KR101303695B1 - 저분자 실크 피브로인과 아가로스 겔을 이용한 3차원 지지체 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 저분자 실크 피브로인과 아가로스 겔을 이용한 3차원 지지체 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 3차원 지지체는 저분자 실크 피브로인과 아가로스 겔을 포함하는 것으로써, 상기 저분자 실크 피브로인은 전체중량에 대하여 0.01 ~ 0.05 중량%가 함유되는 것이 특징이다.
본 발명의 3차원 지지체의 제조방법은 아가로스를 준비한 후, 이를 액체 상태로 하이드로 겔화하여 아가로스 겔을 제조하는 단계와, 상기 아가로스 겔에 지지체 전체중량대비 0.01 ~ 0.05 중량%의 저분자 실크 피브로인 파우더를 넣고 혼합한 후, 이를 성형틀에 주입한 다음, 바로 고체화시킨 후 동결건조시키는 단계를 포함하여 구성된다.
본 발명에 의해, 기존의 방법에서 사용하는 조골세포로 분화를 유도하기 위하여 첨가하여 주는 골 형성 촉진인자들의 사용을 경감시키거나 무용하게 하여 비용 및 시간을 감소시키는 효과를 얻을 수 있게 되어 인공 뼈 또는 인체조직 재생을 목적으로 하는 신소재 개발에 이용가능한 3차원 지지체를 제공할 수 있게 된다.

Description

저분자 실크 피브로인과 아가로스 겔을 이용한 3차원 지지체 및 그 제조방법{3D SCAFFOLDS USING LOW MOLECULES SILK FIROIN AND THE AGAROSE GEL, AND PRODUCTION METHOD THEROF}

본 발명은 조골세포 전구체인 C2C12 세포의 3차원 배양 및 분화유도를 위해 발명된 새로운 개념의 3차원 지지체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 C2C12 등 여러 세포들을 3차원 배양하는데 있어서 보다 효율적으로 지지체에 세포 부착 및 증식과 분화가 이루어질 수 있도록 하는 3차원 지지체에 관한 것이다.

일반적으로, 아가로스는 친수성과 생체적합성 등 중요한 특징을 가지므로 재생의학, 약물탐색, 바이오센서와 같은 여러 다양한 생물학적 소재 개발 분야에서 중요한 재료로 사용되고 있다.

본 발명과 같은 분야로 재생의학을 위한 신소재개발 측면에서 보면 아가로스는 뼈, 연골, 간, 뇌, 기타 장기 등 여러 형태의 조직재생 신소재 개발에 사용되어 왔다.

실크 피브로인 역시 수 천년 전부터 수술용 봉합사로서 널리 이용되어 왔으며, 미국의 David L. Kaplan 교수 등 여러 연구자들에 의해 조직공학 재료로서 세포배양 및 조직 재생용 소재개발을 위한 중요한 재료로 여겨지고 있다.

또한, 최근 연구보고에 따르면 저분자 실크 피브로인은 조골세포 전구체에 배양을 위한 배지에 첨가 시 조골세포로 분화가 촉진된다는 연구결과가 공개된 바 있다.

그러나 이상의 재료는 생물학적, 화학적, 그리고 물리적 특성에 있어서 상호 보완이 필요하며 이를 위하여 여러 고분자 생체재료인 아파타이트, 콜라겐, 수산화인회석, 그리고 칼슘포스페이트 등과 혼합하여 사용하는 제품개발이 주를 이루고 있다.

즉, 기존의 개발방법에 따른 지지체들은 제조시 물리적 특성 개선과 생물학적인 특성을 개선하기 위하여 보조적인 첨가물의 혼합 또는 사후 처리가 필요하여 제조방법이 복잡하고 이에 따른 비용과 시간 소모가 많은 단점이 있다.

특히 배양된 세포가 조골세포로 분화되기 위한 분화유도 인자로서 BMP와 같은 고가의 단백질을 첨가해 주어야만 하기 때문에 인공 뼈 개발을 위한 지지체 개발에 있어 큰 문제점으로 작용하고 있다.

따라서, 이러한 문제를 극복하기 위해 천연 고분자인 아가로스 또는 실크와 접목한 합성 고분자를 주로 사용한 제품고안이 이루어져 왔다.

이러한 결과로 생분해성과 생체적합성 등 여러 생물학적인 장점과 아울러 물리적인 특성을 아우를 수 있는 새로운 재료들이 개발된 것이 사실이다.

하지만 상기재료들은 물리적, 화학적인 장점과 일부 생물학적인 특성을 가지는 재료이긴 하지만 더 많은 생물학적인 이점인 세포부착 및 증식효과 부여와 분화유도와 같은 가장 중요한 요소는 결여가 되어있으며 이를 위하여 새로운 생물학적인 재료를 첨가해야만 하는 문제점을 가지고 있다.

본 발명은 상기 종래의 지지체가 가지는 세포 접착·증식 및 분화에 관한 문제점을 해소하기 위한 것으로서, 아가로스 겔과 누에에서 생산 및 가공된 저분자 실크 피브로인을 접목하여 새로운 형태의 3차원 지지체를 발명함으로써 인공 뼈 또는 인체조직 재생을 목적으로 하는 신소재 발명에 이용하고 함이 목적이다.

또한, 본 발명에서는 저분자 실크 피브로인을 이용함으로써 제조방법이 단순하고 고가의 단백질인 BMP와 같은 뼈 형성촉진인자의 사용을 절감할 수 있기 때문에 인공 뼈 개발을 위한 공정에서 시간 및 비용을 줄일 수 있는 3차원 지지체를 제공하는데 목적도 있다.

본 발명의 3차원 지지체는 저분자 실크 피브로인과 아가로스 겔을 포함하여 구성된다.

상기 저분자 실크 피브로인은 전체중량에 대하여 0.01 ~ 0.05 중량% 함유됨을 특징으로 한다.

상기 아가로스 겔은 전체중량에 대하여 1.0 중량% 함유됨을 특징으로 한다.

상기 저분자 실크 피브로인은 줄기세포 또는 전구세포 중 선택된 1 종을 세포배양을 통한 조골세포로 분화유도함을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 3차원 지지체는 인공 뼈조직 제작 또는 인체조직 재생에 사용된다.

본 발명의 3차원 지지체의 제조방법은 아가로스를 준비한 후, 이를 액체 상태로 하이드로 겔화하여 아가로스 겔을 제조하는 단계와, 상기 아가로스 겔에 지지체 전체중량대비 0.01 ~ 0.05 중량%의 저분자 실크 피브로인 파우더를 넣고 혼합한 후, 이를 성형틀에 주입한 다음, 바로 고체화시킨 후 동결건조시키는 단계를 포함하여 구성된다.

본 발명에 의해, 기존의 방법에서 사용하는 조골세포로 분화를 유도하기 위하여 첨가하여 주는 골 형성 촉진인자들의 사용을 경감시키거나 무용하게 하여 비용 및 시간을 감소시키는 효과를 얻을 수 있게 되어 인공 뼈 개발을 위한 공정에서 시간 및 비용을 줄일 수 있는 3차원 지지체를 제공할 수 있게 된다.

또한, 본 발명에서는 세포 부착 및 증식의 특성을 보여줌으로써 기존의 3차원 세포배양의 문제가 해결되어, 다양한 바이오신소재 개발에 적용 및 응용가능하게 된다.

도 1은 저분자 실크 피브로인 함유 아가로스 겔을 이용한 조골세포분화 유도과정 모식도.
도 2는 저분자 실크 피브로인 함유 아가로스 겔 3차원 지지체 형태를 나타낸 도면.
도 3은 저분자 실크 피브로인 함유를 통한 공극조절 효과를 나타낸 도면.
도 4는 저분자 실크 피브로인 함유 농도별 세포 부착 및 증식력을 나타낸 도면.
도 5는 메틸렌블루로 염색한 지지체 내부의 세포부착 및 증식효과를 나타낸 도면.
도 6은 지지체 내부에서 증식한 세포군집의 광학 현미경 사진을 나타낸 도면.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

아가로스 및 실크 피브로인은 각각 천연물로서 조류(Seaweeds)와 누에 같은 생물체를 통해 직접 얻을 수 있는 생체적합성의 물질로 인정되고 있다.

아가로스(Agarose)는 생체적합성 천연고분자물질로서 현재 지지체로서 발명을 위한 노력이 일부 진행되고 있다.

그러나 합성고분자에 비하여 물리적·화학적인 특성이 부족하여 실질적인 응용에 한계를 가지고 있는 실정이다.

이러한 소재를 이용한 인체 적용은 면역반응을 유발하지 않으면서 조직 재생 작용을 돕는 것이 장점으로 알려져 있다.

현재 아가로스는 사용 목적에 따라 몇 가지로 나누어지며 그 가운데 비교적 낮은 온도에서 용해성을 보이는 아가로스는 현재 세포에 대한 독성이 없어 세포배양 및 바이러스 증식을 위한 실험에 주로 사용이 되어지고 있다.

저분자 실크 피브로인(LSF,Low molecules Silk Firoin)은 최근 조골세포로 분화를 촉진한다고 알려져 있으며, 과거 수 천년 전부터 수술용 봉합사로 사용되어 생체적합성에 대한 검증을 거친 실크 역시 인체에 적용 가능한 소재로서 장점이 있다.

본 발명의 발명자들은 상기와 같은 장점을 가지는 두 가지의 소재 즉, 아가로스와 저분자 실크 피브로인을 혼합하여 하기와 같은 목적의 3차원 구조의 지지체를 개발하고자 한다.

첫째, 세포 및 인체에 독성이 없는 새로운 형태의 3차원 세포배양 지지체 조성을 확립

둘째, 실크 피브로인 함유를 통한 3차원 지지체 내부의 구조 및 강도와 같은 물리적 특성 개선

셋째, 아가로스만 독립적으로 구성된 것에 비해 실크 피브로인이 함유된 지지체의 경우 대상 세포의 부착 및 증식율 증대 효과

마지막으로, 실크 피브로인 함유를 통해 조골세포 분화 유도 효과 도입

이에, 본 발명에서는 대조군으로서 순수 아가로스만을 사용하여 제조한 3차원 지지체와 저분자 실크 피브로인 파우더와 아가로스를 함께 이용하여 제조한 지지체에 적당한 수의 C2C12세포를 접종하여 최대 4주간 배양한 후, 하기의 실험단계들을 통해 그 특성을 관찰하여 비교·분석하였다.

1) 저분자 실크 피브로인을 아가로스 용액에 각 농도별로 첨가한 후, 이를 동결건조 하여 지지체로 제조하는 단계

2) 상기 제조된 지지체에 에탄올을 처리하여 고정하고 멸균한 다음 그 구조적 특성을 비교하는 단계

3)상기 단계 2)에서 제조된 저분자 실크 피브로인 함유 아가로스겔 지지체에 세포배양을 위한 배지를 첨가하여 세포 접종 및 증식이 가능한 상태로 적응하는 단계

4) 상기 단계 3)에서 현미경을 통하여 배지에 적응된 아가로스만 독립적으로 함유한 것과 저분자 실크 피브로인을 혼합한 각 지지체의 공극 및 특성 비교 단계

5) 상기 단계 4)에서 확인된 지지체에 마우스 조골세포 전구체인 C2C12 세포를 접종하여 부착하는 단계

6) 상기 단계 5)에서 부착된 세포를 동물세포 배양기에서 증식할 수 있도록 배양하는 단계

7) 상기 단계 6)에서 각 지지체 별로 배양된 세포의 부착율 및 증식율을 현미경 및 세포 특이적 염색 시약을 통하여 비교하는 단계

상기 단계들을 통해 저분자 실크 피브로인 혼합 아가로스 겔 지지체를 이용하여 마우스 조골세포 전구체인 C2C12 세포가 접착·증식율 향상 및 분화 유도가 가능하게 됨을 확인하였으며, 이에 유사한 목적으로 아가로스 겔을 대신하여 저분자 실크 피브로인을 함유한 실크, 콜라겐, HA, PMMA 등 여러 소재를 사용한 지지체도 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 상기와 같이 3차원 지지체를 이용한 조골세포 전구체 배양과정을 통한 뼈 세포분화 유도는 인공 뼈 생산을 위한 중요 수단으로서 가치가 있음을 알 수 있다.

다시 말해, 아가로스만을 사용하여 제조한 지지체와는 달리 저분자 실크 피브로인이 함유된 아가로스 겔 지지체는 조골세포 전구체로서 C2C12세포의 3차원 세포배양을 가능하게 한 것만으로도 중요한 발명이며 이에 더 나아가 C2C12세포가 조골세포 전구체에서 조골세포로 쉽게 분화 될 수 있도록 도와주는 장치로서 저분자 실크 피브로인을 접목하였다는 것 역시 중요한 본 발명의 특징이자 효과이다.

따라서, 본 발명을 적용한 인공 뼈 개발은 기존의 개발 방법에서 사용하는 조골세포로 분화를 유도하기 위하여 첨가하여 주는 골 형성 촉진인자들의 사용을 경감시키거나 무용하게 하여 개발 비용 및 시간을 감소하는 효과를 가져 올 수 있으며, 기존의 3차원 세포배양의 문제를 해결하여 세포 부착 및 증식의 특성을 보여준 본 발명은 현재 시도되고 있는 다양한 바이오신소재 개발에 적용 및 응용되어 여러 조직공학 시스템 개발을 위한 중요 기술로서 효과를 기대할 수 있게 된다.

이하, 본 발명에 대하여 실시예 및 실험예를 통하여 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 본 발명인 저분자 실크 피브로인 함유 3차원 지지체 제조1

증류수를 사용하여 1%의 아가로스(low melting temperature agarose)를 이용한 지지체의 기본 골격을 형성하였다.

여기서 사용한 아가로스는 일반적으로 세포배양 및 바이러스 역가확인을 위해 사용되는 재료로서 세포독성이 없는 것을 사용하였고 12-well culture plate를 사용하여 성형하였다.

상기 아가로스를 전자렌지에서 액체 상태로 하이드로 겔화 후 성형틀에 주입한 다음, 바로 4℃에서 냉장하여 고체화하였다.

이때, 상기 전자렌지를 사용한 하이드로 겔화 과정에서 0.01g/ml의 저분자 실크 피브로인 파우더를 함께 넣은 후, 이를 성형틀에 주입하였다.

그 후 동결건조 방식을 통해 본 발명의 지지체1을 제조하였다.

<실시예 2> 본 발명인 저분자 실크 피브로인 함유 3차원 지지체 제조2

상기 실시예 1과 같은 방법으로 제조하되, 0.02g/ml의 저분자 실크 피브로인 파우더를 사용하여 본 발명의 지지체2를 제조하였다.

<실시예 3> 본 발명인 저분자 실크 피브로인 함유 3차원 지지체 제조3

상기 실시예 1과 같은 방법으로 제조하되, 0.03g/ml의 저분자 실크 피브로인 파우더를 사용하여 본 발명의 지지체3을 제조하였다.

<실시예 4> 본 발명인 저분자 실크 피브로인 함유 3차원 지지체 제조4

상기 실시예 1과 같은 방법으로 제조하되, 0.04g/ml의 저분자 실크 피브로인을 사용하여 본 발명의 지지체4를 제조하였다.

<실시예 5> 본 발명인 저분자 실크 피브로인 함유 3차원 지지체 제조5

상기 실시예1과 같은 방법으로 제조하되, 0.04g/ml의 저분자 실크 피브로인 파우더를 사용하여 본 발명의 지지체5를 제조하였다.

<비교예 1> 아가로스 겔 지지체 제조

증류수를 사용하여 1%의 아가로스(low melting temperature agarose)를 이용한 지지체의 기본 골격을 형성하였다.

상기 아가로스를 전자렌지에서 액체 상태로 하이드로 겔화 후 성형틀에 주입하고, 이를 바로 4℃에서 냉장하여 고체화하였으며 그 다음으로 동결건조 방법을 사용하여 아가로스 겔 지지체를 제조하였다.

<실험예 1> 지지체를 이용한 인공뼈 형성

실시예 1에서 제조된 지지체와 비교예 1에서 제조된 지지체를 각각 이용하여 인공뼈를 형성하였다.

즉, 도 1의 모식도에 나타나 있듯이, 아가로스만을 이용한 지지체(비교예 1)에 비하여 저분자 실크 피브로인이 함유된 지지체(실시예 1)는 세포의 부착력이 증가하고 부착된 성장조절물질(growth factors)의 도움이 없거나 혹은 적은 양으로 해당 세포가 조골세포로 분화되는 현상을 나타내는 결과를 나타냄을 알 수 있었다.

<실험예 2> 본 발명인 지지체의 형태확인

1. 실험재료

실시예 1 내지 5에서 제조된 지지체와 비교예 1에서 제조된 아가로스 지지체를 준비하였다.

상기 준비된 지지체들을 각각 동결건조한 후 에탄올을 상온에서 1시간 처리하여 고정하였으며 이후 상온에서 완전히 건조하여 각 재료들을 준비하였다.

2. 실험방법

상기 준비된 지지체들 나열한 후 이들의 외관상 형태를 비교하였다.

3. 실험결과

도 2에 나타나 있듯이, 지지체 모두는 약 1.2cm의 지름, 1.0cm 정도의 높이로 이루어진 원통형 구조를 가지며, 특히, 본 발명인 저분자 실크 피브로인이 함유된 지지체(실시예 1 내지 5)의 경우 연한 베이지색을 나타내며 저분자 실크 피브로인의 함유량이 증가할수록 강도가 강해짐을 알 수 있었다.

<실험예 3> 본 발명인 지지체의 공극조절효과 측정

상기 실험예 2의 결과를 토대로 강도 증가의 이유는 내부에 존재하는 공극의 크기가 감소한 이유일 것으로 예상하여 이를 확인하고자 하기 실험을 시행하였다.

1. 실험재료

실시예 1에서 제조된 지지체와 비교예 1에서 제조된 아가로스 지지체를 준비하였다.

상기 준비된 지지체들을 각각 동결건조한 후 에탄올을 상온에서 1시간 처리하여 고정하였으며 이후 상온에서 완전히 건조하여 각 재료들을 준비하였다.

2. 실험방법

상기 준비된 지지체들은 우선 각각 세포배양용 배지에 첨가하였다.

이때, 세포배양용 배지에는 “페놀레드”라는 물질이 존재하기 때문에 붉은 색을 띄게 되고 이는 지지체의 공극을 효과적으로 확인하는 중요 방법으로 사용될 수 있다.

사진은 해부현미경과 디지털 카메라를 사용하였으며, 이를 통해 각 지지체들의 공극조절효과를 확인하였다.

3. 실험결과

도 3에 나타나 있듯이, 아가로스 단독의 지지체(비교예 1)는 내부에 많고 큰 공극으로 인하여 세포의 부착은 좋은 반면 증식을 통한 조직공학 목적의 지지체로서 이용하기에는 한계가 있음을 알 수 있었다.

이에 반면, 실시예 1 지지체에는 내부에 아가로스 단독의 지지체(비교예 1)보다는 적고 작은 공극이 형성됨을 확인하였다.

즉, 적당한 크기로 공극을 조절해야만 하는 물리적 특성의 이유가 반드시 존재하며 본 발명에서 사용된 저분자 실크 피브로인은 지지체 제조시 중요한 요소 가운데 하나인 물리적 특성인 공극 조절방법에도 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

<실험예 4> 세포 부착 및 증식력 확인

1. 실험재료

실시예 1 내지 5에서 제조된 지지체와 비교예 1에서 제조된 아가로스 지지체를 준비하였다.

상기 준비된 지지체들을 각각 동결건조한 후 에탄올을 상온에서 1시간 처리하여 고정하였으며 이후 상온에서 완전히 건조하여 각 재료들을 준비하였다.

2. 실험방법

상기 준비된 지지체들은 우선 각각 세포배양용 배지에 첨가하여 지지체가 완전히 배지를 흡수할 수 있도록 하였다.

그 다음으로 5×10⁴ 개의 C2C12세포를 상기 배지들에 각각 첨가하여 배양하였다.

배지는 매주 2번 새로운 배지로 교환하여 주었으며, 사진은 해부현미경과 디지털 카메라를 사용하여 확인하였다.

이때, 사진에서 하얗고 작은 점으로 보이는 것이 세포군(Cell colonies)들이다.

3. 실험결과

본 실험은 본 발명의 중요한 장점 가운데 생물학적인 특성을 확인한 것으로서 도 4에 나타나 있듯이, 아가로스 만을 단독으로 사용한 지지체(비교예 1)의 경우보다 저분자 실크 피브로인이 함유된 지지체(실시예 1 내지 5)에서 세포의 부착력이 증가함을 보임을 확인할 수 있었다.

<실험예 5> 메틸렌 블루로 염색한 지지체 내부의 세포부착 및 증식효과확인

1. 실험방법

상기 실험예 4의 결과인 도 4를 재확인하기 위한 실험으로써, 각 지지체들을 메틸렌 블루로 염색하여 지지체 내부의 세포부착 및 증식효과를 확인하였다.

도 4와 같이 세포가 증식한 지지체들의 정 가운데 단면을 각각 절단하였다.

그 후 메틸렌블루로 염색하고 증류수를 사용하여 세척하였다.

메틸렌블루는 세포의 막에 염색이 되는 시약으로서 세포가 존재할 경우 푸른색으로 염색되는 세포를 쉽게 현미경을 통하여 관찰할 수 있었다.

사진은 해부현미경과 디지털 카메라를 사용하여 확인하였다.

이때, 사진에서 푸른색으로 염색된 점이 세포군(Cell colonies)들이다.

2. 실험결과

도 4의 경우는 지지체 전체를 bird view 형태로 본 반면, 도 5의 경우는 지지체 단면을 절단하여 그 내부에 세포가 부착하고 성장하는 결과를 확인한 것이다.

즉, 도 5에 나타나있듯이, 본 발명인 실시예 1 내지 5의 지지체에서 세포가 지지체의 내부까지 이동하고 증시하고 있음을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 본 발명의 지지체들(실시예 1 내지 5)이 세포배양을 위한 3차원 지지체로서 사용가능함을 확인하였다.

도 4와 5의 결과를 좀 더 구체척으로 확인하고자 세포군(Cell colonies)로 여겨지는 부분을 획득하고 슬라이드 글라스에 도말하여 현미경을 이용하여 관찰하였다.

그 결과, 도 6에 나타나 있듯이, 세포군 (Cell colonies)들은 정확히 세포들로 구성되어 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (6)

1. 뼈세포로 분화를 촉진하며 세포부착력을 증가시키기 위한 저분자 실크 피브로인 파우더 및 아가로스 겔을 포함하는,
   3차원 지지체.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 저분자 실크 피브로인 파우더는 전체중량에 대하여 0.01 ~ 0.05 중량% 함유됨을 특징으로 하는,
   3차원 지지체.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 아가로스 겔은 전체중량에 대하여 1.0 중량% 함유됨을 특징으로 하는,
   3차원 지지체.
   
4. 삭제
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 3차원 지지체는 인공 뼈조직 제작 또는 인체조직 재생에 사용됨을 특징으로 하는,
   3차원 지지체.
   
6. 아가로스를 준비한 후, 이를 액체 상태로 하이드로 겔화하여 아가로스 겔을 제조하는 단계;및
   상기 아가로스 겔에 지지체 전체중량대비 0.01 ~ 0.05 중량%의 저분자 실크 피브로인 파우더를 넣고 혼합한 후, 이를 성형틀에 주입한 다음, 바로 고체화시킨 후 동결건조시키는 단계;를 포함하여 구성된,
   3차원 지지체의 제조방법.

Images