JP2014218453A - コラーゲン成形体及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】前記課題は、本発明の線維化又は非線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体であって、前記コラーゲン膜が、液体の存在下でγ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はUV照射によって架橋処理することによって得られ、重量法による密度が0.4g/cm3以上であり、そして湿潤下での引張強度が1MPa以上であることを特徴とする、コラーゲン成形体によって解決することができる。
【選択図】なし
Description
従って、本発明の目的は、細胞培養液又は体液等により、溶解、収縮、又は膨張などの変化が起こりにくい、コラーゲン成形体(特には、コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体、及びコラーゲン膜とコラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体)、及びその製造方法を提供することである。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
[1]線維化又は非線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体であって、前記コラーゲン膜が、液体の存在下でγ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はUV照射によって架橋処理することによって得られ、重量法による密度が0.4g/cm3以上であり、そして湿潤下での引張強度が1MPa以上であることを特徴とする、コラーゲン成形体、
[2]前記コラーゲン成形体が、架橋処理コラーゲン膜と線維化又は非繊維化架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体であって、
前記架橋処理コラーゲン多孔体が、液体の存在下でγ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はUV照射によって架橋処理することによって得られる、[1]に記載のコラーゲン成形体、
[3]前記架橋処理が、一般式(1)
[4]前記ポリエチレングリコール誘導体の分子量が1,000〜15,000である、[1]〜[3]のいずれかに記載のコラーゲン成形体、
[5]前記液体のpHが3.0〜10.0である、[1]〜[4]のいずれかに記載のコラーゲン成形体、
[6]前記γ線照射の照射量が、5〜50kGyである、[1]〜[5]のいずれかに記載のコラーゲン成形体、
[7]ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(D−PBS)中に37℃で5日間浸漬した場合の溶解率が10質量%以下である、[1]〜[6]のいずれかに記載のコラーゲン成形体、
[8]ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(D−PBS)中に37℃で5日間浸漬した後の、浸漬前に対する面積変化率が5%以内である、[1]〜[7]のいずれかに記載のコラーゲン成形体、
[9](1)コラーゲン濃度が0.5質量%以上3.0質量%以下のコラーゲン溶液を成形器内に入れ、コラーゲンを線維化することによって、線維化コラーゲンゲルを成形する工程、(2)前記線維化コラーゲンゲルを、水混和性有機溶媒濃度を段階的に高めた水混和性有機溶媒と水との混合液に順次浸漬して脱塩する工程、(3)前記脱塩した線維化コラーゲンゲルを乾燥し線維化コラーゲン膜を得る工程、及び(4)前記線維化コラーゲン膜を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はUV照射によって架橋処理する工程、を含む線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体の製造方法、
[10](1)コラーゲン濃度が0.5質量%以上3.0質量%以下のコラーゲン溶液を成形器内に入れ、コラーゲンを線維化することによって、線維化コラーゲンゲルを成形する工程、(2)前記線維化コラーゲンゲルを、水混和性有機溶媒濃度を段階的に高めた水混和性有機溶媒と水との混合液に順次浸漬して脱塩する工程、(3)前記脱塩した線維化コラーゲンゲルを乾燥し線維化コラーゲン膜を得る工程、(3a)(A)前記線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が0.5質量%以上3.0質量%以下の多孔体作製用線維化コラーゲンゲルとを接触させる工程、若しくは、(B)前記線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が5.0質量%以下の多孔体作製用コラーゲン酸性溶液とを接触させる工程、(3b)前記接触物を凍結乾燥して積層体を得る工程、(4)前記積層体を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はUV照射によって架橋処理する工程を含む、線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含む[9]に記載のコラーゲン成形体の製造方法、
[11]前記乾燥工程(3)が、脱塩した線維化コラーゲンゲルを、上部及び下部を被覆して通気性を遮断した被覆上部と被覆下部との間に、非被覆の外周部を設け、当該外周部から脱媒して乾燥させる工程である、[9]又は[10]に記載のコラーゲン成形体の製造方法、
[12]前記液体、前記コラーゲン溶液、前記多孔体作製用線維化コラーゲンゲル、及び前記多孔体作製用コラーゲン酸性溶液からなる群から選択される少なくとも1つが、一般式(1)
[13](1)酸性液にコラーゲンを溶解し、コラーゲン濃度が0.5質量%以上3.0質量%以下のコラーゲン酸性溶液を得る工程、(2)前記コラーゲン酸性溶液を成形器に入れ、成形する工程、(3)前記コラーゲン酸性溶液を乾燥し非線維化コラーゲン膜を得る工程、及び(4)前記非線維化コラーゲン膜を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はUV照射によって架橋処理する工程、を含む非線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体の製造方法、
[14](1)酸性液にコラーゲンを溶解し、コラーゲン濃度が0.5質量%以上3.0質量%以下のコラーゲン酸性溶液を得る工程、(2)前記コラーゲン酸性溶液を成形器に入れ、成形する工程、(3)前記コラーゲン酸性溶液を乾燥し非線維化コラーゲン膜を得る工程、(3a)(A)前記非線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が0.5質量%以上3.0質量%以下の多孔体作製用線維化コラーゲンゲルとを接触させる工程、若しくは(B)前記非線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が5.0質量%以下の多孔体作製用コラーゲン酸性溶液とを接触させる工程、(3b)前記接触物を凍結乾燥して積層体を得る工程、(4)前記積層体を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はUV照射によって架橋処理する工程、を含む、非線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含む[13]に記載のコラーゲン成形体の製造方法、
[15]前記液体、前記コラーゲン膜作製用コラーゲン酸性溶液、前記多孔体作製用線維化コラーゲンゲル、及び前記多孔体作製用コラーゲン酸性溶液からなる群から選択される少なくとも1つが、一般式(1)
[16][9]〜[15]のいずれかに記載の製造方法によって得ることのできるコラーゲン成形体、
に関する。
また、本発明の成形体は、ポリエチレングリコール誘導体の存在下で架橋処理されることによって、ポリエチレングリコール誘導体がコラーゲン分子または線維同士を架橋し、強度が向上する。更に、コラーゲン分子又は線維に結合したポリエチレングリコール誘導体の片側末端に成長因子またはペプチドなどを結合させるのに好適である。
更に、本発明の製造方法は本発明のコラーゲン成形体を製造することができる。従って、本発明の製造方法によって得られるコラーゲン成形体は、例えば細胞培養液中に数日間浸漬しても分解し難く且つ膨張や収縮が極めて少ない。従って、細胞培養基材、再生医療用の足場材料、移植用材料、創傷被覆材、癒着防止材、又は薬物輸送担体等に適した材料である。
本発明のコラーゲン成形体は、線維化又は非線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体である。そして、前記コラーゲン膜は、液体の存在下でγ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はUV照射によって架橋処理することによって得られ、重量法による密度が0.4g/cm3以上であり、そして湿潤下での引張強度が1MPa以上である。
また本発明のコラーゲン成形体は、架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含んでもよい。そして、前記架橋処理コラーゲン多孔体は、液体の存在下でγ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はUV照射によって架橋処理することによって得られるものである。
本発明のコラーゲン成形体は、限定されるものではないが、後述のコラーゲン成形体の製造方法によって製造することができる。
以下、上記いずれかに係る本発明のコラーゲン成形体を「本発明の成形体」と称する。
また、本発明の成形体に含まれる架橋処理コラーゲン多孔体としては、線維化架橋処理コラーゲン多孔体又は非線維化架橋処理コラーゲン多孔体を挙げることができる。線維化架橋処理コラーゲン多孔体及び非線維化架橋処理コラーゲン多孔体は、後述のコラーゲン成形体の製造方法に記載の手順に従って製造することができる。
本発明の成形体に含まれる架橋処理コラーゲン膜は、重量法による密度が0.4g/cm3以上であり、好ましくは0.5g/cm3以上であり、より好ましくは0.6g/cm3以上であり、更に好ましくは0.65g/cm3以上であり、最も好ましくは0.70g/cm3以上である。密度が0.4g/cm3未満であると架橋の効果を十分に得ることができず、機械的強度が不足することがある。また、密度の上限は、特に限定されるものではないが、1.2g/cm3以下が好ましく、1.15g/cm3以下がより好ましく、1.1g/cm3以下が最も好ましい。重量法による密度は、架橋処理コラーゲン膜の重量を体積で割ることによって計算することができる。
試験片の形態は、例えば幅10mm×長さ20mmの長方形でもよく、図6に示したように、幅10mm×長さ20mmで、中央部分において幅を10mmから5mmに狭くした形状でもよい。引張強度は、試験片の厚み、及び幅から計算することができる。
平均膜厚は、以下の方法によって測定することができる。マイクロメータを用いて最低5点の膜厚を計測して、その平均値を出すことで平均膜厚を測定できる。
膜厚のバラツキは、以下の方法によって測定することができる。マイクロメータを用いて、最低5点の膜厚を計測して、その標準偏差を算出することでバラツキを数値化できる。
以下に、線維化架橋処理コラーゲン膜と異なる非線維化架橋処理コラーゲン膜の物性について説明する。
非線維化架橋処理コラーゲン膜の表面粗さは、極めて低いものであるが、好ましくは30nm以下であり、より好ましくは20nm以下であり、最も好ましくは10nm以下である。30nmを超えると、コラーゲン分子だけではなく線維が混合していることがある。非線維化架橋処理コラーゲン膜の表面粗さが小さく表面が滑らかであるのは、コラーゲン細線維を含まず、表面にコラーゲン線維による凹凸の構造が現れないからである。表面が滑らかであることによって、非線維化架橋処理コラーゲン膜は、光を散乱せずに透過性の優れた膜である。
表面粗さは、以下の方法によって測定することができる。市販のカンチレバー及び原子間力顕微鏡を用いて表面粗さを測定できる。測定範囲を4μmとして、一定速度(0.7Hzから1.2Hz)で走査させ、高さ像(立体像)を計測する。更に原子間力顕微鏡に付随しているソフトウェアで面粗さ(表面粗さ)を計算することで得られる。
透過率を測定する膜厚は、特に限定されるものではないが、例えば1μm〜1mmの膜厚の範囲において90%以上の透過率を示す。
透過率は、以下の方法によって測定することができる。非線維化架橋処理コラーゲン膜を細胞培養皿(ポリスチレンディッシュ)に貼り付け、例えばパワースキャンHT(DSファーマバイオメディカル)により波長300〜700nmの範囲でスキャンを行うことによって測定することができる。透過率は、吸光度(O.D.)から次の式、透過率=1/10^O.D.×100で算出することができる。
本発明の成形体に含まれる架橋処理コラーゲン膜は、コラーゲン膜(以下「コラーゲン膜」とは、線維化コラーゲンゲルを乾燥して得られる線維化コラーゲン膜、又はコラーゲン酸性溶液を乾燥して得られる非線維化コラーゲン膜を指す)を液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はUV照射によって架橋処理することにより、得ることができる。ここで、液体の存在下とは、架橋処理中にコラーゲン膜の表面全体が液体によって覆われている状態を指し、例えば湿潤状態であってもよいが、好ましくはコラーゲン膜全体が水溶液中に浸漬した状態である。従って、コラーゲン膜の表面全体が液体によって覆われている状態である限り、液体の容量も限定されるものではないが、液体の容量がコラーゲン膜の容量に対して2〜100が好ましく、10〜50がより好ましい。
照射条件を適宜設定すれば架橋処理と同時に滅菌も行うことができるため、架橋中及び架橋後の密封状態を保つように包装体を適宜選択すれば、滅菌済み製品として市場に流通させることもできる。
本発明の架橋処理に用いるコラーゲン膜を浸漬する液体は、水を含んでいる限りにおいて限定されるものではなく、例えば水又は緩衝液などの水性溶媒を挙げることができる。更に、水又は緩衝液に、有機溶媒を添加した水性溶媒を用いることもできる。
コラーゲンは、酸性条件では可溶性であり、適度なイオン強度及び適度なpH(中性からアルカリ性)において線維化する。従って、線維化コラーゲン膜を浸漬する液体(水性溶媒)のpHは好ましくはpH3.0〜10.0であり、具体的には塩を含む中性塩水溶液、又はアルカリ性塩水溶液が好ましい。中性塩水溶液またはアルカリ性塩水溶液は、線維化コラーゲン膜が溶解し難いものであることが好ましいが、比較的溶解し易い水溶液を用いたとしても、水溶液との接触後速やかに架橋処理すればよい。前記中性塩水溶液のpHは、例えば6.0〜8.0であり、アルカリ性塩水溶液のpHは、例えば8.0〜10.0の範囲である。
より具体的には、緩衝液として、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、HEPES緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、又はクエン酸緩衝液等を用いることができる。また、それらの生理食塩水であるPBS、D−PBS、トリス緩衝生理食塩水、又はHEPES緩衝生理食塩水を用いてもよい。
例えば、酸性の水性溶媒としては、二酸化炭素が溶解した、酸性水、酸性緩衝液、又は有機溶媒添加酸性水性溶媒などを挙げることができる。前記酸性水、酸性緩衝液、又は有機溶媒添加酸性水性溶媒は、水、緩衝液若しくは有機溶媒添加水性溶媒に二酸化炭素をバブリングする方法、又は水、緩衝液若しくは有機溶媒添加水性溶媒にドライアイスを投入する方法によって作製することができる。二酸化炭素の溶解量は、特に限定されないが、pHを3.0〜5.0とする溶解量が好ましい。
また、酸性の緩衝液の場合、二酸化炭素を含まないものを用いることもでき、酸性緩衝液としては、例えば酢酸緩衝溶液、クエン酸緩衝溶液、又は塩酸を挙げることができる。
本発明の成形体は、架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含んでもよい。架橋処理コラーゲン膜は、前記の線維化架橋処理コラーゲン膜、又は非線維化架橋処理コラーゲン膜を用いることができる。また、架橋処理コラーゲン多孔体としては、線維化架橋処理コラーゲン多孔体、又は非線維化架橋処理コラーゲン多孔体を用いることができる。
従って、積層体の組み合わせとしては、線維化架橋処理コラーゲン膜及び線維化架橋処理コラーゲン多孔体、線維化架橋処理コラーゲン膜及び非線維化架橋処理コラーゲン多孔体、非線維化架橋処理コラーゲン膜及び線維化架橋処理コラーゲン多孔体、又は非線維化架橋処理コラーゲン膜及び非線維化架橋処理コラーゲン多孔体の4つの組み合わせを挙げることができる。
前記積層体に含まれる架橋処理コラーゲン多孔体(線維化架橋処理コラーゲン多孔体、又は非線維化架橋処理コラーゲン多孔体)の物性は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、以下の物性を有するものが好ましい。
(気孔率)
架橋処理コラーゲン多孔体は、例えば気孔率80%以上であり、より好ましくは85%以上であり、最も好ましくは90%以上である。気孔率が80%以上であると、多孔体内部への細胞や組織の侵入性に優れているからである。
架橋処理コラーゲン多孔体は、適当な水浸透性を有することが好ましい。この水浸透性は、細胞培養を行う際に、多孔体の中にまで細胞が侵入できるかどうかの目安として重要であるからである。
架橋処理コラーゲン多孔体の弾性値は、特に限定されるものではないが、2.0kPa〜10MPaが好ましく、20kPa〜2MPaがより好ましい。2.0kPa〜10MPaであることによって、細胞を播種した際に多孔体内部への侵入性及び操作性に優れているからである。
架橋処理コラーゲン多孔体の粘性値は、特に限定されるものではないが、1.0〜500kPaが好ましく、1.5〜100kPaがより好ましい。1.0〜500kPaであることによって、細胞を播種した際に内部への侵入性及び操作性に優れているからである。
架橋処理コラーゲン多孔体の平均孔径は、特に限定されるものではないが、50〜500μmが好ましく、80〜300μmがより好ましい。50〜500μmであることによって、細胞や組織が材料内部に侵入しやすく、細胞培養基材や移植材料として最適であるからである。
架橋処理コラーゲン多孔体の平均孔径は、水銀圧入法又は走査型電子顕微鏡観察によって、測定することができる。以下に走査型電子顕微鏡観察による平均孔径の測定法を記載する。作製した多孔体を任意の高さで断面を作製し、帯電防止のため、白金などによるコーティング(20nm以下)を行う。観察の際には、加速電圧10kV以下で行う。倍率は、1000倍以下が好ましく、100個以上の孔径を計測する。これにより、孔径の分布を計算し、その平均値を求めることで平均孔径を測定することが可能である。
前記コラーゲン膜の架橋処理は、ポリエチレングリコール誘導体の存在下で行うことも好ましい。ポリエチレングリコール誘導体は、一般式(1)
R1又はR2は、前記の基である限りにおいて限定されるものではないが、好ましくは−SH、−NH2、−NH−CO−CH2−CH2−COOH、−CO−C=CH2、又は−CO−C(CH3)=CH2である。
Yは限定されるものではないが、好ましくは、単結合、酸素原子(O)、鎖中に酸素原子を含む炭素数1〜5のアルキレン基である。鎖中に酸素原子を含む炭素数1〜5のアルキレン基に含まれる酸素原子の数は限定されるものではないが、好ましくは2以下であり、より好ましくは1である。酸素原子はアルキレン基の主鎖の任意の位置に含まれてもよいが、重合部分に直接結合することが好ましい。従って、鎖中に酸素原子を含む炭素数1〜5のアルキレン基としては、例えば(R1)−CH2−O−、(R1)−CH2−CH2−O−、(R1)−CH2−CH2−CH2−O−を挙げることができる。
Zは限定されるものではないが、好ましくは単結合、又は炭素数1〜5のアルキレン基である。炭素数1〜5のアルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、又はブチレン基を挙げることができる。
本明細書において、「場合により置換されていることのある炭素数1〜5のアルキレン基」とは、アルキレン基の水素原子が、置換されたアルキレン基を意味する。置換基は限定されるものではないが、好ましくは炭素数1〜4のアルキル基であり、より好ましくは炭素数1〜2のアルキル基である。
具体的なポリエチレングリコール誘導体としては、ポリエチレングリコールビスアミン、ポリエチレングリコールビスカルボキシオキソプロピルアミノ、ポリエチレンジチオール、ポリエチレングリコールジアクリレート、又はポリエチレングリコールジメタクリレートを挙げることができる。
前記ポリエチレングリコール誘導体の分子量は、特に限定されるものではないが、1,000〜15,000が好ましく、2,000〜13,000がより好ましく、4,000〜10,000が更に好ましい。分子量が1,000〜15,000であることにより架橋距離が長くなり、強度を向上させることが可能だからである。
本発明の成形体は、細胞培養液や体液等により分解し難く且つ収縮又は膨張し難いという優れた特性を有するものである。細胞培養液や体液等により分解し難いという特性は、例えば、コラーゲン成形体を37℃のPBSに浸漬した条件下において、GPCによってPBS中の分子量分布を測定することによって、または、本発明の成形体の溶解率を測定することによって評価することができる。例えば、本発明の成形体をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(D−PBS)中に37℃で5日間浸漬した場合の溶解率を測定する方法が挙げられ、溶解率は特に限定されるものではないが10質量%以下であることが好ましく、より好ましくは7質量%であり、更に好ましくは5質量%である。
また、本発明の成形体の収縮又は膨張し難いという特性は、例えば、本発明の成形体をD−PBS中に37℃で、5日間浸漬した後の浸漬前に対する面積変化率を求めることによって評価することができる。面積変化率は特に限定されるものではないが、5%以内であれば、細胞培養液や体液等により収縮又は膨張し難いと判断する目安となる。面積変化率は4%以内であることがより好ましく、3%以内であることが更に好ましい。
コラーゲンは一般的に、温度が上昇するとコラーゲンの3重らせん構造が破壊されて、ゼラチンとなるが、この3重螺旋構造が破壊される温度を変性温度と言う。
本発明の成形体に含まれる架橋処理コラーゲン膜または架橋処理コラーゲン多孔体の変性温度は、その構造により架橋する前のコラーゲンの変性温度と比較すると有意に上昇しているものである。すなわち、本発明の成形体は、温度に対しても耐性を有しているともいえる。
本発明の成形体に含まれる架橋処理コラーゲン膜または架橋処理コラーゲン多孔体の変性温度は、特に限定されるものではないが、架橋する前のコラーゲンの変性温度より、好ましくは3℃以上、より好ましくは5℃以上、更に好ましくは8℃以上高いものである。好ましくは10℃以上、より好ましくは15℃以上、更に好ましくは20℃以上、最も好ましくは25℃以上高いものである。変性温度が、高いことにより熱への耐性が高まり、本発明の用途が広がるからである。上限は特に限定されないが、200℃以下が好ましく、90℃以下がより好ましい。
その他原料の含有量は特に限定されるものではないが、架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体の合計量に対して、30質量%以下が好ましく、10質量%以下がより好ましく、5.0質量%以下が最も好ましい。30質量%を超えると、力学的特性の低下が生じるためである。
架橋処理コラーゲン膜または架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体にその他原料を含有させて本発明の成形体とする方法については、本発明の成形体の機能が維持される限りにおいて特に制限は無く、例えば、架橋処理コラーゲン膜又は架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体をその他原料の溶解液に含浸、塗布又は噴霧した後、乾燥する方法が挙げられる。
ここで、架橋処理コラーゲン膜及び架橋処理コラーゲン多孔体の作製に用いる出発原料としてのコラーゲン、並びに、その他原料として含有させることができるコラーゲンについて説明する。
前記コラーゲンは、特に限定されるものではないが、例えばI型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VI型コラーゲン、VII型コラーゲン、VIII型コラーゲン、IX型コラーゲン、X型コラーゲン、XI型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIII型コラーゲン、XIV型コラーゲン、XV型コラーゲン、XVI型コラーゲン、XVII型コラーゲン、XVIII型コラーゲン、XIX型コラーゲン、XX型コラーゲン、XXI型コラーゲン、XXII型コラーゲン、XXIII型コラーゲン、XXIV型コラーゲン、XXV型コラーゲン、XXVI型コラーゲン、XXVII型コラーゲン、XXVIII型コラーゲン又はこれらの2つ以上の組み合わせを挙げることができる。
前記のコラーゲンのうち、例えばI型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、及びV型コラーゲンは線維型コラーゲンであるが、いずれも原料として使用することができる。更に、これらのコラーゲンのうち、実際に汎用されているのは、I型コラーゲン又はII型コラーゲンである。これらのコラーゲンは、精製・分離するための原料を大量に入手することが可能であり、産業上の利用に適している。
魚類由来コラーゲンを取得する魚の部位も、限定されるものではない。例えば、鱗、皮、骨、軟骨、ひれ、筋肉及び臓器(例えば、浮き袋)等を挙げることができるが、鱗が好ましい。鱗は、魚臭の原因となる脂質が少ないからである。また、魚類の鱗由来のコラーゲンは、細胞との接着性に優れているからである。特に、魚鱗由来のコラーゲンは、分子間の相互作用が強いと考えられ、強度の高い成形体を得ることができる。
チョウザメ科のAcipenserinae亜科のチョウザメ属(Acipenser属)には、Acipenser baeri、Acipenser brevirostrum、Acipenser dabryanus(ダブリーチョウザメ)、Acipenser fulvescens(レイクチョウザメ)、Acipenser gueldenstaedti(ロシアチョウザメ)、Acipenser medirostris(ミドリチョウザメ)、Acipenser mikadoi(ミカドチョウザメ)、Acipenser naccarii(アドリアチョウザメ)、Acipenser nudiventris、Acipenser oxyrinchus、Acipenser persicus(ペルシャチョウザメ)、Acipenser ruthenus(コチョウザメ)、Acipenser schrencki(アムールチョウザメ)、Acipenser sinensis(カラチョウザメ)、Acipenser stellatus、Acipenser sturio(バルトチョウザメ)、及びAcipenser transmontanus(シロチョウザメ)の17種が含まれる。チョウザメ科のAcipenserinae亜科のPseudoscaphirhynchus属には、Pseudoscaphirhynchus fedtschenkoi、Pseudoscaphirhynchus hermannii、及びPseudoscaphirhynchus kaufmanniの3種が含まれる。チョウザメ科のAcipenserinae亜科のScaphirhynchus属には、Scaphirhynchus albus、Scaphirhynchus platorynchus、及びScaphirhynchus suttkusiの3種が含まれる。また、チョウザメ科のHusinae亜科のダウリアチョウザメ属(Huso属)には、Huso huso(オオチョウザメ)、及びHuso douricus(ダウリアチョウザメ)の2種が含まれる。
ヘラチョウザメ科には、ヘラチョウザメ属(Polyodon)のPolyodon spathula(ヘラチョウザメ)及びハシナガチョウザメ属(Psephurus)のPsephurus gladius(シナヘラチョウザメ)の2種が含まれる。
また、養殖種としてオオチョウザメの雌とコチョウザメの雄を人工交配して作出されたベステル(Acipenser ruthenus×Huso huso)、その他、人工交配して作出されたチョウザメも含まれる。
本発明に用いる魚類由来コラーゲンを得るためのチョウザメは限定されるものではないが、ベステル又はアムールチョウザメが好ましい。また、II型の魚類由来コラーゲンを抽出する組織も特に限定されるものではないが、吻部軟骨又は脊索が好ましい。
コラーゲンの取得法は、特に限定されることはなく、常法に従えばよい。例えば、特許文献2(特開2006−257014号公報)又は特許文献3(特開2010−193808号公報)等に記載の方法を挙げることができる。取得法の一態様を鱗の例で簡単に説明すると、酸によって脱灰した鱗をペプシン等のプロテアーゼを用いて処理することによりコラーゲンをアテロ化し、必要に応じて塩析等の精製処理を行うことで、酸性溶液で可溶化する可溶化コラーゲンを取得することができる。また、市販の可溶化コラーゲン製品を用いてもよく、例えば魚鱗由来のものとしては、多木化学株式会社製の「セルキャンパス AQ−03A」(コラーゲン濃度が0.30〜0.36%、pH3.0〜5.0の無色透明のコラーゲン溶液)や「セルキャンパス FD−08G」(コラーゲンの凍結乾燥体)が好適である。
本発明の成形体の製造方法によれば、<1>線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体、<2>線維化架橋処理コラーゲン膜と線維化架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体、<3>線維化架橋処理コラーゲン膜と非線維化架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体、<4>非線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体、<5>非線維化架橋処理コラーゲン膜と線維化架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体、及び<6>非線維化架橋処理コラーゲン膜と非線維化架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体を製造することができる。
以下に、上記<1>〜<6>の製造方法を説明する。
なお、以下では、<2>と<3>を合わせて、「線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体」と称することがある。また、<5>と<6>を合わせて、「非線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体」と称することがある。
本発明の線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体の製造方法は、(1)コラーゲン濃度が0.5質量%以上3.0質量%以下のコラーゲン溶液を成形器内に入れ、コラーゲンを線維化することによって、線維化コラーゲンゲルを成形する工程(以下、成形工程(1)と称することがある)、(2)前記線維化コラーゲンゲルを、水混和性有機溶媒濃度を段階的に高めた水混和性有機溶媒と水との混合液に順次浸漬して脱塩する工程(以下、脱塩工程(2)と称することがある)、(3)前記脱塩した線維化コラーゲンゲルを乾燥し線維化コラーゲン膜を得る工程(以下、乾燥工程(3)と称することがある)、及び(4)前記線維化コラーゲン膜を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はUV照射によって架橋処理する工程(以下、架橋工程(4)と称することがある)、を含む。成形工程(1)、脱塩工程(2)、乾燥工程(3)、及び架橋工程(4)は、この順番で行うことが好ましいが、線維化架橋処理コラーゲン膜が得られる限りにおいて限定されるものではなく、架橋工程(4)を脱塩工程(2)の前に行うことも可能である。すなわち、成形工程(1)、架橋工程(4)、脱塩工程(2)、乾燥工程(3)の順番に行うことにより、線維化架橋処理コラーゲン膜を得ることができる。実施例4に示すように、脱塩工程(2)及び/又は乾燥工程(3)の前に架橋工程(4)を行った線維化架橋処理コラーゲン膜は、高い引張強度を示す。従って、線維化架橋処理コラーゲン膜の引張強度の向上の観点において、脱塩工程(2)及び/又は乾燥工程(3)の前に架橋工程(4)を行うことが好ましい。これらの成形工程(1)、脱塩工程(2)、乾燥工程(3)、及び架橋工程(4)は、前記<2>と<3>を合わせて説明する、以下の[2−2]線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体の製造方法における各工程と基本的に共通である。
本発明の線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体の製造方法は、(1)コラーゲン濃度が0.5質量%以上3.0質量%以下のコラーゲン溶液を成形器内に入れ、コラーゲンを線維化することによって、線維化コラーゲンゲルを成形する工程、(2)前記線維化コラーゲンゲルを、水混和性有機溶媒濃度を段階的に高めた水混和性有機溶媒と水との混合液に順次浸漬して脱塩する工程、(3)前記脱塩した線維化コラーゲンゲルを乾燥し線維化コラーゲン膜を得る工程、(3a)(A)前記線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が0.5質量%以上3.0質量%以下の多孔体作製用線維化コラーゲンゲルとを接触させる工程、若しくは(B)前記線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が5.0質量%以下の多孔体作製用コラーゲン酸性溶液とを接触させる工程(以下、接触工程(3a)と称することがある)、(3b)前記接触物を凍結乾燥して積層体を得る工程(以下、凍結乾燥工程(3b)と称することがある)、及び(4)前記積層体を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はUV照射によって架橋処理する工程を含む。前記成形工程(1)、脱塩工程(2)、乾燥工程(3)、接触工程(3a)、凍結乾燥工程(3b)、及び架橋工程(4)は、この順番で行うことが好ましいが、積層体が得られる限りにおいて、その順番及び回数は限定されるものではなく、例えば1回目の架橋工程(4)を脱塩工程(2)の前に行い、更に凍結乾燥工程(3b)の後に2回目の架橋工程(4)を行うことも可能である。すなわち、成形工程(1)、架橋工程(4)、脱塩工程(2)、乾燥工程(3)、接触工程(3a)、凍結乾燥工程(3b)、及び架橋工程(4)の順番に行うことにより、積層体を得ることができる。線維化架橋処理コラーゲン膜の引張強度の向上の観点において、脱塩工程(2)及び/又は乾燥工程(3)の前に、線維化架橋処理コラーゲン膜の架橋を行ことが好ましい。
本製造方法によって、線維化架橋処理コラーゲン膜及び線維化架橋処理コラーゲン多孔体の組み合わせの積層体を含むコラーゲン成形体、又は線維化架橋処理コラーゲン膜及び非線維化架橋処理コラーゲン多孔体の組み合わせの積層体を含むコラーゲン成形体を製造することができる。
成形工程(1)は、コラーゲンの濃度が0.5質量%以上3.0質量%以下のコラーゲン溶液を成形器内に入れ、コラーゲンを線維化することによって、線維化コラーゲンゲルを成形する工程である。コラーゲンの濃度は、0.5質量%以上であれば、限定されるものではないが、1.0質量%以上が好ましく、1.5質量%以上がより好ましい。
コラーゲンを線維化させる方法は、コラーゲンの濃度が0.5質量%以上3.0質量%以下である限りにおいて特に限定されることはなく、常法に従えばよい。一般に広く知られている方法としては、コラーゲンを溶解させた酸性溶液を適度なイオン強度及びpHとすることでコラーゲンを線維化させる方法である。線維化には、適当な緩衝液を添加してpHを中性付近にする方法が簡便である。緩衝液としては前記作用を有するものであれば特に限定はされず、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、HEPES緩衝液等が例示でき、それらの生理食塩水であってもよい。例えば、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(D−PBS)、トリス緩衝生理食塩水、HEPES緩衝生理食塩水等である。これらのうち、特に生体系用途に用いる場合は、D−PBSが好ましい。pH及びイオン強度は、適宜決定することが可能であるが、例えばコラーゲンを溶解させた酸性溶液にD−PBSの2.5〜10倍程度の濃縮液を添加して、コラーゲンを線維化させる方法が挙げられる。
なお、線維化中は上面をシールで覆うなどして水分の蒸発を防ぐための措置を採ることが望ましい。
脱塩工程(2)は、前記線維化コラーゲンゲルを、水混和性有機溶媒濃度を段階的に高めた水混和性有機溶媒と水との混合液に順次浸漬して脱塩する工程である。
前記成形工程(1)で得られた線維化コラーゲンゲルを、水混和性有機溶媒濃度を段階的に高めた水混和性有機溶媒と水との混合液に順次浸漬することにより脱塩する(以下、段階脱塩法と称する)。なお、この脱塩方法では水分も除去することができる。段階脱塩法は、組織切片作成に一般に用いられている手法であり、一例を挙げると、1段回目は水混和性有機溶媒/水が容量比で50/50の混合液(以下、50/50のように表記する)に線維化コラーゲンゲルを浸漬し、2段回目は70/30、3段階目は90/10、4段階目は100/0に順次浸漬する方法である。なお、水混和性有機溶媒/水の混合液の種類と浸漬時間は適宜設定し、効率的に脱塩することが望ましい。本工程では、線維化コラーゲンゲル中の水分が水混和性有機溶媒と完全に置換されることが望ましい。
ここで、水混和性有機溶媒とは、水と任意の割合で相溶する有機溶媒を指し、例えば、炭素数1〜4の低級アルコール、アセトン、アセトニトリル等が例示でき、これらのうち2種以上を用いてもよい。上記低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、n−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、n−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、sec−ブチルアルコール、tert−ブチルアルコール等を例示することができる。上記例示した水混和性有機溶媒のうち、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール等の低級アルコールが好ましく、特に生体系用途への適用を考慮するとエタノールが好ましい。
乾燥工程(3)は、脱塩した線維化コラーゲンゲルを乾燥し、線維化コラーゲン膜を得る工程である。乾燥方法は、特に限定されるものではなく、例えば、自然乾燥、通風乾燥、真空乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥等が挙げられる。
接触工程(3a)は、線維化コラーゲン膜と、線維化コラーゲンゲルまたはコラーゲン酸性溶液との接触物を作製するための工程である。なお、線維化コラーゲンゲルから線維化コラーゲン多孔体を作製することが可能であり、コラーゲン酸性溶液から非線維化コラーゲン多孔体を作製することができる。線維化コラーゲン膜及び多孔体用コラーゲン液(線維化コラーゲンゲル、又はコラーゲン酸性溶液)を接触させ積層化させる方法として、例えば、(i)多孔体用コラーゲン液を成形器内に入れた後、当該溶液上に線維化コラーゲン膜を載置する方法、(ii)線維化コラーゲン膜を成形器内に入れた後、多孔体用コラーゲン液を注入する方法、(iii)上記(i)の上から更に多孔体用コラーゲン液を注入する方法、(iv)上記(ii)の上に更に線維化コラーゲン膜を載置する方法、などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。なお、上記(i)又は(iv)のように、多孔体用コラーゲン液の上に線維化コラーゲン膜を載置する場合、当該膜は多孔体用コラーゲン液中に沈み込むことはほとんど無く、多孔体用コラーゲン液の上面に保持されることが一般的である。ところで、線維化コラーゲン膜と多孔体用コラーゲン液との接触部分では、線維化コラーゲン膜の一部が溶解する場合があり、これが結着性の向上に寄与するものと考えられる。
積層体作製工程(3a)は、多孔体用コラーゲン液が、線維化コラーゲンゲルであるか、又はコラーゲン酸性溶液であるかによって、以下の(A)又は(B)の2つの工程に分けることができる。
(A)多孔体作製用線維化コラーゲンゲル
前記線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が0.5質量%以上3.0質量%以下の線維化コラーゲンゲルとを接触させることによって線維化コラーゲン膜と線維化コラーゲンゲルとの接触物を得ることができる。ところで、線維化コラーゲン膜と線維化コラーゲンゲルとの接触部分では、線維化コラーゲン膜の一部が溶解する場合があり、これが結着性の向上に寄与するものと考えられる。なお、前記接触物は、線維化コラーゲン膜と線維化コラーゲン多孔体との積層体の前駆体とも云えるものである。
コラーゲンを線維化させる方法は、コラーゲンの濃度が0.5質量%以上3.0質量%以下である限りにおいて特に限定されることはなく、常法に従えばよい。一般に広く知られている方法としては、コラーゲンを溶解させた酸性溶液を適度なイオン強度及びpHとすることでコラーゲンを線維化させる方法である。コラーゲンの線維化を多孔体形成に適した成形器内で行うことにより、線維化コラーゲンゲルを得ることができる。線維化に伴う、緩衝液、pH、イオン強度、成形器の選択、温度、及び時間等は前記の「成形工程(1)」の線維化コラーゲン膜の製造方法に準じて行うことができる。
線維化コラーゲンゲルは、後述の凍結乾燥により線維化コラーゲン多孔体となる。
(B)多孔体作製用コラーゲン酸性溶液
前記線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が5.0質量%以下のコラーゲン酸性溶液とを接触させ、そして積層体化することによって線維化コラーゲン膜とコラーゲン酸性溶液との接触物を得ることができる。なお、コラーゲン濃度の下限は0.5質量%であることが好ましい。ところで、線維化コラーゲン膜とコラーゲン酸性溶液との接触部分では、線維化コラーゲン膜の一部が溶解する場合があり、これが結着性の向上に寄与するものと考えられる。なお、前記接触物は、線維化コラーゲン膜と、非線維化コラーゲン多孔体との積層体の前駆体とも云えるものである。
本工程においては、酸性液にコラーゲンを溶解することによってコラーゲン酸性溶液を得ることができる。酸性液は、水性溶媒に二酸化炭素を溶解させて調製する二酸化炭素酸性液でもよく、水性溶媒に無機酸又は有機酸を溶解して調製する酸性液でもよい。二酸化炭素酸性液は、例えば、水性溶媒に二酸化炭素をバブリングする方法、又は水性溶媒にドライアイスを投入する方法によって作製することができる。二酸化炭素の溶解量は、特に限定されないが、コラーゲンを溶解させるためには、溶媒のpHを2〜4とすることが好ましい。従って、pH4以下になるように、二酸化炭素を溶解させることが望ましい。
また、酸性液を調製するための無機酸又は有機酸は、特に限定されるものでないが、pHを4以下にできる酸が好ましく、特には積層体形成後に酸を除去することができる揮発性の酸が好ましい。具体的には塩酸、酢酸、又は炭酸が好ましい。
本明細書において、水性溶媒は水、又は水と有機溶媒とを混合した溶媒を意味する。水性溶媒に含まれる有機溶媒としては水と混和し、コラーゲンを溶解することができれば特に限定されるものではないが、好ましくは低級アルコールであり、例えば炭素数1〜4の低級アルコール(すなわち、メタノール、エタノール、n−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、n−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、sec−ブチルアルコール、又はtert−ブチルアルコール)を用いることができる。このような低級アルコールは、製造にかかるコストが比較的低廉である。
また、コラーゲン酸性溶液は、コラーゲンと、二酸化炭素、無機酸、又は有機酸とを水性溶媒に同時に溶解することによって調製することも可能である。
凍結乾燥工程は、前記接触物を凍結乾燥することにより積層体を得る工程である。凍結乾燥は、水分を含んだものを凍結し、真空下(0.1〜3mmHg)で氷を昇華させることによって、乾燥する方法である。凍結乾燥を行うことにより、前記線維化コラーゲンゲル、又は前記コラーゲン酸性溶液は、多孔体化し、それぞれ線維化コラーゲン多孔体、又は非線維化コラーゲン多孔体(以下、「コラーゲン多孔体」と総称することがある)となることができる。凍結乾燥を行うことにより、コラーゲン線維、コラーゲン細線維などを破壊することなく、多孔体化することが可能である。
架橋工程(4)は、前記乾燥工程(3)で得られた線維化コラーゲン膜、又は凍結乾燥工程(3b)で得られた線維化コラーゲン膜とコラーゲン多孔体との積層体(以下、両者を「乾燥体」と総称することがある)を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はUV照射によって架橋処理する工程である。
本発明の成形体の製造方法における架橋工程は、前記「《架橋》」の項目に記載の方法に従って、行うことができる。
具体的には、以下のように架橋工程を行うことができる。前記液体の存在下とは、架橋処理中に乾燥体の表面全体が液体によって覆われている状態を指し、例えば湿潤状態であってもよいが、好ましくは乾燥体全体が水溶液中に浸漬した状態である。従って、乾燥体の表面全体が液体によって覆われている状態である限り、液体の容量も限定されるものではないが、液体の容量がコラーゲン成形体の容量に対して2〜100が好ましく、10〜50がより好ましい。また、液体の種類も、上述に従い、線維化架橋処理コラーゲン多孔体又は非線維化架橋処理コラーゲン多孔体のいずれを作製するかにより適宜選択すればよい。
架橋工程(4)は、前記一般式(1)で表されるポリエチレングリコール誘導体の存在下で行ってもよい。ポリエチレングリコール誘導体を添加する液として、架橋工程において線維化コラーゲン膜、又は積層体を浸漬する液体、前記コラーゲン溶液、前記多孔体作製用線維化コラーゲンゲル、前記多孔体作製用コラーゲン酸性溶液、又はそれらの2つ以上の組み合わせを挙げることができるが、前記液体が好ましい。
[2−3]非線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体の製造方法(前記<4>)
本発明の非線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体の製造方法は、(1)酸性液にコラーゲンを溶解し、コラーゲン濃度が0.5質量%以上3.0質量%以下のコラーゲン酸性溶液を得る工程(以下、コラーゲン溶解工程(1)と称することがある)、(2)前記コラーゲン酸性溶液を成形器に入れ、成形する工程(以下、成形工程(2)と称することがある)、(3)前記成形されたコラーゲン酸性溶液(以下、「非線維化コラーゲン膜の前駆体」と称することがある)を乾燥し非線維化コラーゲン膜を得る工程(以下、乾燥工程(3)と称することがある)、及び(4)前記非線維化コラーゲン膜を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はUV照射によって架橋処理する工程(以下、架橋工程(4)と称することがある)、を含む。コラーゲン溶解工程(1)、成形工程(2)、乾燥工程(3)、及び架橋工程(4)は、この順番で行うことが好ましいが、非線維化架橋処理コラーゲン膜が得られる限りにおいて限定されるものではなく、架橋工程(4)を乾燥工程(3)の前に行うことも可能である。すなわち、コラーゲン溶解工程(1)、成形工程(2)、架橋工程(4)、及び乾燥工程(3)の順番に行うことにより、非線維化架橋処理コラーゲン膜を得ることができる。非線維化架橋処理コラーゲン膜の引張強度の向上の観点において、乾燥工程(3)の前に架橋工程(4)を行うことが好ましい。これらのコラーゲン溶解工程(1)、成形工程(2)、乾燥工程(3)、及び架橋工程(4)は、前記<5>と<6>を合わせて説明する、以下の[2−4]非線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体の製造方法における各工程と基本的に共通である。
本発明の非線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体の製造方法は、(1)酸性液にコラーゲンを溶解し、コラーゲン濃度が0.5質量%以上3.0質量%以下のコラーゲン酸性溶液を得る工程、(2)前記コラーゲン酸性溶液を成形器に入れ、成形する工程、(3)非線維化コラーゲン膜の前駆体を乾燥し非線維化コラーゲン膜を得る工程、
(3a)(A)前記非線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が0.5質量%以上3.0質量%以下の多孔体作製用線維化コラーゲン溶液とを接触させる工程、若しくは(B)前記非線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が5.0質量%以下の多孔体作製用コラーゲン酸性溶液とを接触させる工程(以下、接触工程(3a)と称することがある)、(3b)前記接触物を凍結乾燥して積層体を得る工程(以下、凍結乾燥工程(3b)と称することがある)、及び(4)前記積層体を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はUV照射によって架橋処理する工程、を含む。
前記コラーゲン溶解工程(1)、成形工程(2)、乾燥工程(3)、接触工程(3a)、凍結乾燥工程(3b)、及び架橋工程(4)は、この順番で行うことが好ましいが、積層体が得られる限りにおいて、その順番及び回数は限定されるものではなく、例えば1回目の架橋工程(4)を乾燥工程(3)の前に行い、更に凍結乾燥工程(3b)の後に2回目の架橋工程(4)を行うことも可能である。すなわち、コラーゲン溶解工程(1)、成形工程(2)、架橋工程(4)、乾燥工程(3)、接触工程(3a)、凍結乾燥工程(3b)、及び架橋工程(4)の順番に行うことにより、積層体を得ることができる。非線維化架橋処理コラーゲン膜の引張強度の向上の観点において、乾燥工程(3)の前に線維化架橋処理コラーゲン膜の架橋を行ことが好ましい。
本製造方法によって、非線維化架橋処理コラーゲン膜及び線維化架橋処理コラーゲン多孔体の組み合わせの積層体を含むコラーゲン成形体、又は非線維化架橋処理コラーゲン膜及び非線維化架橋処理コラーゲン多孔体の組み合わせの積層体を含むコラーゲン成形体を製造することができる。
以下に、非線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体、及び非線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体の製造方法の工程について説明する。
コラーゲン溶解工程(1)は、酸性液にコラーゲンを溶解し、コラーゲン濃度が0.5質量%以上3.0質量%以下のコラーゲン酸性溶液を得る工程である。コラーゲン酸性溶液のコラーゲン濃度は、0.5質量%以上であれば、限定されるものではないが、1.0質量%以上が好ましく、1.5質量%以上がより好ましい。
コラーゲン溶解工程においては、酸性液にコラーゲンを溶解させ、コラーゲン酸性溶液を得ることができる。酸性液は、水性溶媒に二酸化炭素を溶解させて調製する二酸化炭素酸性液でもよく、水性溶媒に無機酸又は有機酸を溶解して調製する酸性液でもよい。二酸化炭素酸性液は、例えば、水性溶媒に二酸化炭素をバブリングする方法、又は水性溶媒にドライアイスを投入する方法によって作製することができる。二酸化炭素の溶解量は、特に限定されないが、コラーゲンを溶解させるためには、溶媒のpHを2〜4とすることが好ましい。従って、pH4以下になるように、二酸化炭素を溶解させることが望ましい。
また、酸性液を調製するための無機酸又は有機酸は、特に限定されるものでないが、pHを4以下にできる酸が好ましい。また、積層体形成後に酸を除去することができる揮発性の酸が好ましい。具体的には塩酸、酢酸、又は炭酸が好ましい。
また、コラーゲン酸性液は、コラーゲンと、二酸化炭素、無機酸、又は有機酸とを水性溶媒に同時に溶解することによって調製することも可能である。
成形工程(2)は、コラーゲン酸性溶液を成形器に入れ、非線維化コラーゲン膜の前駆体を成形する工程である。
例えば、細胞培養用ウェルプレートに適した膜を作製する場合は、円形に成形できるシリコン製成形器を用いることが好ましい。コラーゲン酸性溶液の注入量は、必要とする膜厚に応じて適宜調整すればよい。また、温度及び時間条件についても、適宜設定すればよいが、例えば保持温度は25〜40℃であるのが好ましく、保持する時間は0.5〜12時間であるのが好ましく、1〜6時間であるのがより好ましい。なお、成形中は上面をシールで覆うなどして水分の蒸発を防ぐための措置を採ることが望ましい。
乾燥工程(3)は、非線維化コラーゲン膜の前駆体を乾燥させる工程である。乾燥方法は、特に限定されるものではなく、例えば、自然乾燥、通風乾燥、真空乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥等が挙げられ、前記「《乾燥工程(3)》」に記載の方法に従って行うことができる。
例えば、非線維化コラーゲン膜の前駆体の乾燥は、以下の通り行うことができる。乾燥は、前駆体の上面から水性溶媒を蒸発させることによって、行うことができる。また、ゲルの上面及び下面を、水性溶媒が通過しない平滑なプレートなど覆い、側面からのみ徐々に脱水させることにより行うことができる。また、平滑なプレートで覆うことによって、得られる非線維化コラーゲン膜の膜厚を均一にすることができ、機械的強度を上昇させることが可能である。プレートは、特に限定されるものではないが、ポリスチレン、シリコーン、ポリエステル、ポリアミド、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメタクリル酸メチル又はガラスを挙げることができるが、これらのうち剥離性の良いポリスチレンが好ましい。
接触工程(3a)は、非線維化コラーゲン膜と、線維化コラーゲンゲルまたはコラーゲン酸性溶液との接触物を作製するための工程である。なお、線維化コラーゲンゲルから線維化コラーゲン多孔体を作製することが可能であり、コラーゲン酸性溶液から非線維化コラーゲン多孔体を作製することができる。非線維化コラーゲン膜及び多孔体用コラーゲン液(線維化コラーゲンゲル又はコラーゲン酸性溶液)を接触させ積層化させる方法として、例えば、(i)多孔体用コラーゲン液を成形器内に入れた後、当該溶液上に非線維化コラーゲン膜を載置する方法、(ii)非線維化コラーゲン膜を成形器内に入れた後、多孔体用コラーゲン液を注入する方法、(iii)上記(i)の上から更に多孔体用コラーゲン液を注入する方法、(iv)上記(ii)の上に更に非線維化コラーゲン膜を載置する方法、などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。なお、上記(i)又は(iv)のように、多孔体用コラーゲン液の上に非線維化コラーゲン膜を載置する場合、当該膜はコラーゲン液中に沈み込むことはほとんど無く、多孔体用コラーゲン液の上面に保持されることが一般的である。ところで、線維化コラーゲン膜と多孔体用コラーゲン液との接触部分では、非線維化コラーゲン膜の一部が溶解する場合があり、これが結着性の向上に寄与するものと考えられる。多孔体用コラーゲン液が、線維化コラーゲンゲルであるか、又はコラーゲン酸性溶液であるかによって、以下の(A)又は(B)の2つの工程に分けることができる。
(A)多孔体作製用線維化コラーゲンゲル
本工程は、線維化コラーゲン膜に代えて、非線維化コラーゲン膜を用いることを除いては、前記「(A)多孔体作製用線維化コラーゲンゲル」に記載の方法に従って行うことができる。
(B)多孔体作製用コラーゲン酸性溶液
本工程も、線維化コラーゲン膜に代えて、非線維化コラーゲン膜を用いることを除いては、前記「(B)多孔体作製用コラーゲン酸性溶液」に記載の方法に従って行うことができる。
架橋工程(4)は、前記乾燥工程(3)で得られた非線維化コラーゲン膜、又は凍結乾燥工程(3b)で得られた非線維化コラーゲン膜とコラーゲン多孔体との積層体を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はUV照射によって架橋処理する工程である。
本発明のコラーゲン成形体の製造方法における架橋工程は、前記[2−2]線維化架橋処理コラーゲン膜及び架橋処理コラーゲン多孔体を含むコラーゲン成形体の製造方法の「架橋工程(4)」に記載の方法に従って、行うことができる。
架橋工程(4)は、前記一般式(1)で表されるポリエチレングリコール誘導体の存在下で行ってもよい。ポリエチレングリコール誘導体を添加する液として、架橋工程において非線維化コラーゲン膜、又は積層体を浸漬する液体、コラーゲン膜作製用コラーゲン酸性溶液、前記多孔体作製用線維化コラーゲンゲル、及び前記多孔体作製用コラーゲン酸性溶液、又はそれらの2つ以上の組み合わせを挙げることができるが、前記液体が好ましい。
なお、実施例において%は、特に断らない限り全て質量%(重量%)を示す。また、特に断らない限り化合物はすべて試薬を用いた。
コラーゲンとして、テラピアの鱗から製造された多木化学(株)製「セルキャンパス FD−08G」スポンジ品をpH3のHCl溶液に溶解し、コラーゲン濃度が1.1%の無色透明溶液(以下、「コラーゲン溶液A」という)を調製した。コラーゲン溶液Aの9容量部と10倍濃い濃度に作製したD−PBSの1容量部とを混合し、この混合液0.79mLをシリコン製の成形器(直径20mm、高さ2.5mm)に注入し、水分の蒸発を防ぐためにスライドグラスで上面を覆い、25℃・12時間保持して線維化コラーゲンゲルを得た。当該線維化コラーゲンゲルを、エタノール/水の容量比が50/50の混合液(以下、50/50のように表記する)、70/30、90/10、100/0に順次浸漬して、脱塩した後、膜の上下面をポリスチレン板で覆い、側面のみから脱媒させることにより乾燥させて線維化コラーゲン膜を得た。
得られた線維化コラーゲン膜は、引張強度は47MPa、平均膜厚は45μmであった。また、線維化コラーゲン膜の重量を体積で除した密度は0.66g/cm3であった。
次に、当該線維化コラーゲン膜をD−PBSに浸漬した状態で、25kGyのγ線照射を行うことにより、線維化架橋処理コラーゲン膜からなるコラーゲン成形体を作製した。
γ線照射を10kGyとした以外は、実施例1の操作を繰り返し、線維化コラーゲン膜からなるコラーゲン成形体を作製した。得られたコラーゲン成形体の膜厚は100μm、面積変化率は0.2%(膨潤)、引張強度は3.7MPaであった。また、溶出試験による溶出率は4%であった。
乾燥させた線維化コラーゲン膜をそのままγ線照射した以外は、実施例1と同様にして架橋線維化コラーゲン膜からなるコラーゲン成形体を作製した。得られたコラーゲン成形体の膜厚は45μmであったが、面積変化率は37℃のD−PBSに浸漬した時点で膜が溶解し始め、3時間後には完全に溶解したため測定できなかった。また、引張強度も1日間のD−PBS浸漬によって膜が脆弱になったため、測定不能であった。また、溶出試験による溶出率は12%であった。
前記実施例1、実施例2、及び比較例1のコラーゲン成形体の物性は、以下の方法により測定した。
実施例1及び実施例2のコラーゲン成形体については、架橋処理後にD−PBSから取り出した湿潤状態のコラーゲン成形体の5箇所の膜厚をマイクロメーターにより計測し、その平均値を求めた。一方、実施例1の架橋処理前の線維化コラーゲン膜及び比較例1のコラーゲン成形体については、乾燥状態で同様に膜厚を測定し、その平均値を求めた。
コラーゲン成形体をD−PBS中に37℃、5日間浸漬した後、角度を変えて3箇所計測した直径から算出した面積の平均値と、浸漬前に同様に算出した面積の平均値との差を求め、これを浸漬前の面積の平均値で除し、面積変化率として算出した。
コラーゲン成形体をD−PBS中に20℃、1日間浸漬し、D−PBSから取り出した後20分以内に、乾燥させること無く湿潤状態のままで、引張強度測定機(Orientec社製「STA−1150」)により引張強度を測定した。具体的には、ロードセル間の距離が10mmとなるように膜の両端を固定し、0.5mm/分の速度で引張り、破断時の応力を測定した。引張強度の計算は以下の式により求めた。
(式)ft=P/S
但し、ft:引張強度(MPa)、P:最大荷重(N)、S:断面積(mm2)
膜5個の平均値を引張強度とした。
コラーゲン成形体を6wellプレートに配し、PBS溶液5mL中に37℃で5日間浸漬した。5日後、上澄みのみをサンプリングし、80℃で1日間乾燥した後、重量を測定し、溶出率を算出した。
コラーゲン成形体を20mLのPBSに浸漬し、37℃で5日間インキュベートした。インキュベート後、上澄みを回収しサンプルとした。得られたサンプルの分子量分布を下記の条件で測定し、結果を図2に示した。
・装置:(株)島津製作所製 高速液体クロマトグラフ LC−20Aシステム
・検出器:RI検出器 RID−10A 温度25℃
・カラム:Shodex PROTEIN KW−803
・カラムオーブン:25℃
・流量:1.0mL/min
・溶離液:PBS
・サンプル量:20μL
図2より、25kGy照射の実施例1及び10kGy照射の実施例2ではクロマトグラフの変化が少なかったのに対し、未照射の比較例1はピークが2つ検出され、そのうちの1つはゼラチンに相当する分子量ピークであった。このことより、37℃で5日間のPBS浸漬によって、実施例1及び実施例2のコラーゲン成形体はほとんど分解しなかった又は分解したとしてもわずかな量にとどまったのに対し、比較例1のコラーゲン成形体は分解しやすいものであることが分かった。
湿潤状態でγ線照射をしない以外は、実施例1の操作を繰り返し、線維化コラーゲン膜を作製した。一方、実施例1に記載のコラーゲン溶液Aを成形器内に入れ、前記線維化コラーゲン膜をコラーゲン溶液Aの上に載置し、しばらく静置して積層体化させた。なお、載置した前記線維化コラーゲン膜は、コラーゲン溶液Aの上面に保持された状態で積層体化した。
次いで、前記積層体を−35℃で約2時間凍結乾燥し、積層体を得た(図3)。乾燥後の積層体は、膜側が緻密構造を有し、反対面には多孔構造を有するものであった(図5)。
次に、当該積層体をD−PBSに浸漬した。このとき、多孔体部分の気泡を平先ピンセットで脱気した。これを25kGyのγ線照射を行うことにより、線維化架橋処理コラーゲン膜と非線維化架橋処理コラーゲン多孔体との積層体からなるコラーゲン成形体を作製した。
当該コラーゲン成形体を37℃条件のD−PBSに24時間浸漬しても殆ど変形は確認されなかった(図4)。
実施例1と同様の方法で作製した線維化コラーゲンゲルをD−PBSに浸漬させ、25kGyのγ線照射を行うことにより、線維化架橋処理コラーゲンゲルを作製した。これを実施例1と同様のエタノール/水の混合液にて、脱塩した後、側面のみから脱媒させることにより、乾燥させて線維化架橋処理コラーゲン膜からなるコラーゲン成形体を得た。引張強度測定は、D−PBSに浸漬した状態で行った。その結果、21.1±4.6MPaであった。
実施例1と同様の方法で、図6に示すダンベル型形状(高さ2.5mm)に加工した成形器を用いて線維化コラーゲンゲルを作製した。当該線維化コラーゲンゲル(5個)を、全コラーゲン分子数の10倍モル量のポリエチレングリコールジアクリレート(分子量2,000)を混合した20mLのD−PBSに浸漬させた。25kGyのγ線照射を行い、線維化架橋処理コラーゲンゲルを作製した。これを実施例1と同様のエタノール/水の混合液にて、脱塩した後、側面から脱水させることにより、乾燥させて線維化架橋処理コラーゲン膜からなるコラーゲン成形体を得た。引張強度測定は、D−PBSに浸漬した状態で行った。その結果、35.4±1.6MPaであった。
全コラーゲン分子数の5倍モル量のポリエチレングリコールジアクリレート(分子量2,000)をD−PBSに混合した以外は、実施例1と同様の方法で、成形器を図6に示すダンベル型形状(高さ2.5mm)に加工した線維化コラーゲンゲルを作製した。当該線維化コラーゲンゲルを、エタノール/水の容量比が50/50の混合液(以下、50/50のように表記する)、70/30、90/10、100/0に順次浸漬して、脱塩した後、膜の上下面をポリスチレン板で覆い、側面のみから脱媒させることにより乾燥させて線維化コラーゲン膜を得た。当該線維化コラーゲン膜をD−PBSに浸漬した状態で、25kGyのγ線照射を行うことにより、線維化架橋処理コラーゲン膜からなるコラーゲン成形体を得た。引張強度測定は、D−PBSに浸漬した状態で行った。その結果、23.8±2.6MPaであった。
これらの結果は、ポリエチレングリコールをコラーゲン成形体に混合することで、架橋密度が向上し、その引張強度を劇的に向上させることを示していた。
Claims (16)
- 線維化又は非線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体であって、前記コラーゲン膜が、
液体の存在下でγ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はUV照射によって架橋処理することによって得られ、
重量法による密度が0.4g/cm3以上であり、そして
湿潤下での引張強度が1MPa以上であることを特徴とする、
コラーゲン成形体。 - 前記コラーゲン成形体が、架橋処理コラーゲン膜と線維化又は非繊維化架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含むコラーゲン成形体であって、
前記架橋処理コラーゲン多孔体が、液体の存在下でγ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はUV照射によって架橋処理することによって得られる、請求項1に記載のコラーゲン成形体。 - 前記架橋処理が、一般式(1)
で表されるポリエチレングリコール誘導体の存在下での架橋処理である、請求項1又は2に記載のコラーゲン成形体。 - 前記ポリエチレングリコール誘導体の分子量が1,000〜15,000である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のコラーゲン成形体。
- 前記液体のpHが3.0〜10.0である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のコラーゲン成形体。
- 前記γ線照射の照射量が、5〜50kGyである、請求項1〜5のいずれか一項に記載のコラーゲン成形体。
- ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(D−PBS)中に37℃で5日間浸漬した場合の溶解率が10質量%以下である、請求項1〜6のいずれか一項に記載のコラーゲン成形体。
- ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(D−PBS)中に37℃で5日間浸漬した後の、浸漬前に対する面積変化率が5%以内である、請求項1〜7のいずれか一項に記載のコラーゲン成形体。
- (1)コラーゲン濃度が0.5質量%以上3.0質量%以下のコラーゲン溶液を成形器内に入れ、コラーゲンを線維化することによって、線維化コラーゲンゲルを成形する工程、
(2)前記線維化コラーゲンゲルを、水混和性有機溶媒濃度を段階的に高めた水混和性有機溶媒と水との混合液に順次浸漬して脱塩する工程、
(3)前記脱塩した線維化コラーゲンゲルを乾燥し線維化コラーゲン膜を得る工程、及び
(4)前記線維化コラーゲン膜を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はUV照射によって架橋処理する工程、
を含む線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体の製造方法。 - (1)コラーゲン濃度が0.5質量%以上3.0質量%以下のコラーゲン溶液を成形器内に入れ、コラーゲンを線維化することによって、線維化コラーゲンゲルを成形する工程、
(2)前記線維化コラーゲンゲルを、水混和性有機溶媒濃度を段階的に高めた水混和性有機溶媒と水との混合液に順次浸漬して脱塩する工程、
(3)前記脱塩した線維化コラーゲンゲルを乾燥し線維化コラーゲン膜を得る工程、
(3a)(A)前記線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が0.5質量%以上3.0質量%以下の多孔体作製用線維化コラーゲンゲルとを接触させる工程、若しくは、
(B)前記線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が5.0質量%以下の多孔体作製用コラーゲン酸性溶液とを接触させる工程、
(3b)前記接触物を凍結乾燥して積層体を得る工程、
(4)前記積層体を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はUV照射によって架橋処理する工程
を含む、線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含む請求項9に記載のコラーゲン成形体の製造方法。 - 前記乾燥工程(3)が、脱塩した線維化コラーゲンゲルを、上部及び下部を被覆して通気性を遮断した被覆上部と被覆下部との間に、非被覆の外周部を設け、当該外周部から脱媒して乾燥させる工程である、請求項9又は10に記載のコラーゲン成形体の製造方法。
- 前記液体、前記コラーゲン溶液、前記多孔体作製用線維化コラーゲンゲル、及び前記多孔体作製用コラーゲン酸性溶液からなる群から選択される少なくとも1つが、一般式(1)
で表されるポリエチレングリコール誘導体を含む、請求項9〜11のいずれか一項に記載のコラーゲン成形体の製造方法。 - (1)酸性液にコラーゲンを溶解し、コラーゲン濃度が0.5質量%以上3.0質量%以下のコラーゲン酸性溶液を得る工程、
(2)前記コラーゲン酸性溶液を成形器に入れ、成形する工程、
(3)前記コラーゲン酸性溶液を乾燥し非線維化コラーゲン膜を得る工程、及び
(4)前記非線維化コラーゲン膜を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はUV照射によって架橋処理する工程、
を含む非線維化架橋処理コラーゲン膜を含むコラーゲン成形体の製造方法。 - (1)酸性液にコラーゲンを溶解し、コラーゲン濃度が0.5質量%以上3.0質量%以下のコラーゲン酸性溶液を得る工程、
(2)前記コラーゲン酸性溶液を成形器に入れ、成形する工程、
(3)前記コラーゲン酸性溶液を乾燥し非線維化コラーゲン膜を得る工程、
(3a)(A)前記非線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が0.5質量%以上3.0質量%以下の多孔体作製用線維化コラーゲンゲルとを接触させる工程、若しくは
(B)前記非線維化コラーゲン膜と、コラーゲン濃度が5.0質量%以下の多孔体作製用コラーゲン酸性溶液とを接触させる工程、
(3b)前記接触物を凍結乾燥して積層体を得る工程、
(4)前記積層体を、液体の存在下で、γ線照射、電子線照射、プラズマ照射、又はUV照射によって架橋処理する工程、
を含む、非線維化架橋処理コラーゲン膜と架橋処理コラーゲン多孔体との積層体を含む請求項13に記載のコラーゲン成形体の製造方法。 - 前記液体、前記コラーゲン膜作製用コラーゲン酸性溶液、前記多孔体作製用線維化コラーゲンゲル、及び前記多孔体作製用コラーゲン酸性溶液からなる群から選択される少なくとも1つが、一般式(1)
で表されるポリエチレングリコール誘導体を含む、請求項13又は14に記載のコラーゲン成形体の製造方法。 - 請求項9〜15のいずれか一項に記載の製造方法によって得ることのできるコラーゲン成形体。
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