CN111051492A - 细胞片形成构件、细胞片形成构件的制造方法、及细胞片的制造方法 - Google Patents

Abstract

一种细胞片形成构件，其具备用于形成细胞片的表面，表面具备多个平坦部和多个凹凸部。各平坦部具有在第1方向延伸的形状，且多个平坦部在整个表面沿着与第1方向交叉的第2方向排列。凸部和凹部中的任一方为阶梯构造，各凹凸部包含将相邻的平坦部之间填埋的多个阶梯构造，阶梯构造的间距为100nm以上10μm以下。

Description

细胞片形成构件、细胞片形成构件的制造方法、及细胞片的制 造方法

技术领域

本发明涉及一种用于形成细胞片的细胞片形成构件、细胞片形成构件的制造方法、及细胞片的制造方法。

背景技术

以往已提出各种用于培养细胞的方法。例如专利文献1记载的细胞培养方法，使用设有用细微的侧壁区划的多个空间构造的细胞培养用基材，使空间构造相互连通的方向与细胞的伸长方向一致，从而控制细胞的配向性。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2006-191809号公报

发明内容

发明所要解决的课题

在上述的细胞培养用基材中，侧壁所具备的侧壁面、上表面等平坦面作为细胞培养的类似基底发挥作用，如此一来，能够使用细胞培养用基材培养的细胞的伸长方向与平坦面的延伸方向相同。另一方面，除了侧壁面、上表面之外，空间构造的底面也是平坦面，而且空间构造的底面为与侧壁面相连的面，也会往与侧壁面的延伸方向、上表面的延伸方向不同的方向扩展。因此，在上述的细胞培养用基材中，细胞的伸长方向容易集中在各平坦面的连接方向、各平坦面的扩展方向，也就是侧壁面的延伸方向以外的其他方向，其结果，从使细胞的伸长方向相同的观点而言，依然有课题尚待解决。

本发明是有鉴于上述实情而完成的，其目的在于提供一种能够提高细胞片中的细胞的配向性的细胞片形成构件、细胞片形成构件的制造方法、及细胞片的制造方法。

用于解决课题的手段

用于解决上述课题的细胞片形成构件，其具备用于形成细胞片的表面，所述表面具备多个平坦部和多个凹凸部。各平坦部具有往第1方向延伸的形状，且所述多个平坦部在整个所述表面沿着与所述第1方向交叉的第2方向排列。此外，凸部和凹部的任一方为阶梯构造，各凹凸部包含将相邻的所述平坦部之间填埋的多个所述阶梯构造，所述阶梯构造的间距为100nm以上10μm以下。

用于解决上述课题的细胞片形成构件的制造方法包含如下步骤：形成凹版的步骤；及通过所述凹版的转印，形成用于形成细胞片的细胞片形成构件的表面的步骤。所述凹版具备多个平坦部和凹凸部，该多个平坦部具有往第1方向延伸的形状，且在整个所述表面沿着与所述第1方向交叉的第2方向排列，凸部和凹部的任一方为阶梯构造，该凹凸部包含将相邻的所述平坦部之间填埋的多个所述阶梯构造，所述阶梯构造的间距为100nm以上10μm以下。此外，所述形成凹版的步骤包含使用光刻法、胶体蚀刻法、阳极氧化法、及干涉曝光法的至少1种来形成所述凹凸部。

用于解决上述课题的细胞片的制造方法包含如下步骤：使细胞粘接在所述细胞片形成构件的表面，在所述细胞片形成构件的表面形成细胞片的步骤，该细胞对于所述平坦部及所述凹凸部中任一方的粘接比对于另一方的粘接具有优势；及从所述细胞片形成构件的表面剥离细胞片的步骤。

上述各构成中，平坦部和凹凸部构成用于形成细胞片的表面，且具有一方被另一方区划的关系。因此，对于平坦部的粘接具有优势的细胞也好，或对于凹凸部的粘接具有优势的细胞也好，只要细胞优先对一方的构造体粘接，即对另一方的构造体的粘接形成劣势。因此，在一方的构造体区划另一方的构造体的细胞片形成构件的构造上，配合平坦部与凹凸部之间粘接性不同的细胞的性质，细胞的伸长方向会在双方的构造体的延伸方向、即第1方向上相同。其结果，在往二维方向扩展的细胞片中，能够使细胞的伸长方向在一维方向相同，也就是说能够使细胞的配向性提高。其中，由于细胞片形成构件的表面具备平坦部和凹凸部，对于平坦部的粘接具有优势的细胞和对于凹凸部的粘接具有优势的细胞这两者能够适用共通的细胞片形成构件，也就是说能够提高细胞片形成构件的泛用性。

在上述细胞片形成构件中，也可以构成为，所述阶梯构造为凸部，所述凹凸部在介于相邻的所述平坦部之间的凹部的底面具备多个所述凸部，各凸部的前端面与所述平坦部齐平。或者，也可以构成为，在所述细胞片形成构件的厚度方向中，所述凹凸部的前端面的高度与所述平坦部的高度间的差为0.5μm以下，较佳为0.3μm以下。根据这种构成，由于凹凸部的顶面与平坦部成为齐平，或者凹凸部的前端面与平坦部之间的高低差为0.5μm以下，较佳为0.3μm以下，以此方式覆盖凹凸部与平坦部所形成的细胞片中，能够提高其平坦性。

在上述细胞片形成构件中，也可以构成为，从与所述表面对向的方向观看，所述阶梯构造具有圆形状，且所述阶梯构造的直径为所述间距的50％以上100％以下，所述阶梯构造的长宽比为0.1以上10以下。根据这种构成，对于平坦部的粘接的优势性和对于凹凸部的粘接的优势性将视细胞所具有的粘接性而容易适当地显现。因此，能够进一步容易地获得使细胞的配向性提高的上述效果。

在上述细胞片形成构件中培养的细胞并无特别限定，以生物体内特别是具有配向性而存在之成肌细胞、成纤维细胞、及心肌细胞的至少1种为宜。所述平坦部的短边方向的长度为10μm以上50μm以下，相邻的所述平坦部之间的所述短边方向的长度也可以为10μm以上50μm以下。根据这种构成，平坦部的短边方向的长度及凹凸部的短边方向的长度具有适合成肌细胞、成纤维细胞、及心肌细胞的配向控制的尺寸。因此，在成肌细胞片、成纤维细胞片、及心肌细胞片中能够提高各自的配向性。

上述细胞片形成构件的表面也可以具有亲水性或疏水性。

上述细胞片形成构件的表面也可以由金属或有机物构成。

附图说明

图1(a)～(d)为表示细胞片形成构件的一实施方式中的该构件的构成的图，图1(a)为同时表示细胞片形成构件的构造和盘体的立体图，图1(b)为将细胞片形成构件的表面的一部分放大示出的立体图，图1(c)为将细胞片形成构件的表面的一部分放大示出的俯视图，图1(d)为将细胞片形成构件的一部分放大示出的局部剖面图。

图2为用于说明图1的细胞片形成构件的制造方法的一例的工艺图。

图3(a)～(c)为用于说明使用图1的细胞片形成构件制造细胞片的过程的示意图。

图4(a)～(c)为用于说明使用图1的细胞片形成构件制造细胞片的过程的示意图。

图5(a)～(c)为用于说明使用图1的细胞片形成构件制造细胞片的过程的示意图。

图6为使用图1的细胞片形成构件培养出的成肌细胞的荧光染色图像。

图7为作为参考例之使用细胞培养盘培养出的成肌细胞的荧光染色图像。

图8为用扫描式电子显微镜对图1的细胞片形成构件的表面进行拍摄的图像。

图9为将图8的图像的一部分放大示出的图像。

具体实施方式

以下针对细胞片形成构件、细胞片形成构件的制造方法、及细胞片的制造方法的一实施方式进行说明。首先说明细胞片形成构件的构成，接着再说明细胞片形成构件的制造方法、细胞片的制造方法。

[细胞片形成构件]

如图1(a)所示，细胞片形成构件100例如为载置于培养盘(Schale)的培养皿110中的片材。培养盘将细胞悬浮液保持在由培养皿110和盖120所包围的空间。细胞悬浮液所包含的细胞的一例为成肌细胞(myoblast)、成纤维细胞(fibroblast)、心肌细胞。

如图1(b)所示，细胞片形成构件100的表面111具备多个平坦部130和多个凹凸部140。凹凸部140构成而包含多个阶梯构造，多个阶梯构造将相邻的平坦部130之间填埋。阶梯构造为凸部或凹部。其中，本实施方式中的阶梯构造为凸部141。凹凸部140具备介于相邻的平坦部130之间的凹部和位于凹部的底面的多个凸部141。换句话说，多个凸部141在细胞片形成构件100中被设置于与介于相邻的平坦部130之间的部分相当的凹部的底面。

如图1(c)所示，各平坦部130是往1个方向、即第1方向(图1(c)的上下方向)延伸的平坦面。多个平坦部130在整个表面111中沿着与第1方向正交的第2方向(图1(c)的左右方向)排列。各凹凸部140也是往第1方向延伸。此外，多个凹凸部140在整个表面111沿第2方向排列。此构成如图8及图9所示，也能够通过扫描式电子显微镜对细胞片形成构件100的表面进行了拍摄的图像而得知。

从与表面111对向的方向观看时，凹凸部140的构成要素、即各凸部141例如位于三角栅格的各顶点。各凹凸部140在第1方向及第2方向反复着凸部141的这种配列。只要是凸部141位于三角栅格的各顶点的凹凸部140，能够通过将用于形成凸部141的母版作为适用于形成微小的反复构造的掩模(mask)，例如通过将单粒子膜作为掩模的蚀刻法来形成。

从与表面111对向的方向观看，各凸部141具有例如圆形状。相邻的凸部141的中心间的距离的众数(mode)为凸部141的间距(pitch)。此外，凸部141的俯视形状中的凸部的最大宽度为凸部141的直径。

从动物细胞，特别是上述成肌细胞、成纤维细胞、及心肌细胞的伸长方向在第1方向相同的观点而言，较佳为凸部141的间距满足下述(A)、(B)的构成。也就是说，从平坦部130及凹凸部140对动物细胞、特别是上述成肌细胞、成纤维细胞、及心肌细胞等的粘接的优劣在平坦部130与凹凸部140之间被明确地区划的观点而言，较佳为凸部141的间距满足下述(A)、(B)的构成。

(A)凸部141的间距：100nm以上10μm以下

(B)凸部141的直径：凸部141的间距的50％以上100％以下

各平坦部130的第2方向(短边方向)的长度为平坦部130的宽度。此外，相邻的平坦部130间的第2方向(短边方向)的长度为凹凸部140的宽度。

平坦部130的宽度及凹凸部140的宽度例如为培养对象的细胞的大小(5μm以上100μm以下)的1/10倍以上10倍以下。从动物细胞、特别是上述成肌细胞、成纤维细胞、及心肌细胞的伸长方向容易在第1方向相同的观点而言，较佳为平坦部130的宽度及凹凸部140的宽度满足下述(C)、(D)之构成。

(C)平坦部130的宽度：10μm以上50μm以下

(D)凹凸部140的宽度：10μm以上50μm以下

如图1(d)所示，凹凸部140也可以在相邻的凸部141之间及平坦部130与其相邻的凸部141之间具备凹部142。由于多个凸部141散置在凹凸部140中，所以凸部141间的空间之凹部142在凹凸部140中于第1方向及第2方向相连。

在细胞片形成构件100的厚度方向中，凹部142的底面与平坦部130之间的长度为平坦部130的高度。此外，在细胞片形成构件100的厚度方向中，各凸部141的前端面与平坦部130之间的高低差为边界阶梯。凹部142的底面与各凸部141的前端面的高低差为凸部141的高度。各凸部141的前端面与平坦部130齐平的构成中，平坦部130的高度与凸部141的高度彼此相同。凸部141的间距相对于凸部141的高度之比为凸部141的长宽比。

从提高细胞片的平坦性的观点而言，较佳为边界阶梯满足下述(E)的构成。从提高在凹凸部140的构造上的稳定性的观点而言，又从容易形成凹凸部140的观点而言，较佳为凸部141的高度满足下述(F)的构成，且凸部141的长宽比满足下述(G)的构成。

(E)边界阶梯：0.5μm以下，较佳为0.3μm以下

(F)凸部141的高度：50nm以上5μm以下

(G)凸部141的长宽比：0.1以上10以下

平坦部130和凹凸部140构成用于形成细胞片的表面，且具有一方被另一方区划的关系。此外，只要满足上述(A)、(B)的构成，无论是对平坦部130的粘接具有优势的细胞也好，或是对凹凸部140的粘接具有优势的细胞也好，只要该细胞优先对一方的构造体粘接，即对另一方的构造体的粘接形成劣势。因此，配合此种细胞的特征，细胞的伸长方向会在双方的构造体的延伸方向、即第1方向上相同。其结果，在往沿着表面111的二维方向扩展的细胞片中，能够将细胞的伸长方向在一维方向相同，也就是说能够使细胞的配向性提高。

此外，满足上述(E)的构成，特别是各凸部141的前端面与平坦部130齐平的构成，在以覆盖凹凸部140和平坦部130的方式形成的细胞片中，能够提高其平坦性。进而，满足上述(F)的构成能够更进一步提高细胞片的平坦性。

另外，由于细胞片形成构件100的表面111具备平坦部130和凹凸部140，对于平坦部130的粘接具有优势的细胞和对于凹凸部140的粘接具有优势的细胞这两者能够适用共通的细胞片形成构件100。也就是说，能够提高细胞片形成构件100的泛用性。

此外，从提高细胞的粘接性的目的而言，细胞片形成构件100的表面111也能够涂布包含例如细胞外基质、聚合物、及凝胶等粘接因子的有机物，或者为由金属构成的面。作为细胞外基质的例子，能够列举层粘连蛋白(laminin)、胶原蛋白、明胶、纤连蛋白(fibronectin)、聚赖氨酸(PDL或PLL)、及玻尿酸等，但不限于此。此外，从提高细胞的粘接性或细胞片的平坦性的目的而言，细胞片形成构件100的表面111也可以具有亲水性或疏水性。

此外，为了在细胞片形成后细胞片的剥离、回收容易进行，也能够涂布刺激响应型材料。刺激响应型材料较佳为随着温度变化水亲和性跟着变化的温度响应型聚合物。具体而言较佳为聚-N-异丙基丙烯酰胺(PIPAAm)。刺激响应型材料能够使用惯用的涂布方法来涂布于基材，也能够对用刺激响应型材料处理过的基材使用如下所述的方法来加工构造。

[细胞片形成构件的制造方法]

接着，针对细胞片形成构件的制造方法的一例进行说明。其中，在以下的说明中说明如下例子：使用纳米压印法，通过凹版150的转印而形成细胞片形成构件的表面111。

如图2所示，细胞片形成构件的制造方法包含形成凹版150的步骤、及通过凹版150的转印而形成细胞片形成构件100的表面111的步骤。

凹版150的下表面具有往第1方向(与纸面垂直的方向)延伸的形状，且具备多个平坦部和凹凸部，该平坦部在与第1方向交叉的第2方向(纸面的左右方向)排列，该凹凸部由将相邻的平坦部之间填埋的多个阶梯构造构成。凹版150的平坦部为用于通过转印而形成细胞片形成构件100的平坦部130的部分。凹版150的凹凸部为用于通过转印而形成细胞片形成构件100的凹凸部140的部分。

凹版150的阶梯构造为凸部或凹部。其中，本实施方式中的凹版150的阶梯构造为用于形成凸部141的凹部151，凹部151的间距为100nm以上10μm以下。在形成凹版150的步骤中，例如对用于形成凹版150的硅基板使用光刻法、胶体蚀刻法、阳极氧化法、及干涉曝光法中的至少1种进行蚀刻来形成凹凸部。此外，凹版150本身也能够通过从母版盘转印1次或者多次而获得。母版是被制作成凹版150的表面形状所对应的形状，例如对硅基板使用光刻法、胶体蚀刻法、阳极氧化法、及干涉曝光法中的至少1种进行蚀刻而得。

接着，使用于形成细胞片形成构件100的基材160的表面111与凹版150的下表面对置。基材160的形成材料例如为热塑性树脂或光固化性树脂。然后，在基材160具有流动性的状态下，将凹版150的下表面往基材160的表面111进行按压。接着，在基材160的流动性被抑制的状态下，将凹版150从基材160的表面111脱模。以此方式，在基材160的表面111转印有凹版150的凹部151，而形成平坦部130和凹凸部140。

从提高细胞的粘接性的目的而言，基材160的形成材料的热塑性树脂或光固化性树脂的表面也能够涂布包含例如细胞外基质、聚合物、凝胶等粘接因子的有机物。作为细胞外基质的例子，能够列举层粘连蛋白、胶原蛋白、明胶、纤连蛋白、聚赖氨酸(PDL或PLL)、及玻尿酸等，但不限于此。此外，基材160的形成材料也能够使用多醣类或蛋白质等生物材料。

[细胞片的制造方法]

接着针对使用细胞片形成构件100所制造的细胞片进行说明。

如图3(a)所示，位于细胞片形成构件100的表面111上的细胞悬浮液包含例如与平坦部130粘接的细胞S1。此时，各平坦部130往凹凸部140的长边方向(第1方向)延伸，各平坦部130的宽度为一般细胞大小的数倍程度。因此，如图3(b)所示，细胞S1的位置会优先分布在平坦部130的范围内，细胞S1以细胞的长轴方向沿着第1方向的方式配置且连成直线状。也就是说，细胞S1的伸长方向被控制成与平坦部130的长边方向相同。图6表示使用细胞片形成构件100所培养的成肌细胞的一例，在该图6所示的例子中，成肌细胞的伸长方向被控制成在一方向相同。

其中，如图3(c)所示，在未满足上述(A)的细胞片形成基材中，由于细胞S1的配向性未受控制，故细胞S1的长轴方向呈随机方向配置。图7表示作为参考例的使用市售细胞培养盘培养的成肌细胞的一例，在该图7所示的例子中，成肌细胞的伸长方向呈随机配置。

如图4(a)所示，位于细胞片形成构件100的表面111上的细胞悬浮液包含例如与凹凸部140粘接的细胞S2。此时，各凹凸部140往凹凸部140的长边方向(第1方向)延伸，各凹凸部140的宽度为一般细胞大小的数倍程度。因此，如图4(b)所示，细胞S2的位置优先分布在凹凸部140的范围内，细胞S2以细胞的长轴方向沿第1方向配置且连成直线状。也就是说，细胞S2的伸长方向被控制成与凹凸部140的长边方向相同。

另外，如图4(c)所示，在未满足上述(A)的细胞片形成基材中，由于细胞S2的配向性未受控制，故细胞S2的长轴方向呈随机方向存在。

另一方面，在满足上述(A)的细胞片形成基材中，如图5(a)所示，细胞片形成构件100所保持的细胞悬浮液的细胞是优先粘接平坦部130的细胞S1，也是虽然粘接平坦部130较为劣势，但被容许粘接凹凸部140的细胞S2。或者，细胞片形成构件100所保持的细胞悬浮液的细胞是优先粘接凹凸部140的细胞S2，也是虽然粘接凹凸部140较为劣势，但被容许粘接平坦部130的细胞S1。

此时，如图5(b)所示，平坦部130及凹凸部140往第1方向延伸，并在第2方向交互地配置。因此，在细胞片形成构件的表面111，例如优先粘接平坦部130的细胞S1的配向性受到平坦部130的构造及将其区划的凹凸部140的构造所控制。

然后，在介于相邻的平坦部130之间的凹凸部140中，通过粘接平坦部130较为劣势但粘接于凹凸部140的细胞S2，反映出平坦部130所造成的配向性的控制。其结果，如图5(c)所示，配向性被控制在第1方向的细胞S1、S2形成在整个表面111扩展的细胞片SA。

或者，优先粘接凹凸部140的细胞S2的配向性受到凹凸部140的构造及将其区划的平坦部130的构造所控制。然后，在介于相邻的凹凸部140之间的平坦部130中，通过粘接凹凸部140较为劣势但粘接于平坦部130的细胞S1，反映出凹凸部140所造成的配向性的控制。其结果，如图5(c)所示，配向性被控制在第1方向的细胞S1、S2形成在整个表面111扩展的细胞片SA。

以下说明上述实施方式所记载的细胞片形成构件、细胞片形成构件的制造方法、及细胞片的制造方法中的实施例。

＜实施例1＞

＜细胞片形成构件的制作＞

首先，制作用来通过转印而形成细胞片形成构件100的凹凸部140的镍制凹版。接着，使用镍制凹版作为压模，利用纳米压印法于聚苯乙烯片上加工凹凸部140，藉此制作实施例1的细胞片形成构件100。实施例1的细胞片形成构件100中的平坦部130具有往第1方向延伸的形状，且在细胞片形成构件100的整个表面排列于与第1方向交叉的第2方向。各平坦部130的宽度(于第2方向的长度)为10μm。各凹凸部140是由将相邻的平坦部130之间填埋的多个阶梯构造所构成，相邻的平坦部130间的在第2方向上的长度为10μm，凹凸部140中的凸部141的间距为300nm。凹凸部140中的各凸部的高度使用AFM来测定，其结果，从凹部的底面至凸部的前端为止的高度的平均为446nm。此外，从凹部的底面至平坦部为止的高度的平均为455nm。然后，将实施例1的细胞片形成构件100裁切成10mm正方形，并将裁切后的细胞片形成构件100进行UV照射，进行此种灭菌处理之后，用于细胞培养试验。

＜细胞培养试验＞

首先，将源自小鼠的成肌细胞(C2C12细胞，DS Pharma Biomedical公司制)在细胞培养用瓶(25cm²)中进行了培养。使用添加FBS(小牛血清)10％的DMEM(Dulbecco'sModified Eagle's Medium)，并于37℃、5％CO²环境下进行了培养。细胞的回收使用胰蛋白酶，并依照常规方法实施。回收的细胞使用血球计数器计测细胞数，然后调制成3.8×10⁴细胞/ml浓度的细胞悬浮液。

接着，于细胞培养用多孔盘(24孔)的底面设置裁切成10mm正方形的实施例1的细胞片形成构件100。对多孔盘分别注入0.5ml的磷酸缓冲生理食盐水，然后再去除磷酸缓冲生理食盐水，以清洗实施例1的细胞片形成构件100。接着，分别注入0.5ml预先调制的细胞悬浮液，播种细胞。将已播种细胞的多孔盘于37℃、5％CO²环境下培养，每2天进行培养基的更换，直到长满为止。确认长满后，更换成肌管诱导培养基(DMEM培养基，不含FBS)，进行肌管分化诱导。其结果，在肌管分化诱导的2天后确认出肌管形成。

接着，在将肌管形成后的细胞粘接在细胞片形成构件100的状态下，使用4％多聚甲醛(磷酸缓冲生理食盐水)于室温固定10分钟，并在去除用来固定的溶液之后，以磷酸缓冲生理食盐水洗净。接着，使用包含0.5％Triton X-100的磷酸缓冲生理食盐水于室温处理5分钟，进行穿透处理。在磷酸缓冲生理食盐水洗净之后，将其浸渍于稀释成100nM的acti-stain488Phalloidin(Cytoskeleton公司制)溶液30分钟，进行染色。将染色后的细胞片形成构件100以磷酸缓冲食盐水洗净后，将其贴合在滴加有封片剂(Antifade mountingmedium，Fluka公司制)的载玻片上，制作观察用的载玻片。然后，使用激光共焦显微镜(Olympus公司制)观察细胞的配向性。其结果，确认出在实施例1的细胞片形成构件100中，细胞的伸长方向为在一维方向相同的状态。

＜实施例2＞

使用与实施例1的镍制凹版不同的镍制凹版，并以与实施例1相同的方式制作实施例2的细胞片形成构件100。实施例2的细胞片形成构件100中各平坦部130的宽度为30μm，相邻的平坦部130间的在第2方向上的长度为30μm，凹凸部140中的凸部141的间距为600nm。凹凸部140中的各凸部的高度使用AFM测定的结果，从凹部的底面至凸部的前端为止的高度的平均为724nm。此外，从凹部的底面至平坦部为止的高度的平均为900nm。

使用实施例2的细胞片形成构件100，并以与实施例1相同的方法进行成肌细胞的培养，确认肌管细胞形成之后，将细胞固定，制作观察用的载玻片。然后，使用荧光显微镜观察细胞的配向性。结果确认出在实施例2的细胞片形成构件100中，细胞的伸长方向为在一维方向相同的状态。

＜实施例3＞

使用与实施例1、2的镍制凹版不同的镍制凹版，并以与实施例1相同的方式制作实施例3的细胞片形成构件100。实施例3的细胞片形成构件100中各平坦部130的宽度为50μm，相邻的平坦部130间的在第2方向上的长度为50μm，凹凸部140中的凸部141的间距为600nm。凹凸部140中的各凸部的高度使用AFM测定的结果，从凹部的底面至凸部的前端为止的高度的平均为717nm。此外，从凹部的底面至平坦部为止的高度的平均为900nm。

使用实施例3的细胞片形成构件100，并以与实施例1相同的方法进行成肌细胞的培养，确认肌管细胞形成之后，将细胞固定，制作观察用的载玻片。然后，使用荧光显微镜观察细胞的配向性。结果确认出在实施例3的细胞片形成构件100中，细胞的伸长方向为在一维方向相同的状态。

＜比较例1＞

将聚苯乙烯片裁切成10mm正方形，获得具有无凹凸部140的平坦表面的片材之比较例的细胞片形成构件。接着，以与实施例1相同的方式对比较例1的细胞片形成构件进行UV照射灭菌处理之后，用于细胞培养试验。

也就是说，使用比较例1的细胞片形成构件，并以与实施例1相同的方法进行成肌细胞的培养，确认肌管细胞形成之后，将细胞固定，制作观察用的载玻片。然后，使用荧光显微镜观察细胞的配向性。结果确认出在比较例1的细胞片形成构件中，细胞伸长的方向为随机。

＜实施例4＞

首先，将实施例1的细胞片形成构件100裁切成10mm正方形，并进行UV照射灭菌处理。接着，将细胞片形成构件100设置于细胞培养用多孔盘(24孔)的底面，并进一步进行纤连蛋白涂布。此时，将其浸渍于规定量的纤连蛋白涂布溶液中，37℃静置1夜，然后以蒸馏水将细胞片形成构件100洗净2次，将其作为实施例4的细胞片形成构件100，用于细胞的培养。

接着，将源自小鼠的心肌细胞使用心肌细胞培养套组(Cosmo Bio公司制)，调制2×10⁵细胞/ml浓度的细胞悬浮液，并将调制的细胞悬浮液分别注入0.5ml，播种细胞。将已播种细胞的多孔盘于37℃、5％CO²环境下培养，每2天进行培养基的更换，直到长满为止。培养至第6天后，在细胞粘接在细胞片形成构件100的状态下，使用4％多聚甲醛(磷酸缓冲生理食盐水)于室温固定10分钟，并在去除用来固定的溶液之后，以磷酸缓冲生理食盐水洗净。接着使用包含0.5％Triton X-100的磷酸缓冲生理食盐水于室温处理5分钟，进行穿透处理。在磷酸缓冲生理食盐水洗净之后，将其浸渍于稀释成100nM的acti-stain488Phalloidin(Cytoskeleton公司制)溶液30分钟，进行染色。将染色后的细胞片形成构件100以磷酸缓冲食盐水洗净后，将其贴合在滴加有封片剂(Antifade mounting medium，Fluka公司制)的载玻片上，制作观察用的载玻片。然后，使用激光共焦显微镜(Olympus公司制)观察心肌细胞的配向性。结果确认出在实施例4的细胞片形成构件100中，细胞的伸长方向为在一维方向相同的状态。

＜比较例2＞

将比较例1的细胞片形成构件设置于细胞培养用多孔盘(24孔)的底面，并以与实施例4相同的方法，对细胞片形成构件进行纤连蛋白涂布，将其作为比较例2的细胞片形成构件，用于细胞的培养。也就是说，以与实施例4相同的方法进行心肌细胞的培养，并在开始培养的第6天制作观察用的载玻片，观察细胞的配向性。结果确认出在比较例2的细胞片形成构件中，细胞伸长的方向为随机。

＜实施例5＞

在聚苯乙烯制细胞片形成构件的表面附加有温度响应型聚合物的培养盘(商品名：UpCell(注册商标)，CellSeed公司制)上，以与实施例1的细胞片形成构件的制法相同的方法，进行纳米压印法之凹凸部140的转印，制作实施例5的细胞片形成构件100。其中，实施例5的细胞片形成构件100中的各平坦部130的宽度为10μm，相邻的平坦部130间的长度为10μm，凹凸部140中的凸部141的间距为300nm。凹凸部140中的凸部的高度使用AFM来测定，结果从凹部的底面至凸部的前端为止的高度平均为432nm。此外，从凹部的底面至平坦部为止的高度为440nm。然后，将实施例5的细胞片形成构件100裁切成10mm正方形，并将裁切后的细胞片形成构件100进行UV照射灭菌处理，进行此种灭菌处理之后，用于细胞培养试验。

使用实施例5的细胞片形成构件100，实施作为成肌细胞培养的2种类的试验。

在第1培养试验中，使用于与实施例1相同的方法进行成肌细胞的培养。然后，确认肌管细胞形成之后，制作观察用的载玻片，观察细胞的配向性。结果确认出细胞的伸长方向为在一维方向相同的状态。

在第2培养试验中，利用细胞片形成构件100的温度响应型功能实施细胞片的回收。也就是说，将播种后的成肌细胞培养至长满为止，并将细胞所附着的细胞片形成构件100以预定时间冷却。接着，使支承体(商品名：CellShifter，CellSeed公司制)与细胞片形成构件100的培养面密合，在细胞附着于支承体的状态下将细胞片从细胞片形成构件100剥离。剥离的细胞片在附着于支承体的状态下静置于胶原蛋白凝胶上，经过一定时间之后再仅将支承体移除。然后，将从细胞片形成构件100剥离、并移动到胶原蛋白凝胶的细胞片以显微镜观察。结果确认出能够回收相对于培养面积70％以上的面积的细胞片。

＜比较例3＞

将聚苯乙烯制细胞片形成构件的表面附加有温度响应型聚合物的培养盘(商品名：UpCell(注册商标)，CellSeed公司制)裁切成10mm正方形，制作具有无凹凸部140的平坦表面之比较例3的细胞片形成构件。将比较例3的细胞片形成构件设置于细胞培养用多孔盘(24孔)的底面，并以与实施例5相同的方法进行使用成肌细胞的第1培养试验和第2培养试验。在第1培养试验中确认出在比较例3的细胞片形成构件中，细胞伸长的方向为随机。第2培养试验中确认出能够回收相对于培养面积70％以上的面积的细胞片。

以上，根据上述实施方式，能够获得以下列举的效果。

(1)对于平坦部130的粘接具有优势的细胞也好，或对于凹凸部140的粘接具有优势的细胞也好，只要细胞优先对一方的构造体粘接，即对另一方的构造体的粘接形成劣势，据此细胞的伸长方向会在双方的构造体的延伸方向之第1方向上相同。其结果，在往二维方向扩展的细胞片中，能够使细胞的伸长方向在一维方向相同，也就是说能够使细胞的配向性提高。

(2)由于细胞片形成构件100的表面111具备平坦部130和凹凸部140，对于平坦部130的粘接具有优势的细胞和对于凹凸部140的粘接具有优势的细胞这两者能够适用共通的细胞片形成构件100，也就是说能够提高细胞片形成构件100的泛用性。

(3)凹凸部140的前端面与平坦部130之间的阶梯为0.5μm以下，较佳为0.3μm以下，更佳为齐平，若为此构成，则能够提高细胞片的平坦性。

(4)在所述细胞片形成构件的厚度方向中，若所述凹凸部的前端面的高度为所述平坦部的高度以下之构成，则能够进而提高细胞片的配向性。

(5)当阶梯构造的长宽比为0.1以上10以下时，对于平坦部130的粘接的优势性和对于凹凸部140的粘接的优势性将视细胞所具有的粘接性而容易适当地显现。因此，能够进一步容易地获得使细胞的配向性提高的效果。此外，也确保了阶梯构造的机械性强度。

(6)当平坦部130的宽度为10μm以上50μm以下，凹凸部140的宽度为10μm以上50μm以下时，能够在动物细胞片、特别是成肌细胞片、成纤维细胞片、及心肌细胞片中使各自的配向性提高。

其中，上述实施方式也能够变更如下方式来实施。

[凹凸部]

凸部141所具有的形状能够为圆锥或角锥等锥状、圆柱或角柱等柱状、圆锥台或角锥台等锥台状、及半球状之任1种。

凸部141的位置能够为四角格子上的各格子点、六角格子上的各格子点、此外也能够为在凹凸部140呈不规则分布。

凹凸部140所具有的形状不限于往第1方向延伸的直线状，也能够变更为往第1方向延伸的折线状或往第1方向延伸的曲线状。

也能够将凹凸部140的底面与平坦部130变更成为齐平，也就是说也能够将凸部141的基端部与平坦部130变成齐平。其中，如上所述，从提高细胞片的平坦性的观点而言，较佳为凹凸部140的前端面与平坦部130齐平的构成。

也能够将构成凹凸部140的阶梯构造变更成凹部，或变更为凹部和凸部之两者。例如也能够变更为如下构造：凹凸部140具备与平坦部130连续的1个侧面，该侧面形成有多个凹部。

1个凹凸部140的宽度与其他的凹凸部140的宽度可以为彼此不同的构成，也可以为彼此相同的构成。其中，若1个凹凸部140的宽度与其他的凹凸部140的宽度为彼此相同的构成，则在细胞片所具有的特性上，能够提高在第2方向上的均匀性。

[平坦部]

1个平坦部130的宽度与其他的平坦部130的宽度可以为彼此不同的构成，也可以为彼此相同的构成。其中，1个平坦部130的宽度与其他的平坦部130的宽度为彼此相同的构成，则在细胞片所具有的特性上，能够提高在第2方向上的均匀性。

平坦部130的宽度与凹凸部140的宽度可以为彼此不同的构成，也可以为彼此相同的构成。例如当细胞的粘接于平坦部130为优势时，平坦部130的宽度较佳为能够控制配向性的范围，且大于凹凸部140的宽度。此外，当细胞的粘接于凹凸部140为优势时，凹凸部140的宽度较佳为能够控制配向性的范围，且大于平坦部130的宽度。

[其他]

平坦部130与凹凸部140交互排列的第2方向不限于与第1方向垂直的方向，只要为与第1方向交叉的方向即可，例如能够为与第1方向形成的角度为45°的方向。

细胞片形成构件不限于使用凹版的转印体，也能够为使用凸版的转印体，此外，也能够为注塑成形的成形体。也就是说，也能够使用注塑成形来制造细胞片成形构件。

细胞片形成构件能够适用于微孔板(Microwell plate)、培养盘、培养瓶(flask)、培养玻片(chamber slide)等，只要能够保持细胞悬浮液者皆可。

Claims (10)

1.一种细胞片形成构件，其具备用于形成细胞片的表面，

所述表面具备多个平坦部和多个凹凸部，

各平坦部具有往第1方向延伸的形状，且所述多个平坦部在整个所述表面沿着与所述第1方向交叉的第2方向排列，

凸部和凹部的任一方为阶梯构造，

各凹凸部包含将相邻的所述平坦部之间填埋的多个所述阶梯构造，所述阶梯构造的间距为100nm以上10μm以下。

2.如权利要求1所述的细胞片形成构件，其中，

所述阶梯构造为凸部，

所述凹凸部在介于相邻的所述平坦部之间的凹部的底面具备多个所述凸部。

3.如权利要求2所述的细胞片形成构件，其中，

在所述细胞片形成构件的厚度方向，所述凹凸部中的前端面的高度与所述平坦部的高度间的差为0.5μm以下。

4.如权利要求2或3所述的细胞片形成构件，其中，

在所述细胞片形成构件的厚度方向，所述凹凸部中的前端面的高度为所述平坦部的高度以下。

5.如权利要求1～4中任一项所述的细胞片形成构件，其中，

从与所述表面对向的方向观看，所述阶梯构造具有圆形状，且所述阶梯构造的直径为所述间距的50％以上100％以下，

所述阶梯构造的长宽比为0.1以上10以下。

6.如权利要求1～5中任一项所述的细胞片形成构件，其中，

所述细胞片形成构件中所培养的细胞为成肌细胞、成纤维细胞及心肌细胞的至少1种，

所述平坦部的短边方向的长度为10μm以上50μm以下，

相邻的所述平坦部之间的所述短边方向的长度为10μm以上50μm以下。

7.如权利要求1～6中任一项所述的细胞片形成构件，其中，

所述细胞片形成构件的表面具有亲水性或疏水性。

8.如权利要求1～7中任一项所述的细胞片形成构件，其中，

所述细胞片形成构件的表面由金属或有机物构成。

9.一种细胞片形成构件的制造方法，其包含如下步骤：

形成凹版的步骤；以及

通过所述凹版的转印，形成用于形成细胞片的细胞片形成构件的表面的步骤；

所述凹版具备多个平坦部和凹凸部，

多个平坦部具有往第1方向延伸的形状，且在整个所述表面沿着与所述第1方向交叉的第2方向排列，

凸部和凹部的任一方为阶梯构造，该凹凸部包含将相邻的所述平坦部之间填埋的多个所述阶梯构造，所述阶梯构造的间距为100nm以上10μm以下，

所述形成凹版的步骤包含使用光刻法、胶体蚀刻法、阳极氧化法、及干涉曝光法的至少1种来形成所述凹凸部。

10.一种细胞片的制造方法，使用权利要求1～8中任一项所述的细胞片形成构件，包含以下步骤：

使细胞粘接在所述细胞片形成构件的表面，在所述细胞片形成构件的表面形成细胞片的步骤，该细胞对于所述平坦部及所述凹凸部中的任一方的粘接比对于另一方的粘接具有优势；以及

从所述细胞片形成构件的表面剥离细胞片的步骤。

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