CN108578617A - 一种脐血间质干细胞药物在促进膝关节软骨再生中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脐血间质干细胞药物在促进膝关节软骨再生中的应用，所述脐血间质干细胞药物包括：7‑9％脐血间质干细胞、1‑3％软骨细胞、14‑17％透明质酸凝胶、3‑4％复合纳米纤维素、15‑20％基质液、9‑11％中药提取物缓释微球，余量微液泡润滑液；脐血间质干细胞药物的制备方法包括：(1)肝素活化复合纳米纤维素；(2)细胞基体的制备；(3)中药提取物缓释微球的制备；(4)微液泡润滑液的制备；(5)试剂成型。总之，本发明配比合理，能有效修复受损软骨组织，治愈率高且患者痛苦感少。在药物研究和临床治疗中具有积极意义，并具有良好的社会和经济效益。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种脐血间质干细胞药物在促进膝关节软骨再生中的应用。
背景技术
软骨损伤是最常见的膝关节疾病之一。由于软骨无血管、神经、淋巴组织，营养成分主要来自膝关节的滑液，这些组织学的特点使得软骨损伤的自我修复能力极为有限。创伤性的软骨损伤会引起患者关节的疼痛和肿胀，若不进行及时处理，则会加快关节的退变，引起更为严重的功能障碍。
目前，临床治疗效果不佳，主要是缓解患者的疼痛，改善膝关节功能，究其原因就是因为不清楚软骨损伤的发病机制。药物治疗主要是对症治疗，暂时缓解病人的痛苦，但长期效果不佳，症状容易反复发作。药物达到一定治疗效果的同时还伴随一些副作用。对于老年、晚期症状较重，保守治疗效果不佳的患者则需要进行人工膝关节置换术，不仅手术费用高，会给患者本人，家庭造成严重负担，而且还需要进行二次手术。同时软骨损伤作为长期和慢性的疾病也消耗着大量的医疗资源。然而，随着组织工程相关再生医学的发展，使得软骨损伤的修复得以实现。
脐带间充质干细胞具有更强的增殖分化能力，免疫原性低，取材方便，无道德伦理问题的限制，易于工业化制备。脐带间充质干细胞能够发育成硬骨、软骨、脂肪和其他类型的细胞，一旦注射入膝关节软骨损伤患者的膝关节可以定向分化为软骨细胞，促进机体损伤软骨的恢复。脐带间充质干细胞在膝关节软骨损伤修复方面具有长远的发展前景，可以治愈更多饱受病痛折磨的膝关节炎患者。
现有技术中的利用脐带间充质干细胞进行治疗药剂，都尽可能的保证了脐带间充质干细胞的活性，使其促进损伤部分内源性干细胞再生，并向成骨细胞及软骨细胞分化，同时促进原有软骨细胞增殖复制，补充修复受损软骨组织；但是对于在治疗期间对关节软骨的保护较为薄弱，延长了治疗时间，并增加了患者的痛苦感。
发明内容
针对以上存在的技术问题，本发明提供一种脐血间质干细胞药物在促进膝关节软骨再生中的应用。
本发明的技术方案为：一种脐血间质干细胞药物在促进膝关节软骨再生中的应用，所述脐血间质干细胞药物按照重量百分比包括：7-9％脐血间质干细胞、1-3％软骨细胞、14-17％透明质酸凝胶、3-4％复合纳米纤维素、15-20％基质液、9-11％中药提取物缓释微球，余量微液泡润滑液；
所述基质液按照重量百分比包括：1-3％硫酸软骨素、12.2-17.0％胶原、2.5-3.4％弹性蛋白、2.7-3.3％蛋白聚糖、4.5-5.0％右旋糖酐、15.6-17.8％维生素D、0.5-1.2％细胞黏附分子、0.4-1.0％葡萄醛酸、0.3-0.6％尿囊素、2.1-2.6％骨形态发生蛋白、1.0-3.0％细胞生长因子，余量为平衡盐溶液；
所述微液泡润滑液按照重量百分比包括：3-5％聚乙二醇、8-12％甘油、1-3％肉豆蔻酸异丙酯、36-38％温敏型纳米凝胶、2-4％葡萄糖乳酸钙、1-3％非离子表面活性剂，余量为去离子水。
进一步地，所述复合纳米纤维素是由多肽纳米纤维素、纳米结晶纤维、季铵化纳米纤维素按照重量比为3:2:1组成；季铵化纳米纤维素具有良好的亲水性，可作为良好的药物缓释材料；多肽纳米纤维素有利于细胞的增殖和黏附；纳米结晶纤维；纳米结晶纤维弹性好，并且还具有一定的抗氧化作用，能够为细胞微提供低氧微环境。
更进一步地，所述复合纳米纤维素经过肝素活化处理，经过肝素活化处理后的复合纳米纤维素可有效的控制细胞释放生长因子，大大提高了药物的缓释效果。
进一步地，所述中药提取物缓释微球按照包括以下重量组份：5-8份没药提取物、4-6份威灵仙提取物、3-5份两头尖提取物、1-2份桂皮提取物、3-4份粉萆薢提取物、7-9份野荞麦根提取物、10-14份鹿茸提取物、3-5份鸡脚参提取物、4-6份黄花稔提取物、7-11份马尾伸筋提取物、1-2份蛏肉提取物、7-9份苍术提取物、3-5份紫河车提取物、100-200份海藻酸钠溶液、60-80份聚谷氨酸、20-30份氯化钙溶液、40-50份柠檬酸钠溶液；其中，没药具有活血化瘀的作用；威灵仙、两头尖具有祛风除湿，通络止痛的功效；桂皮、苍术具有杀菌抑菌的作用；鹿茸具有强筋健骨的功效；蛏肉具有消肿活血的功效；紫河车具有丰富的糖、钙、维生素及免疫因子，可提高患者的免疫功能。
进一步地，所述中药提取物缓释微球的制备方法包括以下步骤：
S1：按照上述比例将没药提取物、威灵仙提取物、两头尖提取物、桂皮提取物、粉萆薢提取物、野荞麦根提取物、鹿茸提取物、鸡脚参提取物、黄花稔提取物、马尾伸筋提取物、蛏肉提取物、苍术提取物、紫河车提取物分别与体积分数为1-3％的所述海藻酸钠溶液混合均匀，得到悬液；
S2：利用静脉滴注管向所述悬液中滴注摩尔浓度为120-130mmol/L的所述氯化钙溶液，滴注速度为60-80滴/min，搅拌速度为120-300r/min，得到海藻酸钙微胶珠；
S3：向所述海藻酸钙微胶珠中加入所述聚谷氨酸，并搅拌均匀后，在室温下成膜反应20-30min，得到非液化的藻酸钙-聚谷氨酸包膜微珠；
S4：最后向所述藻酸钙-聚谷氨酸包膜微珠中加入体积分数为60-70mmol/L的柠檬酸钠溶液进行液化处理，最后得到中药提取物缓释微球，制备成缓释微球，可以将中药的药效进行控释，可长时间作用于病患处。
进一步地，所述微液泡润滑液的制备方法包括以下步骤：
S1：将所述聚乙二醇、甘油、肉豆蔻酸异丙酯按照上述比例进行混合均匀，得到油相，备用，肉豆蔻酸异丙酯具有良好的保湿和滋润效果，并且具有良好的皮肤渗透性，可以将药物中的活性成分深入病灶；再将所述葡萄糖乳酸钙溶解与所述去离子水中，得到水相，备用，葡萄糖乳酸钙可以提高膝关节对于钙离子的吸收；将所述非离子表面活性剂加入到所述温敏型纳米凝胶中，在20-25℃下搅拌3-5min，得到活化温敏型纳米凝胶，备用，温敏型纳米凝胶经过非离子表面活性剂的处理后，可大大提高微液泡的稳定性；
S2：将所述活化温敏型纳米凝胶装入烧杯内，再将十字圆形微通道的下端口通入所述烧杯内，所述油相接入十字圆形微通道的左端口，所述水相接入所述十字圆形微通道的右端口，在十字圆形微通道的上端口接入氮气鼓入机，油相和水相从左右两端的圆形微通道进入后，在中间的圆形混合区混合，形成乳相，并通过氮气进行冲击，产生微液泡，最后通入装有活化温敏型纳米凝胶的烧杯内，进行稳化，得到微液泡润滑液；其中，油相的表观流速为0.1-0.5m/s，水相的表观流速为0.2-1m/s，氮气的表观流速为0.4-4m/s。
进一步地，所述脐血间质干细胞药物的制备方法包括以下步骤：
(1)肝素活化复合纳米纤维素：将5-10mg的肝素溶解于pH值为5-6.5，浓度为2.2-3.0mol/L，体积为100-500ml的PBS缓冲溶液，再加入0.05-0.2mg
的N,N-二环己基碳二亚胺，在25-30℃下搅拌混合20-30min；再将所述复合纳米纤维素加入其中，进行浸泡2-4h，最后进行过滤、冷冻干燥，得到肝素活化复合纳米纤维素；
(2)细胞基体的制备：按照上述比例将硫酸软骨素、胶原、弹性蛋白、蛋白聚糖、右旋糖酐、维生素D、细胞黏附分子、葡萄醛酸、尿囊素、骨形态发生蛋白、细胞生长因子、平衡盐溶液，进行混合，制成基质液，备用；再将步骤(1)制备的肝素活化复合纳米纤维素与所述透明质酸凝胶进行混合均匀，然后再加入从细胞资源库中提取的所述脐血间质干细胞和软骨细胞，最后，加入所述基质液，放入4℃的冰箱中进行冷藏，得到细胞基体；
(3)中药提取物缓释微球的制备：
S1：按照上述比例将没药提取物、威灵仙提取物、两头尖提取物、桂皮提取物、粉萆薢提取物、野荞麦根提取物、鹿茸提取物、鸡脚参提取物、黄花稔提取物、马尾伸筋提取物、蛏肉提取物、苍术提取物、紫河车提取物分别与体积分数为1-3％的所述海藻酸钠溶液混合均匀，得到悬液；
S2：利用静脉滴注管向所述悬液中滴注摩尔浓度为120-130mmol/L的所述氯化钙溶液，滴注速度为60-80滴/min，搅拌速度为120-300r/min，得到海藻酸钙微胶珠；
S3：向所述海藻酸钙微胶珠中加入所述聚谷氨酸，并搅拌均匀后，在室温下成膜反应20-30min，得到非液化的藻酸钙-聚谷氨酸包膜微珠；
S4：最后向所述藻酸钙-聚谷氨酸包膜微珠中加入体积分数为60-70mmol/L的柠檬酸钠溶液进行液化处理，最后得到中药提取物缓释微球；
(4)微液泡润滑液的制备：
S1：将所述聚乙二醇、甘油、肉豆蔻酸异丙酯按照上述比例进行混合均匀，得到油相，备用；再将所述葡萄糖乳酸钙溶解与所述去离子水中，得到水相，备用；将所述非离子表面活性剂加入到所述温敏型纳米凝胶中，在20-25℃下搅拌3-5min，得到活化温敏型纳米凝胶，备用；
S2：将所述活化温敏型纳米凝胶装入烧杯内，再将十字圆形微通道的下端口通入所述烧杯内，所述油相接入十字圆形微通道的左端口，所述水相接入所述十字圆形微通道的右端口，在十字圆形微通道的上端口接入氮气鼓入机，油相和水相从左右两端的圆形微通道进入后，在中间的圆形混合区混合，形成乳相，并通过氮气进行冲击，产生微液泡，最后通入装有活化温敏型纳米凝胶的烧杯内，进行稳化，得到微液泡润滑液；其中，油相的表观流速为0.1-0.5m/s，水相的表观流速为0.2-1m/s，氮气的表观流速为0.4-4m/s；
(5)试剂成型：将所述细胞基体、中药提取物缓释微球、中药提取物缓释微球按照上述比例进行混合，用5ml或10ml玻璃瓶进行分批定容成注射剂，并进行密封，置于4℃的冰箱中进行冷藏。
更进一步地，所述十字圆形微通道中的圆形微通道的直径为0.1-1mm，所述圆形混合区的直径为3-5mm；圆形微通道的直径过小则对油相粘滞性加大，不利于油相的流通，而过大则可能造成生成的液泡粒径过大或大小不均，从而降低稳定性。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明利用肝素活化后的复合纳米纤维素与透明质酸凝胶，为脐血间质干细胞和软骨细胞提供附着载体，其中，复合纳米纤维素包含多肽纳米纤维素、纳米结晶纤维、季铵化纳米纤维素；季铵化纳米纤维素具有良好的亲水性，可作为良好的药物缓释材料；多肽纳米纤维素有利于细胞的增殖和黏附；纳米结晶纤维；纳米结晶纤维弹性好，并且还具有一定的抗氧化作用，能够为细胞微提供低氧微环境。且复合纳米纤维素经过肝素活化后进一步提高生长因子的缓释效果；通过促进损伤部分内源性干细胞再生，并向成骨细胞及软骨细胞分化，同时促进原有软骨细胞增殖复制，补充修复受损软骨组织；
(2)本发明还提供了微液泡润滑液及其制备方法，利用十字圆形微通道将油相和水相混合成乳相后，再通过鼓入氮气，将其乳相液滴吹散成微液泡，并最后通入经过表面活化剂处理后的温敏型纳米凝胶内部，提高微液泡的稳定性，带有微液泡润滑液的注射剂注射入患者膝关节后，可通过微液泡的减阻机理，在起到润滑的基础上，大大降低关节的磨损率，减轻患者的疼痛感；
(3)本发明微液泡润滑液的油相中含有肉豆蔻酸异丙酯，具有良好的保湿和滋润效果，并且具有良好的皮肤渗透性，可以将药物中的活性成分深入病灶；总之，本发明配比合理，能有效提高脐血间质干细胞和软骨细胞的活性，并对病灶进行控释治疗，提高治愈率，并降低患者痛苦感。在药物研究和临床治疗中具有积极意义，并具有良好的社会和经济效益。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步详细说明本发明，但实施例不限制本发明的范围，本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
实施例1
一种脐血间质干细胞药物在促进膝关节软骨再生中的应用，所述脐血间质干细胞药物按照重量百分比包括：7％脐血间质干细胞、1％软骨细胞、14％透明质酸凝胶、3％复合纳米纤维素、15％基质液、9％中药提取物缓释微球，余量微液泡润滑液；其中，所述复合纳米纤维素是由多肽纳米纤维素、纳米结晶纤维、季铵化纳米纤维素按照重量比为3:2:1组成；季铵化纳米纤维素具有良好的亲水性，可作为良好的药物缓释材料；多肽纳米纤维素有利于细胞的增殖和黏附；纳米结晶纤维；纳米结晶纤维弹性好，并且还具有一定的抗氧化作用，能够为细胞微提供低氧微环境。其中，所述复合纳米纤维素经过肝素活化处理，经过肝素活化处理后的复合纳米纤维素可有效的控制细胞释放生长因子，大大提高了药物的缓释效果。
其中，所述中药提取物缓释微球按照包括以下重量组份：5份没药提取物、4份威灵仙提取物、3份两头尖提取物、1份桂皮提取物、3份粉萆薢提取物、7份野荞麦根提取物、10份鹿茸提取物、3份鸡脚参提取物、4份黄花稔提取物、7份马尾伸筋提取物、1份蛏肉提取物、7份苍术提取物、3份紫河车提取物、100份海藻酸钠溶液、60份聚谷氨酸、20份氯化钙溶液、40份柠檬酸钠溶液；其中，没药具有活血化瘀的作用；威灵仙、两头尖具有祛风除湿，通络止痛的功效；桂皮、苍术具有杀菌抑菌的作用；鹿茸具有强筋健骨的功效；蛏肉具有消肿活血的功效；紫河车具有丰富的糖、钙、维生素及免疫因子，可提高患者的免疫功能。
所述中药提取物缓释微球的制备方法包括以下步骤：
S1：按照上述比例将没药提取物、威灵仙提取物、两头尖提取物、桂皮提取物、粉萆薢提取物、野荞麦根提取物、鹿茸提取物、鸡脚参提取物、黄花稔提取物、马尾伸筋提取物、蛏肉提取物、苍术提取物、紫河车提取物分别与体积分数为1％的所述海藻酸钠溶液混合均匀，得到悬液；
S2：利用静脉滴注管向所述悬液中滴注摩尔浓度为120mmol/L的所述氯化钙溶液，滴注速度为60滴/min，搅拌速度为120r/min，得到海藻酸钙微胶珠；
S3：向所述海藻酸钙微胶珠中加入所述聚谷氨酸，并搅拌均匀后，在室温下成膜反应20min，得到非液化的藻酸钙-聚谷氨酸包膜微珠；
S4：最后向所述藻酸钙-聚谷氨酸包膜微珠中加入体积分数为60mmol/L的柠檬酸钠溶液进行液化处理，最后得到中药提取物缓释微球，制备成缓释微球，可以将中药的药效进行控释，可长时间作用于病患处。
所述基质液按照重量百分比包括：1％硫酸软骨素、12.2％胶原、2.5％弹性蛋白、2.7％蛋白聚糖、4.5％右旋糖酐、15.6％维生素D、0.5％细胞黏附分子、0.4％葡萄醛酸、0.3％尿囊素、2.1％骨形态发生蛋白、1.0％细胞生长因子，余量为平衡盐溶液；
所述微液泡润滑液按照重量百分比包括：3％聚乙二醇、8％甘油、1％肉豆蔻酸异丙酯、36％温敏型纳米凝胶、2％葡萄糖乳酸钙、1％非离子表面活性剂，余量为去离子水。
所述微液泡润滑液的制备方法包括以下步骤：
S1：将所述聚乙二醇、甘油、肉豆蔻酸异丙酯按照上述比例进行混合均匀，得到油相，备用，肉豆蔻酸异丙酯具有良好的保湿和滋润效果，并且具有良好的皮肤渗透性，可以将药物中的活性成分深入病灶；再将所述葡萄糖乳酸钙溶解与所述去离子水中，得到水相，备用，葡萄糖乳酸钙可以提高膝关节对于钙离子的吸收；将所述非离子表面活性剂加入到所述温敏型纳米凝胶中，在20℃下搅拌3min，得到活化温敏型纳米凝胶，备用，温敏型纳米凝胶经过非离子表面活性剂的处理后，可大大提高微液泡的稳定性；
S2：将所述活化温敏型纳米凝胶装入烧杯内，再将十字圆形微通道的下端口通入所述烧杯内，所述油相接入十字圆形微通道的左端口，所述水相接入所述十字圆形微通道的右端口，在十字圆形微通道的上端口接入氮气鼓入机，油相和水相从左右两端的圆形微通道进入后，在中间的圆形混合区混合，形成乳相，并通过氮气进行冲击，产生微液泡，最后通入装有活化温敏型纳米凝胶的烧杯内，进行稳化，得到微液泡润滑液；其中，油相的表观流速为0.1m/s，水相的表观流速为0.2m/s，氮气的表观流速为0.4m/s。
所述脐血间质干细胞药物的制备方法包括以下步骤：
(1)肝素活化复合纳米纤维素：将5mg的肝素溶解于pH值为5，浓度为2.2mol/L，体积为100ml的PBS缓冲溶液，再加入0.05mg
的N,N-二环己基碳二亚胺，在25℃下搅拌混合20min；再将所述复合纳米纤维素加入其中，进行浸泡2h，最后进行过滤、冷冻干燥，得到肝素活化复合纳米纤维素；
(2)细胞基体的制备：按照上述比例将硫酸软骨素、胶原、弹性蛋白、蛋白聚糖、右旋糖酐、维生素D、细胞黏附分子、葡萄醛酸、尿囊素、骨形态发生蛋白、细胞生长因子、平衡盐溶液，进行混合，制成基质液，备用；再将步骤(1)制备的肝素活化复合纳米纤维素与所述透明质酸凝胶进行混合均匀，然后再加入从细胞资源库中提取的所述脐血间质干细胞和软骨细胞，最后，加入所述基质液，放入4℃的冰箱中进行冷藏，得到细胞基体；
(3)中药提取物缓释微球的制备：
S1：按照上述比例将没药提取物、威灵仙提取物、两头尖提取物、桂皮提取物、粉萆薢提取物、野荞麦根提取物、鹿茸提取物、鸡脚参提取物、黄花稔提取物、马尾伸筋提取物、蛏肉提取物、苍术提取物、紫河车提取物分别与体积分数为1％的所述海藻酸钠溶液混合均匀，得到悬液；
S2：利用静脉滴注管向所述悬液中滴注摩尔浓度为120mmol/L的所述氯化钙溶液，滴注速度为60滴/min，搅拌速度为120r/min，得到海藻酸钙微胶珠；
S3：向所述海藻酸钙微胶珠中加入所述聚谷氨酸，并搅拌均匀后，在室温下成膜反应20min，得到非液化的藻酸钙-聚谷氨酸包膜微珠；
S4：最后向所述藻酸钙-聚谷氨酸包膜微珠中加入体积分数为60mmol/L的柠檬酸钠溶液进行液化处理，最后得到中药提取物缓释微球；
(4)微液泡润滑液的制备：
S1：将所述聚乙二醇、甘油、肉豆蔻酸异丙酯按照上述比例进行混合均匀，得到油相，备用；再将所述葡萄糖乳酸钙溶解与所述去离子水中，得到水相，备用；将所述非离子表面活性剂加入到所述温敏型纳米凝胶中，在20℃下搅拌3min，得到活化温敏型纳米凝胶，备用；
S2：将所述活化温敏型纳米凝胶装入烧杯内，再将十字圆形微通道的下端口通入所述烧杯内，所述油相接入十字圆形微通道的左端口，所述水相接入所述十字圆形微通道的右端口，在十字圆形微通道的上端口接入氮气鼓入机，油相和水相从左右两端的圆形微通道进入后，在中间的圆形混合区混合，形成乳相，并通过氮气进行冲击，产生微液泡，最后通入装有活化温敏型纳米凝胶的烧杯内，进行稳化，得到微液泡润滑液；其中，油相的表观流速为0.1m/s，水相的表观流速为0.2m/s，氮气的表观流速为0.4m/s；其中，所述十字圆形微通道中的圆形微通道的直径为0.1mm，所述圆形混合区的直径为3mm；圆形微通道的直径过小则对油相粘滞性加大，不利于油相的流通，而过大则可能造成生成的液泡粒径过大或大小不均，从而降低稳定性。
(5)试剂成型：将所述细胞基体、中药提取物缓释微球、中药提取物缓释微球按照上述比例进行混合，用5ml玻璃瓶进行分批定容成注射剂，并进行密封，置于4℃的冰箱中进行冷藏。
实施例2
一种脐血间质干细胞药物在促进膝关节软骨再生中的应用，所述脐血间质干细胞药物按照重量百分比包括：8％脐血间质干细胞、2％软骨细胞、15.5％透明质酸凝胶、3.5％复合纳米纤维素、17.5％基质液、10％中药提取物缓释微球，余量微液泡润滑液；其中，所述复合纳米纤维素是由多肽纳米纤维素、纳米结晶纤维、季铵化纳米纤维素按照重量比为3:2:1组成；季铵化纳米纤维素具有良好的亲水性，可作为良好的药物缓释材料；多肽纳米纤维素有利于细胞的增殖和黏附；纳米结晶纤维；纳米结晶纤维弹性好，并且还具有一定的抗氧化作用，能够为细胞微提供低氧微环境。其中，所述复合纳米纤维素经过肝素活化处理，经过肝素活化处理后的复合纳米纤维素可有效的控制细胞释放生长因子，大大提高了药物的缓释效果。
其中，所述中药提取物缓释微球按照包括以下重量组份：6.5份没药提取物、5份威灵仙提取物、4份两头尖提取物、1.5份桂皮提取物、3.5份粉萆薢提取物、8份野荞麦根提取物、12份鹿茸提取物、4份鸡脚参提取物、5份黄花稔提取物、9份马尾伸筋提取物、1.5份蛏肉提取物、8份苍术提取物、4份紫河车提取物、150份海藻酸钠溶液、70份聚谷氨酸、25份氯化钙溶液、45份柠檬酸钠溶液；其中，没药具有活血化瘀的作用；威灵仙、两头尖具有祛风除湿，通络止痛的功效；桂皮、苍术具有杀菌抑菌的作用；鹿茸具有强筋健骨的功效；蛏肉具有消肿活血的功效；紫河车具有丰富的糖、钙、维生素及免疫因子，可提高患者的免疫功能。
所述中药提取物缓释微球的制备方法包括以下步骤：
S1：按照上述比例将没药提取物、威灵仙提取物、两头尖提取物、桂皮提取物、粉萆薢提取物、野荞麦根提取物、鹿茸提取物、鸡脚参提取物、黄花稔提取物、马尾伸筋提取物、蛏肉提取物、苍术提取物、紫河车提取物分别与体积分数为2％的所述海藻酸钠溶液混合均匀，得到悬液；
S2：利用静脉滴注管向所述悬液中滴注摩尔浓度为125mmol/L的所述氯化钙溶液，滴注速度为70滴/min，搅拌速度为210r/min，得到海藻酸钙微胶珠；
S3：向所述海藻酸钙微胶珠中加入所述聚谷氨酸，并搅拌均匀后，在室温下成膜反应25min，得到非液化的藻酸钙-聚谷氨酸包膜微珠；
S4：最后向所述藻酸钙-聚谷氨酸包膜微珠中加入体积分数为65mmol/L的柠檬酸钠溶液进行液化处理，最后得到中药提取物缓释微球，制备成缓释微球，可以将中药的药效进行控释，可长时间作用于病患处。
所述基质液按照重量百分比包括：2％硫酸软骨素、14.6％胶原、2.95％弹性蛋白、3.0％蛋白聚糖、4.75％右旋糖酐、16.7％维生素D、0.85％细胞黏附分子、0.7％葡萄醛酸、0.45％尿囊素、2.35％骨形态发生蛋白、2.0％细胞生长因子，余量为平衡盐溶液；
所述微液泡润滑液按照重量百分比包括：4％聚乙二醇、10％甘油、2％肉豆蔻酸异丙酯、37％温敏型纳米凝胶、3％葡萄糖乳酸钙、2％非离子表面活性剂，余量为去离子水。
所述微液泡润滑液的制备方法包括以下步骤：
S1：将所述聚乙二醇、甘油、肉豆蔻酸异丙酯按照上述比例进行混合均匀，得到油相，备用，肉豆蔻酸异丙酯具有良好的保湿和滋润效果，并且具有良好的皮肤渗透性，可以将药物中的活性成分深入病灶；再将所述葡萄糖乳酸钙溶解与所述去离子水中，得到水相，备用，葡萄糖乳酸钙可以提高膝关节对于钙离子的吸收；将所述非离子表面活性剂加入到所述温敏型纳米凝胶中，在22℃下搅拌4min，得到活化温敏型纳米凝胶，备用，温敏型纳米凝胶经过非离子表面活性剂的处理后，可大大提高微液泡的稳定性；
S2：将所述活化温敏型纳米凝胶装入烧杯内，再将十字圆形微通道的下端口通入所述烧杯内，所述油相接入十字圆形微通道的左端口，所述水相接入所述十字圆形微通道的右端口，在十字圆形微通道的上端口接入氮气鼓入机，油相和水相从左右两端的圆形微通道进入后，在中间的圆形混合区混合，形成乳相，并通过氮气进行冲击，产生微液泡，最后通入装有活化温敏型纳米凝胶的烧杯内，进行稳化，得到微液泡润滑液；其中，油相的表观流速为0.3m/s，水相的表观流速为0.6m/s，氮气的表观流速为2.2m/s。
所述脐血间质干细胞药物的制备方法包括以下步骤：
(1)肝素活化复合纳米纤维素：将5-10mg的肝素溶解于pH值为5-6.5，浓度为2.6mol/L，体积为300ml的PBS缓冲溶液，再加入0.125mg
的N,N-二环己基碳二亚胺，在28℃下搅拌混合25min；再将所述复合纳米纤维素加入其中，进行浸泡3h，最后进行过滤、冷冻干燥，得到肝素活化复合纳米纤维素；
(2)细胞基体的制备：按照上述比例将硫酸软骨素、胶原、弹性蛋白、蛋白聚糖、右旋糖酐、维生素D、细胞黏附分子、葡萄醛酸、尿囊素、骨形态发生蛋白、细胞生长因子、平衡盐溶液，进行混合，制成基质液，备用；再将步骤(1)制备的肝素活化复合纳米纤维素与所述透明质酸凝胶进行混合均匀，然后再加入从细胞资源库中提取的所述脐血间质干细胞和软骨细胞，最后，加入所述基质液，放入4℃的冰箱中进行冷藏，得到细胞基体；
(3)中药提取物缓释微球的制备：
S1：按照上述比例将没药提取物、威灵仙提取物、两头尖提取物、桂皮提取物、粉萆薢提取物、野荞麦根提取物、鹿茸提取物、鸡脚参提取物、黄花稔提取物、马尾伸筋提取物、蛏肉提取物、苍术提取物、紫河车提取物分别与体积分数为2％的所述海藻酸钠溶液混合均匀，得到悬液；
S2：利用静脉滴注管向所述悬液中滴注摩尔浓度为125mmol/L的所述氯化钙溶液，滴注速度为70滴/min，搅拌速度为210r/min，得到海藻酸钙微胶珠；
S3：向所述海藻酸钙微胶珠中加入所述聚谷氨酸，并搅拌均匀后，在室温下成膜反应25min，得到非液化的藻酸钙-聚谷氨酸包膜微珠；
S4：最后向所述藻酸钙-聚谷氨酸包膜微珠中加入体积分数为65mmol/L的柠檬酸钠溶液进行液化处理，最后得到中药提取物缓释微球；
(4)微液泡润滑液的制备：
S1：将所述聚乙二醇、甘油、肉豆蔻酸异丙酯按照上述比例进行混合均匀，得到油相，备用；再将所述葡萄糖乳酸钙溶解与所述去离子水中，得到水相，备用；将所述非离子表面活性剂加入到所述温敏型纳米凝胶中，在22℃下搅拌4min，得到活化温敏型纳米凝胶，备用；
S2：将所述活化温敏型纳米凝胶装入烧杯内，再将十字圆形微通道的下端口通入所述烧杯内，所述油相接入十字圆形微通道的左端口，所述水相接入所述十字圆形微通道的右端口，在十字圆形微通道的上端口接入氮气鼓入机，油相和水相从左右两端的圆形微通道进入后，在中间的圆形混合区混合，形成乳相，并通过氮气进行冲击，产生微液泡，最后通入装有活化温敏型纳米凝胶的烧杯内，进行稳化，得到微液泡润滑液；其中，油相的表观流速为0.3m/s，水相的表观流速为0.6m/s，氮气的表观流速为2.2m/s；其中，所述十字圆形微通道中的圆形微通道的直径为0.55mm，所述圆形混合区的直径为4mm；圆形微通道的直径过小则对油相粘滞性加大，不利于油相的流通，而过大则可能造成生成的液泡粒径过大或大小不均，从而降低稳定性。
(5)试剂成型：将所述细胞基体、中药提取物缓释微球、中药提取物缓释微球按照上述比例进行混合，用5ml玻璃瓶进行分批定容成注射剂，并进行密封，置于4℃的冰箱中进行冷藏。
实施例3
一种脐血间质干细胞药物在促进膝关节软骨再生中的应用，所述脐血间质干细胞药物按照重量百分比包括：9％脐血间质干细胞、3％软骨细胞、17％透明质酸凝胶、4％复合纳米纤维素、20％基质液、11％中药提取物缓释微球，余量微液泡润滑液；其中，所述复合纳米纤维素是由多肽纳米纤维素、纳米结晶纤维、季铵化纳米纤维素按照重量比为3:2:1组成；季铵化纳米纤维素具有良好的亲水性，可作为良好的药物缓释材料；多肽纳米纤维素有利于细胞的增殖和黏附；纳米结晶纤维；纳米结晶纤维弹性好，并且还具有一定的抗氧化作用，能够为细胞微提供低氧微环境。其中，所述复合纳米纤维素经过肝素活化处理，经过肝素活化处理后的复合纳米纤维素可有效的控制细胞释放生长因子，大大提高了药物的缓释效果。
其中，所述中药提取物缓释微球按照包括以下重量组份：8份没药提取物、6份威灵仙提取物、5份两头尖提取物、2份桂皮提取物、4份粉萆薢提取物、9份野荞麦根提取物、14份鹿茸提取物、5份鸡脚参提取物、6份黄花稔提取物、11份马尾伸筋提取物、2份蛏肉提取物、9份苍术提取物、5份紫河车提取物、200份海藻酸钠溶液、80份聚谷氨酸、30份氯化钙溶液、50份柠檬酸钠溶液；其中，没药具有活血化瘀的作用；威灵仙、两头尖具有祛风除湿，通络止痛的功效；桂皮、苍术具有杀菌抑菌的作用；鹿茸具有强筋健骨的功效；蛏肉具有消肿活血的功效；紫河车具有丰富的糖、钙、维生素及免疫因子，可提高患者的免疫功能。
所述中药提取物缓释微球的制备方法包括以下步骤：
S1：按照上述比例将没药提取物、威灵仙提取物、两头尖提取物、桂皮提取物、粉萆薢提取物、野荞麦根提取物、鹿茸提取物、鸡脚参提取物、黄花稔提取物、马尾伸筋提取物、蛏肉提取物、苍术提取物、紫河车提取物分别与体积分数为3％的所述海藻酸钠溶液混合均匀，得到悬液；
S2：利用静脉滴注管向所述悬液中滴注摩尔浓度为130mmol/L的所述氯化钙溶液，滴注速度为80滴/min，搅拌速度为300r/min，得到海藻酸钙微胶珠；
S3：向所述海藻酸钙微胶珠中加入所述聚谷氨酸，并搅拌均匀后，在室温下成膜反应30min，得到非液化的藻酸钙-聚谷氨酸包膜微珠；
S4：最后向所述藻酸钙-聚谷氨酸包膜微珠中加入体积分数为70mmol/L的柠檬酸钠溶液进行液化处理，最后得到中药提取物缓释微球，制备成缓释微球，可以将中药的药效进行控释，可长时间作用于病患处。
所述基质液按照重量百分比包括：3％硫酸软骨素、17.0％胶原、3.4％弹性蛋白、3.3％蛋白聚糖、5.0％右旋糖酐、17.8％维生素D、1.2％细胞黏附分子、1.0％葡萄醛酸、0.6％尿囊素、2.6％骨形态发生蛋白、3.0％细胞生长因子，余量为平衡盐溶液；
所述微液泡润滑液按照重量百分比包括：5％聚乙二醇、12％甘油、3％肉豆蔻酸异丙酯、38％温敏型纳米凝胶、4％葡萄糖乳酸钙、3％非离子表面活性剂，余量为去离子水。
所述微液泡润滑液的制备方法包括以下步骤：
S1：将所述聚乙二醇、甘油、肉豆蔻酸异丙酯按照上述比例进行混合均匀，得到油相，备用，肉豆蔻酸异丙酯具有良好的保湿和滋润效果，并且具有良好的皮肤渗透性，可以将药物中的活性成分深入病灶；再将所述葡萄糖乳酸钙溶解与所述去离子水中，得到水相，备用，葡萄糖乳酸钙可以提高膝关节对于钙离子的吸收；将所述非离子表面活性剂加入到所述温敏型纳米凝胶中，在25℃下搅拌5min，得到活化温敏型纳米凝胶，备用，温敏型纳米凝胶经过非离子表面活性剂的处理后，可大大提高微液泡的稳定性；
S2：将所述活化温敏型纳米凝胶装入烧杯内，再将十字圆形微通道的下端口通入所述烧杯内，所述油相接入十字圆形微通道的左端口，所述水相接入所述十字圆形微通道的右端口，在十字圆形微通道的上端口接入氮气鼓入机，油相和水相从左右两端的圆形微通道进入后，在中间的圆形混合区混合，形成乳相，并通过氮气进行冲击，产生微液泡，最后通入装有活化温敏型纳米凝胶的烧杯内，进行稳化，得到微液泡润滑液；其中，油相的表观流速为0.5m/s，水相的表观流速为1m/s，氮气的表观流速为4m/s。
所述脐血间质干细胞药物的制备方法包括以下步骤：
(1)肝素活化复合纳米纤维素：将10mg的肝素溶解于pH值为6.5，浓度为3.0mol/L，体积为500ml的PBS缓冲溶液，再加入0.2mg
的N,N-二环己基碳二亚胺，在30℃下搅拌混合30min；再将所述复合纳米纤维素加入其中，进行浸泡4h，最后进行过滤、冷冻干燥，得到肝素活化复合纳米纤维素；
(2)细胞基体的制备：按照上述比例将硫酸软骨素、胶原、弹性蛋白、蛋白聚糖、右旋糖酐、维生素D、细胞黏附分子、葡萄醛酸、尿囊素、骨形态发生蛋白、细胞生长因子、平衡盐溶液，进行混合，制成基质液，备用；再将步骤(1)制备的肝素活化复合纳米纤维素与所述透明质酸凝胶进行混合均匀，然后再加入从细胞资源库中提取的所述脐血间质干细胞和软骨细胞，最后，加入所述基质液，放入4℃的冰箱中进行冷藏，得到细胞基体；
(3)中药提取物缓释微球的制备：
S1：按照上述比例将没药提取物、威灵仙提取物、两头尖提取物、桂皮提取物、粉萆薢提取物、野荞麦根提取物、鹿茸提取物、鸡脚参提取物、黄花稔提取物、马尾伸筋提取物、蛏肉提取物、苍术提取物、紫河车提取物分别与体积分数为1-3％的所述海藻酸钠溶液混合均匀，得到悬液；
S2：利用静脉滴注管向所述悬液中滴注摩尔浓度为130mmol/L的所述氯化钙溶液，滴注速度为80滴/min，搅拌速度为300r/min，得到海藻酸钙微胶珠；
S3：向所述海藻酸钙微胶珠中加入所述聚谷氨酸，并搅拌均匀后，在室温下成膜反应30min，得到非液化的藻酸钙-聚谷氨酸包膜微珠；
S4：最后向所述藻酸钙-聚谷氨酸包膜微珠中加入体积分数为70mmol/L的柠檬酸钠溶液进行液化处理，最后得到中药提取物缓释微球；
(4)微液泡润滑液的制备：
S1：将所述聚乙二醇、甘油、肉豆蔻酸异丙酯按照上述比例进行混合均匀，得到油相，备用；再将所述葡萄糖乳酸钙溶解与所述去离子水中，得到水相，备用；将所述非离子表面活性剂加入到所述温敏型纳米凝胶中，在25℃下搅拌5min，得到活化温敏型纳米凝胶，备用；
S2：将所述活化温敏型纳米凝胶装入烧杯内，再将十字圆形微通道的下端口通入所述烧杯内，所述油相接入十字圆形微通道的左端口，所述水相接入所述十字圆形微通道的右端口，在十字圆形微通道的上端口接入氮气鼓入机，油相和水相从左右两端的圆形微通道进入后，在中间的圆形混合区混合，形成乳相，并通过氮气进行冲击，产生微液泡，最后通入装有活化温敏型纳米凝胶的烧杯内，进行稳化，得到微液泡润滑液；其中，油相的表观流速为0.5m/s，水相的表观流速为1m/s，氮气的表观流速为4m/s；其中，所述十字圆形微通道中的圆形微通道的直径为1mm，所述圆形混合区的直径为5mm；圆形微通道的直径过小则对油相粘滞性加大，不利于油相的流通，而过大则可能造成生成的液泡粒径过大或大小不均，从而降低稳定性。
(1)试剂成型：将所述细胞基体、中药提取物缓释微球、中药提取物缓释微球按照上述比例进行混合，用10ml玻璃瓶进行分批定容成注射剂，并进行密封，置于4℃的冰箱中进行冷藏。
临床应用情况
1、病例选择：选择某省三甲医院收治的临床上需要进行骨软骨缺损治疗的患者240例进行临床观察，将240例患者随机平分成两组，治疗组120例，其中男51例，女性69例，年龄35-71岁，平均年龄50.4岁；对照组120例，其中男61例，女性59例，年龄44-68岁，平均年龄54.6岁；两组患者病历基本一致，无显著差异，具有可比性。
2、治疗方法：治疗组使用本发明的药物注射入关节腔内，对照组采用市售的恩妥新TM干细胞因子注射液注射入关节腔内。
3、治疗结果：根据不同患者不同病情及体质调查，随访之间为6-24个月。
下面是本发明临床资料调查结果：
结论，通过上述治疗结果可见，治疗组的治疗效率明显高于对照组，也就说明了本发明的脐血间质干细胞药物在促进膝关节软骨再生中能取到很好的效果，疗效显著。
Claims (8)
1.一种脐血间质干细胞药物在促进膝关节软骨再生中的应用，其特征在于，所述脐血间质干细胞药物按照重量百分比包括：7-9％脐血间质干细胞、1-3％软骨细胞、14-17％透明质酸凝胶、3-4％复合纳米纤维素、15-20％基质液、9-11％中药提取物缓释微球，余量微液泡润滑液；
所述基质液按照重量百分比包括：1-3％硫酸软骨素、12.2-17.0％胶原、2.5-3.4％弹性蛋白、2.7-3.3％蛋白聚糖、4.5-5.0％右旋糖酐、15.6-17.8％维生素D、0.5-1.2％细胞黏附分子、0.4-1.0％葡萄醛酸、0.3-0.6％尿囊素、2.1-2.6％骨形态发生蛋白、1.0-3.0％细胞生长因子，余量为平衡盐溶液；
所述微液泡润滑液按照重量百分比包括：3-5％聚乙二醇、8-12％甘油、1-3％肉豆蔻酸异丙酯、36-38％温敏型纳米凝胶、2-4％葡萄糖乳酸钙、1-3％非离子表面活性剂，余量为去离子水。
2.如权利要求1所述的一种脐血间质干细胞药物在促进膝关节软骨再生中的应用，其特征在于，所述复合纳米纤维素是由多肽纳米纤维、纳米结晶纤维素、季铵化纳米纤维素、按照重量比为3:2:1组成。
3.如权利要求2所述的一种脐血间质干细胞药物在促进膝关节软骨再生中的应用，其特征在于，所述复合纳米纤维素经过肝素活化处理。
4.如权利要求1所述的一种脐血间质干细胞药物在促进膝关节软骨再生中的应用，其特征在于，所述复合纳米纤维素是由多肽纳米纤维、纳米结晶纤维素、季铵化纳米纤维素、按照重量比为3:2:1组成，所述复合纳米纤维素经过肝素活化处理。
5.如权利要求1所述的一种脐血间质干细胞药物在促进膝关节软骨再生中的应用，其特征在于，所述中药提取物缓释微球按照包括以下重量组份：5-8份没药提取物、4-6份威灵仙提取物、3-5份两头尖提取物、1-2份桂皮提取物、3-4份粉萆薢提取物、7-9份野荞麦根提取物、10-14份鹿茸提取物、3-5份鸡脚参提取物、4-6份黄花稔提取物、7-11份马尾伸筋提取物、1-2份蛏肉提取物、7-9份苍术提取物、3-5份紫河车提取物、100-200份海藻酸钠溶液、60-80份聚谷氨酸、20-30份氯化钙溶液、40-50份柠檬酸钠溶液。
6.如权利要求5所述的一种脐血间质干细胞药物在促进膝关节软骨再生中的应用，其特征在于，所述中药提取物缓释微球的制备方法包括以下步骤：
S1：按照上述比例将没药提取物、威灵仙提取物、两头尖提取物、桂皮提取物、粉萆薢提取物、野荞麦根提取物、鹿茸提取物、鸡脚参提取物、黄花稔提取物、马尾伸筋提取物、蛏肉提取物、苍术提取物、紫河车提取物分别与体积分数为1-3％的所述海藻酸钠溶液混合均匀，得到悬液；
S2：利用静脉滴注管向所述悬液中滴注摩尔浓度为120-130mmol/L的所述氯化钙溶液，滴注速度为60-80滴/min，搅拌速度为120-300r/min，得到海藻酸钙微胶珠；
S3：向所述海藻酸钙微胶珠中加入所述聚谷氨酸，并搅拌均匀后，在室温下成膜反应20-30min，得到非液化的藻酸钙-聚谷氨酸包膜微珠；
S4：最后向所述藻酸钙-聚谷氨酸包膜微珠中加入体积分数为60-70mmol/L的柠檬酸钠溶液进行液化处理，最后得到中药提取物缓释微球。
7.如权利要求1所述的一种脐血间质干细胞药物在促进膝关节软骨再生中的应用，其特征在于，所述微液泡润滑液的制备方法包括以下步骤：
S1：将所述聚乙二醇、甘油、肉豆蔻酸异丙酯按照上述比例进行混合均匀，得到油相，备用；再将所述葡萄糖乳酸钙溶解与所述去离子水中，得到水相，备用；将所述非离子表面活性剂加入到所述温敏型纳米凝胶中，在20-25℃下搅拌3-5min，得到活化温敏型纳米凝胶，备用；
S2：将所述活化温敏型纳米凝胶装入烧杯内，再将十字圆形微通道的下端口通入所述烧杯内，所述油相接入十字圆形微通道的左端口，所述水相接入所述十字圆形微通道的右端口，在十字圆形微通道的上端口接入氮气鼓入机，油相和水相从左右两端的圆形微通道进入后，在中间的圆形混合区混合，形成乳相，并通过氮气进行冲击，产生微液泡，最后通入装有活化温敏型纳米凝胶的烧杯内，进行稳化，得到微液泡润滑液；其中，油相的表观流速为0.1-0.5m/s，水相的表观流速为0.2-1m/s，氮气的表观流速为0.4-4m/s。
8.如权利要求1所述的一种脐血间质干细胞药物在促进膝关节软骨再生中的应用，其特征在于，所述脐血间质干细胞药物的制备方法包括以下步骤：
(1)肝素活化复合纳米纤维素：将5-10mg的肝素溶解于pH值为5-6.5，浓度为2.2-3.0mol/L，体积为100-500ml的PBS缓冲溶液，再加入0.05-0.2mg的N,N-二环己基碳二亚胺，在25-30℃下搅拌混合20-30min；再将所述复合纳米纤维素加入其中，进行浸泡2-4h，最后进行过滤、冷冻干燥，得到肝素活化复合纳米纤维素；
(2)细胞基体的制备：按照上述比例将硫酸软骨素、胶原、弹性蛋白、蛋白聚糖、右旋糖酐、维生素D、细胞黏附分子、葡萄醛酸、尿囊素、骨形态发生蛋白、细胞生长因子、平衡盐溶液，进行混合，制成基质液，备用；再将步骤(1)制备的肝素活化复合纳米纤维素与所述透明质酸凝胶进行混合均匀，然后再加入从细胞资源库中提取的所述脐血间质干细胞和软骨细胞，最后，加入所述基质液，放入4℃的冰箱中进行冷藏，得到细胞基体；
(3)中药提取物缓释微球的制备：
S1：按照上述比例将没药提取物、威灵仙提取物、两头尖提取物、桂皮提取物、粉萆薢提取物、野荞麦根提取物、鹿茸提取物、鸡脚参提取物、黄花稔提取物、马尾伸筋提取物、蛏肉提取物、苍术提取物、紫河车提取物分别与体积分数为1-3％的所述海藻酸钠溶液混合均匀，得到悬液；
S2：利用静脉滴注管向所述悬液中滴注摩尔浓度为120-130mmol/L的所述氯化钙溶液，滴注速度为60-80滴/min，搅拌速度为120-300r/min，得到海藻酸钙微胶珠；
S3：向所述海藻酸钙微胶珠中加入所述聚谷氨酸，并搅拌均匀后，在室温下成膜反应20-30min，得到非液化的藻酸钙-聚谷氨酸包膜微珠；
S4：最后向所述藻酸钙-聚谷氨酸包膜微珠中加入体积分数为60-70mmol/L的柠檬酸钠溶液进行液化处理，最后得到中药提取物缓释微球；
(4)微液泡润滑液的制备：
S1：将所述聚乙二醇、甘油、肉豆蔻酸异丙酯按照上述比例进行混合均匀，得到油相，备用；再将所述葡萄糖乳酸钙溶解与所述去离子水中，得到水相，备用；将所述非离子表面活性剂加入到所述温敏型纳米凝胶中，在20-25℃下搅拌3-5min，得到活化温敏型纳米凝胶，备用；
S2：将所述活化温敏型纳米凝胶装入烧杯内，再将十字圆形微通道的下端口通入所述烧杯内，所述油相接入十字圆形微通道的左端口，所述水相接入所述十字圆形微通道的右端口，在十字圆形微通道的上端口接入氮气鼓入机，油相和水相从左右两端的圆形微通道进入后，在中间的圆形混合区混合，形成乳相，并通过氮气进行冲击，产生微液泡，最后通入装有活化温敏型纳米凝胶的烧杯内，进行稳化，得到微液泡润滑液；其中，油相的表观流速为0.1-0.5m/s，水相的表观流速为0.2-1m/s，氮气的表观流速为0.4-4m/s；
(6)试剂成型：将所述细胞基体、中药提取物缓释微球、中药提取物缓释微球按照上述比例进行混合，用5ml或10ml玻璃瓶进行分批定容成注射剂，并进行密封，置于4℃的冰箱中进行冷藏。
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