CN105268028B

CN105268028B - 一种软骨组织工程支架及其制备方法

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Publication number: CN105268028B
Application number: CN201510724697.1A
Authority: CN
Inventors: 敖英芳; 孟庆阳; 黄洪杰; 胡晓青; 代岭辉; 邵振兴
Original assignee: Peking University Third Hospital
Current assignee: Peking University Third Hospital
Priority date: 2015-10-29
Filing date: 2015-10-29
Publication date: 2018-09-25
Anticipated expiration: 2035-10-29
Also published as: CN105268028A

Abstract

本发明公开了一种软骨组织工程支架及其制备方法，属于软骨修复领域。该软骨组织工程支架包括壳聚糖水凝胶外骨架，包覆在壳聚糖水凝胶外骨架中的至少一个表面修饰有骨髓间充质干细胞亲和肽的脱钙皮质骨基质微球。其中，脱钙皮质骨基质微球的球径为500‑800μm。本发明实施例提供的软骨组织工程支架，具有良好的流变性、易塑性、生物力学强度、以及特异性地富集骨髓间充质干细胞的性能，从而能够适用于形状各异的软骨缺损区，且效果持久，并能获得更多的分化软骨细胞，具有较强的软骨组织修复能力，便于规模化推广应用。

Description

一种软骨组织工程支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及软骨修复领域，特别涉及一种软骨组织工程支架及其制备方法。

背景技术

软骨组织工程是一种采用组织工程学方法构建软骨复合组织的技术。软骨组织工程中三大基本要素是：种子细胞，可降解的软骨组织工程支架以及细胞生长调节因子，其中，软骨组织工程支架在软骨修复过程中所起的作用至关重要。软骨组织工程支架主要用来为构建软骨细胞提供三维空间结构，利于细胞的黏附、增殖，为细胞的生长提供良好的生长环境。

目前，常用的软骨组织工程支架主要采用天然生物支架材料制备而成，例如，丝素蛋白、纤维蛋白和胶原蛋白等蛋白质类，琼脂糖、藻酸盐、透明质酸和壳聚糖等糖类，采用上述天然生物支架材料制备的软骨组织工程支架不仅能够促进正常细胞外基质的生成及重塑，且在生物相容性、生物降解及成软骨分化(即软骨诱导能力)方面具有不可比拟的优势。

在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：

现有技术采用上述蛋白质类、糖类等材料制备软骨组织工程支架，由于蛋白质类、糖类等材料的力学强度较差，导致所制备的软骨组织工程支架的力学强度较差，从而使现有技术软骨组织工程支架在临床应用中的持久性较差。同时，现有技术提供的软骨组织工程支架募集骨髓间充质干细胞能力有限，造成软骨工程支架的成软骨化效果不佳。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供了一种力学强度高、且能特异性募集骨髓间充质干细胞的软骨组织工程支架及其制备方法。具体技术方案如下：

一方面，本发明实施例提供了一种软骨组织工程支架，包括壳聚糖水凝胶外骨架，包覆在所述壳聚糖水凝胶外骨架中的至少一个表面修饰有骨髓间充质干细胞亲和肽的脱钙皮质骨基质微球；所述脱钙皮质骨基质微球的球径为500-800μm。

具体地，作为优选，所述壳聚糖水凝胶外骨架的弹性模量为6-8kPa。

具体地，作为优选，每1mg所述脱钙皮质骨修饰有300-400ng所述骨髓间充质干细胞亲和肽。

具体地，作为优选，所述骨髓间充质干细胞亲和肽为E7多肽。

具体地，作为优选，每1ml所述壳聚糖水凝胶外骨架中，含有150-200mg的所述表面修饰有骨髓间充质干细胞亲和肽的脱钙皮质骨基质微球。

另一方面，本发明实施例还提供了一种软骨组织工程支架的制备方法，所述方法包括：制备至少一个球径为500-800μm的脱钙皮质骨基质微球；将骨髓间充质干细胞亲和肽修饰到所述至少一个脱钙皮质骨基质微球表面，并加入壳聚糖水凝胶溶液中，在32-38℃下进行凝胶化反应28-32min，得到软骨组织工程支架。

具体地，作为优选，所述脱钙皮质骨基质微球的制备方法如下：将股骨上附着的软组织剔去，获取股骨的皮质骨，对所述皮质骨进行脱脂、脱钙处理及清洗处理后，进行粉碎，得到脱钙皮质骨基质微球，筛取球径为500-800μm的所述脱钙皮质骨基质微球，冷冻干燥后备用。

具体地，作为优选，所述将骨髓间充质干细胞亲和肽修饰到所述至少一个脱钙皮质骨基质微球表面，具体为：将所述脱钙皮质骨基质微球置于1,6-已二胺溶液中浸泡1-2h，加入骨髓间充质干细胞亲和肽以及交联剂，进行交联反应，获得用骨髓间充质干细胞亲和肽修饰的脱钙皮质骨基质微球。

具体地，作为优选，所述交联剂为琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯。

具体地，作为优选，所述壳聚糖水凝胶溶液通过如下方法配制：先配制壳聚糖的乙酸溶液，其中，每7.5g的壳聚糖溶于250-300ml的0.1mol/L的乙酸溶液中，高压灭菌后于3-4℃保存；再配制质量浓度为50％-60％的甘油磷酸钠溶液，除菌后于3-4℃保存；在冰浴环境中，将所述甘油磷酸钠溶液滴加到所述壳聚糖的乙酸溶液中，搅拌至澄清，得到所述壳聚糖水凝胶溶液，室温保存。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：

本发明实施例提供的软骨组织工程支架，用壳聚糖水凝胶包覆表面修饰有骨髓间充质干细胞亲和肽的脱钙皮质骨基质微球，一方面，通过壳聚糖水凝胶外骨架赋予该支架良好的流变性和易塑性，以便于使该支架适用于形状各异的软骨缺损区；另一方面，通过脱钙皮质骨基质微球赋予该支架良好的力学支撑，使其具有适宜的生物力学强度，提高该支架的持久性；再一方面，通过将骨髓间充质干细胞亲和肽修饰于脱钙皮质骨基质微球表面，利于该支架在软骨缺损区特异性地富集骨髓间充质干细胞，进而获得更多的分化软骨细胞。可见，本发明实施例提供的软骨组织工程支架具有较强的软骨组织修复能力，便于规模化推广应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的软骨组织工程支架的结构示意图；

图2是本发明实施例1提供的用罗丹明荧光剂标记的E7多肽在脱钙皮质骨基质微球上修饰状态示意图；

图3是本发明实施例1提供的软骨组织工程支架的扫描电镜图；

图4是本发明实施例2提供的，第一支架、第一对比支架和第二对比支架的生物降解率对比示意图；

图5是本发明实施例2提供的，第一支架、第一对比支架和第二对比支架的平衡膨胀率对比示意图；

图6-1是本发明实施例3提供的，骨髓间充质干细胞在第一支架、第一对比支架和第二对比支架上的增殖量结果示意图；

图6-2是本发明实施例3提供的，第一支架、第一对比支架和第二对比支架上DNA测定结果示意图；

图6-3是本发明实施例3提供的，第一支架、第一对比支架和第二对比支架上GAG测定结果示意图；

图7-1是本发明实施例4提供的，第一支架、第一对比支架和第二对比支架上蛋白聚糖基因表达的对比示意图；

图7-2是本发明实施例4提供的，第一支架、第一对比支架和第二对比支架上II型胶原基因表达的对比示意图；

图8是本发明实施例5提供的，骨髓间充质干细胞在第一支架、第一对比支架和第二对比支架上的增殖状态示意图；

图9是本发明实施例6提供的，第一支架在裸鼠皮下形成的软骨的形态结构示意图；

图10是本发明实施例6提供的，第一支架、第一对比支架和第二对比支架进行HE染色、甲苯胺蓝染色和II型胶原免疫组化染色后的对比示意图。

附图标记分别表示：

1 壳聚糖水凝胶外骨架；

2 脱钙皮质骨基质微球；

3 第一对比支架；

4 第二对比支架；

5 第一支架。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

一方面，本发明实施例提供了一种软骨组织工程支架，如图1所示，该支架包括壳聚糖水凝胶外骨架1，包覆在壳聚糖水凝胶外骨架1中的至少一个表面修饰有骨髓间充质干细胞亲和肽的脱钙皮质骨基质微球2。其中，脱钙皮质骨基质微球的球径为500-800μm。

本发明实施例提供的软骨组织工程支架，用壳聚糖水凝胶包覆表面修饰有骨髓间充质干细胞亲和肽的脱钙皮质骨基质微球2，一方面，通过壳聚糖水凝胶外骨架1赋予该支架良好的流变性和易塑性，以便于使该支架适用于形状各异的软骨缺损区；另一方面，通过脱钙皮质骨基质微球2赋予该支架良好的力学支撑，使其具有适宜的生物力学强度，提高该支架的持久性；再一方面，通过将骨髓间充质干细胞亲和肽修饰于脱钙皮质骨基质微球2表面，利于该支架在软骨缺损区特异性地富集骨髓间充质干细胞，进而获得更多的分化软骨细胞。可见，本发明实施例提供的软骨组织工程支架具有较强的软骨组织修复能力，便于规模化推广应用。

具体地，在该支架中，壳聚糖水凝胶外骨架1可以理解为已经发生了凝胶化反应，在未发生凝胶化反应之前，该壳聚糖水凝胶外骨架1的粘度为300-400cP，通过使其粘度在如上范围内，以保证软骨组织支架具有适宜的流变性和易塑性，使该支架能适应不规则的软骨缺损区域，更好地修复软骨组织的损伤。壳聚糖水凝胶外骨架1的结构与待修复的软骨缺损区的结构一致，以便于使该支架恰好填充在软骨缺损区，获得更好的软骨修复效果。具体地，该壳聚糖水凝胶外骨架1的结构呈规则的多面体结构，例如正四面体结构、长方体结构、正棱锥结构。或者，该壳聚糖水凝胶外骨架1呈不规则几何结构，举例来说，其结构可如附图1所示，如此以便于适应各种结构的软骨缺损区。

进一步地，为了保证该该软骨组织工程支架的力学强度，该壳聚糖水凝胶外骨架的弹性模量为6-8kPa，优选6kPa。

具体地，为提高该软骨组织工程支架募集骨髓间充质干细胞的能力，每1mg脱钙皮质骨基质微球2上修饰300-400ng，优选380ng的骨髓间充质干细胞亲和肽。其中，骨髓间充质干细胞亲和肽为优选为E7多肽。

具体地，为使软骨组织工程支架在具有流变性和易塑性的基础上，还具有一定的生物力学强度，在每1ml壳聚糖水凝胶外骨架1中包覆有150-200mg的表面修饰有骨髓间充质干细胞亲和肽的脱钙皮质骨基质微球2，以保证骨髓间充质干细胞亲和肽募集到的骨髓间充质干细胞能在脱钙皮质骨基质微球2上增殖，进而分化成软骨组织，并填满软骨缺损区。其中，该软骨组织工程支架随着时间的推移，在植入软骨缺损区2-3个月内将发生生物降解，并被新分化的软骨组织所替代。

另一方面，本发明实施例还提供了上述软骨组织工程支架的制备方法，包括：制备至少一个球径为500-800μm的脱钙皮质骨基质微球2；将骨髓间充质干细胞亲和肽修饰到至少一个脱钙皮质骨基质微球2表面，并将修饰有骨髓间充质干细胞亲和肽的脱钙皮质骨基质微球2加入壳聚糖水凝胶溶液中，在32-38℃下进行凝胶化反应28-32min，优选30min，得到软骨组织工程支架。

具体地，脱钙皮质骨基质微球2的制备方法如下：将股骨上附着的软组织，如肌肉、筋膜等剔除，获取股骨的皮质骨，对皮质骨进行脱脂、脱钙处理，以去除抗原，防止制成的软骨组织工程支架进入人或动物体内后产生免疫。然后对上述皮质骨进行清洗，除去残留的脱钙液，最后进行粉碎，得到脱钙皮质骨基质微球。筛取球径为500-800μm的脱钙皮质骨基质微球2，冷冻干燥后备用。

具体地，将骨髓间充质干细胞亲和肽修饰到至少一个脱钙皮质骨基质微球表面，具体为：将脱钙皮质骨基质微球置于1,6-已二胺溶液中浸泡1-2h，加入骨髓间充质干细胞亲和肽以及交联剂，进行交联反应，其中，交联剂为琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯。为了观察骨髓间充质干细胞亲和肽在脱钙皮质骨基质微球上的修饰情况，可用荧光基团标记骨髓间充质干细胞亲和肽，并在激光共聚焦显微镜下观察骨髓间充质干细胞亲和肽与脱钙皮质骨基质微球的偶联情况，最后获得表面修饰有骨髓间充质干细胞亲和肽的脱钙皮质骨基质微球2。

具体地，壳聚糖水凝胶溶液通过如下方法配制：先配制壳聚糖的乙酸溶液，其中，每7.5g的壳聚糖溶于250-300ml的0.1mol/L的乙酸溶液中，过滤除去不溶物，然后进行高压蒸汽灭菌并在3-4℃下保存备用。再配制质量浓度为50％-60％的甘油磷酸钠溶液，除菌后于3-4℃保存。最后，在冰浴环境中，将甘油磷酸钠溶液滴加到壳聚糖的乙酸溶液中，搅拌至澄清，调整pH至7.17±0.3，得到壳聚糖水凝胶溶液，室温保存。

以下将通过具体实施例进一步详细描述本发明。

实施例1

本实施例提供了一种软骨组织工程支架，包括壳聚糖水凝胶外骨架1，以及包覆在壳聚糖水凝胶外骨架1中的至少一个表面修饰有E7多肽的脱钙皮质骨基质微球2。

本实施例提供的软骨组织工程支架的制备方法为：

步骤1、制备脱钙皮质骨基质微球

配制质量浓度为20％的乌拉坦溶液，取一只4Kg的新西兰大白兔，用过量的乌拉坦溶液将其麻醉处死。取出该大白兔的四肢长骨，剔除肌肉和筋膜，得到股骨的皮质骨，然后将该皮质骨置入甲醇和三氯甲烷的混合溶液中，脱脂48小时。其中，甲醇和三氯甲烷的体积比为1:1。将脱脂后的皮质骨置入质量浓度为10％的EDTA(Ethylene Diamine TetraaceticAcid，乙二胺四乙酸)脱钙液中进行脱钙，每3天更换一次脱钙液，脱钙完全约需3周。将脱钙完全的皮质骨置入质量浓度为3％的双氧水溶液中浸泡过夜。然后，将上述皮质骨用超纯水流动冲洗24小时以除去残留的双氧水溶液，得到脱钙皮质骨基质。将脱钙皮质骨基质在液氨中浸泡5min，然后，放入硬组织匀浆仪机器中进行粉碎，获得脱钙皮质骨基质微球。其中，硬组织匀浆仪机器的粉碎频率为28Hz，粉碎时间为3min。最后，用筛网筛取500-800μm的脱钙皮质骨基质微球2，冷冻干燥后备用。

步骤2、采用E7多肽修饰脱钙皮质骨基质微球

将步骤1中制备得到的备用脱钙皮质骨基质微球2置于10％w/v的1,6-己二胺溶液中，在37℃下浸泡1h。用罗丹明荧光基团标记骨髓间充质干细胞亲和多肽E7(简称E7多肽)，通过琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯交联剂，使脱钙皮质骨基质微球2表面的氨基与E7多肽交联反应，使E7多肽修饰在脱钙皮质骨基质微球2表面。通过对E7多肽的荧光标记，观察到本实施例中，E7多肽成功地修饰到脱钙皮质骨基质微球2表面，可参见图2(图2中灰白色部分为已成功修饰到脱钙皮质骨基质微球2上的E7多肽)。交联反应完成后，即得到修饰有E7多肽的脱钙皮质骨基质微球2。

步骤3、制备壳聚糖水凝胶溶液

将1.71ml的冰醋酸加入到300ml的ddH₂O中，配成0.1mol/L的乙酸溶液。然后，将7.5g壳聚糖溶于300ml上述乙酸溶液中，用磁力搅拌器在室温下搅拌12h，然后用双层纱布过滤，除去溶液中的不溶物，得到壳聚糖的乙酸溶液。将过滤后的壳聚糖的乙酸溶液在高压蒸汽下灭菌，并在4℃下保存备用。将0.6gβ-磷酸甘油溶于1ml ddH₂O中，配制成质量浓度为60％的β-磷酸甘油溶液。在冰浴条件下，边搅拌边将该β-磷酸甘油溶液逐滴加入到9ml壳聚糖的乙酸溶液中。最后，将反应体系的pH调整为7.17±0.3，得到壳聚糖水凝胶溶液。

步骤4、制备软骨组织工程支架

将200mg步骤2中得到的修饰有E7多肽的脱钙皮质骨基质微球2加入到1ml步骤3中得到的壳聚糖水凝胶溶液中，混合均匀后置于37℃下进行凝胶化反应30min，使壳聚糖水凝胶溶液凝胶化成壳聚糖水凝胶外骨架1，并将脱钙皮质骨基质微球2包覆在其中，得到软骨组织工程支架。

通过扫描电镜观察本实施例得到的软骨组织工程支架的结构，其如图3所示，可见，壳聚糖水凝胶外骨架1赋予本实施例提供的支架期望的多孔结构(孔径为30μm-80μm)，以供给软骨细胞足够且适宜的增殖空间，从而利于软骨组织的分化，实现该支架对软骨缺损区的修复。

实施例2

本实施例的目的是为了说明实施例1提供的软骨组织工程支架的持久性和力学性能，对实施例1提供的软骨组织工程支架的体外降解率和平衡溶胀比进行了测定。为了便于描述，以下将实施例1提供的软骨组织工程支架定义为第一支架5。其中，对由单一的壳聚糖水凝胶构成的第一对比支架3、由单一的脱钙皮质骨基质颗粒包覆在壳聚糖水凝胶中构成的第二对比支架4的相应性能进行同样的测试过程以作为对比。

具体测定过程如下：首先，将第一对比支架3、第二对比支架4、以及第一支架5分别放入直径2.5mm、高2.5mm的容器中，经冷冻干燥后备用。然后，分别称量三种支架的质量，并浸入PBS溶液(Phosphate Buffered Saline，磷酸盐缓冲液)中，在第7、14和21天时取出支架冷冻干燥后称重，计算体外降解率；在第0.5、1、4、8、12和24小时后取出支架后称量，计算平衡溶胀比。从图4中可以看出，相比第一对比支架3和第二对比支架4，第一支架5的体外降解量最少，能够使该支架在软骨缺损区维持更长的时间，作用效果更持久。从图5中可以看出，第一支架5的平衡溶胀比最小，说明该支架在湿润环境中变形最小，利于保持支架的形状和力学性能。由此可知，相比于第一对比支架3和第二对比支架4，第一支架5具有恰当的体外降解率和平衡溶胀比，能够较长时间保持自身形状，为募集到的骨髓间充质干细胞的增殖和分化提供了空间和力学支撑，对于修复软骨组织损伤效果最好。

实施例3

为了说明骨髓间充质干细胞在第一支架5中的增殖及分化能力，本实施例将骨髓间充质干细胞分别接种到第一支架5、以及实施例2所提及的第一对比支架3和第二对比支架4上，并分别测定其上骨髓间充质干细胞增殖并分化成软骨组织的能力，以及由该骨髓间充质干细胞所分化的软骨组织中软骨细胞的DNA(Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸)和软骨基质的GAG(Glycosaminoglycan，软骨糖胺多糖)含量。

具体测试过程如下：

1)将10⁶个骨髓间充质干细胞接种于上述各支架上，加入完全培养基培养，在第1、3、5、和7天时弃去培养基，PBS溶液冲洗2次后加入200μL新培养基，然后滴入10μL的CCK-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)工作液，并在37℃、CO₂质量分数为5％的条件下孵化2小时。取100μL上述孵化得到的溶液加入到96孔板中，测定骨髓间充质干细胞的OD值(Optical Density，光密度值)，在此用OD值来表征骨髓间充质干细胞的增殖能力。实验结果如图6-1所示，可见，第一支架5的OD值在第1、3、5、7天时，均为最大，说明第一支架5上募集到的骨髓间充质干细胞最多，新增的软骨细胞也最多，且第一支架5适宜骨髓间充质干细胞的生长和分化，有利于修复软骨组织损伤。

2)将10⁶个骨髓间充质干细胞接种于支架之上，加入完全培养基培养，在第7、14、和21天时弃去培养基，用PBS溶液冲洗2次后加入200μL木瓜蛋白酶，在60℃条件下过夜，使支架和细胞完全溶解，得到溶解液。最后，取20μL上述溶解液滴入96孔板后，加入200μL的Hoechst 33258溶液或200μL的DMMB(1,9-dimethylmethylene blue，二甲基亚甲基蓝)3，在37℃下孵化30min后，测定由上述骨髓间充质干细胞分化成的软骨细胞的OD值。其中，测定软骨细胞DNA的条件：激发光的波长为360nm，发射光的波长为460nm。测定软骨基质GAG的条件：用波长为520nm的光。根据DNA和GAG标准曲线校正实际值，从图6-2和图6-3中可以看出，相比于第一对比支架3和第二对比支架4，第一支架5可以募集更多的骨髓间充质干细胞，产生更多的软骨特异性细胞外基质，其DNA和GAG含量更高，显著优于其他两组，具有更好的修复软骨组织损伤的效果。

实施例4

对第一对比支架3、第二对比支架4和第一支架5进行蛋白聚糖和II型胶原基因表达的测定，具体测定过程为：

将10⁶个骨髓间充质干细胞分别接种于上述三种支架之上，加入完全培养基进行培养，在第7和14天时弃去培养基，用PBS溶液冲洗2次后提取支架上细胞的RNA，在其逆转录生成cDNA(complementary DNA，互补脱氧核糖核酸)第一条链后进行RT-PCR(Reversetranscription Polymerase Chain Reaction，逆转录)试验，并计算试验结果。如图7-1和图7-2所示，相比于第一对比支架3和第二对比支架4，第一支架5，由于其表面修饰有E7多肽，所以能够募集更多的骨髓间充质干细胞，更利于蛋白聚糖和II型胶原基因的表达，从而形成新的软骨组织，对于修复软骨组织损伤效果更好。

实施例5

用激光共聚焦显微镜观察骨髓间充质干细胞在第一对比支架3、第二对比支架4和第一支架5上的生长与分布情况。

将10⁶个骨髓间充质干细胞分别接种于上述三种支架之上，加入完全培养基培养24小时，然后弃去培养基，用PBS溶液冲洗2次后，滴入吖啶橙荧光染液，室温下孵化30分钟后再用PBS溶液冲洗浮色，置于激光共聚焦显微镜下获取图像。

如图8所示，相比于单纯的第一对比支架3和第二对比支架4，第一支架5募集了更多的骨髓间充质干细胞，且这些骨髓间充质干细胞在该支架上的生长更均匀，使得实施例1提供的支架5具有更好的软骨组织损伤修复效果。

实施例6

本实施例对第一对比支架3、第二对比支架4和实施例1提供的第一支架5上成软骨的能力进行测定。

将10⁶个骨髓间充质干细胞分别接种于上述三种支架之上，并加入完全培养基培养48小时，然后弃去培养基，用PBS溶液冲洗2次后，加入成软骨诱导培养基培养7天，再将上述支架植入到裸鼠皮下。最后，在第4周时获取标本，进行组织学评估。

如图9所示，第一支架5上形成的软骨组织，外观光滑坚挺，能够达到软骨组织损伤修复的要求。图10中展示了上述三种支架经HE染色(Hematoxylin-eosin staining，苏木精-伊红染色法)、甲苯胺蓝染色和II型胶原免疫组化染色的结果，相比于第一对比支架3和第二对比支架4，第一支架5染色更加均匀致密，说明软骨组织细胞生长效果更好，具有良好的软骨组织损伤修复效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种软骨组织工程支架，包括壳聚糖水凝胶外骨架，包覆在所述壳聚糖水凝胶外骨架中的至少一个表面修饰有骨髓间充质干细胞亲和肽的脱钙皮质骨基质微球；

所述脱钙皮质骨基质微球的球径为500-800μm；

所述壳聚糖水凝胶外骨架的弹性模量为6-8kPa；

每1ml所述壳聚糖水凝胶外骨架中，含有150-200mg的所述表面修饰有骨髓间充质干细胞亲和肽的脱钙皮质骨基质微球。

2.根据权利要求1所述的支架，其特征在于，每1mg所述脱钙皮质骨修饰有300-400ng所述骨髓间充质干细胞亲和肽。

3.根据权利要求1所述的支架，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞亲和肽为E7多肽。

4.权利要求1所述的软骨组织工程支架的制备方法，包括：制备至少一个球径为500-800μm的脱钙皮质骨基质微球；

将骨髓间充质干细胞亲和肽修饰到所述至少一个脱钙皮质骨基质微球表面，并加入壳聚糖水凝胶溶液中，在32-38℃下进行凝胶化反应28-32min，使所述壳聚糖水凝胶溶液凝胶化成壳聚糖水凝胶外骨架，并将所述脱钙皮质骨基质微球包覆在所述壳聚糖水凝胶溶液中，得到软骨组织工程支架；

所述壳聚糖水凝胶外骨架的弹性模量为6-8kPa；

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述脱钙皮质骨基质微球的制备方法如下：

将股骨上附着的软组织剔去，获取股骨的皮质骨，对所述皮质骨进行脱脂、脱钙处理及清洗处理后，进行粉碎，得到脱钙皮质骨基质微球，筛取球径为500-800μm的所述脱钙皮质骨基质微球，冷冻干燥后备用。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述将骨髓间充质干细胞亲和肽修饰到所述至少一个脱钙皮质骨基质微球表面，具体为：

将所述脱钙皮质骨基质微球置于1,6-已二胺溶液中浸泡1-2h，加入骨髓间充质干细胞亲和肽以及交联剂，进行交联反应，获得用骨髓间充质干细胞亲和肽修饰的脱钙皮质骨基质微球。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述交联剂为琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖水凝胶溶液通过如下方法配制：

先配制壳聚糖的乙酸溶液，其中，每7.5g的壳聚糖溶于250-300ml的0.1mol/L的乙酸溶液中，高压灭菌后于3-4℃保存；再配制质量浓度为50％-60％的甘油磷酸钠溶液，除菌后于3-4℃保存；在冰浴环境中，将所述甘油磷酸钠溶液滴加到所述壳聚糖的乙酸溶液中，搅拌至澄清，得到所述壳聚糖水凝胶溶液，室温保存。

9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞亲和肽为E7多肽。