CN1175912C

CN1175912C - 一种体内可降解管状肝组织框架材料的制备方法

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Publication number: CN1175912C
Application number: CNB02103608XA
Authority: CN
Inventors: 冯庆玲; 崔福斋; 李大鹏; 王小红; 徐迎新
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2002-01-29
Filing date: 2002-01-29
Publication date: 2004-11-17
Anticipated expiration: 2022-01-29
Also published as: CN1363399A

Abstract

一种体内可降解管状肝组织框架材料的制备方法，涉及一种用于体内肝细胞培养的具有管状结构的三维肝组织框架材料。本发明采用石蜡与硬脂酸为原料，加热混合后制成网状模具；然后以1，4-二氧六环为溶剂配制聚乳酸(聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物、聚己内酯)等可降解高分子溶液，并在其中加入制孔剂，将其涂覆于模具上，经物理、化学方法处理，制得多管状支架材料，之后再经抗凝血药物处理和消毒，即制得具有管状结构且细胞相容性和血液相容性均较好的框架材料。本发明可使管道内外的细胞通过管壁发生间接接触，肝细胞的极性得以充分表达，因而克服了以往框架材料设计中的缺陷，延长了肝细胞的存活期，从而使得将其直接植入体内进行细胞培养成为可能。

Description

一种体内可降解管状肝组织框架材料的制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于体内肝细胞培养的具有管状结构的三维肝组织框架材料，属生物工程技术领域。

背景技术

对于肝组织大面积损坏/丢失及终末期肝病所致急、慢性肝功能衰竭，肝移植是可供救治的有效措施。但供肝的严重不足已成为开展这一治疗的主要障碍，在解决这一矛盾时，需要解决异种肝移植面临人畜间感染传播的危险及更大的免疫排斥反应的问题。目前体外人工肝辅助装置，包括非生物型、生物型和混合型，可以在短时间内辅助支持肝脏功能，做为病人等待供肝进行移植的桥梁，或者支持肝功能以度过危险期，等待病人自身肝组织再生。即使目前世界上最先进的VitaGen公司研发的以C3A人肝细胞系为基础的生物型体外人工肝装置，也受到使用时间的限制。对于那些肝脏严重病变已无自行再生能力的病人，体外人工肝装置的短期支持也无能为力。体内病变肝脏的替代及供应问题仍然没有从根本上解决。近年来发展起来的组织工程学技术为人工器官的制造和最终解决供肝问题开辟了新的前景。如何运用组织工程技术再造这样结构和功能极为复杂的肝脏器官是生物医学和材料工程学界研究的课题。

框架材料是组织工程的三大要素之一，由于考虑到以后的体内植入，因此可降解高分子成为框架的首选材料。然而目前所设计的框架在内部结构上多是一种简单的多孔结构，在这样的框架中，所植细胞是无序排列的，肝细胞的极性无法得以充分表达；没有考虑血管化及天然细胞外基质支持问题，与体内细胞的真实环境相去甚远，因此导致所种植的细胞的存活时间很短，无法实现体内植入。文献“D.J.Mooney，K.Sano，P.M.Kaufmann，K.Majahod，B.Schloo，J.P.Vacanti，R.Langer，J.Biomed.Mater.Res.37(1996)413”中采用多孔的聚乳酸和聚羟基乙酸共聚物为框架，将肝细胞种植其中然后植入体内培养，结果发现24小时内有95-99％的肝细胞死亡。文献“B.L.Seal，T.C.Otero，A.Panitch，MaterialsScience and Engineering：R：Reports 34(2001)147”中指出其可能原因在于系统中物质交换的不利使得营养物质得不到补充而代谢废物不能及时排走。肝脏是高度血管化的组织，每个肝细胞都邻近血管系统(其距离不超出一个细胞的尺寸范围)，从框架材料的设计角度考虑，能够促进肝组织血管化，肝组织工程才有可能成功。

发明内容

本发明的目的是提出一种用于体内可降解的具有管状结构的肝组织框架材料的制备方法，使所制得的框架材料能较好地模拟肝组织的解剖结构，并能在一个月内维持其原有的机械强度和结构特性，可有望延长所种植的肝细胞的存活时间，使后期的体内植入成为可能。

本发明提出的一种体内可降解管状肝组织支架材料的制备方法，包括下列各步骤：

(1)将切片石蜡与硬脂酸按0.5～1.5∶1(W/W)的比例加热混合制坯，然后制成网状模具；

(2)以1，4-二氧六环为溶剂，配制浓度为5～35(W/V)％的可降解高分子材料聚乳酸(或聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物、聚己内酯)溶液，加入制孔剂，并涂覆于上述模具上，冻干成膜；

(3)用盐酸或去离子水浸泡上述样品，除去其中的制孔剂，再用二甲苯将模具溶解掉，得多管状支架材料；

(4)将上述样品在氢氧化钠溶液中活化，在1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐/2-(N-吗啉)-乙烷-磺酸水溶液中浸泡，然后在明胶水溶液或胶原蛋白(壳聚糖)醋酸溶液中偶联反应；

(5)将由(4)制得的样品放入丙酮与抗凝血药物的水溶液的混合液中浸泡，将浸泡后的样品在丙酮浓度依次递减的水溶液中缩聚；

(6)将步骤(5)处理过的样品在医用消毒酒精中浸泡，然后水洗，凉干，即可制得所需的框架材料。

本发明步骤(2)中所述的制孔剂为碳酸氢铵、碳酸氢钠、过氧水(H₂O₂)、磷酸氢二钠、氯化钠中的任一种；其制孔剂与可降解高分子材料溶液的比例为0.5～1.5(W/V)％。本发明步骤(5)所述抗凝血药物为肝素钠或阿司匹林(乙酰水杨酸)。

本发明还可将步骤(3)制得的多管状支架材料，在真空条件下浸泡在胶原盐酸溶液中，然后冻干，以形成胶原微海绵；用戊二醛蒸气处理胶原微海绵，使其交联，然后用去离子水清洗、冻干，再按步骤(5)、(6)进行制备。

本发明首次利用石蜡与硬脂酸制坯，聚乳酸(PLLA)、由聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯可降解高分子涂覆，再用化学和物理方法处理，制得具有管状结构且细胞相容性和血液相容性均较好的框架材料，管道内外的细胞通过管壁发生间接接触，肝细胞的极性得以充分表达，因而克服了以往框架材料设计中的缺陷，延长肝细胞的存活期，从而使得将其直接植入体内进行细胞培养成为可能。

附图说明

图1：为可降解管状肝组织框架材料的结构示意图。

图2：为图1的A-A剖面图。

具体实施方法

图1、图2为制成的可降解管状肝组织的框架材料。在体外培养阶段，管道内壁栽种血管内皮细胞，管道内部可通入培养液，在管道外部栽种肝细胞。在体内培养阶段，管道内部可直接通血液。

本发明的具体制备步骤如下：

(1)模具的制备：

将切片石蜡与硬脂酸按0.5-1.5∶1(W/W)的比例加热(60-80℃)均匀混合制坯，然后制成网状模具。

(2)可降解材料的涂覆：

取一定量的聚乳酸(分子量Mw：3×10⁴～3×10⁵)、聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物(70～90∶30～10M/M)、聚己内酯(分子量Mw：5×10⁴～5×10⁵)可降解高分子在其溶剂1，4-二氧六环中按比例配成浓度为5～35(W/V)％的溶液。并加入适量的的制孔剂(如碳酸氢铵、碳酸氢钠、过氧水(H₂O₂)、磷酸氢二钠、氯化钠)，混合均匀后静置、去泡，并涂覆于上述模具上，冻干成膜。

(3)造孔和脱模：

用0.05-0.2M的盐酸或去离子水浸泡上述样品，除去其中的制孔剂，再用二甲苯将模具溶解掉，得多管状支架材料(孔径为50-300μm，孔隙率为45～75％)。

(4)材料的改性：

将上述样品用0.5～1M的氢氧化钠(NaOH)溶液活化后，用0.1～1mol/L的盐酸溶液将过量的氢氧化钠中和，并用去离子水冲洗；在0.5～1wt％的交联剂1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液中4℃下浸泡12～36h，用2-(N-吗啉)-乙烷-磺酸(MES)缓冲液将体系的pH值调至4.5～6.0，在1～10wt％的壳聚糖或0.1～1wt％的I型胶原醋酸(0.1～1M)溶液中，4～25℃下偶联反应24-60h。

此步骤也可由如下方法替代进行：

在真空条件下，将上述制得的多管状支架材料浸泡在I型胶原的酸溶液中(pH 3.2，0.3wt％)。然后将孔隙充满了胶原溶液的多管状支架材料在-20～-80℃下冷冻12h，再冻干，以形成胶原微海绵。在37℃下，用戊二醛蒸气处理胶原微海绵4h，使得胶原微海绵进一步交联。最后，用去离子水清洗再冻干，制备混合海绵体。

(5)抗凝血处理

将丙酮与0.5-1.5wt％肝素钠(或羧基化硫酸酯化壳聚糖)水溶液按1～1.5∶1(V/V)混合，再将由(4)制得的样品浸入其中浸泡2-8h。然后在浓度依次递减的丙酮(如40％、30％、20％、10％)水溶液中缩聚。

(6)消毒处理：

将经抗凝血处理的样品在医用消毒酒精中浸泡6h，水冲，凉干。

本发明使用的切片石蜡、硬脂酸、碳酸氢铵、过氧水、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、盐酸、氯化钠、氢氧化钠、丙酮、乙醇、二甲苯、1、4-二氧六环、肝素钠、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐均为分析纯，由北京化工试剂店购买。阿司匹林(乙酰水杨酸)、壳聚糖(Mw：9.8×10⁴，脱乙酰度：78％)、I型胶原蛋白、明胶、2-(N-吗啉)-乙烷-磺酸(MES)，为美国Sigma公司产品。医用消毒酒精由北京挚友酒精制品厂购买。聚乳酸、聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物、聚己内酯由山东医疗器械厂购买。冻干机(Labconco型，德国)，孔径和孔隙率的测定采用压汞仪(Quantachrome Autosorb-60，American)，压力范围：0～400MPa。

实施例1：

(1)将切片石蜡与硬脂酸按1∶1(W/W)比例，在60℃水浴中加热混合制坯，然后刻成细网状模具。

(2)取一定量的聚乳酸(Mw：3×10)溶解在1、4-二氧六环中，配成浓度为5(W/V)％的溶液并加入0、5(W/V)％制孔剂碳酸氢铵，混合均匀后涂覆于(1)中模具上，冻干、成膜。

(3)用0.05M的盐酸浸泡该样品，除去其中的制孔剂，再用二甲苯脱模，制得孔径为50-100μm，孔隙率为45％的多管状支架材料。

(4)将上述样品用0.5M的NaOH溶液活化后，用0.1mol/L的盐酸溶液将过量的氢氧化钠中和，并用去离子水冲洗；在0.5wt％的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液中4℃下浸泡12h，用2-(N-吗啉)-乙烷-磺酸作为稳定剂，调节pH＝4.5，在0.1wt％的I型胶原醋酸(0.1M)溶液中，4℃下偶联反应24h。

(5)将丙酮与0.5wt％的肝素钠水溶液按1∶1(V/V)混合，再将由(4)制得的样品浸入其中浸泡2h。然后依次在40％、30％、20％、10％的丙酮水溶液中缩聚。

(6)消毒处理：

实施例2：

(1)切片石蜡与硬脂酸按1.25∶1(W/W)比例在烧杯中加热至65℃混合制坯，然后刻成细网状模具。

(2)取一定量的聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物(70∶30M/M)溶解在1、4-二氧六环中，配成浓度为15(W/V)％的溶液并加入0.5(W/V)％的磷酸氢二钠，均匀混合后涂覆于(1)中模具上，冻干、成膜。

(3)用去离子水浸泡该样品，除去其中的制孔剂，再用二甲苯脱模，制得孔径为80-150μm，孔隙率为60％的多管状支架材料。

(4)将上述样品用0.75M的NaOH溶液活化后，用0.5mol/L的盐酸溶液将过量的氢氧化钠中和，并用去离子水冲洗，在0.75wt％的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液中、4℃下浸泡24h，采用2-(N-吗啉)-乙烷-磺酸作为稳定剂，调节pH＝5.0，在1wt％的I型胶原醋酸(1M)溶液中，4℃下偶联反应48h。

(5)将丙酮与1wt％的肝素钠水溶液按1∶1(V/V)混合，再将由(4)制得的样品浸入其中浸泡3h。然后依次在40％、30％、20％、10％的丙酮水溶液中缩聚。

(6)将经抗凝血处理的样品在医用消毒酒精中浸泡6h，水冲，凉干。

实施例3：

(1)切片石蜡与硬脂酸按1.4∶1(W/W)比例在烧杯中加热至70℃混合制坯，然后刻成细网状模具。

(2)取一定量的聚己内酯(Mw：5×10⁴)溶解在1、4-二氧六环中，配成浓度为25(W/V)％的溶液，并加入1(W/V)％的磷酸氢二钠，均匀混合后涂覆于(1)中模具上，冻干、成膜。

(3)用去离子水浸泡该样品，再用二甲苯脱模得孔径为100-300μm，孔隙率为75％的多管状支架材料。

(4)将上述样品用1M的NaOH溶液活化后，用1mol/L的盐酸溶液将过量的氢氧化钠中和，并用去离子水冲洗；在1wt％的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液中、4℃下浸泡36h，采用2-(N-吗啉)-乙烷-磺酸作为稳定剂，调节pH＝6.0，在1wt％的壳聚糖醋酸(0.1M)溶液中，4℃下偶联反应60h。

(5)将丙酮与1.5wt％的肝素钠水溶液按1.5∶1(V/V)混合，再将由(4)制得的样品浸入其中浸泡4h。然后依次在40％、30％、20％、10％的丙酮水溶液中缩聚。

实施例4：

(1)将切片石蜡与硬脂酸按1.5∶1(W/W)比例在烧杯中加热至75℃混合制坯，然后刻成细网状模具。

(2)取一定量的聚乳酸(Mw：3×10⁵)溶解在1、4-二氧六环中，配成浓度为30(W/V)％的溶液并加入1(W/V)％的过氧水(H₂O₂)，均匀混合后涂覆于(1)中模具上，冻干、成膜。

(3)用去离子水浸泡该样品，除去其中的制孔剂，再用二甲苯脱模，得孔径为50-100μm，孔隙率为50％的多管道支架材料。

(4)将上述样品用1M的NaOH溶液活化后，用1mol/L的盐酸溶液将过量的氢氧化钠中和，并用去离子水冲洗；在1wt％的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液中、4℃下浸泡36h，采用2-(N-吗啉)-乙烷-磺酸作为稳定剂，调节pH＝6.O，在10wt％的I型胶原醋酸(1M)溶液中，25℃下偶联反应24h。

(5)将丙酮与0.5wt％的羧基化硫酸酯化壳聚糖水溶液按1∶1(V/V)混合，再将由(4)制得的样品浸入其中浸泡4h。然后依次在40％、30％、20％、10％的丙酮水溶液中缩聚。

(6)将抗凝血处理后的样品在医用消毒酒精中浸泡6h，水冲，凉干。

实施例5：

(2)取一定量的聚乳酸(Mw：3×10⁵)溶解在1、4-二氧六环中，配成浓度为30(W/V)％的溶液并加入1(W/V)％的氯化钠，均匀混合后涂覆于(1)中模具上，冻干、成膜。

(3)用去离子水浸泡该样品，除去其中的制孔剂，再用二甲苯脱模，得孔径为70-200μm，孔隙率为65％的多管道支架材料。

(4)在真空条件下，将上述制得的多管状支架材料浸泡在I型胶原的酸溶液中(pH 3.2，0.3wt％)。然后将孔隙充满了胶原溶液的多管状支架材料在-20℃下冷冻12h，再冻干，以形成胶原微海绵。在37℃下，用戊二醛蒸气处理胶原微海绵4h，使得胶原微海绵进一步交联。最后，用去离子水清洗再冻干，制备混合海绵体。

(5)将丙酮与1wt％的羧基化硫酸酯化壳聚糖水溶液按1∶1(V/V)混合，再将由(4)制得的样品浸入其中浸泡6h。然后依次在40％、30％、20％、10％的丙酮水溶液中缩聚。

(6)将上述样品在医用消毒酒精中浸泡6h，水冲，凉干。

实施例6：

(1)将切片石蜡与硬脂酸按1.5∶1(W/W)比例在烧杯中加热至80℃混合制坯，然后刻成细网状模具。

(2)取一定量的聚乳酸(Mw：3×10⁵)溶解在1、4-二氧六环中，配成浓度为35(W/V)％的溶液并加入1(W/V)％的氯化钠，均匀混合后涂覆于(1)中模具上，冻干、成膜。

(3)用去离子水浸泡该样品，除去其中的制孔剂，再用二甲苯脱模得孔径为90-300μm，孔隙率为75％的多管道支架材料。

(4)在真空条件下，将上述制得的多管状支架材料浸泡在I型胶原的酸溶液中(pH 3.2，O.3wt％)。然后将孔隙充满了胶原溶液的多管状支架材料在-80℃下冷冻12h，再冻干，以形成胶原微海绵。在37℃下，用戊二醛蒸气处理胶原微海绵4h，使得胶原微海绵进一步交联。最后，用去离子水清洗再冻干，制备混合海绵体。

(5)将丙酮与1.5wt％的羧基化硫酸酯化壳聚糖水溶液按1.5∶1(V/V)混合，再将由(4)制得的样品浸入其中浸泡8h。然后依次在40％、30％、20％、10％的丙酮水溶液中缩聚。

(6)将上述样品在医用消毒酒精中浸泡6h，水冲，凉干。

上述各实施例所制得的体内可降解管状肝组织框架材料经动物实验测定，可在一个月内维持其结构和形状，然后逐步形成新的肝组织。

Claims

1、一种体内可降解管状肝组织框架材料的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(2)以1，4-二氧六环为溶剂，配制浓度为5～35(W/V)％的可降解高分子材料聚乳酸、聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物或聚己内酯溶液，加入制孔剂，并涂覆于上述模具上，冻干成膜；

(4)将上述样品在氢氧化钠溶液中活化后，在交联剂1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液中浸泡，用2-(N-吗啉)-乙烷-磺酸作为稳定剂，在明胶水溶液或胶原蛋白、壳聚糖醋酸溶液中偶联反应；

2、按照权利要求1所述的一种体内可降解管状肝组织框架材料的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的制孔剂为碳酸氢铵、碳酸氢钠、过氧水、磷酸氢二钠、氯化钠中的任一种。

3、按照权利要求1或2所述的一种体内可降解管状肝组织框架材料的制备方法，其特征在于其制孔剂与可降解高分子材料溶液的比例为0.5～1.5(W/V)％。

4、按照权利要求1所述的一种体内可降解管状肝组织框架材料的制备方法，其特征在于步骤(5)所述抗凝血药物为肝素钠或阿司匹林。

5、按照权利要求1或2所述的一种体内可降解管状肝组织框架材料的制备方法，其特征在于由步骤(3)制得的多管状支架材料，还可将其在真空条件下浸泡在胶原盐酸溶液中，然后冻干，以形成胶原微海绵；用戊二醛蒸气处理胶原微海绵，使其交联，然后用去离子水清洗、冻干，再按步骤(5)、(6)进行制备。