CN115282341B - 一种具有多肽双向梯度分布表面的多孔金属材料及其制备方法与应用 - Google Patents

一种具有多肽双向梯度分布表面的多孔金属材料及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有多肽双向梯度分布表面的多孔金属材料及其制备方法与应用。本发明方法为：设计并制备包括具有凸起的第一模块和具有凹槽的第二模块多孔金属支架，第一模块和第二模块可通过凸起和凹槽的配合，组装形成一体式多孔金属支架；将第一模块和第二模块羟基化处理，然后分别竖直置于反应器中，凸起和凹槽朝下，向反应器中匀速加入生物活性多肽溶液，并于T时间内恰好浸没材料；清洗，组装，即可。本发明可以利用简单的组装在多孔金属支架上双向梯度接枝生物活性多肽，并通过比较不同斜率下细胞的迁移距离筛选出促进细胞迁移的最佳梯度接枝斜率。该多孔金属支架具有促进细胞向支架内迁移的功能，在修复大段骨缺损中起到显著的优化作用。

Description

一种具有多肽双向梯度分布表面的多孔金属材料及其制备方 法与应用
技术领域
本发明属于生物材料表面改性技术领域，具体涉及一种具有多肽双向梯度分布表面的多孔金属材料及其制备方法与应用。
背景技术
由创伤、严重感染、肿瘤切除和先天性骨骼异常引起的骨缺损的重建是骨科手术的主要治疗挑战。骨缺损的修复方法主要为骨移植，骨移植在临床上主要包含自体骨移植、异种骨移植、同种异体骨移植。自体骨移植使用相关的问题包括组织可用性、疾病传播、供体发病率和高成本。
随着组织工程的发展，3D打印的金属多孔支架在生物医学方面的应用逐渐增多。3D打印可以制备出具有精确尺寸及形貌的支架，而多孔的结构也有利于营养物质的运输和组织的生长。然而单纯的金属支架面临着表面缺少生物活性物质导致骨结合弱、细胞增殖分化能力差的缺点，为了克服这些缺点，需要对支架表面进行改性。传统的改性方法是在支架上均匀覆盖生物活性涂层。但是，均匀涂层在小部位骨缺损修复中，可以起到较好的效果；而面对大段骨缺损修复时，细胞难以迁移到支架内部，使支架内部缺少血管的长入，导致营养缺失，骨愈合困难。
发明内容
为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种具有多肽双向梯度分布表面的多孔金属材料的制备方法。该方法通过3D打印制备出具有过盈连接和螺纹连接的组装支架，制备简单，能够在多孔材料表面构建出双向的生物活性多肽接枝梯度，有效诱导细胞在材料内部的迁移，加速植入体骨修复。
本发明的另一目的在于提供一种具有多肽双向梯度分布表面的多孔金属材料。
本发明的再一目的在于提供上述具有多肽双向梯度分布表面的多孔金属材料在制备骨修复材料中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种具有多肽双向梯度分布表面的多孔金属材料的制备方法，包括如下步骤：
S1、设计并制备多孔金属支架，所述多孔金属支架包括具有凸起的第一模块和具有凹槽的第二模块；所述凸起和凹槽的厚度相等；所述第一模块和第二模块可通过凸起和凹槽的配合，组装形成一体式多孔金属支架；
S2、将第一模块和第二模块分别进行羟基化处理；
S3、将羟基化处理后的第一模块和第二模块分别竖直置于反应器中，凸起和凹槽朝下，向反应器中匀速加入生物活性多肽溶液，并于T时间内恰好浸没材料；对材料进行清洗，组装，即得到具有多肽双向梯度分布表面的多孔金属材料。
优选地，步骤S1中所述的配合为过盈连接或螺纹连接。过盈连接即凸起部分为梯形插入块，插入凹槽后连接牢固，但不可再次分离；螺纹连接即凸起部分为插入块，凹槽是可供插入块转入的滑轨，滑轨上可添加凸起防止插入块滑动。
优选地，步骤S1中所述的第一模块和第二模块均为具有多层有序三维多孔网结构的柱状体，细丝直径为0.1～4mm，孔径大小为0.1～1mm，底面直径为4～20mm，高度为3～15mm，底面形状及孔形状可以是圆形、矩形或其他多边形；进一步优选地，细丝直径为0.1～0.3mm，孔径大小为0.2～0.6mm，底面直径为4～10mm，高度为4～10mm。
优选地，步骤S1中所述的第一模块和第二模块可通过3D打印技术制备得到。
进一步优选地，所述的3D打印技术操作如下：(1)准备Ti-6Al-4V粉末；
(2)采用激光熔融烧结法，根据构建的模型激光烧结Ti-6Al-4V粉末，3D打印得到所述具有凸起的第一模块和具有凹槽的第二模块。
优选地，步骤S2中所述的羟基化可通过酸腐蚀方法实现。
进一步优选地，所述的酸腐蚀方法操作如下：用去离子水、丙酮、无水乙醇、去离子水依次超声清洗材料10～20min，氮气吹干；将材料浸泡在0.1％～30％的HF酸中处理1～240min，用超纯水清洗支架，以除去残留的氟离子；将材料浸泡在65％浓硝酸中1～240min，用超纯水清洗支架，氮气吹干，备用。
优选地，步骤S3中所述的生物活性多肽溶液中的生物活性多肽包括但不仅限于N端CPAPAP修饰的QK(IGKYKLQYLEQWTLK))、RGD和YIGSR，结构式分别如图3、图4、图5所示。
优选地，步骤S3中所述的生物活性多肽溶液的浓度为5～2000μM；进一步优选为50～200μM。
优选地，步骤S3中所述的T时间范围为1min～1200min；进一步优选为3h～5h。
一种具有多肽双向梯度分布表面的多孔金属材料，通过上述制备方法得到。
上述具有多肽双向梯度分布表面的多孔金属材料在制备骨修复材料中的应用。
优选地，所述的骨修复材料为大段骨缺损修复材料。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明方法简单，能够利用简单的组装得到具有多肽双向梯度分布表面的3D打印多孔金属材料，材料表面接枝密度中间大，两端小；
(2)通过本发明所述方法制备的多肽双向梯度分布表面的3D打印多孔金属材料具有诱导细胞向支架内迁移的功能，即细胞会向多肽接枝密度增加的方向迁移，且有效迁移距离显著性增大，在修复大段骨缺损中起到显著的优化作用；
(3)本发明能够快速确定生物活性多肽在材料表面的梯度接枝斜率，通过比较不同斜率下细胞的迁移距离，筛选出诱导细胞迁移的最佳梯度接枝斜率。
附图说明
图1为本发明3D打印的多孔金属支架；其中a为以底面为10mm的六边形，5mm高度为例的过盈连接的设计方案，b为以底面为10mm的六边形，5mm高度为例的螺纹连接的设计方案；
图2为本发明在多孔金属支架表面制备生物活性多肽双向梯度接枝过程中的示意图；其中，1:生物活性多肽溶液；2:第一模块或第二模块；深色区域代表多肽接枝密度高；
图3为多肽QK的结构式；
图4为多肽RGD的结构式；
图5为多肽YIGSR的结构式。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例和对比例中涉及的生物材料及其来源如下：
人骨髓间充质干细胞(ATCC CRL-12424)；人脐静脉内皮细胞(ATCC CRL-2873)，神经细胞(ATCC CRL-9855)购买途径：VWR International,LLC,Pennsylvania,USA；
QK(CPAPAPIGKYKLQYLEQWTLK)，QK-FITC(CPAPAPIGKYKLQYLEQWTLK-FITC)，RGD(CPAPAPRGD)，RGD-FITC(CPAPAPRGD-FITC)，YIGSR(CPAPAPYIGSR)，YIGSR-FITC(CPAPAPYIGSR-FITC)多肽购买于上海强耀生物科技有限公司；
下述实施例中在支架上进行细胞迁移实验，利用鬼笔环肽(F-actin)以及DAPI标记染色，并利用激光共聚焦显微镜，观察细胞在支架上的迁移情况，具体步骤如下：
(1)将成功接枝生物活性多肽的组装支架放置于24孔板中，在超净台中浸泡于75％乙醇中2.5h，并开启紫外灭菌；经过PBS润洗3次，培养基润洗1次后，在孔板中加入200uL浓度为5×105个/mL的人骨髓间充质干细胞或人脐静脉内皮细胞或神经细胞悬液，静置培养8h；
(2)取出支架，转移至新的24孔板，用PBS清洗支架后，倒转支架，重复步骤(1)中细胞悬液的加入，静置培养8h；
(3)取出步骤(2)中的支架，倒转支架，加入2mL培养基使其浸没支架，静置培养5天，隔一天换一次培养基使细胞有充足的营养物质；
(4)取出支架，用PBS清洗，然后用4％多聚甲醛在4℃冰箱固定过夜；
(5)将固定后的支架清洗，在鬼笔环肽(F-actin)溶液中浸泡2h，清洗样品；将支架浸泡在DAPI溶液中8min，清洗支架；
(6)在激光共聚焦显微镜下，利用409nm和488nm通道观察步骤(5)的支架每个区域的细胞的分布情况、细胞粘附数量以及支架上细胞总体的最远迁移距离，确定促进细胞迁移的最佳梯度斜率。
下述实施例中采用的第一模块和第二模块的高度均为5mm(组装形成一体式多孔金属支架总高10mm)，底面形状为正六边形，六边形外接圆半径为5mm，细丝直径为0.2mm，孔径大小为0.4mm(第一模块和第二模块式使用前用去离子水、丙酮、无水乙醇、去离子水依次超声清洗材料10～20min，氮气吹干)。
下述实施例中采用的浓硝酸是指浓度为65％的硝酸溶液。
下述实施例中接枝密度的计算方法：
(1)将1μL浓度为0.2～1000μM的QK-FITC或RGD-FITC或YIGSR-FITC的去离子水溶液直接加入到3D打印多孔金属材料表面(5mm×5mm)，计算出表面荧光分子的表面密度，0.1～40个/nm2；
(2)通过荧光显微镜测量制备的表面的荧光强度MFI，从而得到MFI与表面荧光分子密度的标准曲线，即MFI-Density标准函数；
(3)参照标准函数，通过荧光显微镜测量待测材料表面的荧光强度，可以计算出表面接枝密度。
下述实施例中梯度接枝斜率的计算方法：
(1)将前面的反应中多肽溶液恰好浸没材料的时间计为T；
(2)将组装好的支架自一端向另一端划分为n个区域，区域标号为1～n(在下述实施例中，n的取值为10)；各个区域内的接枝时间按如下公式进行计算：t＝k/n*T；
(3)通过上述接枝密度的计算方法确定各个区域内的接枝密度；
(4)以各个区域内的接枝时间为横坐标，以各个区域内的接枝密度为纵坐标绘制曲线，所得曲线的斜率即为梯度接枝斜率。
实施例1
一种具有多肽双向梯度分布表面的3D打印多孔金属材料的制备方法，步骤如下：
(1)将第一模块和第二模块用30％HF酸处理1min，用超纯水超声清洗5min，去除表面残留的氟离子。
(2)将步骤(1)的第一模块和第二模块放入浓硝酸当中浸泡240min，获得反应足够的羟基，用超纯水冲洗干净，氮气吹干。
(3)配置浓度为2000μM的多肽溶液，使用水作为溶剂，配置QK-FITC多肽的水溶液。
(4)将第一模块和第二模块竖直置于24孔板中，凸起和凹槽朝下，用5mL注射器吸取步骤(3)所述的QK-FITC溶液1mL，以50μl/h速度垂直注入孔中，溶液自下而上逐渐升高，在20h范围内恰好浸没材料，注射过程示意图如图2所示。
(5)反应20h后，取出步骤(4)所述的第一模块和第二模块，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。将组装好的支架自一端向另一端划分为10个区域，区域标号为1～10。
(6)在支架材料表面滴加水膜，在荧光显微镜下观察每个区域的荧光，统计荧光值，绘制MFI值变化柱状图，根据标准曲线绘制接枝密度梯度斜率，材料表面具有均匀的荧光强度，斜率为0。可能是因为接枝时间过长，材料表面荧光饱和呈均匀状态。
(7)配置浓度为2000μM的QK多肽溶液，使用去离子水作为溶剂，配置QK多肽的水溶液。
(8)用5mL注射器吸取步骤(3)所述的QK溶液1mL，以50μl/h速度，接枝20h，注射过程示意图如图2所示。
(9)反应20h后，取出步骤(8)所述的3D打印支架，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(10)将步骤(9)所述的3D打印组装支架使用细胞迁移法进行人脐静脉内皮细胞的迁移距离表征，观察每个区域的细胞生长情况，以及支架上细胞自两端向中心的迁移距离。经过观察发现，细胞多分布于区域1、2、9、10，在区域1和区域10细胞数量较多，细胞密集生长，在区域2和区域9细胞数量减少，呈现出向该两个区域迁移的趋势，其余区域仅有零散的细胞分布。经确定，其最远迁移距离为4.1mm，支架总距离为10mm。
实施例2
一种具有多肽双向梯度分布表面的3D打印多孔金属材料的制备方法，步骤如下：
(1)将第一模块和第二模块利用4％HF酸处理240min，用超纯水超声清洗5min，去除表面残留的氟离子。
(2)将步骤(1)的第一模块和第二模块放入浓硝酸当中浸泡15min，获得反应足够的羟基，用超纯水冲洗干净，氮气吹干。
(3)配置浓度为5μM的多肽溶液，使用水作为溶剂，配置QK-FITC多肽的水溶液。
(4)将第一模块和第二模块竖直置于24孔板中，凸起和凹槽朝下，用5mL注射器吸取步骤(3)所述的QK-FITC溶液1mL，以500μl/h速度垂直注入孔中，溶液自下而上逐渐升高，在2h范围内恰好浸没材料，注射过程示意图如图2所示。
(5)反应2h后，取出步骤(4)所述的3D打印支架，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。将组装好的支架自一端向另一端划分为10个区域，区域标号为1～10。
(6)在支架材料表面滴加水膜，在荧光显微镜下观察每个区域的荧光，统计荧光值，绘制MFI值变化柱状图，根据标准曲线绘制接枝密度的梯度斜率，斜率为0.51和-0.51，且整体的荧光值较弱，接枝密度较低，可能是因为接枝多肽的浓度低。
(7)配置浓度为5μM的QK多肽溶液，使用去离子水作为溶剂，配置QK多肽的水溶液。
(8)将第一模块和第二模块竖直置于24孔板中，凸起和凹槽朝下，用5mL注射器吸取步骤(3)所述的QK溶液1mL，以0.5μl/h速度垂直注入孔中，溶液自下而上逐渐升高，在2h范围内恰好浸没材料，注射过程示意图如图2所示。
(9)反应2h后，取出步骤(8)所述的第一模块和第二模块，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(10)将步骤(9)所述的3D打印组装支架使用细胞迁移法进行人脐静脉内皮细胞的迁移距离表征，观察每个区域的细胞生长情况，以及支架上细胞自两端向中心的迁移距离。观察发现，细胞多分布于区域1和区域10，其他区域细胞数量较少，区域1和区域10上的细胞数量多，呈现迁移的凸起趋势，但未能完全填满该两个区域。经确定其最远迁移距离为2.06mm，支架总距离为10mm。
实施例3
一种具有多肽双向梯度分布表面的3D打印多孔金属材料的制备方法，步骤如下：
(1)将第一模块和第二模块利用4％HF酸处理5min，用超纯水超声清洗5min，去除表面残留的氟离子。
(2)将步骤(1)的第一模块和第二模块放入浓硝酸当中浸泡15min，获得反应足够的羟基，用超纯水冲洗干净，氮气吹干。
(3)配置浓度为100μM的多肽溶液，使用水作为溶剂，配置QK-FITC多肽的水溶液。
(4)将第一模块和第二模块竖直置于24孔板中，凸起和凹槽朝下，用5mL注射器吸取步骤(3)所述的QK-FITC溶液1mL，以333μl/h速度，溶液自下而上逐渐升高，在3h范围内恰好浸没材料，注射过程示意图如图2所示。
(5)反应3h后，取出步骤(4)所述的3D打印支架，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。将组装好的支架自一端向另一端划分为10个区域，区域标号为1～10。
(6)在支架材料表面滴加水膜，在荧光显微镜下观察每个区域的荧光，统计荧光值，绘制MFI值变化柱状图，根据标准曲线绘制接枝密度的梯度斜率，斜率为1.35和-1.35，材料表面荧光强度高，整体明亮。
(7)配置浓度为100μM的QK多肽溶液，使用去离子水作为溶剂，配置QK多肽的水溶液。
(8)将第一模块和第二模块竖直置于24孔板中，凸起和凹槽朝下，用5mL注射器吸取步骤(3)所述的QK溶液1mL，以333μl/h速度，溶液自下而上逐渐升高，在3h范围内恰好浸没材料，注射过程示意图如图2所示。
(9)反应3h后，取出步骤(8)所述的第一模块和第二模块，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(10)将步骤(9)所述的3D打印组装支架使用细胞迁移法进行人脐静脉内皮细胞的迁移距离表征，观察每个区域的细胞生长情况，以及支架上细胞自两端向中心的迁移距离。观察发现，细胞分布在区域1、2、3、8、9、10，区域1、2、9、10上细胞密集生长，几乎将该4个区域全部填满，在区域3和区域8上，细胞呈现向中心迁移的凸起趋势，数量较多，能够占据该两个区域一半面积，其余区域仅有零散细胞。经确定其最远迁移距离为5.12mm，支架总距离为10mm。
实施例4
一种具有多肽双向梯度分布表面的3D打印多孔金属材料的制备方法，步骤如下：
(1)将第一模块和第二模块利用4％HF酸处理5min，用超纯水超声清洗5min，去除表面残留的氟离子。
(2)将步骤(1)的第一模块和第二模块放入浓硝酸当中浸泡15min，获得反应足够的羟基，用超纯水冲洗干净，氮气吹干。
(3)配置浓度为100μM的多肽溶液，使用水作为溶剂，配置QK-FITC多肽的水溶液。
(4)将第一模块和第二模块竖直置于24孔板中，凸起和凹槽朝下，用5mL注射器吸取步骤(3)所述的QK-FITC溶液1mL，以250μl/h速度垂直注入孔中，溶液自下而上逐渐升高，在4h范围内恰好浸没材料，注射过程示意图如图2所示。
(5)反应4h后，取出步骤(4)所述的第一模块和第二模块，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。将组装好的支架自一端向另一端划分为10个区域。
(6)在支架材料表面滴加水膜，在荧光显微镜下观察每个区域的荧光，统计荧光值，绘制MFI值变化柱状图，根据标准曲线绘制接枝密度的梯度斜率，斜率为2.20和-2.20，材料表面整体明亮，荧光值较高。
(7)配置浓度为100μM的QK多肽溶液，使用去离子水作为溶剂，配置QK多肽的水溶液。
(8)用5mL注射器吸取步骤(3)所述的QK溶液1mL，以250μl/h速度垂直注入孔中，溶液自下而上逐渐升高，在4h范围内恰好浸没材料，注射过程示意图如图2所示。
(9)反应4h后，取出步骤(8)所述的3D打印支架，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(10)将步骤(9)所述的3D打印组装支架使用细胞迁移法进行人脐静脉内皮细胞的迁移距离表征，观察每个区域的细胞生长情况，以及支架上细胞自两端向中心的迁移距离。观察发现，细胞在区域1～10均有分布，细胞在区域1～4及区域7～10数量最多，在该区域密集生长，几乎填满整个区域，在区域5和区域6，细胞呈现向中心迁移的凸起趋势，在该两个区域，细胞数量较少，但仍能够看出细胞自两端向中心迁移的数量由多至少的趋势。经确定其最远迁移距离为8.25mm，支架总距离为10mm。
实施例5
一种具有多肽双向梯度分布表面的3D打印多孔金属材料的制备方法，步骤如下：
(1)将第一模块和第二模块利用4％HF酸处理5min，用超纯水超声清洗5min，去除表面残留的氟离子。
(2)将步骤(1)的第一模块和第二模块放入浓硝酸当中浸泡15min，获得反应足够的羟基，用超纯水冲洗干净，氮气吹干。
(3)配置浓度为100μM的多肽溶液，使用水作为溶剂，配置QK-FITC(CPAPAPIGKYKLQYLEQWTLK-FITC)多肽的水溶液。
(4)将第一模块和第二模块竖直置于24孔板中，凸起和凹槽朝下，用5mL注射器吸取步骤(3)所述的QK-FITC溶液1mL，以200μl/h速度垂直注入孔中，溶液自下而上逐渐升高，在5h范围内恰好浸没材料，注射过程示意图如图2所示。
(5)反应5h后，取出步骤(4)所述的第一模块和第二模块，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。将组装好的支架自一端向另一端划分为10个区域。
(6)在支架材料表面滴加水膜，在荧光显微镜下观察每个区域的荧光，统计荧光值，绘制MFI值变化柱状图，根据标准曲线绘制接枝密度的梯度斜率，斜率为2和-2。
(7)配置浓度为100μM的QK多肽溶液,使用去离子水作为溶剂，配置QK多肽的水溶液。
(8)将第一模块和第二模块竖直置于24孔板中，凸起和凹槽朝上，用5mL注射器吸取步骤(3)所述的QK溶液1mL，以200μl/h速度垂直注入孔中，溶液自下而上逐渐升高，在5h范围内恰好浸没材料，注射过程示意图如图2所示。
(9)反应5h后，取出步骤(8)所述的第一模块和第二模块，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(10)将步骤(9)所述的3D打印组装支架使用细胞迁移法进行人脐静脉内皮细胞的迁移距离表征，观察每个区域的细胞生长情况，以及支架上细胞自两端向中心的迁移距离。观察发现，细胞在区域1～10均有分布，细胞在区域1～3及区域8～10数量最多，在该区域密集生长，几乎填满整个区域，在区域4和区域7，细胞呈现向中心迁移的凸起趋势，在该两个区域，细胞分布占据一半区域，细胞数量较多，但并不密集，仍能够看出细胞自两端向中心迁移的数量由多至少的趋势。经确定其最远迁移距离为7.16mm，支架总距离为10mm。
实施例6
一种具有多肽双向梯度分布表面的3D打印多孔金属材料的制备方法，步骤如下：
(1)将第一模块和第二模块利用4％HF酸处理5min，用超纯水超声清洗5min，去除表面残留的氟离子。
(2)将步骤(1)的第一模块和第二模块放入浓硝酸当中浸泡15min，获得反应足够的羟基，用超纯水冲洗干净，氮气吹干。
(3)配置浓度为100μM的多肽溶液,使用水作为溶剂，配置QK-FITC(CPAPAPIGKYKLQYLEQWTLK-FITC)多肽的水溶液。
(4)将第一模块和第二模块竖直置于24孔板中，凸起和凹槽朝上，用5mL注射器吸取步骤(3)所述的QK-FITC溶液1mL，以167μl/h速度垂直注入孔中，溶液自下而上逐渐升高，在6h范围内恰好浸没材料，注射过程示意图如图2所示。
(5)反应6h后，取出步骤(4)所述的第一模块和第二模块，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。将组装好的支架自一端向另一端划分为10个区域，区域标号为1～10。
(6)在支架材料表面滴加水膜，在荧光显微镜下观察每个区域的荧光，统计荧光值，绘制MFI值变化柱状图，根据标准曲线绘制接枝密度的梯度斜率，斜率为1.97和-1.97。
(7)配置浓度为100μM的QK多肽溶液，使用去离子水作为溶剂，配置QK多肽的水溶液。
(8)将第一模块和第二模块竖直置于24孔板中，凸起和凹槽朝上，用5mL注射器吸取步骤(3)所述的QK溶液1mL，以167μl/h速度垂直注入孔中，溶液自下而上逐渐升高，在2h范围内恰好浸没材料，注射过程示意图如图2所示。
(9)反应6h后，取出步骤(8)所述的第一模块和第二模块，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(10)将步骤(9)所述的3D打印组装支架使用细胞迁移法进行人脐静脉内皮细胞的迁移距离表征，观察每个区域的细胞生长情况，以及支架上细胞自两端向中心的迁移距离。观察发现，细胞在区域1～10均有分布，细胞在区域1～3及区域8～10数量最多，在该区域密集生长，几乎填满整个区域，在区域4和区域7，细胞呈现向中心迁移的凸起趋势，在该两个区域，细胞分布区域的面积较少，细胞整体数量少，并不密集，但仍能够看出细胞自两端向中心迁移的数量由多至少的趋势。经确定其最远迁移距离为6.48mm，支架总距离为10mm。
实施例7
一种具有多肽双向梯度分布表面的3D打印多孔金属材料的制备方法，步骤如下：
(1)将第一模块和第二模块利用0.1％HF酸处理5min，用超纯水超声清洗5min，去除表面残留的氟离子。
(2)将步骤(1)的第一模块和第二模块放入浓硝酸当中浸泡1min，获得反应足够的羟基，用超纯水冲洗干净，氮气吹干。
(3)配置浓度为100μM的多肽溶液，使用水作为溶剂，配置QK-FITC多肽的水溶液。
(4)将第一模块和第二模块竖直置于24孔板中，凸起和凹槽朝下，用5mL注射器吸取步骤(3)所述的QK-FITC溶液1mL，以1mL/min速度垂直注入孔中，溶液自下而上逐渐升高，在1min范围内恰好浸没材料，注射过程示意图如图2所示。
(5)反应1min后，取出步骤(4)所述的第一模块和第二模块，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。将组装好的支架自一端向另一端划分为10个区域。
(6)在支架材料表面滴加水膜，在荧光显微镜下观察每个区域的荧光，统计荧光值，绘制MFI值变化柱状图，根据标准曲线绘制接枝密度的梯度斜率，斜率为0，材料表面几乎没有荧光，可能的原因有酸蚀过程中氢氟酸的浓度太低以及浓硝酸的浸泡时间过短，导致材料表面的羟基数量少，还可能因为多肽的接枝时间过短，多肽未能接枝到材料表面。
(7)配置浓度为100μM的QK多肽溶液，使用去离子水作为溶剂，配置QK多肽的水溶液。
(8)将第一模块和第二模块竖直置于24孔板中，凸起和凹槽朝下，用5mL注射器吸取步骤(3)所述的QK溶液1mL，以1mL/min速度垂直注入孔中，溶液自下而上逐渐升高，在1min范围内恰好浸没材料，注射过程示意图如图2所示。
(9)反应1min后，取出步骤(8)所述的第一模块和第二模块，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(10)将步骤(9)所述的3D打印组装支架使用细胞迁移法进行人脐静脉内皮细胞的迁移距离表征，观察每个区域的细胞生长情况，以及支架上细胞自两端向中心的迁移距离。观察发现，材料表面几乎没有细胞，在区域1和区域10有零散的细胞在材料表面，但细胞数量少，且细胞分布零散并不密集，未呈现迁移的趋势。经确定其最远迁移距离为0mm，支架总距离为10mm，材料表面未能成功接枝多肽，细胞并未迁移。
实施例8
一种具有多肽双向梯度分布表面的3D打印多孔金属材料的制备方法，步骤如下：
(1)将第一模块和第二模块利用4％HF酸处理5min，用超纯水超声清洗5min，去除表面残留的氟离子。
(2)将步骤(1)的第一模块和第二模块放入浓硝酸当中浸泡15min，获得反应足够的羟基，用超纯水冲洗干净，氮气吹干。
(3)配置浓度为100μM的多肽溶液，使用水作为溶剂，配置RGD-FITC多肽的水溶液。
(4)将第一模块和第二模块竖直置于24孔板中，凸起和凹槽朝下，用5mL注射器吸取步骤(3)所述的RGD-FITC溶液1mL，以250μl/h速度垂直注入孔中，溶液自下而上逐渐升高，在4h范围内恰好浸没材料，注射过程示意图如图2所示。
(5)反应4h后，取出步骤(4)所述的第一模块和第二模块，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(6)在支架材料表面滴加水膜，在荧光显微镜下观察每个区域的荧光，统计荧光值，绘制MFI值变化柱状图，根据标准曲线绘制接枝密度的梯度斜率，斜率为1.74和-1.74，整体荧光强度高，材料表面明亮。
(7)配置浓度为100μM的RGD多肽溶液，使用去离子水作为溶剂，配置RGD多肽的水溶液。
(8)将第一模块和第二模块竖直置于24孔板中，凸起和凹槽朝下，用5mL注射器吸取步骤(3)所述的RGD溶液1mL，以250μl/h速度垂直注入孔中，溶液自下而上逐渐升高，在4h范围内恰好浸没材料，注射过程示意图如图2所示。
(9)反应4h后，取出步骤(8)所述的第一模块和第二模块，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(10)将步骤(9)所述的3D打印组装支架使用细胞迁移法进行人骨髓间充质干细胞的迁移距离表征，观察每个区域的细胞生长情况，以及支架上细胞自两端向中心的迁移距离。观察发现，细胞在区域1～10均有分布，细胞在区域1～3及区域8～10数量最多，在该区域密集生长，几乎填满整个区域，在区域4和区域7，细胞呈现向中心迁移的凸起趋势，在该两个区域，细胞最远迁移距离几乎可以跨越整个区域，该两个区域的细胞数量多，迁移区域明显，能够看出细胞自两端向中心迁移的数量由多至少的趋势，区域5和区域6仅有零散细胞分布。经确定其最远迁移距离为7.8mm，支架总距离为10mm。
实施例9
一种具有多肽双向梯度分布表面的3D打印多孔金属材料的制备方法，步骤如下：
(1)将第一模块和第二模块利用4％HF酸处理5min，用超纯水超声清洗5min，去除表面残留的氟离子。
(2)将步骤(1)的第一模块和第二模块放入浓硝酸当中浸泡15min，获得反应足够的羟基，用超纯水冲洗干净，氮气吹干。
(3)配置浓度为100μM的多肽溶液,使用水作为溶剂，配置YIGSR-FITC(CPAPAPYIGSR-FITC)多肽的水溶液。
(4)将第一模块和第二模块竖直置于24孔板中，凸起和凹槽朝下，用5mL注射器吸取步骤(3)所述的YIGSR-FITC溶液1mL，以250μl/h速度垂直注入孔中，溶液自下而上逐渐升高，在4h范围内恰好浸没材料，注射过程示意图如图2所示。
(5)反应4h后，取出步骤(4)所述的第一模块和第二模块，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(6)在支架材料表面滴加水膜，在荧光显微镜下观察每个区域的荧光，统计荧光值，绘制MFI值变化柱状图，根据标准曲线绘制接枝密度的梯度斜率，斜率为1.53和-1.53，材料表面荧光强度整体偏弱。
(7)配置浓度为100μM的YIGSR多肽溶液,使用去离子水作为溶剂，配置YIGSR多肽的水溶液。
(8)将第一模块和第二模块竖直置于24孔板中，凸起和凹槽朝下，用5mL注射器吸取步骤(3)所述的YIGSR(CPAPAPYIGSR)溶液1mL，以250μl/h速度垂直注入孔中，溶液自下而上逐渐升高，在4h范围内恰好浸没材料，注射过程示意图如图2所示。
(9)反应4h后，取出步骤(8)所述的第一模块和第二模块，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(10)将步骤(9)所述的3D打印组装支架使用细胞迁移法进行神经细胞的迁移距离表征，观察每个区域的细胞生长情况，以及支架上细胞自两端向中心的迁移距离。观察发现，细胞分布在区域1～3、8～10，区域1、2、9、10上细胞密集生长，几乎将该4个区域全部填满，在区域3和区域8上，细胞呈现向中心迁移的凸起趋势，数量较多，能够占据该两个区域的大部分面积，其余区域仅有零散细胞。经确定其最远迁移距离为5.7mm，支架总距离为10mm。
对比例1
传统用于3D打印均匀接枝生物活性多肽的多孔金属支架的方法，步骤如下：
(1)将底面形状为正六边形、六边形外接圆半径为5mm，高度为10mm的3D打印多孔一体式金属支架利用4％HF酸处理5min，用超纯水超声清洗5min，去除表面残留的氟离子。
(2)将步骤(1)的3D打印支架放入浓硝酸当中浸泡15min，获得反应足够的羟基，用超纯水冲洗干净，氮气吹干。
(3)配置浓度为100μM的多肽溶液,使用水作为溶剂，配置QK-FITC多肽的水溶液。
(4)将支架浸泡在1mL步骤(3)所述的QK-FITC溶液中1h。
(5)反应1h后，取出步骤(4)所述的3D打印支架，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(6)在支架材料表面滴加水膜，在荧光显微镜下观察每个区域的荧光，统计荧光值，根据标准曲线计算材料表面的接枝密度。
(7)配置浓度为100μM的QK多肽溶液，使用去离子水作为溶剂，配置QK多肽的水溶液。
(8)将支架浸泡在1mL步骤(3)所述的QK溶液中1h。
(9)反应1h后，取出步骤(8)所述的3D打印支架，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(10)将步骤(9)所述的3D打印组装支架使用细胞迁移法进行人脐静脉内皮细胞的迁移距离表征，观察每个区域的细胞生长情况，以及支架上细胞自两端向中心的迁移距离。观察发现，材料表面细胞数量少，细胞仅分布在区域1和区域10，且该两个区域的细胞不密集，整体向中心迁移的趋势不明显。经确定其最远迁移距离为1.12mm，支架总距离为10mm。
对比例2
传统用于3D打印均匀接枝生物活性多肽的多孔金属支架的方法，步骤如下：
(1)将底面形状为正六边形、六边形外接圆半径为5mm，高度为10mm的3D打印多孔一体式金属支架利用4％HF酸处理5min，用超纯水超声清洗5min，去除表面残留的氟离子。
(2)将步骤(1)的3D打印支架放入浓硝酸当中浸泡15min，获得反应足够的羟基，用超纯水冲洗干净，氮气吹干。
(3)配置浓度为100μM的多肽溶液，使用水作为溶剂，配置QK-FITC多肽的水溶液。
(4)将支架浸泡在1mL步骤(3)所述的QK-FITC溶液中2h。
(5)反应2h后，取出步骤(4)所述的3D打印支架，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(6)在支架材料表面滴加水膜，在荧光显微镜下观察每个区域的荧光，统计荧光值，根据标准曲线计算材料表面的接枝密度。
(7)配置浓度为100μM的QK多肽溶液,使用去离子水作为溶剂，配置QK多肽的水溶液。
(8)将支架浸泡在1mL步骤(3)所述的QK溶液中2h。
(9)反应2h后，取出步骤(8)所述的3D打印支架，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(10)将步骤(9)所述的3D打印组装支架使用细胞迁移法进行人脐静脉内皮细胞的迁移距离表征，观察每个区域的细胞生长情况，以及支架上细胞自两端向中心的迁移距离。观察发现，细胞分布在区域1和区域10较多，该区域的细胞较为密集，其他区域有零散细胞，细胞数量少，整体的迁移趋势不明显，细胞向中心的迁移效果较差。经确定其最远迁移距离为2.26mm，支架总距离为10mm。
对比例3
传统用于3D打印均匀接枝生物活性多肽的多孔金属支架的方法，步骤如下：
(1)将底面形状为正六边形、六边形外接圆半径为5mm，高度为10mm的3D打印多孔一体式金属支架利用4％HF酸处理5min，用超纯水超声清洗5min，去除表面残留的氟离子。
(2)将步骤(1)的3D打印支架放入浓硝酸当中浸泡15min，获得反应足够的羟基，用超纯水冲洗干净，氮气吹干。
(3)配置浓度为100μM的多肽溶液,使用水作为溶剂，配置QK-FITC多肽的水溶液。
(4)将支架浸泡在1mL步骤(3)所述的QK-FITC溶液中3h。
(5)反应3h后，取出步骤(4)所述的3D打印支架，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(6)在支架材料表面滴加水膜，在荧光显微镜下观察每个区域的荧光，统计荧光值，根据标准曲线计算材料表面的接枝密度。
(7)配置浓度为100μM的QK多肽溶液,使用去离子水作为溶剂，配置QK多肽的水溶液。
(8)将支架浸泡在1mL步骤(3)所述的QK溶液中3h。
(9)反应3h后，取出步骤(8)所述的3D打印支架，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(10)将步骤(9)所述的3D打印组装支架使用细胞迁移法进行人脐静脉内皮细胞的迁移距离表征，观察每个区域的细胞生长情况，以及支架上细胞自两端向中心的迁移距离。观察发现，细胞多集中在区域1、2、9、10，其中区域1和区域10上细胞较为密集，其余区域的细胞数量较少，整体迁移趋势和实施例中梯度的接枝相比较差，迁移效果不明显。经确定其最远迁移距离为3.13mm，支架总距离为10mm。
对比例4
传统用于3D打印均匀接枝生物活性多肽的多孔金属支架的方法，步骤如下：
(1)将底面形状为正六边形、六边形外接圆半径为5mm，高度为10mm的3D打印多孔一体式金属支架利用4％HF酸处理5min，用超纯水超声清洗5min，去除表面残留的氟离子。
(2)将步骤(1)的3D打印支架放入浓硝酸当中浸泡15min，获得反应足够的羟基，用超纯水冲洗干净，氮气吹干。
(3)配置浓度为100μM的多肽溶液,使用水作为溶剂，配置QK-FITC多肽的水溶液。
(4)将支架浸泡在1mL步骤(3)所述的QK-FITC溶液中4h。
(5)反应4h后，取出步骤(4)所述的3D打印支架，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(6)在支架材料表面滴加水膜，在荧光显微镜下观察每个区域的荧光，统计荧光值，根据标准曲线计算材料表面的接枝密度。
(7)配置浓度为100μM的QK多肽溶液,使用去离子水作为溶剂，配置QK(CPAPAPIGKYKLQYLEQWTLK)多肽的水溶液。
(8)将支架浸泡在1mL步骤(3)所述的QK溶液中4h。
(9)反应4h后，取出步骤(8)所述的3D打印支架，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(10)将步骤(9)所述的3D打印组装支架使用细胞迁移法进行人脐静脉内皮细胞的迁移距离表征，观察每个区域的细胞生长情况，以及支架上细胞自两端向中心的迁移距离。观察发现，细胞分布在区域1、2、3、8、9、10，区域1和区域10上细胞密集生长，在区域2和区域9上，细胞呈现向中心迁移的凸起趋势，其余区域仅有零散细胞。但和实施例中4h梯度接枝相比，细胞的区域占比、细胞数量和细胞的迁移效果均更差，细胞在材料表面向中心迁移的趋势更差。经确定其最远迁移距离为4.12mm，支架总距离为10mm。
对比例5
传统用于3D打印均匀接枝生物活性多肽的多孔金属支架的方法，步骤如下：
(1)将底面形状为正六边形、六边形外接圆半径为5mm，高度为10mm的3D打印多孔一体式金属支架利用4％HF酸处理5min，用超纯水超声清洗5min，去除表面残留的氟离子。
(2)将步骤(1)的3D打印支架放入浓硝酸当中浸泡15min，获得反应足够的羟基，用超纯水冲洗干净，氮气吹干。
(3)配置浓度为100μM的多肽溶液,使用水作为溶剂，配置QK-FITC多肽的水溶液。
(4)将支架浸泡在1mL步骤(3)所述的QK-FITC溶液中5h。
(5)反应5h后，取出步骤(4)所述的3D打印支架，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(6)在支架材料表面滴加水膜，在荧光显微镜下观察每个区域的荧光，统计荧光值，根据标准曲线计算材料表面的接枝密度。
(7)配置浓度为100μM的QK多肽溶液,使用去离子水作为溶剂，配置QK多肽的水溶液。
(8)将支架浸泡在1mL步骤(3)所述的QK溶液中5h。
(9)反应5h后，取出步骤(8)所述的3D打印支架，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(10)将步骤(9)所述的3D打印组装支架使用细胞迁移法进行人脐静脉内皮细胞的迁移距离表征，观察每个区域的细胞生长情况，以及支架上细胞自两端向中心的迁移距离。观察发现，细胞分布在区域1、2、3、8、9、10，区域1和区域10上细胞密集生长，在区域2和区域9上，细胞呈现向中心迁移的凸起趋势，其余区域仅有零散细胞。但和实施例中5h梯度接枝相比，细胞的区域占比、细胞数量和细胞的迁移效果均更差，细胞在材料表面向中心迁移的趋势更差。经确定其最远迁移距离为4.08mm，支架总距离为10mm。
对比例6
传统用于3D打印均匀接枝生物活性多肽的多孔金属支架的方法，步骤如下：
(1)将底面形状为正六边形、六边形外接圆半径为5mm，高度为10mm的3D打印多孔一体式金属支架利用4％HF酸处理5min，用超纯水超声清洗5min，去除表面残留的氟离子。
(2)将步骤(1)的3D打印支架放入浓硝酸当中浸泡15min，获得反应足够的羟基，用超纯水冲洗干净，氮气吹干。
(3)配置浓度为100μM的多肽溶液,使用水作为溶剂，配置QK-FITC多肽的水溶液。
(4)将支架浸泡在1mL步骤(3)所述的QK-FITC溶液中6h。
(5)反应6h后，取出步骤(4)所述的3D打印支架，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(6)在支架材料表面滴加水膜，在荧光显微镜下观察每个区域的荧光，统计荧光值，根据标准曲线计算材料表面的接枝密度。
(7)配置浓度为100μM的QK多肽溶液,使用去离子水作为溶剂，配置QK多肽的水溶液。
(8)将支架浸泡在1mL步骤(3)所述的QK(CPAPAPIGKYKLQYLEQWTLK)溶液中6h。
(9)反应6h后，取出步骤(8)所述的3D打印支架，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(10)将步骤(9)所述的3D打印组装支架使用细胞迁移法进行人脐静脉内皮细胞的迁移距离表征，观察每个区域的细胞生长情况，以及支架上细胞自两端向中心的迁移距离。观察发现，细胞分布在区域1、2、3、8、9、10，区域1和区域10上细胞密集生长，在区域2和区域9上，细胞呈现向中心迁移的凸起趋势，其余区域仅有零散细胞。但和实施例中6h梯度接枝相比，细胞的区域占比、细胞数量和细胞的迁移效果均更差，细胞在材料表面向中心迁移的趋势更差。经确定其最远迁移距离为4.11mm，支架总距离为10mm。
对比例7
传统用于3D打印均匀接枝生物活性多肽的多孔金属支架的方法，步骤如下：
(1)将底面形状为正六边形、六边形外接圆半径为5mm，高度为10mm的3D打印多孔一体式金属支架利用4％HF酸处理5min，用超纯水超声清洗5min，去除表面残留的氟离子。
(2)将步骤(1)的3D打印支架放入浓硝酸当中浸泡15min，获得反应足够的羟基，用超纯水冲洗干净，氮气吹干。
(3)配置浓度为100μM的多肽溶液,使用水作为溶剂，配置RGD-FITC多肽的水溶液。
(4)将支架浸泡在1mL步骤(3)所述的RGD-FITC溶液中4h。
(5)反应4h后，取出步骤(4)所述的3D打印支架，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(6)在支架材料表面滴加水膜，在荧光显微镜下观察每个区域的荧光，统计荧光值，根据标准曲线计算材料表面的接枝密度。
(7)配置浓度为100μM的RGD多肽溶液，使用去离子水作为溶剂，配置RGD多肽的水溶液。
(8)将支架浸泡在1mL步骤(3)所述的RGD溶液中4h。
(9)反应4h后，取出步骤(8)所述的3D打印支架，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(10)将步骤(9)所述的3D打印组装支架使用细胞迁移法进行人骨髓间充质干细胞的迁移距离表征，观察每个区域的细胞生长情况，以及支架上细胞自两端向中心的迁移距离。观察发现，细胞多集中在区域1、2、9、10，其中区域1和区域10上细胞较为密集，区域2和区域9细胞呈现向中心迁移的趋势，整体迁移趋势和实施例中梯度的接枝相比较差，迁移效果不明显。经确定其最远迁移距离为3.89mm，支架总距离为10mm。
对比例8
传统用于3D打印均匀接枝生物活性多肽的多孔金属支架的方法，步骤如下：
(1)将底面形状为正六边形、六边形外接圆半径为5mm，高度为10mm的3D打印多孔一体式金属支架利用4％HF酸处理5min，用超纯水超声清洗5min，去除表面残留的氟离子。
(2)将步骤(1)的3D打印支架放入浓硝酸当中浸泡15min，获得反应足够的羟基，用超纯水冲洗干净，氮气吹干。
(3)配置浓度为100μM的多肽溶液,使用水作为溶剂，配置YIGSR-FITC多肽的水溶液。
(4)将支架浸泡在1mL步骤(3)所述的YIGSR-FITC溶液中4h。
(5)反应4h后，取出步骤(4)所述的3D打印支架，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(6)在支架材料表面滴加水膜，在荧光显微镜下观察每个区域的荧光，统计荧光值，根据标准曲线计算材料表面的接枝密度。
(7)配置浓度为100μM的YIGSR多肽溶液，使用去离子水作为溶剂，配置YIGSR多肽的水溶液。
(8)将支架浸泡在1mL步骤(3)所述的YIGSR溶液中4h。
(9)反应4h后，取出步骤(8)所述的3D打印支架，用去离子水清洗干净，用氮气吹干，组装支架。
(10)将步骤(9)所述的3D打印组装支架使用细胞迁移法进行神经细胞的迁移距离表征，观察每个区域的细胞生长情况，以及支架上细胞自两端向中心的迁移距离。观察发现，细胞多集中在区域1、2、9、10，其中区域1和区域10上细胞较为密集，其余区域的细胞数量较少，整体迁移趋势和实施例中梯度的接枝相比较差，迁移效果不明显。经确定其最远迁移距离为2.87mm，支架总距离为10mm。
综上实施例和对比例可以看出，相比于传统的在材料表面均匀接枝生物活性多肽的方法，本发明方法可以快速确定生物活性多肽在材料表面的梯度接枝斜率，通过比较不同斜率下细胞的迁移距离筛选出促进细胞迁移的最佳梯度接枝斜率，通过本发明方法制备的双向梯度接枝生物活性多肽的多孔金属支架具有促进细胞向支架内迁移的功能。综合实施例可以看出，酸蚀方法中以4％HF酸蚀5min、浓硝酸浸泡15min进行羟基化表面处理后，接枝浓度为100μM的多肽溶液，梯度接枝时间3～5h，该条件材料表面具有较优的梯度接枝密度，在该接枝斜率下进行细胞迁移实验，细胞在材料表面的分布面积最大、材料表面的细胞数量最多，细胞几乎在所有区域都能够密集生长，细胞整体向中心迁移的趋势最明显，细胞的迁移距离最大且最高效。而在相同的条件下，对比例中的细胞分布、细胞数量以及细胞的迁移距离均无法达到实施例中的效果。综合能够看到，通过本发明制备的双向梯度接枝生物活性多肽的筛选方法，能够筛选得到具有促进细胞向支架内迁移的最佳工艺，所制备得到的材料能够有效地促进细胞向支架中心迁移，对于骨修复来说，细胞向支架中心迁移能够在支架内部形成血管，这些血管有利于营养物质和废物的运输，促进材料周围新生血管的形成、神经的形成以及新骨的形成，能够促进生物体内的骨修复，特别地，能够有效修复大段骨缺损。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。本专利保护的范围包括但不仅限于上述几种实施例中所提到的多肽，任何其他多肽接枝在本材料表面上后所进行的接枝都在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种具有多肽双向梯度分布表面的多孔金属材料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、设计并制备多孔金属支架，所述孔金属支架包括具有凸起的第一模块和具有凹槽的第二模块；所述凸起和凹槽的厚度相等；所述第一模块和第二模块可通过凸起和凹槽的配合，组装形成一体式多孔金属支架；
S2、将第一模块和第二模块分别进行羟基化处理；
S3、将羟基化处理后的第一模块和第二模块分别竖直置于反应器中，凸起和凹槽朝下，向反应器中匀速加入生物活性多肽溶液，并于T时间内恰好浸没材料；对材料进行清洗，组装，即得到具有多肽双向梯度分布表面的多孔金属材料；
步骤S2中所述的羟基化通过酸腐蚀方法实现；
所述的酸腐蚀方法操作如下：用去离子水、丙酮、无水乙醇、去离子水依次超声清洗材料10～20min，氮气吹干；将材料浸泡在0.1％～30％的HF酸中处理1～240min，用超纯水清洗支架，以除去残留的氟离子；将材料浸泡在65%浓硝酸中1～240min，用超纯水清洗支架，氮气吹干，备用；
步骤S3中所述的生物活性多肽溶液中的生物活性多肽为N端CPAPAP修饰的QK、RGD或YIGSR；
步骤S3中所述的生物活性多肽溶液的浓度为5～2000μM；
步骤S3中所述的反应时间T为1min～1200min。
2.根据权利要求1所述的具有多肽双向梯度分布表面的多孔金属材料的制备方法，其特征在于：
步骤S1中所述的第一模块和第二模块均为具有多层有序三维多孔网结构的柱状体，细丝直径为0.1～4mm，孔径大小为0.1～1mm，底面直径为4～20mm，高度为3～15mm，底面形状及孔形状为圆形、矩形或其他多边形；
步骤S1中所述的配合为过盈连接或螺纹连接。
3.根据权利要求2所述的具有多肽双向梯度分布表面的多孔金属材料的制备方法，其特征在于：
所述的细丝直径为0.1～0.3mm，孔径大小为0.2～0.6mm，底面直径为4～10mm，高度为4～10mm。
4.根据权利要求1～3任一项所述的具有多肽双向梯度分布表面的多孔金属材料的制备方法，其特征在于：
步骤S1中所述的第一模块和第二模块通过3D打印技术制备得到，操作如下：
（1）准备Ti-6Al-4V粉末；
（2）采用激光熔融烧结法，根据构建的模型激光烧结Ti-6Al-4V粉末，3D打印得到所述具有凸起的第一模块和具有凹槽的第二模块。
5.根据权利要求4所述的具有多肽双向梯度分布表面的多孔金属材料的制备方法，其特征在于：
步骤S3中所述的生物活性多肽溶液的浓度为50～200μM；
步骤S3中所述的T时间范围为3h～5h。
6.一种具有多肽双向梯度分布表面的多孔金属材料，通过权利要求1～5任一项中所述的制备方法得到。
7.权利要求6中所述的具有多肽双向梯度分布表面的多孔金属材料在制备骨修复材料中的应用。
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