的更換，直到長滿為止。培養至第6天後，在細胞黏接在細胞層片形成構件100的狀態下，使用4％多聚甲醛（磷酸緩衝生理食鹽水）於室溫固定10分鐘，並在去除用來固定的溶液之後，以磷酸緩衝生理食鹽水洗淨。接著使用包含0.5％Triton X-100的磷酸緩衝生理食鹽水於室溫處理5分鐘，進行穿透處理。在磷酸緩衝生理食鹽水洗淨之後，將其浸漬於稀釋成100nM的acti-stain488 Phalloidin（Cytoskeleton公司製）溶液30分鐘，進行染色。將染色後的細胞層片形成構件100以磷酸緩衝食鹽水洗淨後，將其貼合在滴加有包埋劑（Antifade　mounting　medium，　Fluka公司製）的載玻片上，製作觀察用的載玻片。然後，使用共焦點雷射顯微鏡（Olympus公司製）觀察心肌細胞的配向性。結果確認出在實施例4的細胞層片形成構件100中，細胞的伸長方向為集中在一維方向的狀態。

＜比較例2＞

將比較例1的細胞層片形成構件設置於細胞培養用多孔盤（24孔）的底面，並以與實施例4相同的方法，對細胞層片形成構件進行纖網蛋白塗布，將其作為比較例2的細胞層片形成構件，用於細胞的培養。也就是說，以與實施例4相同的方法進行心肌細胞的培養，並在開始培養的第6天製作觀察用的載玻片，觀察細胞的配向性。結果確認出在比較例2的細胞層片形成構件中，細胞伸長的方向為隨機。

＜實施例5＞

在聚苯乙烯製細胞層片形成構件的表面附加有溫度回應性聚合物的培養盤（商品名：UpCell（註冊商標），CellSeed公司製）上，以與實施例1的細胞層片形成構件的製法相同的方法，進行奈米壓印法之凹凸部140的轉印，製作實施例5的細胞層片形成構件100。其中，實施例5的細胞層片形成構件100中各平坦部130的寬度為10μm，相鄰的平坦部130間的長度為10μm，凹凸部140中凸部141的節距為300nm。凹凸部140中凸部的高度使用AFM來測定，結果從凹部的底面至凸部的前端為止的高度平均為432nm。此外，從凹部的底面至平坦部為止的高度為440nm。然後，將實施例5的細胞層片形成構件100裁切成10mm正方形，並將裁切後的細胞層片形成構件100進行UV照射之滅菌處理，進行此種滅菌處理之後，用於細胞培養試驗。

使用實施例5的細胞層片形成構件100，實施作為肌母細胞培養的2種類的試驗。

在第1培養試驗中，使用以與實施例1相同的方法進行肌母細胞的培養。然後，確認肌管細胞形成之後，製作觀察用的載玻片，觀察細胞的配向性。結果確認出細胞的伸長方向為集中在一維方向的狀態。

在第2培養試驗中，利用細胞層片形成構件100的溫度回應性功能實施細胞層片的回收。也就是說，將播種後的肌母細胞培養至長滿為止，並將細胞所附著的細胞層片形成構件100以既定時間冷卻。接著，使支持體（商品名：CellShifter，CellSeed公司製）與細胞層片形成構件100的培養面密合，在細胞附著於支持體的狀態下將細胞層片從細胞層片形成構件100剝離。剝離的細胞層片在附著於支持體的狀態下靜置於膠原蛋白凝膠上，經過一定時間之後再僅將支持體移除。然後，將從細胞層片形成構件100剝離、並移動到膠原蛋白凝膠的細胞層片以顯微鏡觀察。結果確認出能夠回收相對於培養面積70％以上的面積的細胞層片。

＜比較例3＞

將聚苯乙烯製細胞層片形成構件的表面附加有溫度回應性聚合物的培養盤（商品名：UpCell（註冊商標），CellSeed公司製）裁切成10mm正方形，製作具有無凹凸部140的平坦表面之比較例3的細胞層片形成構件。將比較例3的細胞層片形成構件設置於細胞培養用多孔盤（24孔）的底面，並以與實施例5相同的方法進行使用肌母細胞的第1培養試驗與第2培養試驗。在第1培養試驗中確認出在比較例3的細胞層片形成構件中，細胞伸長的方向為隨機。第2培養試驗中確認出能夠回收相對於培養面積70％以上的面積的細胞層片。

以上，根據上述實施形態，能夠獲得以下列舉的效果。

（1）對於平坦部130的黏接具有優勢的細胞也好，或對於凹凸部140的黏接具有優勢的細胞也好，只要細胞優先對一者的構造體黏接，即對另一者的構造體的黏接形成劣勢，據此細胞的伸長方向會集中在雙方的構造體的延伸方向之第1方向上。結果往二維方向擴展的細胞層片中，能夠將細胞的伸長方向集中在一維方向，也就是說能夠使細胞的配向性提高。

（2）由於細胞層片形成構件100的表面111具備平坦部130與凹凸部140，對於平坦部130的黏接具有優勢的細胞和對於凹凸部140的黏接具有優勢的細胞這兩者能夠試用共通的細胞層片形成構件100，也就是說能夠提高細胞層片形成構件100的泛用性。

（3）凹凸部140的前端面與平坦部130之間的段差為0.5μm以下，較佳為0.3μm以下，更佳為齊平，若為此構成，則能夠提高細胞層片的平坦性。

（4）在前述細胞層片形成構件的厚度方向中，若前述凹凸部的前端面的高度為前述平坦部的高度以下之構成，則能夠進而提高細胞層片的配向性。

（5）當段差構造的長寬比為0.1以上10以下時，對於平坦部130的黏接的優勢性和對於凹凸部140的黏接的優勢性將視細胞所具有的黏接性而容易適當地顯現。因此，能夠進一步輕易地獲得使細胞的配向性提高的效果。此外，也確保了段差構造的機械性強度。

（6）當平坦部130的寬度為10μm以上50μm以下，凹凸部140的寬度為10μm以上50μm以下時，能夠提高動物細胞的層片，特別是肌母細胞的層片、纖維母細胞的層片、及心肌細胞的層片之各別的配向性。

其中，上述實施形態也能夠變更如下方式來實施。

［凹凸部］

凸部141所具有的形狀能夠為圓錐或角錐等錐狀、圓柱或角柱等柱狀、圓錐台或角錐台等錐台狀、及半球狀之任1種。

凸部141的位置能夠為四角格子上的各格子點、六角格子上的各格子點、此外也能夠為在凹凸部140呈不規則分布。

凹凸部140所具有的形狀不限於往第1方向延伸的直線狀，也能夠變更為往第1方向延伸的折線狀或往第1方向延伸的曲線狀。

也能夠將凹凸部140的底面與平坦部130變更成為齊平，也就是說也能夠將凸部141的基端部與平坦部130變成齊平。其中，如上所述，從提高細胞層片的平坦性的觀點而言，較佳為凹凸部140的前端面與平坦部130齊平的構成。

也能夠將構成凹凸部140的段差構造變更成凹部，或變更為凹部與凸部之兩者。例如也能夠變更為如下構造：凹凸部140具備與平坦部130連續的1個側面，該側面形成有多個凹部。

1個凹凸部140的寬度與其他的凹凸部140的寬度能夠為彼此不同的構成，也能夠為彼此相同的構成。其中，若1個凹凸部140的寬度與其他的凹凸部140的寬度為彼此相同的構成，則在細胞層片所具有的特性上，能夠提高於第2方向的均一性。

［平坦部］

1個平坦部130的寬度與其他的平坦部130的寬度能夠為彼此不同的構成，也能夠為彼此相同的構成。其中，1個平坦部130的寬度與其他的平坦部130的寬度為彼此相同的構成，則在細胞層片所具有的特性上，能夠提升於第2方向的均一性。

坦部130的寬度與凹凸部140的寬度能夠為彼此不同的構成，也能夠為彼此相同的構成。例如當細胞的黏接於平坦部130為優勢時，平坦部130的寬度較佳為能夠控制配向性的範圍，且大於凹凸部140的寬度。此外，當細胞的黏接於凹凸部140為優勢時，凹凸部140的寬度較佳為能夠控制配向性的範圍，且大於平坦部130的寬度。

［其他］

平坦部130與凹凸部140交互排列的第2方向不限於與第1方向垂直的方向，只要為與第1方向交叉的方向即可，例如能夠為與第1方向形成角度為45°之方向。

細胞層片形成構件不限於使用凹版的轉印體，也能夠為使用凸版的轉印體，此外，也能夠為射出成形的成形體。也就是說，也能夠使用射出成形來製造細胞層片成形構件。

細胞層片形成構件能夠適用於微量培養盤、培養盤、培養瓶、培養玻片等，只要能夠保持細胞懸浮液者皆可。

其中，關於比較例2所得的粉體，亦以與上述相同方式製作試驗用的液晶面板，而針對其液晶分子的配向的狀態的評價結果，有發生漏光。

100 細胞層片形成構件

110‧‧‧培養皿

130‧‧‧平坦部

140‧‧‧凹凸部

141‧‧‧凸部

142‧‧‧凹部

150‧‧‧凹版

160‧‧‧基材

S1‧‧‧細胞

S2‧‧‧細胞

圖1為表示細胞層片形成構件的一實施形態中同構件的構成的圖，（a）為同時表示細胞層片形成構件的構造和盤體的立體圖，（b）為表示細胞層片形成構件的表面的一部分經擴大的立體圖，（c）為表示細胞層片形成構件的表面的一部分經擴大的俯視圖，（d）為表示細胞層片形成構件的一部分經擴大的部分剖面圖。　　圖2為用以說明圖1的細胞層片形成構件的製造方法的一例的程序圖。　　圖3（a）～（c）為用以說明使用圖1的細胞層片形成構件製造細胞層片的過程的模式圖。　　圖4（a）～（c）為用以說明使用圖1的細胞層片形成構件製造細胞層片的過程的模式圖。　　圖5（a）～（c）為用以說明使用圖1的細胞層片形成構件製造細胞層片的過程的模式圖。　　圖6為使用圖1的細胞層片形成構件培養出的肌母細胞的螢光染色影像。　　圖7為作為參考例之使用細胞盤體培養出的肌母細胞的螢光染色影像。　　圖8為圖1的細胞層片形成構件的表面藉由掃描式電子顯微鏡拍攝的影像。　　圖9為表示圖8的影像的部分經擴大的影像。

Claims

一種細胞層片形成構件，其具備用以形成細胞層片的表面，　前述表面具備多個平坦部與多個凹凸部，　　各平坦部具有往第1方向延伸的形狀，且前述多個平坦部排列在前述表面的整體中與前述第1方向交叉的第2方向，　　凸部與凹部的任一者為段差構造，　　各凹凸部包含填充在相鄰的前述平坦部之間的多個前述段差構造，前述段差構造的節距為100nm以上10μm以下。
如請求項1所述的細胞層片形成構件，其中，　　前述段差構造為凸部，　　前述凹凸部在相鄰的前述平坦部所包夾的凹部的底面具備多個前述凸部。
如請求項2所述的細胞層片形成構件，其中，　　在前述細胞層片形成構件的厚度方向，前述凹凸部中前端面的高度與前述平坦部的高度間的差為0.5μm以下。
如請求項2或3所述的細胞層片形成構件，其中，　　在前述細胞層片形成構件的厚度方向，前述凹凸部中前端面的高度為前述平坦部的高度以下。
如請求項1～4中任一項所述的細胞層片形成構件，其中，　　從與前述表面對向的方向觀看，前述段差構造具有圓形狀，且前述段差構造的直徑為前述節距的50％以上100％以下，　　前述段差構造的長寬比為0.1以上10以下。
如請求項1～5中任一項所述的細胞層片形成構件，其中，　　前述細胞層片形成構件中所培養的細胞為肌母細胞、纖維母細胞、及心肌細胞之至少1種，　　前述平坦部的短邊方向的長度為10μm以上50μm以下，　　相鄰的前述平坦部之間前述短邊方向的長度為10μm以上50μm以下。
如請求項1～6中任一項所述的細胞層片形成構件，其中，　　前述細胞層片形成構件的表面具有親水性或疏水性。
如請求項1～7中任一項所述的細胞層片形成構件，其中，　　前述細胞層片形成構件的表面由金屬或有機物構成。
一種細胞層片形成構件的製造方法，其包含如下步驟：　　形成凹版的步驟，　　藉由前述凹版的轉印，形成用以形成細胞層片的細胞層片形成構件的表面的步驟；　　前述凹版具備多個平坦部與凹凸部，　　該平坦部具有往第1方向延伸的形狀，且排列在前述表面的整體中與前述第1方向交叉的第2方向，　　凸部與凹部的任一者為段差構造，該凹凸部包含填充在相鄰的前述平坦部之間的多個前述段差構造，前述段差構造的節距為100nm以上10μm以下，　　前述形成凹版的步驟包含使用光蝕刻法、膠體蝕刻法、陽極氧化法、及干涉曝光法之至少1種來形成前述凹凸部。
一種細胞層片的製造方法，係使用請求項1～8中任一項所述的細胞層片形成構件，並包含以下步驟：　　使細胞黏接在前述細胞層片形成構件的表面，於前述細胞層片形成構件的表面形成細胞層片的步驟，該細胞對於前述平坦部及前述凹凸部中任一者的黏接較對於另一者的黏接具有優勢；　　從前述細胞層片形成構件的表面剝離細胞層片的步驟。