CN109224128A - 负载生物活性因子的胶原支架的缓释体系与其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种负载生物活性因子的胶原支架的缓释体系及其构建方法。所述的构建方法包括：将胶原支架于包含一种以上融合有胶原特异性结合肽的生物活性因子溶液中浸渍后清洗，除去未结合在所述胶原支架上的生物活性因子；以及，将胶原支架置入高分子溶液中并反应；对胶原支架进行清洗后，再置入胶原溶液中浸渍，之后再进行清洗。本发明提供的负载生物活性因子的胶原支架的缓释体系生物相容性良好，可实现生物活性因子的长期缓慢并可控的释放，释放量和释放速率稳定可控，可杜绝“突释”现象，同时其构建方法简单，可控性好，反应条件温和，在生物组织损伤修复、药物的缓控释等方面具有巨大的应用潜力。

Description

负载生物活性因子的胶原支架的缓释体系与其构建方法
技术领域
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种负载一种或多种生物活性因子的胶原支架的缓释体系、其构建方法及应用。
背景技术
脊髓损伤的修复目前为止仍是全球性的医学难题，给个人、家庭和社会带来沉重的负担。越来越多的研究者已经证明，损伤部位神经营养因子的匮乏是阻碍损伤修复的重要因素之一。因此，对损伤部位神经营因子的补充就成为脊髓损伤治疗的突破口之一。
目前，发现的具有神经营养作用的因子主要有，脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子NT-3、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等，具有保护神经元，促进感觉和运动神经元轴突生长的功能。
然而，神经营养因子释放入培养液后，很短时间内就会失活，只有很少部分因子能发挥与细胞的相互作用，治疗效果大打折扣。因此，如何建立行之有效的缓释策略使蛋白因子在治疗期间在损伤部位都能形成有效治疗浓度十分必要。
传统的缓释策略大多采用微囊微球包裹蛋白因子再负载于支架材料上，依靠包裹材料的降解缓慢释放蛋白因子，而这种方法的一个重大缺陷是负载的粒子不稳定，容易从支架上滑脱。另外，也有研究者将蛋白因子与凝胶材料共混，构建蛋白因子缓释支架，在这种方法中，由于蛋白因子参与了凝胶支架的制备过程，可能会经历有机溶剂、冻干、灭菌等过程，容易造成活性的丧失。近年来，层层自组装的方法被引入到药物的缓释体系中，目前为止，其中大多数方法利用的都是氢键、范德华力、疏水作用、共价键、亲水作用等作用力相互结合，但是这些方式的结合力弱或稳定性差，使得由此形成的缓释体系也仍然存在药物释放速度和释放量难以稳定控制等缺陷，例如会出现“突释”，导致治疗效果差，甚至会带来副作用。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种负载生物活性因子的胶原支架的缓释体系、其构建方法及应用，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种负载生物活性因子的胶原支架的缓释体系的构建方法，其包括：
(1)将胶原支架于包含一种以上融合有胶原特异性结合肽的生物活性因子的生物活性因子溶液中浸渍；
(2)清洗除去未结合在所述胶原支架上的生物活性因子；
(3)将经步骤(2)处理后的胶原支架置入至少含有能与胶原结合的可降解的高分子的溶液中并反应；
(4)对经步骤(3)处理后的胶原支架进行清洗；
(5)将经步骤(4)处理后的胶原支架于胶原溶液中浸渍；
(6)对经步骤(5)处理后的胶原支架进行清洗。
在一些较佳实施方案中，所述的构建方法还包括步骤(7)：重复步骤(1)～步骤(6)的操作一次或多次。
本发明实施例还提供了由所述方法构建的负载生物活性因子的胶原支架的缓释体系。
本发明实施例还提供了一种负载生物活性因子的胶原支架的缓释体系，其包括：
胶原支架，
直接结合于胶原支架上的一种以上融合有胶原特异性结合肽的生物活性因子，以及
依次于胶原支架上自组装形成的至少一高分子材料层和至少一胶原层，且至少部分的所述生物活性因子被所述高分子材料层和胶原层包覆。
在一些较佳实施方案中，所述的缓释体系包括交替设置的多个高分子材料层和多个胶原层，其中至少部分的胶原层上结合有所述的生物活性因子。
进一步的，前述胶原支架包括胶原海绵支架、胶原束或胶原膜等，例如可以优选为胶原束。
进一步的，前述融合有胶原特异性结合肽的生物活性因子至少选自CBD-BDNF，CBD-bFGF和CBD-VEGF中的任意一种或多种的组合，且不限于此。
本发明实施例还提供了所述负载生物活性因子的胶原支架的缓释体系于制备具有生物组织损伤修复功能的产品或至少具有缓释功能的药物中的用途。优选的，所述产品至少具有长效的生物组织损伤修复功能。
与现有技术相比，本发明提供的负载生物活性因子的胶原支架的缓释体系生物相容性良好，可实现生物活性因子的长期缓慢并可控的释放，释放量和释放速率稳定可控，可杜绝“突释”现象，同时其构建方法简单，可控性好，反应条件温和，在生物组织损伤修复、药物的缓控释等方面具有巨大的应用潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明结构特征和技术要点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
图1是本发明一典型实施方案中一种负载生物活性因子的胶原支架的缓释体系的层层自组装原理图。
图2是本发明实施例1采用的一种胶原束的横切SEM图。
图3是本发明实施例1中一种负载CBD-BDNF的胶原缓释体系的构建流程示意图。
图4是本发明实施例1-实施例3所构建的各缓释体系的CBD-bFGF的累积释放曲线。
图5是本发明实施例1构建的典型缓释体系、空白对照组和阳性对照组的H&E染色结果。
图6是本发明实施例2构建的典型缓释体系、空白对照组和阳性对照组的H&E染色结果。
图7是本发明实施例3构建的典型缓释体系、空白对照组和阳性对照组的H&E染色结果。
具体实施方式
本发明实施例一个方面提供的一种负载生物活性因子的胶原支架的缓释体系的构建方法包括：
(1)将胶原支架于包含一种以上融合有胶原特异性结合肽的生物活性因子溶液中浸渍；
(2)清洗除去未结合在所述胶原支架上的生物活性因子；
(3)将经步骤(2)处理后的胶原支架置入至少含有能与胶原结合的可降解的高分子的溶液中并反应；
(4)对经步骤(3)处理后的胶原支架进行清洗；
(5)将经步骤(4)处理后的胶原支架于胶原溶液中浸渍；
(6)对经步骤(5)处理后的胶原支架进行清洗。
在一些优选实施方案中，所述胶原支架包括胶原海绵支架、胶原束或胶原膜等，优选为胶原束。
在一些优选实施方案中，所述融合有胶原特异性结合肽的生物活性因子至少选自CBD-BDNF(脑源性神经营养因子)、CBD-bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、CBD-VEGF(血管内皮生长因子)中的任意一种或多种的组合，且不限于此。
尤其优选的，所述生物活性因子选自CBD-BDNF，CBD-bFGF和CBD-VEGF中的两种以上的组合。
当然，针对不同的实际应用需求，所述融合有胶原特异性结合肽的生物活性因子亦可选用其它的功能性生物活性因子。
在一些较为优选的实施方案中，步骤(1)中所述生物活性因子溶液中生物活性因子的浓度可以依据实际需求而定，例如可以为在1ug/ml以上，优选为10ug/ml～100ug/ml，尤其优选为20ug/ml～50ug/ml。
进一步的，所述高分子包括PEG、海藻酸钠、肝素中的任意一种或多种的组合，且不限于此。其中，所述的高分子的溶液的浓度可以依据实际需求而定，例如：
在一些较为优选的实施方案中，步骤(3)中所述高分子溶液所含PEG的浓度为0.1mg/ml～10mg/ml，优选为1mg/ml～5mg/ml，尤其优选为1mg/ml～3mg/ml。
在一些较为优选的实施方案中，步骤(3)中所述高分子溶液所含海藻酸钠的浓度为0.1mg/ml～10mg/ml，优选为1mg/ml～5mg/ml，尤其优选为1mg/ml～3mg/ml。
在一些较为优选的实施方案中，步骤(3)中所述高分子溶液所含肝素的浓度为0.1mg/ml～10mg/ml，优选为1mg/ml～5mg/ml，尤其优选为1mg/ml～3mg/ml。
在一些较为优选的实施方案中，所述步骤(5)中胶原溶液的浓度也可以依据实际需求而定，例如可以为0.5mg/ml-5mg/ml，优选为1mg/ml-3mg/ml。
在一些较为优选的实施方案中，所述的构建方法还包括步骤(7)：重复步骤(1)～步骤(6)的操作一次或多次。其中，重复的次数可以依据实际应用的需求(例如需修复的生物组织的损伤的尺寸等等)而定。例如，可以重复步骤(1)～步骤(6)的操作n次，2≤n≤50。一般而言，重复的次数越多，则所形成的缓释体系所负载的生物活性因子越多，缓释的时间越长，但相应也会使缓释体系的体积增大。
在一些较为优选的实施方案中，所述的构建方法还可包括步骤(8)：重复步骤(1)～步骤(2)或者重复步骤(1)～步骤(4)。
请参阅图1所示是本发明一典型实施方案中一种所述缓释体系的层层自组装原理图。
在一些较为优选的实施方案中，步骤(1)包括：将胶原支架于所述生物活性因子溶液中浸渍10min～100min。其中，浸渍的时间也可以依据实际需求而适当的缩减或延长，例如可以优选为20min～50min。
在一些较为优选的实施方案中，步骤(3)包括：将经步骤(2)处理后的胶原支架置入所述高分子溶液中并反应10min～100min。其中，浸渍的时间也可以依据实际需求而适当的缩减或延长，例如可以优选为20min～50min。
在一些较为优选的实施方案中，步骤(5)包括：将经步骤(4)处理后的胶原支架于胶原溶液中浸渍10min～100min。其中，浸渍的时间也可以依据实际需求而适当的缩减或延长，例如可以优选为20min～50min。
本发明的前述缓释体系的构建方法以胶原支架作为模板，通过层层自组装技术实现一种或多种融合有胶原特异性结合肽(--CBD)的生物活性因子在胶原支架上的负载，使得形成的缓释体系可实现长期缓慢并可控的释放生物活性因子，释放量和释放速率可控有效，避免了突释现象。而且，在前述缓释体系的构建方法中，可以根据实际需求而调整生物活性因子的种类及数目、组装层数等等，可控性高，稳定性好，反应条件温和，操作简单，所采用的材料生物相容性良好。
本发明实施例另一个方面提供了由所述方法构建的负载生物活性因子的胶原支架的缓释体系。
本发明实施例另一个方面提供的一种负载生物活性因子的胶原支架的缓释体系包括：
胶原支架，
直接结合于胶原支架上的一种以上融合有胶原特异性结合肽的生物活性因子，以及
依次于胶原支架上自组装形成的至少一高分子材料层和至少一胶原层，且至少部分的所述生物活性因子被所述高分子材料层和胶原层包覆。
在一些较为优选的实施方案中，所述的缓释体系包括交替设置的N个高分子材料层和N个胶原层，其中至少部分的胶原层上结合有所述的生物活性因子，N为大于或等于2的整数。优选的，2≤N≤50。优选的，该N个胶原层上均结合有所述的生物活性因子。
在一些较为优选的实施方案中，所述胶原支架包括胶原海绵支架、胶原束或胶原膜等多种形式的，且不限于此，优选为胶原束。
在一些较为优选的实施方案中，所述融合有胶原特异性结合肽的生物活性因子至少选自CBD-BDNF，CBD-bFGF和CBD-VEGF中的任意一种或多种的组合，且不限于此。
尤其优选的，所述生物活性因子选自CBD-BDNF，CBD-bFGF和CBD-VEGF中的两种以上的组合。
在一些较为优选的实施方案中，所述高分子材料层主要由能与胶原结合的、可降解的高分子组成。优选的，所述高分子至少选自PEG、海藻酸钠和肝素中的任意一种或多种的组合，且不限于此。
本发明中前述各种类型的胶原支架均是可以通过本领域已知的方式制取，此处不再赘述。
本发明中前述CBD-BDNF，CBD-bFGF和CBD-VEGF等可以通过本领域已知的方式获取的。在本发明的前述实施方案中，利用可以通过物理和/或化学方式与胶原结合的、且可以降解的高分子于胶原支架上形成高分子层，其一方面可作为屏障膜层，保护结合在胶原支架及胶原层上的生物活性因子免受溶液冲刷和脱吸附扩散，同时依靠高分子自身的降解性能来延缓生物活性因子的释放，达到长期缓释作用，另一方面通过使高分子与胶原结合，还可在层层自组装的过程中保证各组装层的稳固性。
在本发明的前述实施方案中，利用融合有胶原特异性结合肽的生物活性因子与胶原分子之间的特异性识别作用，可以实现生物活性因子从胶原支架上的缓慢扩散，同时因具有由前述层层自组装技术而产生的多层结构，使得其负载的生物活性因子的量更多且更为可控，同时生物活性因子在向外扩散的过程中，不断与外层的胶原分子层发生吸附与解吸附，发挥“双重缓释”的效果，使得释放速率和释放量可控有效，缓释效果更佳，可以从根本上杜绝突释现象。特别是，当在所述缓释体系中同时包含两种以上生物活性因子时，还可实现多种因子的联合治疗，使得生物组织损伤(例如血管、脊髓损伤)等的修复效果更佳，因此在生物组织损伤修复、药物的缓释等领域具有巨大应用前景。
相应的，本发明实施例的另一个方面还提供了所述负载生物活性因子的胶原支架的缓释体系于制备至少具有生物组织损伤修复功能的产品或至少具有缓释功能的药物中的用途。
例如，所述产品至少具有长效的生物组织损伤修复功能。
进一步的，所述的产品于治疗期间都能在损伤部位释放出达到有效治疗浓度的所述生物活性因子。
在下文中将结合附图及实施例对本发明进行详细描述，其目的是使本技术领域技术人员更容易理解本发明的实施及优点，而不能构成对本发明的限制。除非在本发明说明书中另有定义，否则在此所有的技术术语都是根据本领域一般技术人员所通常使用和理解的惯用定义来使用。
实施例1一种负载CBD-bFGF的胶原支架的缓释体系的构建方法包括：
(1)将胶原束(其形貌可参阅图2所示)置于浓度为1ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、50ug/ml、100ug/ml的CBD-bFGF溶液中10min～100min(优选为20min～50min)，使CBD-bFGF通过特异性识别作用负载于胶原束；
(2)用纯水清洗除去完成步骤(1)后胶原束上未结合的CBD-bFGF；
(3)将上述完成步骤(2)的胶原束浸于浓度为0.1mg/ml、1mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、10mg/ml的PEG溶液内10min～100min(优选为20min～50min)，使PEG分子通过氢键作用在上述支架的基础上形成PEG层；
(4)清洗完成步骤(3)的胶原束，除去未结合的PEG分子；
(5)将完成步骤(4)的胶原束浸入浓度为0.5mg/ml、1mg/ml、3mg/ml、5mg/ml的胶原溶液中10min～100min(优选为20min～50min)；
(6)清洗完成步骤(5)的胶原束，除去未结合的胶原分子；
(7)参阅图2所示，重复步骤(1)～(6)的操作15次，从而构建形成一系列所述的缓释体系，命名为Col(Col/CF/PEG)15。
空白对照组：与实施例1的操作基本相同，但仅采用了其中的步骤(3)-(6)，并重复步骤(3)-(6)的操作15次，获得的对照体系命名为Col(Col/PEG)15。
阳性对照组：
(1)将胶原束置于10ug/ml的CBD-bFGF溶液中孵育过夜，使CBD-bFGF通过特异性识别作用负载于胶原束；
(2)用纯水清洗除去完成步骤(1)后胶原束上未结合的CBD-bFGF，获得的阳性对照体系命名为Col/CF。
实施例2一种负载CBD-bFGF的胶原支架的缓释体系的构建方法包括：
(1)将胶原束置于浓度约10ug/ml的CBD-bFGF溶液中约15min；
(2)用纯水清洗除去完成步骤(1)后胶原束上未结合的CBD-bFGF；
(3)将上述完成步骤(2)的胶原束浸于浓度约2mg/ml的海藻酸钠(SA)溶液约10min，其中海藻酸钠带有丰富的负电荷，CBD-bFGF以及胶原都带有正电荷，可通过电性吸引作用组装于胶原束表面；
(4)清洗完成步骤(3)的胶原束，除去未结合的海藻酸钠分子；
(5)将完成步骤(4)的胶原束浸入浓度约1mg/ml的胶原溶液中约15min；
(6)清洗完成步骤(5)的胶原束，除去未结合的胶原分子；
(7)重复步骤(1)～(6)的操作15次，从而构建形成所述缓释体系，命名为Col(Col/CF/SA)15。
空白对照组：与实施例1的操作基本相同，但仅采用了其中的步骤(3)-(6)，并重复步骤(3)-(6)的操作15次，获得的对照体系命名为Col(Col/SA)15。
实施例3一种负载CBD-bFGF的胶原支架的缓释体系的构建方法包括：
(1)将胶原束置于浓度约30ug/ml的CBD-bFGF溶液中约30min；
(2)用纯水清洗除去完成步骤(1)后胶原束上未结合的CBD-bFGF；
(3)将上述完成步骤(2)的胶原束浸于浓度约3mg/ml的肝素(HP)溶液约30min，其中，肝素分子带有丰富的负电荷，可与带正电荷的CBD-bFGF以及胶原分子发生静电引力，在胶原束表面形成肝素分子层；
(4)清洗完成步骤(3)的胶原束，除去未结合的肝素分子；
(5)将完成步骤(4)的胶原束浸入浓度约3mg/ml的胶原溶液中约30min；
(6)清洗完成步骤(5)的胶原束，除去未结合的胶原分子；
(7)重复步骤(1)～(6)的操作15次，从而构建形成所述缓释体系，命名为Col(Col/CF/HP)15。
空白对照组：与实施例1的操作基本相同，但仅采用了其中的步骤(3)-(6)，并重复步骤(3)-(6)的操作15次，获得的对照体系命名为Col(Col/HP)15。
实施例4：本实施例与实施例1基本相同，区别之处在于：以CBD-BDNF替代了CBD-bFGF。
实施例5：本实施例与实施例2基本相同，区别之处在于：以CBD-VEGF替代了CBD-bFGF。
实施例6本实施例与实施例1～3的区别之处之处在于：在整个缓释体系中同时负载3种活性蛋白因子(CBD-BDNF、CBD-bFGF、CBD-VEGF)。具体步骤如下，
(1)将胶原束置于40ug/ml的CBD-BDNF溶液中30min；
(2)清洗除去胶原束上未结合的CBD-BDNF；
(3)将上述完成步骤(2)的胶原束浸于3mg/ml的肝素溶液30min；
(4)清洗完成步骤(3)的胶原束，除去未结合的肝素分子；
(5)将完成步骤(4)的胶原束浸入3mg/ml的胶原溶液中30min；
(6)清洗完成步骤(5)的胶原束，除去未结合的胶原分子；
(7)将完成步骤(6)的胶原束置于20ug/ml的CBD-VEGF溶液中30min；
(8)清洗胶原束，除去未结合的CBD-VEGF；
(9)将上述完成步骤(8)的胶原束浸于3mg/ml的肝素溶液30min；
(10)清洗完成步骤(9)的胶原束，除去未结合的肝素分子；
(11)将完成步骤(10)的胶原束浸入3mg/ml的胶原溶液中30min；
(12)清洗完成步骤(11)的胶原束，除去未结合的胶原分子；
(13)将胶原束置于30ug/ml的CBD-bFGF溶液中30min；
(14)清洗胶原束，除去未结合的CBD-bFGF；
(15)将上述完成步骤(14)的胶原束浸于3mg/ml的肝素溶液30min；
(16)清洗完成步骤(15)的胶原束，除去未结合的肝素分子；
(17)将完成步骤(16)的胶原束浸入3mg/ml的胶原溶液中30min；
(18)清洗完成步骤(17)的胶原束，除去未结合的胶原分子；
(19)重复步骤(1)～(18)的操作10次，从而构建形成所述缓释体系。
在实际应用中，也可以根据需要，负载不同的生物活性因子并组建不同的层数。
请参阅图4示出了前述实施例1-3构建的各缓释体系、空白对照组和阳性对照组的CBD-bFGF的累积释放曲线。
请参阅图5示出了前述实施例1构建的典型缓释体系、空白对照组和阳性对照组的的H&E染色结果。其中，a为Col(Col/PEG)15空白对照组，b为Col/CF阳性对照组，c为自组装缓释组Col(Col/CF/PEG)15。
请参阅图6示出了前述实施例2构建的典型缓释体系、空白对照组和阳性对照组的的H&E染色结果，其中，a为Col(Col/SA)15空白对照组，b为Col/CF阳性对照组，c为自组装缓释组Col(Col/CF/SA)15。
请参阅图7示出了前述实施例3构建的典型缓释体系、空白对照组和阳性对照组的的H&E染色结果。其中，a为Col(Col/HP)15空白对照组，b为Col/CF阳性对照组，c为自组装缓释组Col(Col/CF/HP)15。而且大鼠皮下血管模型动物实验表明，实施例1-3的缓释体系还能明显促进血管直径增大和数量增多。另外，本案发明人还对实施例4、5所获缓释体系进行了体外实验和大鼠皮下血管模型动物实验，结果显示，这两种缓释体系在长达30天的时间内均能缓慢、持续的释放出浓度达到有效治疗浓度的生物活性因子。
上述具体实施方式，仅为说明本发明的技术构思和结构特征，目的在于让熟悉此项技术的相关人士能够据以实施，但以上所述内容并不限制本发明的保护范围，凡是依据本发明的精神实质所作的任何等效变化或修饰，均应落入本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种负载生物活性因子的胶原支架的缓释体系的构建方法，其特征在于包括：
(1)将胶原支架于包含一种以上融合有胶原特异性结合肽的生物活性因子溶液中浸渍；
(2)清洗除去未结合在所述胶原支架上的生物活性因子；
(3)将经步骤(2)处理后的胶原支架置入至少含有能与胶原结合的可降解的高分子的溶液中并反应；
(4)对经步骤(3)处理后的胶原支架进行清洗；
(5)将经步骤(4)处理后的胶原支架于胶原溶液中浸渍；
(6)对经步骤(5)处理后的胶原支架进行清洗。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述胶原支架包括胶原海绵支架、胶原束或胶原膜，优选为胶原束。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述融合有胶原特异性结合肽的生物活性因子至少选自CBD-BDNF，CBD-bFGF和CBD-VEGF中的任意一种或多种的组合；优选的，所述生物活性因子选自CBD-BDNF，CBD-bFGF和CBD-VEGF中的两种以上的组合；优选的，步骤(1)中所述生物活性因子溶液中生物活性因子的浓度在1ug/ml以上，优选为10ug/ml～100ug/ml，尤其优选为20ug/ml～50ug/ml。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述高分子包括PEG、海藻酸钠、肝素中的任意一种或多种的组合；优选的，步骤(3)中所述的高分子的溶液所含PEG的浓度为0.1mg/ml～10mg/ml，优选为1mg/ml～5mg/ml，尤其优选为1mg/ml～3mg/ml；优选的，步骤(3)中所述的高分子的溶液所含海藻酸钠的浓度为0.1mg/ml～10mg/ml，优选为1mg/ml～5mg/ml，尤其优选为1mg/ml～3mg/ml；优选的，步骤(3)中所述的高分子的溶液所含肝素的浓度为0.1mg/ml～10mg/ml，优选为1mg/ml～5mg/ml，尤其优选为1mg/ml～3mg/ml。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在：所述的构建方法还包括步骤(7)：重复步骤(1)～步骤(6)的操作n次，n为自然数，优选的2≤n≤50；优选的，所述的构建方法还包括步骤(8)：重复步骤(1)～步骤(2)的操作或重复步骤(1)～步骤(4)的操作。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)包括：将胶原支架于所述生物活性因子溶液中浸渍10min～100min，优选为20min～50min；和/或，步骤(3)包括：将经步骤(2)处理后的胶原支架置入所述高分子溶液中并反应10min～100min，优选为20min～50min；和/或，步骤(5)包括：将经步骤(4)处理后的胶原支架于胶原溶液中浸渍10min～100min，优选为20min～50min；和/或，所述步骤(5)中胶原溶液的浓度为0.5mg/ml-5mg/ml，优选为1mg/ml-3mg/ml。
7.由权利要求1-6中任一项所述方法构建的负载生物活性因子的胶原支架的缓释体系。
8.一种负载生物活性因子的胶原支架的缓释体系，其特征在于包括：
胶原支架，
直接结合于胶原支架上的一种以上融合有胶原特异性结合肽的生物活性因子，以及
依次于胶原支架上自组装形成的至少一高分子材料层和至少一胶原层，且至少部分的所述生物活性因子被所述高分子材料层和胶原层包覆。
9.根据权利要求8所述的缓释体系，其特征在于：所述缓释体系包括交替设置的多个高分子材料层和多个胶原层，其中至少部分的胶原层上结合有所述的生物活性因子。
10.根据权利要求8所述的缓释体系，其特征在于：所述胶原支架包括胶原海绵支架、胶原束或胶原膜，优选为胶原束；和/或，所述融合有胶原特异性结合肽的生物活性因子至少选自CBD-BDNF，CBD-bFGF和CBD-VEGF中的任意一种或多种的组合；优选的，所述生物活性因子选自CBD-BDNF，CBD-bFGF和CBD-VEGF中的两种以上的组合；和/或，所述高分子材料层主要由能与胶原结合的、可降解的高分子组成；优选的，所述高分子至少选自PEG、海藻酸钠和肝素中的任意一种或多种的组合。
11.权利要求7-10中任一项所述负载生物活性因子的胶原支架的缓释体系于制备至少具有生物组织损伤修复功能的产品或至少具有缓释功能的药物中的用途；优选的，所述产品至少具有长效的生物组织损伤修复功能；优选的，所述的产品于治疗期间都能在损伤部位释放出达到有效治疗浓度的所述生物活性因子。
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