IT201800020242A1 - Substrato tridimensionale per le colture microbiche - Google Patents
Substrato tridimensionale per le colture microbiche Download PDFInfo
- Publication number
- IT201800020242A1 IT201800020242A1 IT102018000020242A IT201800020242A IT201800020242A1 IT 201800020242 A1 IT201800020242 A1 IT 201800020242A1 IT 102018000020242 A IT102018000020242 A IT 102018000020242A IT 201800020242 A IT201800020242 A IT 201800020242A IT 201800020242 A1 IT201800020242 A1 IT 201800020242A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- compartment
- nitrate
- calcium
- bac3gel
- dimensional substrate
- Prior art date
Links
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims description 25
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 title claims description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 28
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 claims description 23
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims description 22
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 21
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 claims description 16
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 claims description 16
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 16
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 10
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims description 10
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 10
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 10
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N potassium nitrate Chemical compound [K+].[O-][N+]([O-])=O FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 claims description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002585 base Substances 0.000 claims description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 239000004227 calcium gluconate Substances 0.000 claims description 5
- 235000013927 calcium gluconate Nutrition 0.000 claims description 5
- 229960004494 calcium gluconate Drugs 0.000 claims description 5
- NEEHYRZPVYRGPP-UHFFFAOYSA-L calcium;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanoate Chemical compound [Ca+2].OCC(O)C(O)C(O)C(O)C([O-])=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C([O-])=O NEEHYRZPVYRGPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 5
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- IWOUKMZUPDVPGQ-UHFFFAOYSA-N barium nitrate Chemical compound [Ba+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O IWOUKMZUPDVPGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ZCCIPPOKBCJFDN-UHFFFAOYSA-N calcium nitrate Chemical compound [Ca+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ZCCIPPOKBCJFDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 claims description 4
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- CHPZKNULDCNCBW-UHFFFAOYSA-N gallium nitrate Chemical compound [Ga+3].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O CHPZKNULDCNCBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims description 4
- VCJMYUPGQJHHFU-UHFFFAOYSA-N iron(3+);trinitrate Chemical compound [Fe+3].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O VCJMYUPGQJHHFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- YIXJRHPUWRPCBB-UHFFFAOYSA-N magnesium nitrate Chemical compound [Mg+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O YIXJRHPUWRPCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- RAFRTSDUWORDLA-UHFFFAOYSA-N phenyl 3-chloropropanoate Chemical compound ClCCC(=O)OC1=CC=CC=C1 RAFRTSDUWORDLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000010333 potassium nitrate Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000004323 potassium nitrate Substances 0.000 claims description 4
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical compound [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 claims description 4
- QDZRBIRIPNZRSG-UHFFFAOYSA-N titanium nitrate Chemical compound [O-][N+](=O)O[Ti](O[N+]([O-])=O)(O[N+]([O-])=O)O[N+]([O-])=O QDZRBIRIPNZRSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 4
- ONDPHDOFVYQSGI-UHFFFAOYSA-N zinc nitrate Chemical compound [Zn+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ONDPHDOFVYQSGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229960002713 calcium chloride Drugs 0.000 claims description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 3
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims description 3
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 claims description 3
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 claims description 3
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 2
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- JTNCEQNHURODLX-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethanimidamide Chemical compound NC(=N)CC1=CC=CC=C1 JTNCEQNHURODLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 claims description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 2
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 claims description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 claims description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims description 2
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 claims description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims description 2
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 claims description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 claims description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H aluminium sulfate (anhydrous) Chemical compound [Al+3].[Al+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 2
- 230000009435 amidation Effects 0.000 claims description 2
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 claims description 2
- VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L calcium acetate Chemical compound [Ca+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 claims description 2
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 claims description 2
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 claims description 2
- FNAQSUUGMSOBHW-UHFFFAOYSA-H calcium citrate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O FNAQSUUGMSOBHW-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 2
- 239000001354 calcium citrate Substances 0.000 claims description 2
- 229960004256 calcium citrate Drugs 0.000 claims description 2
- 229960002283 calcium glubionate Drugs 0.000 claims description 2
- YPCRNBPOUVJVMU-LCGAVOCYSA-L calcium glubionate Chemical compound [Ca+2].OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O.[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YPCRNBPOUVJVMU-LCGAVOCYSA-L 0.000 claims description 2
- 229940078512 calcium gluceptate Drugs 0.000 claims description 2
- FUFJGUQYACFECW-UHFFFAOYSA-L calcium hydrogenphosphate Chemical compound [Ca+2].OP([O-])([O-])=O FUFJGUQYACFECW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 claims description 2
- FATUQANACHZLRT-XBQZYUPDSA-L calcium;(2r,3r,4s,5r,6r)-2,3,4,5,6,7-hexahydroxyheptanoate Chemical compound [Ca+2].OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O FATUQANACHZLRT-XBQZYUPDSA-L 0.000 claims description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 2
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- XTVVROIMIGLXTD-UHFFFAOYSA-N copper(II) nitrate Chemical compound [Cu+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O XTVVROIMIGLXTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- WIVXEZIMDUGYRW-UHFFFAOYSA-L copper(i) sulfate Chemical compound [Cu+].[Cu+].[O-]S([O-])(=O)=O WIVXEZIMDUGYRW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940061607 dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 claims description 2
- 235000019700 dicalcium phosphate Nutrition 0.000 claims description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 claims description 2
- 230000032050 esterification Effects 0.000 claims description 2
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 claims description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 claims description 2
- 229940044658 gallium nitrate Drugs 0.000 claims description 2
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 2
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 2
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- VXWSFRMTBJZULV-UHFFFAOYSA-H iron(3+) sulfate hydrate Chemical compound O.[Fe+3].[Fe+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O VXWSFRMTBJZULV-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 2
- 229940050906 magnesium chloride hexahydrate Drugs 0.000 claims description 2
- DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L magnesium dichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[Cl-].[Cl-] DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims description 2
- 229910000392 octacalcium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001814 pectin Substances 0.000 claims description 2
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 claims description 2
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 claims description 2
- 229920000371 poly(diallyldimethylammonium chloride) polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 claims description 2
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 claims description 2
- -1 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 claims description 2
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 claims description 2
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 claims description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 2
- 229910000343 potassium bisulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001120 potassium sulphate Substances 0.000 claims description 2
- 235000011151 potassium sulphates Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 claims description 2
- YIGWVOWKHUSYER-UHFFFAOYSA-F tetracalcium;hydrogen phosphate;diphosphate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].OP([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O YIGWVOWKHUSYER-UHFFFAOYSA-F 0.000 claims description 2
- 235000013337 tricalcium citrate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910000391 tricalcium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000019731 tricalcium phosphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940078499 tricalcium phosphate Drugs 0.000 claims description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 claims description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- DQDCXYHZRIWBQD-UHFFFAOYSA-N O.O.O.[K] Chemical compound O.O.O.[K] DQDCXYHZRIWBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M hydrogensulfate Chemical compound OS([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 claims 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 claims 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 claims 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 32
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 13
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 11
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 10
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 10
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 10
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 9
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 7
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 229940106164 cephalexin Drugs 0.000 description 4
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 4
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 4
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 4'-epidoxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 0.000 description 3
- HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N Epirubicin Natural products COc1cccc2C(=O)c3c(O)c4CC(O)(CC(OC5CC(N)C(=O)C(C)O5)c4c(O)c3C(=O)c12)C(=O)CO HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 3
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 229960001904 epirubicin Drugs 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229940051875 mucins Drugs 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 3
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003816 axenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 2
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 239000006994 mh medium Substances 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 238000010146 3D printing Methods 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 208000004434 Calcinosis Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 102000009338 Gastric Mucins Human genes 0.000 description 1
- 108010009066 Gastric Mucins Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- PQMWYJDJHJQZDE-UHFFFAOYSA-M Methantheline bromide Chemical compound [Br-].C1=CC=C2C(C(=O)OCC[N+](C)(CC)CC)C3=CC=CC=C3OC2=C1 PQMWYJDJHJQZDE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 229940121357 antivirals Drugs 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 230000002715 bioenergetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 1
- 229960005069 calcium Drugs 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 229910000336 copper(I) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 229940111685 dibasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001746 injection moulding Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005486 microgravity Effects 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000004682 mucosal barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000005067 remediation Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 235000015424 sodium Nutrition 0.000 description 1
- WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M sodium bisulfate Chemical compound [Na+].OS([O-])(=O)=O WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000342 sodium bisulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
- C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
- C12M1/12—Apparatus for enzymology or microbiology with sterilisation, filtration or dialysis means
- C12M1/123—Apparatus for enzymology or microbiology with sterilisation, filtration or dialysis means with flat plate filter elements
- C12M1/125—Culture inserts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/02—Membranes; Filters
- C12M25/04—Membranes; Filters in combination with well or multiwell plates, i.e. culture inserts
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
Descrizione
Forma oggetto della presente invenzione un substrato tridimensionale per le colture e co-colture microbiche e un metodo per la preparazione dello stesso dove detto substrato tridimensionale comprende:
-Un sistema di diffusione (1) che comprende un primo compartimento (2) e un secondo compartimento (3), dove detto primo compartimento, apicale (2) è posto al di sopra di detto secondo compartimento, basolaterale (3), detto primo e detto secondo compartimento (2, 3) essendo separati da una membrana semipermeabile (4);
-Una soluzione base che comprende polisaccaridi, proteine e sali; o in alternativa un idrogelo pre-formato che comprende polisaccaridi, proteine e sali;
-Un mezzo di reticolazione che comprende sali, terreni di coltura e acqua distillata.
Stato dell’arte
Le colture batteriche sono oggi tipicamente ottenute in agar, con i limiti che ne conseguono. Tra questi, è rilevante notare che i gel di agar morbido rendono possibile una certa mobilità batterica oltre che la diffusione di sostanze all'interno. Tuttavia, detti gel necessariamente sono posizionati su una base di agar dura (1,5 - 2,0% p / v) portando ad una migrazione tridimensionale che è solo parziale, poiché limitata da detta base.
Inoltre, la colata di gel di agar morbido in supporti ad alta resistenza quali le piastre per colture cellulari o piastre multipozzetto per high-throughput screening e l'interpretazione dei risultati richiede una certa manipolazione e strutture complesse, limitando la capacità di screening e aumentando il rischio di contaminazioni.
È fortemente avvertita l’esigenza di metodi alternativi per le colture e co-colture microbiche, in grado di mimare sia le condizioni che si trovano nel muco ma anche condizioni di coltura fisio-patologiche.
Descrizione dell’invenzione
Forma oggetto della presente invenzione un substrato tridimensionale adatto allo studio di colture co-colture batteriche e/o microbiche e un metodo per la sua produzione.
Descrizione delle figure
Figura 1: rappresentazione schematica del sistema di diffusione che contiene Bac3gel.
Figura 2: proprietà reologiche di Bac3gel con l’aggiunta di albumina di siero umano.
Figura 3: proprietà viscoelastiche di Mucin-Bac3Gel.
Figura 4: effetto barriera alla diffusione di attivi e nanoparticelle.
Figura 5: A) Bac3Gel colorato con rosso di alizarina per rappresentare il suo gradiente interno di reticolazione; B) proprietà viscoelastiche a diversi tempi di reticolazione.
Figura 6: Pseudomonas aeruginosa CFU/ml valutate su Bac3gel o su colture planctoniche
Figura 7: Escherichia coli CFU/ml valutate su Bac3gel o su colture planctoniche
Descrizione dettagliata dell’invenzione:
Il substrato tridimensionale secondo la presente invenzione, in seguito denominato Bac3gel, comprende una miscela di componenti in grado di formare gel utilizzando diversi agenti di reticolazione mediante un processo di diffusione. Gli autori della presente invenzione hanno sorprendentemente dimostrato che le proprietà reologiche di Bac3gel sono modificabili con precisione variando i parametri di reticolazione.
Bac3gel comprende un sistema di diffusione che è un sistema bicompartimentale che produce un gradiente di grado di reticolazione (distanza tra due punti di reticolazione) tale da modellare la tipica diffusione di nutrienti e molecole del microambiente microbiche.
Con riferimento alla figura 1, detto sistema di diffusione 1 comprende un primo compartimento 2 e un secondo compartimento 3. Detti primo e secondo compartimento sono separati da una membrana semipermeabile 4. In una forma preferita, detto primo compartimento 2 è posto sopra detto secondo compartimento 3. Detta membrana semipermeabile 4 è realizzata ad esempio in policarbonato, polistirolo, poli(diallildimetilammonio cloruro), polietilene tereftalato o poliammide (nylon). Detta membrana semipermeabile 4 è permeabile ai sali ma non alla soluzione di alginato e/o mucina.
In una forma preferita, detto sistema di diffusione 1 è progettato con software di progettazione e prodotto mediante stampa tridimensionale; alternativamente, è prodotto mediante prototipazione rapida, lavorazione con metodi additivi e sottrattivi, e stampaggio ad iniezione.
Una soluzione, definita soluzione base, comprendente polisaccaridi, proteine e sali è depositata in detto primo compartimento apicale 2. Un mezzo di reticolazione che comprende sali, terreni di coltura e acqua distillata è depositato nel secondo compartimento basolaterale 3.
In una forma di realizzazione, detta soluzione base ha una viscosità compresa tra 0.05 e 100 Pa.s, preferibilmente tra 0.2 e 10 Pa.s.
In una forma di realizzazione alternativa, in detto primo compartimento apicale 2 è immesso un gel preformato che comprende polisaccaridi, proteine e sali. Il sistema di diffusione secondo una delle rivendicazioni 1, dove al posto di una soluzione si utilizza un gel preformato con i medesimi componenti della soluzione che viene introdotto nel primo compartimento apicale (2).
In una forma di realizzazione, detti polisaccaridi in detta soluzione base sono selezionati tra alginato di sodio a diversi pesi molecolari, pectina a diversi pesi molecolari diversi gradi di esterificazione e ammidazione, acido ialuronico a diversi pesi molecolari, gellano a diversi pesi molecolari, destrano a diversi pesi molecolari; dette proteine sono selezionate tra mucina, albumina sierica, fibrinogeno, fibronectina, collagene, elastina, insulina; detti sali sono selezionati tra cloruro di sodio, fosfato di ammonio, cloruro di potassio, fosfato di sodio bibasico, sodio bicarbonato, cloruro di potassio, fosfato di potassio dibasico triidrato, magnesio cloruro esaidrato, sodio solfato, tris (idrossimetil) amminometano, nitrato di sodio, nitrito di sodio, nitrato di potassio, nitrato di argento, nitrato di ammonio, nitrito di calcio, bisolfato di potassio, solfato di potassio, bisolfato di sodio, solfato di sodio e/o solfato di rame(I).
In una forma di realizzazione, detti sali compresi in detto mezzo di reticolazione sono selezionati tra calcio acetato, calcio citrato, calcio cloruro, calcio glubionato, calcio gluceptato, calcio gluconato, nitrato di calcio, fosfato di calcio, calcio idrogeno fosfato, idrossiapatite, carbonato-idrossiapatite, tricalcio fosfato, ottacalcio fosfato, nitrato di potassio, nitrato di zinco, nitrato di magnesio, nitrato di bario, nitrato di titanio, nitrato di ferro(III), nitrato di rame, nitrato di gallio, nitrito di calcio, solfato di alluminio, solfacetato di alluminio, solfato di zinco, solfato di tetraamino rame(II), rame solfato, ferro(III) solfato idrato, solfato di ferro, solfato di calcio e/o solfato di magnesio.
In una forma di realizzazione, i componenti di Bac3gel vengono sciolti in un terreno batterico adatto allo scopo o in soluzione acquosa.
In un’altra forma di realizzazione un idrogelo preformato contenente i medesimi componenti descritti per la soluzione viene introdotto in detto primo compartimento apicale (2).
Il processo di preparazione non espone Bac3gel ad alte temperature o a reagenti incompatibili con il caricamento di cellule eucariotiche o procariotiche, proteine o sostanze termolabili.
Gli autori della presente invenzione hanno sorprendentemente dimostrato che, con l'aggiunta di albumina di siero umano a Bac3gel, aumentano le proprietà viscoelastiche di Bac3gel. Questa osservazione è indicativa del fatto che non solo la proteina non è denaturata da Bac3gel, ma anche che Bac3gel consente di riprodurre le interazioni fisiologiche dell’albumina nel muco.
Questa osservazione rende particolarmente vantaggioso Bac3gel per modellare il muco. Infatti, le mucine oggi disponibili non possono essere reticolate poiché, durante il processo di estrazione e purificazione, perdono i siti di reticolazione. La gelificazione delle mucine è possibile solo in condizioni di forte acidità, non compatibili con le colture microbiche. Bac3Gel rende possibile produrre un idrogelo dalle mucine commerciali, definito Mucin-Bac3gel.
Mucin-Bac3gel così ottenuto è stato utilizzato per valutare la diffusione di attivi attraverso la barriera mucosa. Si è dimostrato che Bac3Gel agisce come una barriera verso la diffusione di attivi, sia in presenza che in assenza di mucina. Bac3Gel agisce anche da barriera verso la diffusione di nanoparticelle.
La tecnologia di produzione di Bac3gel permette l’applicazione del processo precedentemente descritto ad un idrogelo preformato, producendo gradienti che consentono di ottenere le proprietà viscoelastiche di interesse per la specifica applicazione.
L’utilizzo di Bac3gel, utilizzato per ottenere la MIC per un trattamento antibiotico, permette di ottenere risultati che più si avvicinano a quella che è la MIC richiesta per l’eradicazione di batteri nella matrice tridimensionale di diversi ecosistemi microbici. Bac3gel produce infatti un materiale in grado di fornire ai batteri un contesto adatto per consentire loro di produrre biofilm se sono batteri formanti biofilm oppure di mimare matrici tridimensionali quali il muco per ricreare fenomeni legati all'eterogeneità spaziale dei terreni. Questo è reso possibile dall’architettura tridimensionale di Bac3gel, oltre che dal gradiente di nutrienti, ossigeno e acqua, fattori che tipicamente non sono presi in considerazioni nelle colture planctoniche dello stato dell’arte.
In una forma di realizzazione, Bac3Gel è collocato all’interno di supporti, ad esempio supporti ad alta resistenza quali le piastre per colture cellulari o piastre multipozzetto per high-throughput screening consentendo di ottenere dati significativi in un'analisi a breve termine e una manipolazione minima, prevenendo così le contaminazioni incrociate.
In una forma di realizzazione, Bac3Gel può essere suddiviso in piastre multipozzetto della dimensione desiderata.
Gli esempi che seguono sono da considerarsi illustrativi dell’invenzione e non limitativi della stessa, la cui portata è definita dalle rivendicazioni che seguono.
Esempi:
Esempio 1: caricamento di Bac3gel con albumina di siero umano.
Albumina di siero umano (HSA) è stata aggiunto alla soluzione di alginato e alla soluzione di alginato di mucina prima della reticolazione, utilizzando il metodo della doppia siringa. In breve, 10 ȝl di soluzione di HSA 56,2 mg/ml sono stati miscelati con soluzioni di alginato o di mucina/alginato per ottenere una concentrazione finale di HSA pari a 1,182 mg/ml. Le proprietà viscoelastiche dell’idrogelo così ottenuto sono riportate in figura 2.
Esempio 2: ottenimento e caratterizzazione di Mucin-Bac3gel
A Bac3gel è stata aggiunta mucina nei quantitativi riportati in tabella 1, dove le concentrazioni di mucina sono indicate in riferimento al prodotto finito:
Tabella 1
Mucina gastrica porcina commerciale è stata sciolta in soluzione acquosa di NaCl (16,33 mg/ml) ad una concentrazione di 25 mg/ml. Dopo agitazione durante la notte a 4°C, la polvere di alginato è stata aggiunta fino a raggiungere la concentrazione desiderata indicata in tabella 1 e agitata fino a completa dissoluzione.
L’idrogelo è stato formato utilizzando il sistema di diffusione bicompartimentale. In breve, 200 ȝl di soluzione di mucina/alginato sono stati introdotti nella camera apicale del sistema di diffusione (diametro = 1.5 cm, spessore � 120 �m) e lasciati a 4°C per 20 ore per consentire la diffusione di ioni Ca<2+ >dalla soluzione di calcio gluconato caricata nella camera inferiore. L’esperto del settore sa come adattare lo spessore di Bac3Gel variando il volume di soluzione introdotto e il diametro di detto primo compartimento 2.
Si sono poi misurate le proprietà viscoelastiche e i dati ottenuti sono riportati in figura 3.
I dati ottenuti mostrano la possibilità offerta dal sistema secondo la presente invenzione di ottimizzare le proprietà viscoelastiche di idrogeli a base di mucina controllando il grado di reticolazione, come il tempo di reticolazione e la concentrazione del reticolante, e la concentrazione di polisaccaridico e il suo peso molecolare. Nella figura 3, è riportato un esempio di variazione delle proprietà al variare della concentrazione di alginato.
Esempio 3: Bac3gel e Mucin-Bac3gel (Mu<3>gel) come modello della barriera mucosa.
Bac3gel e Mu<3>gel con le caratteristiche di cui all’esempio 2 sono stati testati per la loro capacità di mimare la barriera mucosa.
Sono stati testati gli attivi Cefalexina e Epirubicina, oltre che nanoparticelle d’oro.
Le nanoparticelle d’oro hanno un ingombro sterico di circa 25 nm, la Cefalexina di circa 3 nm e l’Epirubicina di circa 4 nm.
I grafici di figura 4 mostrano la capacità di dette molecole di attraversare una barriera dove la barriera è costituita da un supporto permeabile, Bac3gel oppure Mu<3>gel.
I risultati mostrano che nel caso in cui il farmaco abbia una forte interazione con la mucina, come nel caso della Epirubicina (pKa = 8.01, logD7.4 = 0.03), il passaggio del farmaco è rallentato. Invece, nel caso di bassa interazione con la mucina, come nel caso della Cefalexina (pKa = 3.26 and 7.23, logD7.4 = -2.5) il passaggio è molto rapido. Questo dimostra la capacità di fungere come barriera interattiva, permettendo alla mucina nel Bac3Gel di conservare la sua capacità di interagire con le molecole.
A parità di interazione, è possibile evidenziare l’effetto di barriera sterica: dal confronto tra nanoparticelle d’oro (25 nm) e la Cefalexina (3 nm) si osserva che le nanoparticelle d’oro di maggiori dimensioni vengono rallentate dalla presenza de Bac3Gel.
Esempio 4: ottenimento di Bac3gel con proprietà viscoelastiche e gradienti differenziali.
Bac3gel prodotto da un idrogelo precedentemente reticolato viene indicato con double.
Bac3Gel sono stati prodotti all'interno del sistema di diffusione bicompartimentale con diversi tempi di reticolazione, per produrre una doppia struttura reticolante. In breve, l’alginato di sodio è stato sciolto al 2,8% (p / v) in soluzione di NaCl (16,33 mg / ml), sotto agitazione magnetica lenta per 12 ore. Le soluzioni di alginato e acqua distillata sono state miscelate in proporzione 1:4 usando il metodo a doppia siringa (fase 1). Una sospensione di carbonato di calcio (7 mg / ml) in soluzione di NaCl (16,33 mg / ml) è stata sottoposta a ultrasuoni (UP200S, processore ultrasonico, Hielscher, Ultrasound Technology) per 5 minuti, centrifugata (agitatore orbitale Vortex IKA MS3 100-240 V) a 3500 rpm per 1 min e ulteriormente miscelato con la soluzione preparata nel passaggio 1 in proporzione 1:5 (fase 2). Infine, una soluzione di GDL (10 mg / ml) è stata preparata in NaCl (16,33 mg / ml) e miscelata con la soluzione preparata al punto 2 in proporzione 1:6. Approssimativamente, 706 �l della miscela finale sono stati inseriti nel primo compartimento apicale e questa miscela è stata lasciata reagire per una notte (Bac3Gel - single). Dopo reticolazione durante la notte, 0,2% di calcio gluconato o calcio cloruro sono stati sciolti in 40 mM di rosso di alizarina e 6 ml di questa soluzione sono stati introdotti nel secondo compartimento basolaterale e lasciati reagire per diverso tempo, ad esempio per 5, 30 e 60 minuti, così come per 20 ore per consentire la produzione di un gradiente (Bac3Gel -doppio). Il rosso di alizarina è un colorante rosso organico utilizzato per identificare i depositi di calcio nella coltura cellulare con un protocollo di colorazione ben definito. Come osservato nella Figura 5A, la diffusione del gluconato di calcio porta alla formazione di un gradiente di calcio all'interno di Bac3Gel, con aree rosse intense o miste (rispettivamente nella parte inferiore e superiore dei campioni), mentre Bac3Gel - single era trasparente e Bac3Gel - double dopo 20 ore di seconda reticolazione ha mostrato un colore rosso omogeneo (nero nella figura).
Sono stati anche analizzati i cambiamenti viscoelastici indotti dalla seconda reticolazione di Bac3gel (Figura 5B). Entrambi i moduli conservativo e dissipativo sono aumentati con il tempo della seconda reticolazione, che era più visibile tra 60 minuti e 20 ore. Infatti, i valori massimi del modulo conservativo sono stati rilevati per il campione esposto a 20 ore di diffusione e non sono state riscontrate differenze significative tra 30 e 60 minuti di diffusione.
Esempio 5: Bac3gel simula un contesto fisiologico o patologico.
Una coltura batterica starter è stata inoculata nel terreno appropriato e coltivata durante la notte. Per inoculare la coltura starter, in questo caso Pseudomonas aeruginosa, una piccola quantità di materiale congelato batterico è stata rimossa meccanicamente dal crioflacone originale, conservato a -80°C, e sospesa in 10 ml di terreno di Mueller Hinton (MH), poi mantenuto a 37ºC sotto agitazione a 200 rpm durante la notte.
Il giorno seguente la stima del numero di batteri è stata eseguita spettrofotometricamente a Ȝ = 600 nm (Optical Density600; OD600). Per preparare i campioni per il test di assorbanza, la sospensione è stata diluita in proporzione 1:10 con terreno MH fresco. Lo stesso terreno è stato usato come bianco. Una volta misurata l'assorbanza del campione diluito, il numero di batteri è stato stimato utilizzando una curva di calibrazione che riporta il numero di batteri con un valore di OD600. Questa concentrazione è stata poi corretta per il volume non diluito.
Per testare la vitalità batterica all'interno di Bac3Gel, ogni Bac3Gel è stato infettato da 500, 1000 e 5000 batteri per 24 e 48 ore di incubazione. Per fare ciò, 1 ml di sospensione è stato preso dalla coltura iniziale starter e diluito alle concentrazioni necessarie. Bac3Gel è stato quindi infettato introducendo 100 μl di sospensione di batteri e lasciato in incubazione in condizioni statiche a 37°C.
Conteggi di CFU sono stati usati per studiare la presenza di batteri all'interno di Bac3Gel, vale a dire i batteri che erano migrati e proliferati efficacemente all'interno di Bac3Gel come confronto con batteri coltivati in condizioni planctoniche. In questo caso, le colture axeniche sono state condotte sia in condizioni planctoniche che in Bac3Gel.
Per stimare il numero di batteri migrati e proliferati all'interno del Bac3Gel, i batteri residui presenti sulla parte superiore del Bac3Gel e sulle pareti del pozzetto sono stati rimossi grazie a due lavaggi con terreno MH fresco. Bac3gel è stato quindi sciolto utilizzando una soluzione di citrato di sodio 50 mM a pH 7,4. Dopo la dissoluzione, la sospensione è stata diluita e piastrata dopo il conteggio della CFU. In breve, il terreno è stato immesso in una provetta da centrifuga da 1,5 ml e quindi diluito a [10<-6>-10<-10>] volte in soluzione acquosa allo 0,9% di soluzione acquosa di cloruro di sodio, pH 7,4. Successivamente, 10 ȝl della sospensione diluita sono stati distribuiti uniformemente su piastre MH Agar.
Le piastre di MH agar sono state lasciate nell'incubatore per una notte. Le colonie effettive all'interno del Bac3Gel infetto sono state calcolate moltiplicando per il fattore di diluizione. Nel caso di Bac3Gel, sono stati considerati i 150 μl dell'agente di dissoluzione per calcolare CFU / ml. I risultati sono riportati in figura 6A.
In un ulteriore esperimento, Bac3gel è stato seminato con 10<4 >batteri/ml, necessari per raggiungere 10<8 >batteri dopo 24 ore. Dopo questo periodo, il supernatante su Bac3gel è stato rimosso e il Bac3gel è stato lavato due volte con terreno di coltura fresco. Successivamente, sono stati aggiunti 100 μl di antibiotico a tre diverse concentrazioni, ovvero 0,1 MIC, MIC e 10MIC. L'antibiotico è stato lasciato agire per 24 ore in incubazione statica a 37°C.
Dopo l'efficace tempo di azione antibiotica, è stato eseguito un conteggio CFU vitale. Sono stati eseguiti diversi controlli: (I) batteri planctonici a ciascuna concentrazione di antibiotici; (II) batteri planctonici senza alcun trattamento; (III) Bac3gel infetto non trattato; e (IV) soluzioni per la formazione di Bac3Gel. Per quanto riguarda il Bac3gel infetto e testato con antibiotici, anche in quest'ultimo caso, sono stati considerati solo i CFU di Bac3gel disciolto. I dati ottenuti sono riportati in figura 6B.
Esempio 6: A Bac3Gel preparato come descritto nell’Esempio 5 (Bac3Gel – single), si aggiunge Escherichia coli.
Una coltura batterica starter è stata precedentemente inoculata in Luria-Bertani (LB) broth e coltivata durante la notte. Per inoculare la coltura starter, in questo caso Escherichia coli, una piccola quantità di materiale congelato batterico è stata rimossa meccanicamente dal crio-flacone originale, conservato a -80°C, e sospesa in 10 ml di terreno di Luria-Bertani (LB) broth, poi mantenuto a 37ºC sotto agitazione a 200 rpm durante la notte.
Il giorno seguente la stima del numero di batteri è stata eseguita spettrofotometricamente a λ = 600 nm (Optical Density600; OD600). Per preparare i campioni per il test di assorbanza, la sospensione è stata diluita in proporzione 1:10 con terreno fresco. Lo stesso terreno è stato usato come bianco. Una volta misurata l'assorbanza del campione diluito, il numero di batteri è stato stimato utilizzando una curva di calibrazione che riporta il numero di batteri con un valore di OD600. Questa concentrazione è stata poi corretta per il volume non diluito.
Per testare la vitalità batterica all'interno di Bac3gel, ogni Bac3gel è stato infettato da 500, 1000 e 5000 batteri per 24 ore di incubazione. Per fare ciò, 1 ml di sospensione è stato preso dalla coltura iniziale starter e diluito alle concentrazioni necessarie. Bac3Gel è stato quindi infettato introducendo 100 ȝl di sospensione di batteri e lasciato in incubazione in condizioni statiche a 37°C.
Conteggi di CFU sono stati usati per studiare la presenza di batteri all'interno di Bac3gel, vale a dire i batteri che erano migrati e proliferati efficacemente all'interno di Bac3gel come confronto con batteri coltivati in condizioni planctoniche. In questo caso, le colture axeniche sono state condotte sia in condizioni planctoniche che in Bac3gel.
Per stimare il numero di batteri migrati e proliferati all'interno del Bac3Gel, i batteri residui presenti sulla parte superiore del Bac3Gel e sulle pareti del pozzetto sono stati rimossi grazie a due lavaggi con terreno fresco. Bac3gel è stato quindi sciolto utilizzando una soluzione di citrato di sodio 50 mM a pH 7,4. Dopo la dissoluzione, la sospensione è stata diluita e piastrata dopo il conteggio della CFU. In breve, il terreno è stato immesso in una provetta da centrifuga da 1,5 ml e quindi diluito a [10<-6>-10<-10>] volte in soluzione acquosa allo 0,9% di soluzione acquosa di cloruro di sodio, pH 7,4. Successivamente, 10 ȝl della sospensione diluita sono stati distribuiti uniformemente su piastre LB Agar.
Le piastre di LB agar sono state lasciate nell'incubatore per una notte. Le colonie effettive all'interno del Bac3Gel infetto sono state calcolate moltiplicando per il fattore di diluizione. Nel caso di Bac3Gel, sono stati considerati i 150 ȝl dell'agente di dissoluzione per calcolare CFU / ml. I risultati sono riportati in figura 7.
Sono stati eseguiti diversi controlli: (I) batteri planctonici a ciascuna concentrazione di antibiotici; (II) Bac3gel senza infezione; e (III) soluzioni per la formazione di Bac3Gel.
Vantaggi: Il substrato tridimensionale secondo la presente invenzione presenta caratteristiche tali da renderlo vantaggioso in applicazioni nel settore alimentare, ambientale e della salute. Bac3gel trova anche impiego nel settore della produzione di prodotti correlati ai batteri, quali a titolo di esempio cellulosa, poliesteri, insulina, antibatterici, antimicotici, antivirali, antitrombotici, immunomodificanti, antitumorali, inibitori enzimatici, insetticidi, erbicidi, fungicidi (ad esempio alcaloidi e flavonoidi) e sostanze che promuovono la crescita per piante e animali. A titolo esemplificativo, il substrato tridimensionale trova vantaggiosamente impiego nelle analisi finalizzate al monitoraggio della crescita batterica, l'interazione tra comunità microbiche e/o il potenziale antimicrobico di farmaci e micro/nanoparticelle, inquinanti, probiotici, rilascio di probiotici. Detto substrato tridimensionale si presta inoltre a procedure di screening per la selezione di trattamenti antimicrobici efficaci, così come alle fasi iniziali di ricerca di nuovi farmaci oltre che alla ricerca aerospaziale per comprendere adattamenti microbici all'ambiente spaziale, come microgravità e alti livelli di radiazione. Ulteriori applicazioni sono nell’industria alimentare, ad esempio per capire in che modo determinati regimi dietetici e/o i probiotici influenzano il comportamento batterico e le comunità microbiche, così come agente di trasporto di probiotici come integratore alimentare e nelle scienze ambientali, ad esempio per valutare l'effetto di inquinanti o agenti biocidi in prodotti di pulizia rispetto alle comunità microbiche, come prodotto per migliorare la produzione agricola o per la bonifica della contaminazione ambientale. Altro esempio includono il settore cosmetico, come ad esempio prodotti cosmetici che rilasciano microrganismi con effetti dermatologici. Bac3Gel può anche essere sfruttato come un modo per riprodurre il microambiente di microrganismi all'interno di stuoie microbiche per il trattamento delle acque e la riduzione dell'inquinamento. La coltura simultanea di diversi microrganismi all'interno del substrato tridimensionale può essere sfruttata nella produzione di biocarburanti e conversione bioenergetica, poiché i microrganismi adottati per queste applicazioni richiedono un'organizzazione fisica e spaziale. Infine, il substrato tridimensionale può essere sfruttato come pila a combustibile microbiologica.
L’utilizzo del substrato tridimensionale qui descritto è di immediata comprensione, non richiede alcuna esperienza tecnica o attrezzatura specifica. Inoltre, il substrato tridimensionale secondo la presente invenzione è compatibile con le piattaforme comunemente utilizzate, quali le piastre multi-pozzetto convenzionali a 6, 12, 24, 48, 96 o 384 pozzetti, i sistemi Transwell® ed i dispositivi microfluidici. Detto substrato tridimensionale ha un costo assolutamente competitivo, e la sua produzione è scalabile e modulare, laddove le proprietà viscoelastiche e il rispettivo gradiente dello stesso sono facilmente modificabili in base allo scopo dello studio.
Esperimenti condotti avvalendosi del substrato tridimensionale secondo la presente invenzione hanno portato a risultati realistici e con un'elevata riproducibilità.
Bac3gel presenta ulteriori vantaggi rispetto ai materiali sintetici o a base di agar, vantaggi che si riepilogano nei paragrafi che seguono:
-I componenti possono essere fonti di carbonio per i batteri e, in alcuni casi, sono prodotti dagli stessi batteri, ad esempio Pseudomonas aeruginosa secernono alginato.
-Bac3Gel consente di coltivare i batteri in una struttura tridimensionale a gradiente, che i metodi attuali non mostrano.
-I microorganismi in coltura in Bac3Gel possono essere collocati in supporti ad alta resistenza (come piastre di high throughput screening), consentendo di ottenere dati significativi in un'analisi a breve termine e una manipolazione minima, prevenendo così le contaminazioni incrociate.
-Il processo di preparazione evita l'uso di alte temperature o reagenti incompatibili con l'incapsulamento di microorganismi (ad esempio cellule di batteri) o stratificati su un monostrato cellulare.
-Il processo di preparazione evita l'uso di alte temperature o reagenti incompatibili con il caricamento di cellule eucariotiche o procariotiche, proteine o sostanze termolabili.
-Il controllo della cinetica di reazione di Bac3Gel consente di suddividerlo efficacemente in piastre Multi-well di dimensioni diverse, da piastre da 6 a 96 o 384 piastre.
I gel di agar disponibili nell’arte nota, in particolare gel di agar 0,2 - 0,8% p / v, sono una possibilità per le colture microbiche in tridimensionale, ma presentano diverse limitazioni:
-non mostrano gradienti e sono posizionati su piastre 2D di agar dura;
-gel di agar morbido mostrano la possibile mobilità batterica e la diffusione della sostanza all'interno del gel. Tuttavia, sono posizionati su una base di agar dura (1,5 - 2,0% p / v). Ciò consente alle celle di migrare parzialmente in tridimensionale, poiché saranno bloccate dal livello alla base.
-la colata di gel di agar morbido in supporti ad alta resistenza (piastre di high throughput screening) e l'interpretazione dei risultati richiederebbe manipolazione e strutture complesse, pertanto aumenterebbe la possibilità di contaminazione e la capacità di screening unitamente all'efficacia dei costi sarebbe limitata rispetto a Bac3Gel.
-l'agar deve essere bollito per completa dissoluzione e mantenuto a 50-55°C per mantenerlo in forma liquida prima dell'inoculazione e della piastratura. Queste temperature sono ostili per molti microrganismi e influenzeranno i componenti termolabili che potrebbero essere necessari per arricchire la struttura della coltura (ad esempio proteine e vitamine). Bac3Gel è stato ideato per sintesi e polimerizzazione in condizioni che non influenzano componenti termolabili o incapsulamento di microorganismi (ad esempio cellule di batteri) o stratificati su un monostrato cellulare.
Infine, il substrato tridimensionale secondo la presente invenzione, composto da polimeri di origine naturale e idrosolubili e prodotto senza l'uso di solventi tossici, è un dispositivo eco-compatibile.
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Un substrato tridimensionale per le colture microbiche che comprende: -Un sistema di diffusione (1) che comprende un primo compartimento apicale (2) e un secondo compartimento basolaterale (3), dove detto primo compartimento (2) è posto al di sopra di detto secondo compartimento (3), detto primo e detto secondo compartimento (2, 3) essendo separati da una membrana semipermeabile (4); -Una soluzione base che comprende polisaccaridi, proteine e Sali o un idrogelo pre-formato che comprende polisaccaridi, proteine e sali; -Un mezzo di reticolazione che comprende sali, terreni di coltura e acqua distillata.
- 2. Il substrato tridimensionale secondo la rivendicazione 1, dove detta membrana semipermeabile è realizzata in policarbonato, polistirolo, poli(diallildimetilammonio cloruro), polietilene tereftalato o poliammide (nylon).
- 3. Il substrato tridimensionale secondo la rivendicazione 1 o 2, dove detti polisaccaridi in detta soluzione base sono selezionati tra alginato di sodio a diversi pesi molecolari, pectina a diversi pesi molecolari diversi gradi di esterificazione e ammidazione, acido ialuronico a diversi pesi molecolari, gellano a diversi pesi molecolari, destrano a diversi pesi molecolari.
- 4. Il substrato tridimensionale secondo una delle rivendicazioni da 1 a 3, dove dette soluzioni hanno una viscosità compresa tra 0.05 e 100 Pa.s, o tra 0.2 e 10 Pa.s.
- 5. Il substrato tridimensionale secondo una delle rivendicazioni da 1 a 4, dove in detta soluzione base dette proteine sono selezionate tra mucina, albumina sierica, fibrinogeno, fibronectina, collagene, elastina, insulina.
- 6. Il substrato tridimensionale secondo una delle rivendicazioni da 1 a 5, dove in detta soluzione base detti sali sono selezionati tra cloruro di sodio, fosfato di ammonio, cloruro di potassio, fosfato di sodio bibasico, sodio bicarbonato, cloruro di potassio, fosfato di potassio dibasico triidrato, magnesio cloruro esaidrato, sodio solfato, tris (idrossimetil) amminometano, nitrato di sodio, nitrito di sodio, nitrato di potassio, nitrato di argento, nitrato di ammonio, nitrito di calcio, bisolfato di potassio, solfato di potassio, bisolfato di sodio, solfato di sodio e/o solfato di rame(I).
- 7. Il substrato tridimensionale secondo una delle rivendicazioni da 1 a 6, dove in detta soluzione di reticolazione detti sali sono selezionati tra calcio acetato, calcio citrato, calcio cloruro, calcio glubionato, calcio gluceptato, calcio gluconato, nitrato di calcio, fosfato di calcio, calcio idrogeno fosfato, idrossiapatite, carbonatoidrossiapatite, tricalcio fosfato, ottacalcio fosfato, nitrato di potassio, nitrato di zinco, nitrato di magnesio, nitrato di bario, nitrato di titanio, nitrato di ferro(III), nitrato di rame, nitrato di gallio, nitrito di calcio, solfato di alluminio, solfacetato di alluminio, solfato di zinco, solfato di tetraamino rame(II), rame solfato, ferro(III) solfato idrato, solfato di ferro, solfato di calcio e/o solfato di magnesio.
- 8. Un metodo per la preparazione di un substrato tridimensionale per le colture microbiche che comprende: -Mettere a disposizione un sistema di diffusione (1) che comprende un primo compartimento (2) e un secondo compartimento (3), dove detto primo compartimento (2) è posto al di sopra di detto secondo compartimento (3), detto primo e detto secondo compartimento (2, 3) essendo separati da una membrana semipermeabile (4); -Caricare in detto primo compartimento (2) una soluzione base o un idrogelo preformato che comprende polisaccaridi, proteine e sali; -Caricare in detto secondo compartimento (3) un mezzo di reticolazione che comprende sali, terreni di coltura e acqua distillata. -Incubare.
- 9. Un substrato tridimensionale per le colture microbiche ottenuto secondo il metodo di cui alla rivendicazione 8.
- 10. Il substrato per l’uso secondo la rivendicazione 9, dove dette colture microbiche sono colture batteriche.
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT102018000020242A IT201800020242A1 (it) | 2018-12-19 | 2018-12-19 | Substrato tridimensionale per le colture microbiche |
| JP2021536114A JP2022517524A (ja) | 2018-12-19 | 2019-12-19 | 微生物培養のための三次元基質 |
| EP19836577.7A EP3898937A1 (en) | 2018-12-19 | 2019-12-19 | Three-dimensional substrate for microbial cultures |
| PCT/IB2019/061120 WO2020128965A1 (en) | 2018-12-19 | 2019-12-19 | Three-dimensional substrate for microbial cultures |
| AU2019401996A AU2019401996A1 (en) | 2018-12-19 | 2019-12-19 | Three-dimensional substrate for microbial cultures |
| CA3122929A CA3122929A1 (en) | 2018-12-19 | 2019-12-19 | Three-dimensional substrate for microbial cultures |
| US17/416,161 US20220073857A1 (en) | 2018-12-19 | 2019-12-19 | Three-dimensional substrate for microbial cultures |
| BR112021012041-6A BR112021012041A2 (pt) | 2018-12-19 | 2019-12-19 | Substrato tridimensional para culturas microbianas |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT102018000020242A IT201800020242A1 (it) | 2018-12-19 | 2018-12-19 | Substrato tridimensionale per le colture microbiche |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| IT201800020242A1 true IT201800020242A1 (it) | 2020-06-19 |
Family
ID=66049460
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT102018000020242A IT201800020242A1 (it) | 2018-12-19 | 2018-12-19 | Substrato tridimensionale per le colture microbiche |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220073857A1 (it) |
| EP (1) | EP3898937A1 (it) |
| JP (1) | JP2022517524A (it) |
| AU (1) | AU2019401996A1 (it) |
| BR (1) | BR112021012041A2 (it) |
| CA (1) | CA3122929A1 (it) |
| IT (1) | IT201800020242A1 (it) |
| WO (1) | WO2020128965A1 (it) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040063206A1 (en) * | 2002-09-30 | 2004-04-01 | Rowley Jon A. | Programmable scaffold and method for making and using the same |
| US20040147016A1 (en) * | 2002-09-30 | 2004-07-29 | Rowley Jonathan A. | Programmable scaffold and methods for making and using the same |
| WO2010022151A1 (en) * | 2008-08-19 | 2010-02-25 | Absorption Systems Group Llc | Methods of transporting epithelial cell monolayers |
| WO2010118857A2 (en) * | 2009-04-14 | 2010-10-21 | Universiteit Gent | Technology and method to study microbial growth and adhesion to host-related surface and the host-microbiota interactions |
| WO2016026877A1 (en) * | 2014-08-20 | 2016-02-25 | F. Hoffmann-La Roche Ag | In vitro method and apparatus for analysing the behaviour of substances in simulated physiological environment |
-
2018
- 2018-12-19 IT IT102018000020242A patent/IT201800020242A1/it unknown
-
2019
- 2019-12-19 US US17/416,161 patent/US20220073857A1/en active Pending
- 2019-12-19 JP JP2021536114A patent/JP2022517524A/ja active Pending
- 2019-12-19 AU AU2019401996A patent/AU2019401996A1/en active Pending
- 2019-12-19 CA CA3122929A patent/CA3122929A1/en active Pending
- 2019-12-19 WO PCT/IB2019/061120 patent/WO2020128965A1/en unknown
- 2019-12-19 EP EP19836577.7A patent/EP3898937A1/en active Pending
- 2019-12-19 BR BR112021012041-6A patent/BR112021012041A2/pt unknown
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040063206A1 (en) * | 2002-09-30 | 2004-04-01 | Rowley Jon A. | Programmable scaffold and method for making and using the same |
| US20040147016A1 (en) * | 2002-09-30 | 2004-07-29 | Rowley Jonathan A. | Programmable scaffold and methods for making and using the same |
| WO2010022151A1 (en) * | 2008-08-19 | 2010-02-25 | Absorption Systems Group Llc | Methods of transporting epithelial cell monolayers |
| WO2010118857A2 (en) * | 2009-04-14 | 2010-10-21 | Universiteit Gent | Technology and method to study microbial growth and adhesion to host-related surface and the host-microbiota interactions |
| WO2016026877A1 (en) * | 2014-08-20 | 2016-02-25 | F. Hoffmann-La Roche Ag | In vitro method and apparatus for analysing the behaviour of substances in simulated physiological environment |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20220073857A1 (en) | 2022-03-10 |
| BR112021012041A2 (pt) | 2021-09-21 |
| CA3122929A1 (en) | 2020-06-25 |
| AU2019401996A1 (en) | 2021-07-08 |
| WO2020128965A1 (en) | 2020-06-25 |
| EP3898937A1 (en) | 2021-10-27 |
| JP2022517524A (ja) | 2022-03-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Trujillo-de Santiago et al. | The tumor-on-chip: Recent advances in the development of microfluidic systems to recapitulate the physiology of solid tumors | |
| Abdelhamid et al. | Biomimetic and bioinspired silicifications: Recent advances for biomaterial design and applications | |
| Soll et al. | Plasticity of Candida albicans biofilms | |
| Schmieden et al. | Printing of patterned, engineered E. coli biofilms with a low-cost 3D printer | |
| Wang et al. | Bio-inspired encapsulation and functionalization of living cells with artificial shells | |
| Kim et al. | In situ monitoring of antibiotic susceptibility of bacterial biofilms in a microfluidic device | |
| Luo et al. | Biofabrication of stratified biofilm mimics for observation and control of bacterial signaling | |
| Baca et al. | Cell-directed-assembly: directing the formation of nano/bio interfaces and architectures with living cells | |
| CN102140422B (zh) | 用于控制不同种细胞相互作用的装置、其制备方法及用途 | |
| Eun et al. | Fabrication of microbial biofilm arrays by geometric control of cell adhesion | |
| Nickel et al. | In vitro sponge fragment culture of Chondrosia reniformis (Nardo, 1847) | |
| Wang et al. | Cellular shellization: Surface engineering gives cells an exterior | |
| Morita et al. | Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures | |
| Homem et al. | Functionalization of crosslinked sodium alginate/gelatin wet-spun porous fibers with nisin Z for the inhibition of Staphylococcus aureus-induced infections | |
| Han et al. | Precipitation of calcite induced by Synechocystis sp. PCC6803 | |
| Celik et al. | Fabrication of human keratinocyte cell clusters for skin graft applications by templating water-in-water Pickering emulsions | |
| Fraczyk et al. | Conjugates of copper alginate with arginine-glycine-aspartic acid (RGD) for potential use in regenerative medicine | |
| Zhang et al. | The optimization of a novel hydrogel—Egg white-alginate for 2.5 D tissue engineering of salivary spheroid-like structure | |
| Simon-Colin et al. | Use of natural antimicrobial peptides and bacterial biopolymers for cultured pearl production | |
| Soozanipour et al. | Biotechnological advancements towards water, food and medical healthcare: A review | |
| Crivello et al. | In vitro models of bacterial biofilms: innovative tools to improve understanding and treatment of infections | |
| Sardelli et al. | Bioinspired in vitro intestinal mucus model for 3D-dynamic culture of bacteria | |
| Yuan et al. | Microfluidics for Biofilm Studies | |
| Chakraborty et al. | Biomimetic and bioinspired nanostructures: recent developments and applications | |
| Lo Presti et al. | Perspectives on applications of nanomaterials from shelled plankton |