CN102977391A - 一种在组织工程支架上定量装载生长因子的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种运用分子层层组装技术在组织工程支架中定量装载生长因子的方法，包括如下步骤：a．将组织工程支架浸于活性组分Ⅰ水溶液中1~8小时；b．将完成步骤a的组织工程支架取出并清洗掉多余的活性组分Ⅰ；c．将完成步骤b的组织工程支架浸于生长因子水溶液中1~2小时；d．将完成步骤c的组织工程支架浸于活性组分Ⅱ水溶液中1~8小时；e．将完成步骤d的组织工程支架取出并清洗掉多余的活性组分Ⅱ；f．重复a-e步骤n次，0≤n≤100。本发明通过活性组分、生长因子与支架之间的相互作用将生长因子层层组装在支架网络中，改变组装的层数和成份可以定量装载并控制释放生长因子，此方法简单实用，可控性强，清洁低成本。

Description

一种在组织工程支架上定量装载生长因子的方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，尤其是一种在组织工程支架中运用层层组装技术定量装载生长因子的方法。

背景技术

生物支架的制备是组织工程学研究的重要内容之一，理想的生物支架应具备以下特性：1.具有良好的生物相容性，能促进细胞的黏附并为细胞在其表面增殖提供适宜的微环境，在体外培养时无细胞毒性，植入体内时不会引起机体炎症和排斥反应；2.具有三维立体结构，内部互相贯通形成开放孔道结构，为细胞提供足够的黏附空间，并利于营养物质和代谢产物的传输；3.具有生物可降解性，与细胞的增殖速度相匹配，且降解产物对细胞繁殖无害，容易被机体代谢或吸收；4.可塑性强，方便构建与需要再生、修复的组织器官相同的外形；5.具有与被移植组织器官相适应的力学性能；6.方便消毒杀菌处理，且不影响材料的性质。

生长因子是细胞分泌的、具有诱导和刺激细胞增殖、维持细胞存活等生物效应的水溶性蛋白质，对细胞增殖、组织或器官的修复和再生都具有重要的促进作用，是组织工程的关键因素之一。一般来讲，生长因子在水中及室温环境下很容易失去活性，因此直接使用生长因子会因为环境因素而失活,达不到预期的生物效应。将药物控释技术引入组织工程，即由适宜的支架材料装载各种生长因子，在准确的时间和部位按一定剂量向种子细胞持续释放，从而促进细胞的生长和分化，能有效引导组织再生。

生长因子装载于组织工程支架上的方法主要有共混、凝胶、微球包埋及化学键合4种，其结合方式不同造成生长因子的释放机制也有所差异。1.共混的方法是将生长因子直接与生物材料混和成型得到多孔的三维支架，是最简单的装载方法。然而，由于大多数加工成型过程在高温或有机溶剂的条件下进行,极易造成生长因子的失活。简单的共混使生长因子与材料之间没有任何相互作用，仅靠扩散实现生长因子地释放，不易实现对释放速率的控制，极易出现突释现象。2.凝胶的方法是指将生长因子固定在凝胶的交联网络中，随着交联键的断裂和凝胶支架的水解缓慢地释放生长因子。凝胶是组织工程中常用的支架材料，它不但具有良好的亲水性、生物降解性,而且其交联网络的多孔结构利于细胞活性物质的传递和细胞的迁移。采用凝胶法将生长因子固定在凝胶网络中，生长因子释放速率受凝胶降解速率的控制，因而对生长因子控释效率大大提高。但是，在化学交联过程中生长因子也容易被破坏而失去活性。3.微球包埋的方法是将生长因子包埋于聚合物微球中形成胶囊从而控制释放生长因子的方法。其中载体多为生物相容性良好且可生物降解的聚合物材料。生长因子凭借扩散作用和聚合物载体的降解而释放，因此其释放速率可由载体的降解速率控制。生长因子在微球内部不受周围环境的影响，可以较好地保持其生物活性。微球包埋法使高分子载体支架对生长因子有了进一步的控制。但是由于载体和生长因子之间仍然没有任何相互作用，对其释放的控制只停留在物理水平上。4.化学键合的方法是采用化学的方法将生长因子键合在载体支架上，可以对生长因子的释放提供更精确的控制。可逆的化学键合可以通过载体周围生长因子浓度的变化来促进生长因子的释放。不可逆的化学键合可以将生长因子固定在载体材料内部，通过调节载体材料的降解、化学键的断裂而达到生长因子的持续释放。所使用的载体多为生物降解性好的亲水性聚合物，其中的亲水基团对生长因子有很好的亲和力,可以减少其变性的可能性。

以凝胶装载生长因子的方法为例，Lee等将不同量的血管内皮生长因子(VEGF)或成纤维细胞生长因子(FGF)加入海藻酸钠的溶液中，搅拌均匀后加入硫酸钙水溶液中，由于Ca²⁺与海藻酸盐中带有负电的羧酸基团发生离子间相互作用使体系凝胶化，得到装载生长因子的水凝胶支架。两种生长因子在培养基中的释放曲线见图1。(Kuen Yong Lee,Martin C.Peters,David J.Mooney.Comparison of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factoron angiogenesis in SCID mice.Journal of Controlled Release,2003,87,49-56.)

上述凝胶法装载并释放生长因子的缺点在于：

1.生长因子的装载量无法控制。在生长因子装载过程中，仅通过改变生长因子的加入量来调控其装载量，由于生长因子的可溶性，无法准确控制凝胶形成过程中生长因子的装载量。生长因子装载过少无法获得特定的生物效应，装载过多可能引起细胞生长失控、组织畸形、甚至肿瘤生成等不良后果。

2.破坏生长因子的活性。水凝胶形成过程中Ca²⁺浓度，交联度等因素可能影响生长因子分子上的活性位点，导致其活性降低。

3.无法精确控制生长因子的释放行为。由于海藻酸盐水凝胶的降解速率缓慢且难以控制，而生长因子与海藻酸钠分子之间不存在特殊的相互作用，因此，生长因子的释放行为由水凝胶的交联度和分子扩散作用决定。然而这两种决定因素无法精确控制，造成生长因子的释放行为无法精确调控，降低生长因子的时效性。

层层组装技术(Layer-by-Layer assembly technique,LbL)最初是基于聚电解质所带正负电荷间相互作用开发的一种超分子自组装技术，而后拓展到氢键作用、疏水作用及生物分子间特异性识别作用等都可以作为层层自组装膜的驱动力，这大大延伸了此技术在生物材料制备及改性中的应用潜力，组装材料涉及功能性聚电解质、生物活性分子、纳米粒子、有机/无机微粒、细菌、病毒等。在组织工程领域，运用层层组装技术装载生长因子具有如下优势：1.组装分子的选择范围广泛。生物活性分子（如蛋白质、多糖、DNA等）都含有分子间相互作用位点，只要可以特异性结合生长因子都可以用于装载生长因子。2.制备工艺简单。通过简单的交替浸涂技术可以实现生物活性分子的组装，改变组装的成份和层数可以调控生物活性分子的含量，并通过分子特异性识别作用调控生长因子的装载量。3.生长因子装载过程温和。可在常温水溶液中进行，从而保持生长因子的生物活性。由于在支架材料制备过程之后装载生长因子，制备过程中存在的高温、有机溶剂、交联剂等不利因素可以避免。4.精确控制生长因子的释放行为。组装过程中生物活性分子的含量通过组装成份和层数进行调控，同时生物活性分子与生长因子分子之间存在特异性识别作用。装载于支架材料表面的生长因子，除扩散作用外，分子特异性识别作用直接影响其释放行为，因此调控组装过程可以精确控制生长因子的释放行为。

发明内容

针对支架材料中生长因子失活、无法定量装载，无法控制释放等问题，本发明的目的在于运用层层组装技术在组织工程支架中定量装载生长因子，提供一种简单实用，可控性强，清洁低成本的方法定量装载生长因子。

一种在组织工程支架上定量装载生长因子的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a．将组织工程支架浸于活性组分Ⅰ水溶液中1~8小时；

b．将完成步骤a的组织工程支架取出并清洗掉多余的活性组分Ⅰ；

c．将完成步骤b的组织工程支架浸于生长因子水溶液中1~2小时；；

d．将完成步骤c的组织工程支架浸于活性组分Ⅱ水溶液中1~8小时；

e．将完成步骤d的组织工程支架取出并清洗掉多余的活性组分Ⅱ；

f．重复a-e步骤n次，0≤n≤100。

其中，所述组织工程支架、活性组分Ⅰ或活性组分Ⅱ、生长因子之间是通过静电、氢键、范德华力、疏水作用、共价键、分子特异性识别作用中的至少一种作用力相互结合的。所述活性组分Ⅰ和活性组分Ⅱ可以根据组织工程支架表面分子的电荷、组成、化学键以及目标组织的细胞外基质成分等因素选择，所述生长因子根据组织工程支架的特定功能选择。

所述活性组分Ⅰ在其水溶液中的质量百分比为0.1~1wt.%；所述活性组分Ⅱ在其水溶液中的质量百分比为0.1~1wt.%；所述生长因子水溶液的浓度为10~20ng/mL。

进一步地，所述活性组分Ⅰ是软骨素、透明质酸、肝素、粘多糖、纤维粘连蛋白、层连蛋白中的一种。

进一步地，所述活性组分Ⅱ是壳聚糖、赖氨酸、胶原中的至少一种。

进一步地，所述生长因子选自成纤维细胞生长因子、转化生长因子、骨形成蛋白、血管内皮生长因子、内皮细胞生长因子中的至少一种。

进一步地，所述组织工程支架包括水凝胶支架，所述水凝胶支架是由凝胶组分通过交联剂相互交联获得。

进一步地，所述凝胶组分是壳聚糖、胶原、海藻酸钠、海藻酸钾、聚乙烯醇、聚丙烯酸中的至少一种。

进一步地，所述交联剂是京尼平水溶液、CaCl₂水溶液、BaCl₂水溶液、FeCl₃水溶液、CrCl₃水溶液、戊二醛水溶液、乙二醇二甲基丙烯酸酯水溶液中的至少一种。

本发明还提供另一种在组织工程支架上定量装载生长因子的方法，步骤如下：

a．将组织工程支架浸于活性组分Ⅰ水溶液中1~8小时；

b．将完成步骤a的组织工程支架取出并清洗掉多余的活性组分Ⅰ；

c．将完成步骤b的组织工程支架浸于活性组分Ⅱ水溶液中1~8小时；

d．将完成步骤c的组织工程支架取出并清洗掉多余的活性组分Ⅱ；

e．重复a-d步骤n次，0≤n≤100；

f．将完成步骤e的组织工程支架浸于生长因子水溶液中1~2小时。

本发明还提供这种在组织工程支架中运用层层组装技术定量装载生长因子的方法及其在制备医疗器械中的应用。

本发明在组织工程支架上运用层层组装技术装载生长因子，通过活性组分与生长因子的特异性识别作用，改变组装的层数和成份可以定量装载生长因子。该方法简单实用，可控性强，清洁低成本。

附图说明

图1为现有技术中生长因子VEGF(°)和FGF(·)在海藻酸盐水凝胶支架中的释放曲线图。

图2为本发明实施例1在水凝胶支架上定量装载并控制释放生长因子的流程图。

图3为本发明实施例1水凝胶支架中生长因子FGF装载量随生物活性分子软骨素组装层数的变化图。

图4为本发明实施例1未组装软骨素(°)和组装软骨素(·)的水凝胶支架中生长因子FGF释放率随释放时间的变化图。

具体实施方式

在下文将结合附图及实施实例对本发明进行详细描述，其目的是使本技术领域技术人员更容易理解本发明的实施及优点，而不能构成对本发明的限制。

除非在本发明说明书中另有定义，否则在此所有的技术术语都是根据本领域一般技术人员所通常使用和理解的惯用定义来使用。

实施例1

运用层层组装技术在水凝胶支架上定量装载并控制释放生长因子的流程见图2。

本实施例的组织工程支架是采用交联剂和凝胶组分制备的水凝胶支架，例如，交联剂是京尼平水溶液、CaCl₂水溶液、BaCl₂水溶液、FeCl₂水溶液、CrCl₂水溶液、戊二醛水溶液、乙二醇二甲基丙烯酸酯水溶液中的至少一种，凝胶组分是壳聚糖、胶原、海藻酸钠、海藻酸钾、聚乙烯醇、聚丙烯酸中的至少一种，两者发生交联反应获得水凝胶支架。具体制备方法可参见申请号为：201010237869.X的发明申请“生物大分子的水凝胶生物支架及其制备方法”。

配制0.2wt.%软骨素水溶液作为活性组分Ⅰ溶液；0.2wt.%壳聚糖水溶液（含0.1wt.%醋酸）作为活性组分Ⅱ水溶液；10ng/mL成纤维细胞生长因子FGF（下简称FGF）水溶液备用。然后采用层层组装技术通过下列步骤在水凝胶支架中装载生长因子：

a.将壳聚糖水凝胶支架浸入0.2wt.%软骨素水溶液中2h，使水凝胶支架上组装上一层软骨素。根据不同的组装浓度需要，浸泡过程可以适当延长，一般浸泡时长达到8小时可保证装载完成。

b.然后将组装有软骨素的水凝胶支架置于纯水中浸泡2h，清洗掉多余软骨素。当组装到一定数量的软骨素分子，由于静电作用的减弱，壳聚糖与软骨素之间的静电作用已不足组装更多的软骨素分子，此时软骨素的组装达到饱和，一些组装不牢固的软骨素将被清洗掉。

c.将完成步骤b的水凝胶支架浸入10ng/mL FGF水溶液中2h装载FGF。FGF与软骨素是通过静电作用和分子特异性识别作用的方式结合。根据不同的组装浓度需要，浸泡过程可以适当延长，一般浸泡时长达到2小时可保证装载完成。

d.将完成步骤c的水凝胶支架浸入0.2wt.%壳聚糖水溶液中2h，在组装有软骨素和FGF的水凝胶支架上，通过静电作用组装一层壳聚糖。根据不同的组装浓度需要，浸泡过程可以适当延长，一般浸泡时长达到8小时可保证装载完成。

e.同样地，待软骨素、FGF、壳聚糖之间的静电吸附达到饱和，将完成步骤d的水凝胶支架置于纯水中浸泡1h，清洗掉多余壳聚糖。

本实施例重复上述步骤a~e为10次。根据需要重复以上步骤a~e步骤n次，0≤n≤100，装载FGF步骤可以增加或减少，也可以在组装过程完成后进行，从而调控FGF在壳聚糖水凝胶支架中的装载量。

下面是含不同层数组装结构的壳聚糖水凝胶支架中生长因子FGF的装载量测试。

通过酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测生长因子FGF水溶液中FGF浓度，比较装载FGF前后生长因子FGF水溶液中FGF的浓度变化计算壳聚糖水凝胶组织结构中FGF的装载量。组装不同层数软骨素的壳聚糖水凝胶支架中生长因子FGF的装载量变化见图3。由图可知，通过软骨素组装层数的变化可以调控壳聚糖水凝胶组织结构中生长因子FGF的装载量。

下面是含不同层数组装结构的壳聚糖水凝胶支架中生长因子FGF释放行为测试。

将装载生长因子FGF的壳聚糖水凝胶组织结构置于1mL PBS水溶液中，通过酶联免疫吸附实验检测PBS水溶液中FGF浓度并计算FGF释放量，比较FGF释放量和装载量计算壳聚糖水凝胶组织结构中FGF的释放率。未组装生物活性分子软骨素(°)和组装软骨素(·)的壳聚糖水凝胶组织结构中生长因子FGF释放率随释放时间的变化曲线见图4。由图可知，在壳聚糖水凝胶支架中通过组装软骨素可以控制释放生长因子FGF。

实施例2

本实施与实施例1不同的是，将壳聚糖水凝胶支架浸入0.1wt.%肝素水溶液中2h在支架上组装肝素，然后置于纯水中1h清洗多余肝素；将水凝胶支架浸入20ng/mL血管内皮生长因子VEGF（以下简称VEGF）水溶液中2h装载VEGF；将水凝胶支架浸入0.2wt.%壳聚糖水溶液中2h在支架上组装壳聚糖，然后置于纯水中1h清洗多余壳聚糖。本实施例重复上述步骤20次。根据需要重复以上步骤，装载VEGF步骤可以增加或减少，也可以在组装过程完成后进行。由此在水凝胶支架上装载VEGF。

实施例3

本实施与实施例1不同的是，将胶原水凝胶支架浸入0.4wt.%软骨素水溶液中8h在支架上组装软骨素，然后置于纯水中1h清洗多余软骨素；将水凝胶支架浸入10ng/mL成纤维细胞生长因子CB-FGF（通过基因工程制备的特异性结合的生长因子，如与胶原特异性识别，以下简称CB-FGF）水溶液中2h装载CB-FGF；将水凝胶支架浸入1wt.%胶原水溶液中3h在水凝胶支架上组装胶原，然后置于纯水中1h清洗多余胶原。本实施例重复上述步骤30次。根据需要重复以上步骤，装载CB-FGF步骤可以增加或减少，也可以在组装过程完成后进行。由此在水凝胶支架上装载CB-FGF。

实施例4

本实施与实施例1不同的是，首先将壳聚糖水凝胶支架浸入1wt.%肝素水溶液中2h在支架上组装肝素，然后置于纯水中1h清洗多余肝素；将水凝胶支架浸入0.2wt.%壳聚糖水溶液中6h在水凝胶支架上组装壳聚糖，然后置于纯水中1h清洗多余壳聚糖。重复以上步骤10次，然后将水凝胶支架浸入10ng/mL内皮细胞生长因子EGF（以下简称EGF）水溶液中1h装载EGF，其中肝素组份可以通过静电及分子特异性识别作用与EGF结合。由此获得在水凝胶支架上装载EGF。

实施例5

本实施与实施例1不同的是，首先将胶原水凝胶支架浸入0.4wt.%肝素水溶液中3h在水凝胶支架上组装肝素，然后置于纯水中1h清洗多余肝素；将水凝胶支架浸入10ng/mL生长因子FGF水溶液中2h装载FGF；将水凝胶支架浸入0.2wt.%胶原水溶液中8h在水凝胶支架上组装胶原，然后置于纯水中1h清洗多余胶原。本实施例重复上述步骤40次。根据需要重复以上步骤，装载FGF步骤可以增加或减少，也可以在组装过程完成后进行。由此获得在水凝胶支架上装载FGF。

在其他实施例中生长因子还可以是转化生长因子TGF、骨形成蛋白BMP。

本发明中活性组分Ⅰ和活性组分Ⅱ可以根据组织工程支架表面分子的电荷、组成、化学键等因素选择。本发明中组织工程支架表面的初始电性为正值，故活性组分Ⅰ选择在水溶液中显负电性的分子，而生长因子呈现正电性，通过静电及分子特异性识别作用与活性组分Ⅰ结合；活性组分Ⅱ再通过静电作用装载到支架上，这样生长因子、活性组分Ⅰ和活性组分Ⅱ通过静电作用和分子特异性识别作用层层组装到支架上。同样地，修饰不同的组织工程支架也可以通过不同的作用力，例如还可以是氢键、范德华力、疏水作用、共价键或分子特异性识别作用等。本发明实施例中活性组分Ⅰ、活性组分Ⅱ、生长因子的选择不能构成对本发明的限制。

Claims (11)

1.一种在组织工程支架上定量装载生长因子的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a．将组织工程支架浸于活性组分Ⅰ水溶液中1~8小时；

b．将完成步骤a的组织工程支架取出并清洗掉多余的活性组分Ⅰ；

c．将完成步骤b的组织工程支架浸于生长因子水溶液中1~2小时；

d．将完成步骤c的组织工程支架浸于活性组分Ⅱ水溶液中1~8小时；

e．将完成步骤d的组织工程支架取出并清洗掉多余的活性组分Ⅱ；

f．重复a-e步骤n次，0≤n≤100。

2.根据权利要求1所述装载生长因子的方法，其特征在于，所述组织工程支架、活性组分Ⅰ或活性组分Ⅱ、生长因子之间是通过静电、氢键、范德华力、疏水作用、共价键、分子特异性识别作用中的至少一种作用力相互结合的。

3.根据权利要求1或2所述装载生长因子的方法，其特征在于，所述活性组分Ⅰ在其水溶液中的质量百分比为0.1~1wt.%；所述活性组分Ⅱ在其水溶液中的质量百分比为0.1~1wt.%；所述生长因子水溶液的浓度为10~20ng/mL。

4.根据权利要求3所述装载生长因子的方法，其特征在于，所述活性组分Ⅰ是软骨素、透明质酸、肝素、粘多糖、纤维粘连蛋白、层连蛋白中的至少一种。

5.根据权利要求3所述装载生长因子的方法，其特征在于，所述活性组分Ⅱ是壳聚糖、赖氨酸、胶原中的至少一种。

6.根据权利要求3所述装载生长因子的方法，其特征在于，所述生长因子选自成纤维细胞生长因子、转化生长因子、骨形成蛋白、血管内皮生长因子、内皮细胞生长因子中的至少一种。

7.根据权利要求1所述装载生长因子的方法，其特征在于，所述组织工程支架包括水凝胶支架，所述水凝胶支架是由凝胶组分通过交联剂相互交联获得。

8.根据权利要求7所述装载生长因子的方法，其特征在于，所述凝胶组分是壳聚糖、胶原、海藻酸钠、海藻酸钾、聚乙烯醇、聚丙烯酸中的至少一种。

9.根据权利要求7或8所述装载生长因子的方法，其特征在于，所述交联剂是京尼平水溶液、CaCl₂水溶液、BaCl₂水溶液、FeCl₃水溶液、CrCl₃水溶液、戊二醛水溶液、乙二醇二甲基丙烯酸酯水溶液中的至少一种。

10.根据权利要求1~9任一项所述在组织工程支架上定量装载生长因子的方法，采用以下步骤代替：

a．将组织工程支架浸于活性组分Ⅰ水溶液中1~8小时；

b．将完成步骤a的组织工程支架取出并清洗掉多余的活性组分Ⅰ；

c．将完成步骤b的组织工程支架浸于活性组分Ⅱ水溶液中1~8小时；

d．将完成步骤c的组织工程支架取出并清洗掉多余的活性组分Ⅱ；

e．重复a-d步骤n次，0≤n≤100；

f．将完成步骤e的组织工程支架浸于生长因子水溶液中1~2小时。

11.一种根据权利要求1~10任一项所述的在组织工程支架中装载生长因子的方法在制备医疗器械中的应用。

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