CN102335455B

CN102335455B - 生物大分子的水凝胶生物支架及其制备方法

Info

Publication number: CN102335455B
Application number: CN201010237869.XA
Authority: CN
Inventors: 李峻柏; 杜明春; 崔岳
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2010-07-26
Filing date: 2010-07-26
Publication date: 2016-04-13
Anticipated expiration: 2030-07-26
Also published as: CN102335455A

Abstract

本发明涉及一种生物大分子的水凝胶生物支架及其制备方法，更具体地，涉及一种海藻酸盐水凝胶生物支架及其制备方法。本发明运用层层组装技术在水体系制备交联剂交联的海藻酸盐水凝胶生物支架，通过非水溶性碳酸盐原位生成CO₂发泡的方法在生物支架内制孔，提供一种简单实用，可控性强，清洁低成本的方法制备生物支架。

Description

生物大分子的水凝胶生物支架及其制备方法

技术领域

本申请涉及一种生物大分子的水凝胶生物支架及其制备方法，更具体地，涉及一种海藻酸盐水凝胶生物支架及其制备方法。

背景技术

生物支架的制备是组织工程学研究的重要内容之一，理想的生物支架应具备以下特性：1.具有良好的生物相容性，能促进细胞的黏附并为细胞在其表面增殖提供适宜的微环境，在体外培养时无细胞毒性，植入体内时不会引起机体炎症和排斥反应；2.具有三维立体结构，内部互相贯通形成开放孔道结构，为细胞提供足够的黏附空间，并利于营养物质和代谢产物的传输；3.具有生物可降解性，与细胞的增殖速度相匹配，且降解产物对细胞繁殖无害，容易被机体代谢或吸收；4.可塑性强，方便构建与需要再生、修复的组织器官相同的外形；5.具有与被移植组织器官相适应的力学性能；6.方便消毒杀菌处理，且不影响材料的性质。

作为生物材料应用的形式之一，水凝胶可定义为在水中溶胀并保持大量水分，可降解或不可降解的聚合物。由于水凝胶网络中充斥有大量的水分，使得整个材料具备了一种流体的性质，这与充盈有大量水分的机体组织极其相似，利于营养物质的传输和细胞代谢产物的排出，柔软湿润的表面以及组织亲和力大大减少了材料对周围组织的刺激性，使得水凝胶具有良好的生物相容性。水凝胶因其流动性很容易充满整个不规则的缺损部位，手术创伤非常微小且易于操作，最适合用于构建力学强度较低的软组织器官。用于制备水凝胶的材料有海藻酸盐，透明质酸，聚乙烯醇等。

海藻酸盐是一种生物相容性优良的高亲水性天然多糖生物大分子，从海带、马尾藻等海藻类植物中提取得到，由古罗糖醛酸和甘露糖醛酸的分子链段组成，其中含有大量的羧基和羟基，相对分子量在32000～250000之间，在接近温和的体内环境下，可作为组织细胞的培养基质及生物活性成份的控释载体。海藻酸钠在水中有很好的溶解性，将钠盐转化为钙盐时，可形成交联的水凝胶网络结构，既有弹性又有强度，可制备高含水的膜和颗粒。在组织再生研究中，海藻酸盐最终可被降解吸收，生成小分子多糖降解产物，无毒性。与其他聚合物相比，海藻酸盐价格低、来源丰富、易塑形、具有更好的亲水性，更适于细胞的贴壁生长和营养物质的渗透。

作为适于细胞生长繁殖的生物支架，光有材料本身是不够的，组织工程的关键技术之一在于将生物材料制成具有特定形状和孔道结构的三维支架。研究表明，支架中孔的形状、大小和孔隙率直接影响细胞的迁移、分化和增殖，对新生组织的功能也有重要影响，而这些因素与采用的制备方法息息相关。通常用于构建生物支架的方法有溶液浇铸法、颗粒析出法，相分离法、气体发泡法、冷冻干燥法、快速成型法、电纺丝法以及多种方法的联合应用等。这些方法存在诸如有机试剂残留，过程复杂，成本过高等不足之处，限制了实际应用。

图1示出了现有技术中压降/颗粒析出法及其制备的生物支架。具体制备过程(见图A)如下：

将聚碳酸氨酯(PCU)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，调控到适当的粘度，形成聚合物溶液。将造孔剂氯化铵(NH₄Cl)颗粒(图B)或石蜡球(图C)填充于玻璃柱状模具中，如图A所示将聚合物溶液从玻璃柱状模具上端导入，通过供气管和真空泵形成的压降组装聚合物溶液和造孔剂，当聚合物溶液到达玻璃柱状模具下端不锈钢筛网时停止组装。去除玻璃柱状模具，蒸发溶剂，并在水中析出氯化铵颗粒或在正己烷中析出石蜡球，即制得柱状(图D，E，H为微观结构)或管状生物支架(图F，G，I为微观结构)。StéphanieGrenier，MartinSandig，KibretMequanint.Polyurethanebiomaterialsforfabricating3Dporousscaffoldsandsupportingvascularcells.JournalofBiomedicalMaterialsResearchPartA，2007，82A，802-809。

压降/颗粒析出法利用有机溶剂蒸发快速成型的原理在有机溶液中制备了非水溶性聚合物生物支架，并通过造孔剂溶解析出的方法在生物支架中原位形成多孔结构。但是，压降/颗粒析出法的缺点很明显：

1.成本高，通过压降/颗粒析出法制备生物支架，必须使用空气压缩机，真空泵等特殊设备；氯化铵颗粒和石蜡球必须满足一定的尺寸要求，需要特殊设备制备氯化铵颗粒和石蜡球，并进行粒径筛选。

2.过程复杂，通过压降/颗粒析出法制备生物支架，需要配制适当粘度的聚合物溶液，需要制备一定尺寸的造孔剂，需要调节空气压和真空泵获得适当的压降等繁琐步骤。

3.有机试剂残留，聚合物溶液中含有有毒溶剂二甲基甲酰胺，即使在制备过程中有溶剂蒸发步骤，但生物支架中仍会残留；溶解造孔剂石蜡球的正己烷也会在制备过程中残留在生物支架中。

针对生物支架制备中存在的有机试剂残留，过程复杂，成本过高等问题，本发明的目的在于运用层层组装技术在水溶液中制备交联剂交联的海藻酸盐水凝胶生物支架，通过非水溶性碳酸盐原位生成CO₂发泡的方法在生物支架内制孔，提供一种简单实用，可控性强，清洁低成本的方法制备生物支架。与传统的无定形注射类水凝胶相比，运用本发明提供的方法可以制备组织工程所需要的具有特定形状的水凝胶生物支架，其具有均匀的力学性能，符合软组织支架的设计要求。

发明内容

一种生物大分子的水凝胶生物支架，其特征在于包括2层或2层以上的生物大分子水凝胶，所述生物支架为中空结构或实心结构；所述生物大分子选自海藻酸钠、海藻酸钾、聚乙烯醇、聚丙烯酸、壳聚糖中的一种或多种的组合；所述水凝胶为生物大分子通过交联剂交联得到，在支架表面任选包括表面修饰层；水凝胶中任选包括胎牛血清或紫杉醇；水凝胶层中任选包括空心的孔。

根据本发明所述的生物支架，其中，所述交联剂溶液选自CaCl₂水溶液、BaCl₂水溶液、FeCl₃水溶液、CrCl₃水溶液、戊二醛水溶液、乙二醇二甲基丙烯酸酯水溶液中的一种或多种的组合。

根据本发明所述的生物支架，其中，所述支架的形状选自由柱状、人血管状、人耳状、人鼻状、人指骨状组成的组。

根据本发明的实施例，本发明提供一种制备生物大分子的水凝胶生物支架的方法，包括如下步骤：

a.将水不溶性模板浸于生物大分子水溶液中进行吸附；

b.将吸附了所述生物大分子的模板浸于交联剂溶液中交联形成水凝胶；

c.将水凝胶浸于水中清洗掉多余的交联剂；

d.再次重复a-c的步骤n次，n为0-100之间的整数，在重复时每层之间的生物大分子溶液和交联剂溶液可以相同，也可以不同

e.任选包括将水凝胶生物支架与模板分离的步骤；任选包括水凝胶生物支架进行表面修饰的步骤；

根据本发明所述的方法，其中，所述生物大分子选自海藻酸钠、海藻酸钾、聚乙烯醇、聚丙烯酸、壳聚糖中的一种或多种的组合。

根据本发明所述的方法，其中，所述交联剂溶液选自CaCl₂水溶液、BaCl₂水溶液、FeCl₃水溶液、CrCl₃水溶液、戊二醛水溶液、乙二醇二甲基丙烯酸酯水溶液中的一种或多种的组合。

根据本发明所述的方法，其中，所述模板的形状选自由柱状、人血管状、人耳状、人鼻状、人指骨状组成的组。

根据本发明所述的方法，其中，所述模板的材料不溶于水且不与制备过程中的材料发生反应；优选模板的材料是聚碳酸酯或聚乙烯。

根据本发明所述的方法，其中，可以在所述生物大分子水溶液中加入水溶性成分或非水溶性成分。

根据本发明所述的方法，其中，在所述生物大分子水溶液中加入的水溶性成分或非水溶性成分是胎牛血清或紫杉醇。

根据本发明所述的方法，其中，包括通过静电作用将壳聚糖组装于水凝胶生物支架中的步骤。

根据本发明的另一个实施例，提供一种制备生物大分子的多孔水凝胶生物支架的方法，包括如下步骤：

a.将模板浸于添加有非水溶性碳酸盐颗粒的生物大分子水溶液中进行吸附；

c.将水凝胶浸于水中清洗掉多余的交联剂；

d.将含非水溶性碳酸盐颗粒的水凝胶生物支架浸于酸性水溶液中，原位生成CO₂气体制孔，得到多孔水凝胶生物支架；

e.任选包括将水凝胶与模板分离得到含非水溶性碳酸盐颗粒的水凝胶生物支架的步骤；任选包括水凝胶生物支架进行表面修饰的步骤；

根据本发明所述的方法，还包括在完成步骤d后重复a至d的步骤。

根据本发明所述的方法，其中，所述模板的材料不溶于水且不与制备过程中的材料发生反应，所述模板的材料优选是聚碳酸酯或聚乙烯。

根据本发明所述的方法，其中，所述非水溶性碳酸盐选自CaCO₃、MgCO₃、BaCO₃中的一种或多种的组合。

根据本发明所述的方法，其中，所述酸性水溶液选自由HCl水溶液、H₃PO₄水溶液、H₂SO₄水溶液组成的组。

一种根据本发明所述的方法制备的生物大分子的水凝胶生物支架。

一种根据本发明所述的方法制备的生物大分子的水凝胶生物支架在制备医疗器械中的应用。

附图说明

图1压降/颗粒析出法及其制备的生物支架

图2海藻酸盐水凝胶生物支架制备流程图(海藻酸盐(alginate，ALG)；聚碳酸酯(polycarbonate，PC))

图3海藻酸盐水凝胶生物支架(a为无孔支架，b为多孔支架)

图4本发明制备的水凝胶生物支架(样品1)和直接交联形成的无定形水凝胶(样品2)的拉伸模量比较

具体实施方式

在下文将结合附图及实施实例对本发明进行详细描述，其目的是使本技术领域技术人员更容易理解本发明的实施及优点，而不能构成对本发明的限制。

除非在本发明说明书中另有定义，否则在此所有的技术术语都是根据本领域一般技术人员所通常使用和理解的惯用定义来使用。

生物大分子的水凝胶生物支架的制备实例

制备实例1

海藻酸盐水凝胶生物支架制备流程见图2，所制备的管状水凝胶生物支架见图3。

首先剪裁制作聚碳酸酯管(a)，用聚乙烯封口膜密封管两端，然后将聚碳酸酯管浸入30mg/mL海藻酸钠水溶液中5min(b)，聚碳酸酯管表面吸附海藻酸钠后取出浸入4mol/L的GaGl₂水溶液中10min使其完全交联(c)，而后置于纯水中10min清洗多余的Ca²⁺和Cl^-(d)。根据需要重复以上步骤可制备多层水凝胶(e)，将多层水凝胶逐层分离即得不同管径的管状水凝胶生物支架(f)。如需制备多孔水凝胶生物支架，在海藻酸钠水溶液中加入CaCO₃颗粒，混合均匀，如上述步骤制得含有CaCO₃颗粒的管状水凝胶生物支架，将其浸泡于1mol/LHCl水溶液中至支架中的CaCO₃颗粒完全溶解生成CO₂气体(g)，纯水清洗后即制得多孔海藻酸盐水凝胶生物支架(h)。

力学性能测试

测试比较了本发明制备的水凝胶生物支架和直接交联形成的无定形水凝胶的拉伸模量，测试结果见表1，说明通过本发明制备的水凝胶生物支架具有均匀的力学性能，力学强度符合软组织支架的设计要求。

测试过程如下：分别以1，2，3，4，5mol/LCa²⁺浓度交联制备水凝胶生物支架和无定形水凝胶，剪切80mm×10mm的样品在电子拉力试验机上进行拉伸实验，直至样品断裂，测试过程中样品保持湿润状态。每个测试点均为5个测试样品的平均值。

制备实例2

首先剪裁制作聚乙烯管，用聚乙烯封口膜密封管两端，将聚乙烯管浸入20mg/mL的海藻酸钾水溶液中10min，取出浸入3mol/L的BaCl2水溶液中20min使其完全交联，然后置于纯水中浸泡20min清洗多余的Ba²⁺和Cl^-，最后浸入10mg/mL的壳聚糖水溶液中20min通过静电作用吸附壳聚糖。重复以上步骤可制备含有海藻酸盐和壳聚糖两种生物大分子的水凝胶生物支架。如需制备多孔水凝胶生物支架，在海藻酸钾水溶液中加入BaCO₃颗粒，混合均匀，如上述步骤制得含有BaCO₃颗粒的管状水凝胶生物支架，将其浸泡于2mol/LHCl水溶液中至支架中的BaCO₃颗粒完全溶解生成CO₂气体，纯水清洗后即制得多孔水凝胶生物支架。

制备实例3

首先剪裁制作聚碳酸酯管，用聚乙烯封口膜密封管两端，将聚碳酸酯管浸入含有MgCO₃颗粒的10mg/mL的聚乙烯醇水溶液中20min，然后取出浸入3wt.％的戊二醛水溶液中30min使其完全交联，而后置于纯水中60min清洗多余的戊二醛。根据需要重复以上步骤，将含有MgCO₃颗粒的聚乙烯醇水凝胶生物支架浸泡于2mol/LHCl水溶液中至支架中的MgCO₃颗粒完全溶解生成CO₂气体，纯水清洗后即制得多孔聚乙烯醇水凝胶生物支架。在90℃干燥箱中蒸干此多孔水凝胶生物支架后将其浸于3wt.％明胶水溶液中溶胀，即可在水凝胶生物支架表面修饰明胶活性组份。

制备实例4

首先剪裁制作聚碳酸酯管，用聚乙烯封口膜密封管两端，将聚碳酸酯管浸入含有CaCO₃颗粒的20mg/mL的聚丙烯酸水溶液中20min，然后取出浸入5wt.％的乙二醇二甲基丙烯酸酯水溶液中30min使其完全交联，而后置于纯水中30min清洗多余的乙二醇二甲基丙烯酸酯。根据需要重复以上步骤，将含有CaCO₃颗粒的聚丙烯酸水凝胶生物支架浸泡于1mol/LHCl水溶液中至支架中的CaCO₃颗粒完全溶解生成CO₂气体，纯水清洗后即制得多孔聚丙烯酸水凝胶生物支架。

制备实例5

首先剪裁制作聚乙烯管，用聚乙烯封口膜密封管两端，将聚乙烯管浸入含有MgCO₃颗粒的20mg/mL的壳聚糖水溶液中10min，取出浸入3wt.％的戊二醛水溶液中30min使其完全交联，而后置于纯水中60min清洗多余的戊二醛。根据需要重复以上步骤，将含有MgCO₃颗粒的壳聚糖水凝胶生物支架浸泡于2mol/LHCl水溶液中至支架中的MgCO₃颗粒完全溶解生成CO₂气体，纯水清洗后即制得多孔壳聚糖水凝胶生物支架。

Claims

1.一种生物大分子的水凝胶生物支架，其特征在于包括2层或2层以上的生物大分子水凝胶，所述生物支架为中空结构或实心结构；所述生物大分子选自聚乙烯醇、聚丙烯酸、壳聚糖中的一种或多种的组合；所述水凝胶为生物大分子通过交联剂交联得到，在支架表面任选包括表面修饰层；水凝胶中任选包括胎牛血清或紫杉醇；水凝胶层中任选包括空心的孔；所述交联剂溶液选自戊二醛水溶液、乙二醇二甲基丙烯酸酯水溶液中的一种或多种的组合。

2.根据权利要求1所述的生物支架，其中，所述支架的形状选自由柱状、人血管状、人耳状、人鼻状、人指骨状组成的组。

3.一种制备生物大分子的水凝胶生物支架的方法，包括如下步骤：

a.将水不溶性模板浸于生物大分子水溶液中进行吸附；

c.将水凝胶浸于水中清洗掉多余的交联剂；

d.再次重复a-c的步骤n次，n为0-100之间的整数，在重复时每层之间的生物大分子溶液和交联剂溶液可以相同，也可以不同；

所述生物大分子选自聚乙烯醇、聚丙烯酸、壳聚糖中的一种或多种的组合；

所述交联剂溶液选自戊二醛水溶液、乙二醇二甲基丙烯酸酯水溶液中的一种或多种的组合。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述模板的形状选自由柱状、人血管状、人耳状、人鼻状、人指骨状组成的组。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述模板的材料不溶于水且不与制备过程中的材料发生反应。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述模板的材料是聚碳酸酯或聚乙烯。

7.根据权利要求3所述的方法，其中，在所述生物大分子水溶液中加入水溶性成分或非水溶性成分。

8.一种制备生物大分子的多孔水凝胶生物支架的方法，包括如下步骤：

c.将水凝胶浸于水中清洗掉多余的交联剂；

e.任选包括将水凝胶与模板分离得到多孔水凝胶生物支架的步骤；任选包括水凝胶生物支架进行表面修饰的步骤；

9.一种根据权利要求3至8中任一项所述的方法制备的生物大分子的水凝胶生物支架。

10.权利要求1和2中任一项所述的生物大分子的水凝胶生物支架在制备医疗器械中的应用。

11.权利要求9所述的生物大分子的水凝胶生物支架在制备医疗器械中的应用。