CN111214705B - 软骨复合支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种软骨复合支架及其制备方法。软骨复合支架包括：支架，包括脱钙松质骨和交联复合于所述脱钙松质骨的孔中的基质材料，所述支架为三维多孔结构体；生长因子，所述生长因子通过与所述基质材料之间的亲和作用固定于所述支架中。

Description

软骨复合支架及其制备方法
技术领域
本发明属于软骨修复技术领域，具体涉及一种软骨复合支架及其制备方法。
背景技术
软骨是人或动物体内骨骼系统的重要组成部分。例如，关节软骨能够起到缓冲应力作用和润滑作用，保护关节不易损伤，还能增加关节的灵活性。软骨受损伤后会影响其功能的发挥，甚至会随着时间的发展累及软骨下骨，最终导致骨关节炎，引起关节功能障碍。
然而，软骨由于无血液供应、神经支配和淋巴循环的特殊结构，导致其损伤后难以自我修复。目前临床治疗软骨损伤的方法包括微骨折术、自体移植或同种异体移植等，但均难以满足临床以及患者愈后的运动要求。
发明内容
因此，本发明提供一种能提高软骨再生修复效果的软骨复合支架及其制备方法。
第一方面，本发明提供一种软骨复合支架，其包括：
支架，包括脱钙松质骨(demineralized cancellous bone，DCB)和交联复合于脱钙松质骨的孔中的基质材料，支架为三维多孔结构体；
生长因子，生长因子通过与基质材料之间的亲和作用固定于支架中。
在本发明第一方面的实施例中，基质材料包括脱细胞细胞外基质(decellularized extracellular matrix，dECM)、糖胺多糖(Glycosaminoglycan，GAG)、硫酸软骨素、透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素和肝素中的一种或多种；和/或，
生长因子包括血小板源性生长因子-AA(PDGF-AA)、血小板源性生长因子-AB(PDGF-AB)、血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、转化生长因子-β3(TGF-β3)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)、胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP-5)、骨形态发生蛋白2(BMP-2)、骨形态发生蛋白4(BMP-4)、表皮生长因子(EGF)、肝素结合的表皮生长因子(HB-EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、血管内皮细胞生长因子-A(VEGF-A)和肝细胞生长因子(HGF)中的一种或多种。
第二方面，本发明提供一种软骨复合支架的制备方法，其包括：
提供脱钙松质骨；
使包含基质材料的浆料填充于脱钙松质骨的孔中，经干燥后，得到初始支架；
对初始支架进行交联处理，以使基质材料交联复合于脱钙松质骨，得到三维多孔的支架；
使包含生长因子的溶液浸润于支架的孔中，经干燥后，生长因子通过与基质材料之间的亲和作用固定于支架，得到复合支架。
在本发明第二方面的实施例中，基质材料的颗粒粒径为100nm～10μm；和/或，包含基质材料的浆料中含2％～4％重量/体积的基质材料。
在本发明第二方面的实施例中，包含生长因子的溶液中含1μg/mL～500μg/mL的所述生长因子。
在本发明第二方面的实施例中，交联处理所使用的交联剂包括碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或多种；交联处理的温度为2℃～6℃，时间为18h～24h。
在本发明第二方面的实施例中，干燥为冷冻干燥。
在本发明第二方面的实施例中，方法还包括：
使用无菌的磷酸缓冲盐溶液(Phosphate Buffered Saline，PBS)对支架进行浸泡处理；
使用三蒸水对浸泡处理后的支架进行清洗，并干燥。
在本发明第二方面的实施例中，脱钙松质骨的制备方法包括：
获取松质骨；
采用氯仿和甲醇的体积比为1:2～2:1的混合液对松质骨进行浸泡脱脂，脱脂的温度为33℃～37℃，时间为20h～26h；
采用8％～12％重量/体积的乙二胺四乙酸脱钙液对脱脂后的松质骨进行浸泡脱钙，脱钙的温度为33℃～37℃，时间为600h～680h，其中每隔120h～170h更换一次脱钙液，脱钙液的pH为7～7.3。
在本发明第二方面的实施例中，松质骨取自管状骨。
在本发明第二方面的实施例中，基质材料可包括脱细胞细胞外基质。脱细胞细胞外基质的制备方法可包括：
对包含细胞外基质的组织进行无菌处理；
对无菌的组织进行湿法粉碎，获得悬浮浆料；
采用低渗联合冻融的方法和/或差速离心法对悬浮浆料进行脱细胞处理，获得脱细胞细胞外基质。
相对于现有技术，本发明至少具有以下有益效果：
本发明提供的软骨复合支架及其制备方法，通过将基质材料交联复合于脱钙松质骨的孔中，能使软骨复合支架具有良好的生物力学性能、生物相容性和可降解性，同时为细胞提供了良好的天然微环境。并且，将生长因子通过与基质材料之间的亲和作用固定于上述支架中，使得软骨复合支架能在初期进行生长因子的快速释放，保证软骨缺损区域快速达到有效生长因子浓度，之后进行生长因子的有序缓释，实现长期维持有效生长因子浓度，从而能在较长时间内持续有效地发挥生长因子的生物学效应，促进软骨再生修复。采用本发明的软骨复合支架能获得较高的软骨损伤再生修复效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例的软骨复合支架的大体观图。
图2为本发明一个实施例的软骨复合支架的扫描电子显微镜(SEM)图像。
图3为本发明一个实施例的软骨复合支架的病理染色图，其中A是苏木精-伊红染色(Hematoxylin-Eosin，HE)结果图像；B是甲苯胺蓝染色(Toluidine Blue，TB)结果图像；C是番红花-O染色(Safarin O，S-O)结果图像；D是II型胶原(Collagen II，COL2)免疫组化染色结果图像。标尺长度均为200微米。
图4为本发明一个实施例的软骨复合支架的糖胺多糖(GAG)定量检测结果图。
图5为本发明一个实施例的软骨复合支架的总胶原(Total collagen，Col)定量检测结果图。
图6为本发明一个实施例的软骨复合支架负载兔脂肪间充质干细胞(Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells，ADSCs)体外培养1周后死/活染色共聚焦结果图。
图7为本发明一个实施例的软骨复合支架的负载兔脂肪间充质干细胞(Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells，ADSCs)体外培养1周后扫描电子显微镜(SEM)图像。
图8为本发明一个实施例的软骨复合支架的CCK-8细胞毒性实验结果图。
图9为本发明一个实施例的软骨复合支架的体外因子累计释放度曲线图。
图10为本发明一个实施例的软骨复合支架的Transwell迁移实验结果图，其中A为阴性组；B为阳性组；C为实验组。
图11为本发明一个实施例的软骨复合支架的Transwell迁移实验结果统计分析图，其中A为阴性组；B为阳性组；C为实验组。
具体实施方式
为了使本申请的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合具体实施例对本申请进行详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本申请，并非为了限定本申请。
为了简便，本文仅明确地公开了一些数值范围。然而，任意下限可以与任何上限组合形成未明确记载的范围；以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围，同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外，尽管未明确记载，但是范围端点间的每个点或单个数值都包含在该范围内。因而，每个点或单个数值可以作为自身的下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。
在本文的描述中，需要说明的是，除非另有说明，“以上”、“以下”为包含本数，“一种或多种”中“多种”的含义是两种以上。
本申请的上述发明内容并不意欲描述本申请中的每个公开的实施方式或每种实现方式。如下描述更具体地举例说明示例性实施方式。在整篇申请中的多处，通过一系列实施例提供了指导，这些实施例可以以各种组合形式使用。在各个实例中，列举仅作为代表性组，不应解释为穷举。
本发明第一方面的实施方式提供一种软骨复合支架，其包括支架和生长因子，其中支架包括脱钙松质骨(DCB)和交联复合于脱钙松质骨的孔中的基质材料，且支架为三维多孔结构体；生长因子通过与基质材料之间的亲和作用固定于支架中。
支架材料的选择是影响软骨损伤再生修复质量的一个重要因素。DCB作为生物源性材料，具有良好的生物相容性和良好的生物降解性，同时还具有较强的生物力学性能。DCB还保留了松质骨的天然网状孔隙结构，有利于细胞(如干细胞)的黏附、增殖和分化。更优选地，DCB具有细胞外基质成分，其中包含I型胶原，可促进种子细胞的粘附、增殖及分化。
基质材料交联复合于DCB的大孔结构中，形成相互交织的网络微环境。由此获得的支架能具有更好的生物力学性，同时为细胞的迁移、粘附和生长提供良好的天然微环境。更优选地，DCB与基质材料相复合还可使得软骨复合支架易于与宿主的软骨组织粘附和整合，这对于软骨缺损的修复也具有重要意义。
将生长因子复合于支架中，构建的软骨复合支架对体内特定细胞(如干细胞)的募集能力明显提高，显著促进细胞的迁移，并且能进一步促进细胞粘附、增殖、分化和成熟，从而达到体内原位诱导软骨再生的目的，以修复软骨缺损。尤其是，本发明是将生长因子通过与基质材料之间的亲和作用固定于DCB复合基质材料的支架中，无需加入外源性缓释载体，即能具有良好的生长因子缓释性能。软骨复合支架能在初期进行生长因子的快速释放，保证软骨缺损区域快速达到有效生长因子浓度，之后进行生长因子的有序缓释，实现长期维持有效生长因子浓度，由此能在较长时间内持续有效地发挥生长因子的生物学效应，原位募集更多细胞，显著地促进细胞的迁移、粘附和生长，从而提高缺损软骨组织的再生修复效果。
在一些实施例中，生长因子与基质材料之间的亲和作用可包括氢键、静电作用(如范德华力)、疏水性相互作用、配位键和弱共价键中的一种或多种，例如包括氢键、范德华力和疏水性相互作用中的一种或多种。通过亲和作用既能将生长因子有效地固定于支架中，又能实现生长因子的初期突释和长期有序缓释，从而提高软骨再生修复效果。
在一些实施例中，基质材料可包括脱细胞细胞外基质(dECM)、糖胺多糖(GAG)、硫酸软骨素、透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素和肝素中的一种或多种，优选包括dECM。dECM能够为细胞的迁移和生长提供组织特异性的微环境，具有促进内源性细胞如干细胞迁移的作用，并且为细胞生长提供结构支持。同时，dECM还能提供生物化学信号和生物力学信号，来诱导和调控细胞的黏附、增殖和分化以及调节组织结构的形成，促进软骨组织的修复与再生，且无须降解和去除。进一步地，dECM与DCB的复合结构支架还有利于生长因子的负载，同时改善生长因子释放性能。
dECM优选包括脱细胞软骨细胞外基质(decellularized cartilageextracellular matrix)。脱细胞软骨细胞外基质复合于DCB的大孔结构中，形成的天然微环境与正常软骨相仿，而且能达到与正常软骨相仿的生物力学功能，还能使得软骨复合支架更容易与宿主的软骨组织粘附和整合，从而更好的修复软骨缺损。
在一些实施例中，生长因子可包括PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、TGF-β1、TGF-β3、IGF-1、IGF-2、IGFBP-3、IGFBP-5、BMP-2、BMP-4、EGF、HB-EGF、TGF-α、FGF-2、VEGF-A和HGF中的一种或多种，例如包括TGF-β1和TGF-β3中的一种或多种。选择合适的生长因子能募集更多的内源性细胞(如间充质干细胞)，进一步促进细胞迁移，并且能进一步促进细胞的粘附、以及向软骨方向的增殖和分化，在软骨原位再生修复过程中发挥至关重要的作用。
在一些优选的实施例中，软骨复合支架中，支架为脱钙松质骨与脱细胞软骨细胞外基质的交联复合结构体，TGF-β3通过与脱细胞软骨细胞外基质之间的亲和作用固定于支架中。采用该软骨复合支架能进一步提高缺损软骨组织的原位再生修复效果。
本发明第二方面的实施方式提供一种软骨复合支架的制备方法，其包括提供脱钙松质骨的步骤S100、负载基质材料的步骤S200、交联步骤S300和复合生长因子的步骤S400。
在步骤S100，脱钙松质骨可来源于人体或其它动物，如猪、兔、羊、牛等。优选地，脱钙松质骨来源于人体或其它动物的管状骨。
将生物来源的松质骨进行脱脂和脱钙处理，得到脱钙松质骨。示例性方法包括获取松质骨的步骤S110、松质骨脱脂步骤S120和松质骨脱钙步骤S130。
在步骤S110，松质骨可商购获得或者采用本领域已知的方法制备得到。在一些优选的实施例中，松质骨的制备方法可包括：
S111，取新鲜管状骨，去除骨膜、软骨及软组织，取其松质骨部分，获得初始松质骨。
在步骤S111，管状骨可取自人体或其它动物，如猪、兔、羊、牛等。可采用刀具将新鲜管状骨上的骨膜、软骨和软组织剔除。进一步地，还可将初始松质骨制备成小块，以便于后续的处理步骤。可以根据实际需求确定骨块的大小及形状。例如，骨块可为圆片状、圆柱状、块状等。优选地，骨块的厚度为10mm以下，如2mm、5mm、8mm等。作为一个示例，骨块为直径2mm～30mm、高1mm～10mm的圆柱状。
S112，去除初始松质骨的骨髓、血污和表面油脂。
经过步骤S112的处理，能降低所得松质骨的免疫原性。其中可采用本领域已知的方法来去除初始松质骨的骨髓、血污和表面油脂。作为示例，S112可包括：
S1121，采用流水冲洗初始松质骨。
在步骤S1121，可采用流水反复冲洗初始松质骨，能初步清除初始松质骨上的骨髓、血污及表面油脂。
S1122，采用酸性氧化电位水(EOW)浸泡初始松质骨。
在步骤S1122，酸性氧化电位水为广谱灭菌剂，通常地，EOW的pH为2.0～3.0，氧化还原电位(ORP)≥1100mV，有效氯含量为30～80mg/L，而且主要是以次氯酸、次氯酸根的形式存在于EOW中。采用EOW浸泡初始松质骨，能有效杀灭其所携带的细菌、病毒等，从而能提高软骨复合支架的生物相容性。EOW浸泡处理还能进一步去除初始松质骨上的骨髓、血污及表面油脂。且EOW为微酸性水，基本不会对松质骨的如I型胶原等有效成分造成不利影响。例如，可采用由北京州际资源环保科技有限公司提供的EOW。
在步骤S1122，采用EOW浸泡初始松质骨的时间可以为20h～26h，进一步为23h～25h，如24h。
S1123，采用高压水枪冲洗初始松质骨。
在步骤S1123，采用高压水枪冲洗初始松质骨，能进一步去除初始松质骨上的骨髓、血污及表面油脂，同时还能去除EOW残留液，使所得松质骨具有较高的生物相容性。高压水枪冲洗的水压可以为1MPa～8MPa，如2MPa、3MPa、4MPa、5MPa或6MPa。
S1124，使用无水乙醇对初始松质骨进行脱水，经干燥，获得松质骨。
在步骤S1124，脱水的时间可以为3h～7h，如4h～6h。可采用本领域已知的干燥手段进行干燥，如风干、自然晾干、冷冻干燥等。
采用上述制备方法得到的松质骨具有较高的生物相容性和生物力学性能，且较好地保留了其天然骨基质成分。
在一些实施例中，在步骤S120，可采用氯仿和甲醇的混合液对松质骨进行脱脂。采用氯仿和甲醇的混合液能深度去除松质骨中的油脂，进一步降低松质骨的免疫原性。
在步骤S120，可将松质骨浸泡于氯仿和甲醇的混合液中进行脱脂。进一步地，可对混合体系进行振荡，例如将混合体系置于恒温摇床中进行振荡脱脂。这样可以提高脱脂效率。其中震荡速度可以为40rpm～80rpm，如50rpm～60rpm。
在步骤S120，氯仿和甲醇的混合液中氯仿和甲醇的体积比可以为1:2～2:1，进一步为1:1.5～1.5:1，优选为1:1。脱脂的温度可以为33℃～37℃，如35℃～37℃。脱脂的时间可以为20h～26h，进一步为23h～25h，如24h。
在一些实施例中，在步骤S130，可采用乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙液对脱脂后的松质骨进行脱钙。采用EDTA脱钙液对松质骨进行脱钙，能在有效去除松质骨中的钙盐，同时较大限度地保留松质骨的生物学活性和生物力学性能。
在步骤S130，可将松质骨浸泡于EDTA脱钙液中进行脱钙。进一步地，可对混合体系进行振荡，例如将混合体系置于恒温摇床中进行振荡脱脂。这样可以提高脱钙效率。其中震荡速度可以为40rpm～80rpm，如50rpm～60rpm。
在步骤S130，EDTA脱钙液中可含有8％～12％重量/体积的EDTA。进一步地，EDTA脱钙液的pH为7～7.3，如7.2。其中可pH调节剂可为MOH，M为Na和/或K。溶剂可以为去离子水。作为示例，可将EDTA按10％的重量体积比加入去离子水中，并用NaOH调节pH为7.2，得到10％重量/体积的EDTA脱钙液。
在步骤S130，脱钙的温度可以为33℃～37℃，如35℃～37℃。脱钙的时间可以为600h～680h，如28天。其中每隔120h～170h更换一次脱钙液，例如每隔7天更换一次脱钙液。
经步骤S130能获得较好的脱钙效果。脱钙松质骨既具有较高的机械强度，又有较高的诱导细胞增殖和分化功能，进一步促进软骨组织再生。
采用氯仿和甲醇的混合液对松质骨进行脱脂，采用EDTA脱钙液进行脱钙，试剂成分简单且操作简便，能减少松质骨中的化学试剂残留，从而能使软骨复合支架具有更低的毒性。
在步骤S130之前，还可选地采用75％体积分数的乙醇溶液清洗脱脂后的松质骨。采用75％体积分数的乙醇溶液(医用酒精)清洗脱脂后的松质骨，能更充分地发挥EDTA脱钙液的脱钙效果。
作为具体的示例，可将松质骨浸泡于75％体积分数的乙醇溶液中，并置于恒温摇床中进行振荡清洗。清洗的温度可以为33℃～37℃，如35℃～37℃。清洗的时间可以为42h～48h，其中每隔4h～6h更换一次乙醇溶液。震荡速度可以为40rpm～80rpm，如50rpm～60rpm。
在步骤S130之后，还可进一步对脱钙后的松质骨进行清洗、干燥和灭菌。作为示例，可采用三蒸水对脱钙后的松质骨进行反复清洗3次，经冷冻干燥后，采用Co60照射灭菌。其中，冷冻干燥的温度可以为-60℃～-80℃。冷冻干燥的时间可以为18h～24h。Co60灭菌的照射剂量可以为35Gy。
可将制备得到的脱钙松质骨于4℃保存备用。
在步骤S200，可使包含基质材料的浆料填充于脱钙松质骨的孔中，经干燥后，得到初始支架。
在步骤S200，可将DCB浸入包含基质材料的浆料中，并置于35℃～37℃的恒温摇床中进行混合，使浆料充分填充于脱钙松质骨的孔中。其中，DCB与浆料的体积比可以为1:2～1:10，优选为1:2.5～1:5，更优选为1:3～1:4。混合的时间可以为20h～24h。震荡速度可以为40rpm～80rpm，如50rpm～60rpm。
在步骤S200可采用本领域已知的手段进行干燥，其中优选冷冻干燥。冷冻干燥的温度可以为-60℃～-80℃。冷冻干燥的时间可以为18h～24h。
在步骤S200，基质材料可包括前文所述的基质材料。
在一些实施例中，包含基质材料的浆料中可含有1％～5％重量/体积的基质材料，优选含有2％～4％重量/体积的基质材料。浆料中含有适量的基质材料，能使所得支架中形成相互交织的网络微环境，且与正常软骨更相仿。
可将基质材料分散于蒸馏水(优选三蒸水)中制成包含基质材料的浆料。浆料可于低温下保存备用，例如保存温度可以为4℃。
在一些实施例中，基质材料的颗粒粒径可以为100nm～10μm。采用该基质材料能使支架形成更好的微孔结构，有利于细胞迁移、粘附和生长。基质材料还具有较高的比表面积，能提高支架中生长因子的负载量，从而能更长期有效地发挥生长因子的生理功能。此外，还可提高生长因子的分布均匀性，这有利于生长因子的有序缓释。优选地，基质材料的颗粒粒径为150nm～5μm，更优选为200nm～2μm。
基质材料可按照本领域已知的方法制备得到或商购获得。在一些优选的实施例中，基质材料包括dECM，dECM的示例性制备方法包括：
S210，提供包含ECM的组织。
在步骤S210，包含ECM的组织可以是半月板组织、软骨组织、脂肪组织等，优选软骨组织，如关节软骨组织。包含ECM的组织可来自于人、猪、牛、兔、羊等。作为示例，包含ECM的组织可以为新鲜的软骨组织如猪的膝关节软骨。优选地，软骨组织不包含软骨下骨。
S220，对包含ECM的组织进行无菌处理。在本文中，术语“无菌”指的是达到医学上的无菌要求。
在步骤S220，可以采用任何不会明显损害细胞外基质成分的方法来对组织进行无菌处理。
作为示例，在步骤S220可包括：对包含ECM的组织用PBS冲洗后，再浸泡于EOW中进行灭菌，之后采用3％质量分数的过氧化氢溶液(即双氧水)再次灭菌。其中，PBS的pH可为7.4(25℃)。PBS冲洗的次数可以为2～4次，如3次。可进行EOW灭菌2～4次，如3次；每次时间为8min～12min，如10min。过氧化氢溶液灭菌的时间可以为20min～40min，如30min。
在一些实施例中，在用过氧化氢溶液灭菌之前，还可包括将组织制成碎块。这样有利于后续处理步骤。例如，在无菌的条件下将组织剪成体积约为1mm×1mm×1mm的碎块。进一步地，采用无菌蒸馏水(如三蒸水)冲洗碎块2～4次，如3次。
在一些实施例中，在用过氧化氢溶液灭菌之后，还可包括：采用无菌蒸馏水(如三蒸水)漂洗碎块2～4次，如3次。每次漂洗的时间可以20min～40min，如30min。
步骤S220优选在无菌的容器中进行。
S230，对无菌的组织进行湿法粉碎，获得悬浮浆料。
在步骤S230，湿法粉碎是以水为介质，机械粉碎组织。水例如是蒸馏水，优选三蒸水。采用湿法粉碎能避免或大幅减少机械粉碎过程产生的热量，从而保护细胞外基质成分。
步骤S230可以采用本领域已知的方法和装置进行。例如匀浆机。可将无菌的组织块加入蒸馏水中，用匀浆机破碎成悬浮浆料。
在一些实施例中，在步骤S230，组织块与蒸馏水的体积比可以为1:2～1:5。
S240，采用低渗联合冻融的方法和/或差速离心法对S230所得悬浮浆料进行脱细胞处理，获得dECM。
在步骤S240，低渗联合冻融的方法可包括：S241，将悬浮浆料与低渗液混合，进行低渗处理；S422，对低渗处理后的混合料进行冻融3～5次，如4次。
在一些实施例中，在S241，低渗液与悬浮浆料的体积比可以为8:1～12:1，如10:1。低渗液优选为蒸馏水，更优选三蒸水。
在一些实施例中，在S241，进行低渗处理包括将混合料静置6h～12h或静置过夜。
在一些实施例中，将混合料进行冻融可包括：将混合料于-15℃～-30℃(如-20℃)条件下冷冻，冷冻时间可以为6h～24h，优选为8h～12h；之后于20℃～30℃(如25℃)条件下融化。
通过低渗冻融法能去除组织颗粒中的细胞，且因为可不使用化学试剂，有利于避免毒性物质残留。
在步骤S240，差速离心法(还可称为差速梯度离心法或梯度离心法)是对悬浮浆料进行多级离心处理，且后一级离心处理的离心速度均大于前一级离心处理的离心速度。通过差速离心处理，能有效地去除组织中的细胞及其它免疫原性物质，同时较大限度地保留天然的外基质成分。
差速离心法可使用蒸馏水(优选三蒸水)作为分散剂。因为可不使用化学试剂，有利于避免毒性物质残留。
优选地，离心速度小于5000rpm时，离心处理的温度可以为20℃～25℃；离心速度在5000rpm以上时，离心处理的温度可以为0℃～4℃。
在一些优选的实施例中，差速离心法可包括：
S241，将悬浮浆料在20℃～25℃下以1500rpm～2000rpm离心25min～30min，获得第一上清液。
S242，将第一上清液在20℃～25℃下以2500rpm～3000rpm离心25min～30min，获得第二上清液。
S243，对第二上清液在20℃～25℃下以3500rpm～4000rpm离心4～6次，如5次；每次离心时间为25min～30min；获得第三上清液。以充分洗去细胞碎片和残留物质，且使第三上清液的pH约为7.0。
S244，将第三上清液在0℃～4℃下以9000rpm～10000rpm离心25min～30min，收集沉淀，得到dECM。优选地，dECM为纳米级颗粒。
rpm即r/min(转/分)。
差速离心可采用低温高速离心机进行，例如赛默飞Sorvall RC6+型离心机。
通过采用适当的差速离心处理的温度、转速和时间，能去除组织中的细胞，同时很好地保留天然的外基质成分，使所得dECM具有良好的生物相容性和生物学活性。
在一些优选的实施例中，在步骤S240，采用低渗联合冻融的方法和差速离心法对悬浮浆料进行脱细胞处理，获得dECM。进一步地，可先采用低渗联合冻融的方法对悬浮浆料进行脱细胞处理，再采用差速离心法对悬浮浆料进行脱细胞处理。具体可参照前文所述的操作方法。
在步骤S300，可对初始支架进行交联处理，以使基质材料交联复合于脱钙松质骨，得到三维多孔的支架。通过交联处理，使基质材料交织成网络微孔结构，并且使基质材料稳定地复合于脱钙松质骨中，提高支架的力学性能。
在步骤S300，可采用本领域已知的交联手段进行交联处理，例如化学交联、紫外线交联、伽马射线辐射交联等中的一种或多种联合使用。作为示例，可采用交联剂对初始支架进行交联处理。交联剂可包括碳二亚胺(EDAC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)中的一种或多种，优选包括EDAC和NHS。更优选地，交联剂可分散于蒸馏水(优选三蒸水)中，制成包含15mmol/L～20mmol/L的EDAC和9mmol/L～14mmol/L的NHS的交联液使用。将初始支架置于交联液中进行交联处理。初始支架与交联液的体积比可以为1:2～1:10，优选为1:3～1:7，更优选为1:4～1:5。交联处理的温度可以为2℃～6℃，如4℃。交联处理的时间可以为18h～24h。
在步骤S300，所得支架的孔隙率可以为85％～99％，优选90％～99％。
在步骤S400，使包含生长因子的溶液浸润于支架的孔中，经干燥后，生长因子通过与基质材料之间的亲和作用固定于支架，得到复合支架。
在一些实施例中，包含生长因子的溶液中包含生长因子的浓度可以为1μg/mL～500μg/mL，优选为5μg/mL～200μg/mL，更优选为10μg/mL～100μg/mL，如12μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、80μg/mL。
在步骤S400，可使用例如微量移液器等器材将包含生长因子的溶液注射于支架中，使溶液充分浸润于支架中。在一些实施例中，支架与溶液的体积比可以为1:1～1:3，优选为1:1.5～1:2。
在步骤S400所得复合支架的孔隙率可以为80％～95％，如82％、84％、85％、87％、90％、92％、93％或94％。
在步骤S400可采用本领域已知的手段进行干燥，其中优选冷冻干燥。冷冻干燥的温度可以为-60℃～-80℃。冷冻干燥的时间可以为18h～24h。
在步骤S400之前，还可包括清洗步骤。通过清洗除去支架上残留的交联剂，能提高软骨复合支架的生物相容性，同时有利于生长因子的复合和保持生长因子的生物学活性。
在一些实施例中，清洗步骤可包括：使用无菌的PBS对支架进行浸泡处理，再使用三蒸水对浸泡处理后的支架进行清洗。PBS浸泡的时间可以为1h～3h，如2h。之后可采用三蒸水对支架进行漂洗。漂洗的次数可以为2～4次，如3次。
对清洗后的支架进行干燥。可采用本领域已知的干燥方法进行干燥，其中优选冷冻干燥。冷冻干燥的温度可以为-60℃～-80℃。冷冻干燥的时间可以为18h～24h。
在步骤S400之后，还可包括灭菌步骤。通过灭菌处理能提高软骨复合支架的生物相容性。
灭菌步骤可采用本领域已知的灭菌方法，例如采用Co60照射灭菌。其中，Co60灭菌的照射剂量可以为35Gy。
制备得到的软骨复合支架可以于低温下进行长期保存备用。保存温度可以为-15℃～-20℃。
本发明提供的软骨复合支架制备方法操作简便，可进行批量化生产。且本发明提供的制备方法制备得到的软骨复合支架具有可塑性，可按修复缺损的形状制成不同的形状和大小，应用方便。尤其是，采用本发明的制备方法制备得到的软骨复合支架，能提高缺损软骨组织的再生修复效果。
实施例
下述实施例更具体地描述了本申请公开的内容，这些实施例仅仅用于阐述性说明，因为在本申请公开内容的范围内进行各种修改和变化对本领域技术人员来说是明显的。除非另有声明，以下实施例中所报道的所有份、百分比、和比值都是基于重量计，而且实施例中使用的所有试剂都可商购获得或是按照常规方法进行合成获得，并且可直接使用而无需进一步处理，以及实施例中使用的仪器均可商购获得。
以下实施例中采用的：
EOW：北京州际资源环保科技有限公司提供。
PBS：美国corning公司提供，pH＝7.4(25℃)。
DMEM/F12(50:50)低糖培养基：美国corning公司提供。DMEM/F12(50:50)低糖培养基是F12培养基(Ham’s F 12nutrient medium动物细胞培养基)与DMEM(Dulbecco’sModified Eagle Medium)培养基以体积比1:1结合。
胎牛血清FBS：美国Sigma公司提供。
扫描电子显微镜：日本Hitachi S-4800型。
恒温摇床：日本Taitec公司Shake-XR型。
实施例1
1、DCB的制备
(1)采用猪新鲜管状骨，剔除骨膜、软骨及软组织，取其松质骨部分，制备成大致10mm×10mm×10mm的块状。
(2)流水反复冲洗骨块，初步清除骨髓、血污及表面油脂。
(3)将骨块置于酸性EOW中浸泡24小时，进一步去除骨髓、血污及表面油脂，同时起到灭菌作用。
(4)高压水枪冲洗骨块，进一步去除骨髓、血污及表面油脂。
(5)使用无水乙醇对骨块进行脱水4h～6h，风干，获得松质骨。
(6)将松质骨浸泡于氯仿/甲醇(体积比1:1)溶液中，并于37℃恒温摇床中脱脂24h，震荡速度为60rpm。
(7)将松质骨浸泡于75％医用乙醇溶液中，并于37℃恒温摇床中清洗48h，每隔6小时换液，震荡速度为60rpm。重复清洗三次。
(8)将松质骨浸入10％重量/体积的EDTA脱钙液(美国Sigma公司提供)中，并于37℃恒温摇床中脱钙28天，每隔7天更换一次脱钙液，震荡速度为60rpm。脱钙液是以NaOH调节pH为7.2。
(9)三蒸水反复清洗3次后，冻干(-60℃温度下冷冻干燥24h)，钴60灭菌(照射剂量35Gy)后，得到脱钙松质骨。4℃保存备用。
2、dECM的制备
(1)取新鲜猪膝关节的软骨组织，不带软骨下骨，以PBS冲洗3次。
(2)将关节软骨组织浸泡在EOW中进行灭菌，其中灭菌次数为3次，10分钟/次。
(3)无菌条件下用眼科剪将关节软骨组织剪碎成大致1mm×1mm×1mm的小块，并采用无菌三蒸水冲洗3次。
(4)用3％双氧水浸泡关节软骨组织，进行再次消毒灭菌，灭菌时间为30min。之后采用无菌三蒸水漂洗3次，30分钟/次。
(5)将关节软骨组织放入匀浆机中，加入相当于关节软骨组织2倍体积的无菌三蒸水，在低温下将关节软骨组织破碎成悬浮浆料。
(6)对关节软骨组织进行低渗冻融，包括：加入相当于悬浮浆料10倍体积的三蒸水低渗混匀，静置过夜；之后将混合料于-20℃下冷冻10h后，于常温(25℃)融化；反复冻融4次。
(7)采用低温高速离心机对关节软骨组织进行差速离心，包括：将浆料在20℃下以2000rpm离心30分钟；取上清在20℃下以3000rpm离心30分钟；取上清20℃下以4000rpm离心处理5次，30分钟/次，充分洗去细胞碎片和残留物质；取上层液(pH为7左右)在4℃下以10000rpm离心30分钟，去上清，收集沉淀为无细胞的纳米级猪软骨dECM。
3、软骨复合支架的制备
(1)将DCB进入dECM浆料中，并于37℃的恒温摇床中进行混合24h，震荡速度为60rpm，使浆料充分填充于DCB的孔中。其中，dECM浆料中含3％重量/体积的dECM；DCB与浆料的体积比为1:3。
(2)取出负载dECM的DCB，经冻干(-60℃温度下冷冻干燥24h)后，得到初始支架。
(3)将初始支架置于交联液中，于4℃下交联24h，得到支架。其中交联液为包含碳二亚胺(EDAC，20mmol/L)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，14mmol/L)的水溶液。
(4)使用无菌的PBS对支架进行浸泡处理2h，再使用三蒸水对浸泡处理后的支架进行漂洗3次，然后冻干(-60℃温度下冷冻干燥24h)。
(5)将包含20μg/mL的生长因子TGF-β3的溶液充分浸润于支架中，冻干(-60℃温度下冷冻干燥24h)。
(6)钴60灭菌(照射剂量35Gy)后，即得到无菌的DCB/dECM/TGF-β3软骨复合支架。于-20℃保存备用。
测试部分
1、软骨复合支架的大体观如图1所示。肉眼观察软骨复合支架的外观呈白色海绵状，其能维持原有形态并有一定的强度，表面见疏松的多孔结构，表面孔隙与深层孔隙相连通，孔隙大小不等。
软骨复合支架的SEM图像如图2所示。SEM观察可以看到，DCB构成较大的孔隙结构，dECM复合于DCB的大孔中构成微孔结构。DCB和dECM两种材料的整合良好，支架整体布满大小不等的孔隙。该支架形成天然的网状多孔结构，各孔隙相互交通。
2、将软骨复合支架充分浸水后，使用冰冻切片机切成7μm厚的切片，在含95％(体积/体积)乙醇和1％(体积/体积)乙酸的固定液中固定20分钟，复水后行以下染色：
(1)HE染色：切片浸入苏木素染色液(Solarbio公司的HE染色试剂盒)染色10min，过水，分化液分化1min，蒸馏水洗15min，伊红染色液浸染1min，蒸馏水洗5min，使用脱水机进行常规脱水，透明，中性树胶封片。
(2)甲苯胺蓝染色：切片放入到甲苯胺蓝染色液(北京化学试剂有限公司)中浸泡5min，蒸馏水洗2min，常规脱水，透明，中性树胶封片。
(3)番红O染色：切片放入到番红O染色液(北京化学试剂有限公司)中浸泡20min，蒸馏水洗2min，常规脱水，透明，中性树胶封片。
(4)II型胶原免疫组化染色：切片放入3％过氧化氢溶液中避光孵育30min。小鼠来源II型胶原单克隆抗体(美国NOVUS公司)用PBS按体积比1:200稀释作为一抗，在4℃湿盒中孵育切片，过夜。第二天去除多余一抗，切片用PBS洗3次，每次5min。然后将辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)(美国NOVUS公司)用PBS按体积比1:200稀释作为二抗，在室温(25℃)避光条件下孵育1h。去除多余二抗后，PBS洗3次，每次5min。切片用新鲜配制的DAB显色液(迈新试剂公司)适当显色，蒸馏水及时水洗。切片放入苏木素染色液3min，过水，分化液分化，常规脱水，透明，中性树胶封片。
图3示出染色结果。HE染色结果(A)显示DCB和dECM材料都被染成红色，证实软骨复合支架含有丰富的细胞外基质成分，且在结构方面，DCB构成大孔，大孔中填充dECM，构成微孔，两种材料的整合良好。甲苯胺蓝染色结果(B)显示软骨复合支架染色为阳性，DCB和dECM材料都被染成蓝色，证明酸性粘多糖的存在。番红O染色结果(C)也显示软骨复合支架染色为阳性，其中DCB材料呈弱阳性，dECM材料呈强阳性，表明dECM包含正常软骨的糖胺多糖成分多于DCB含量。软骨复合支架的成分与结构与正常软骨更相仿。II型胶原染色结果(D)显示DCB和dECM均呈阳性，说明DCB和dECM中也含有II型胶原。从病理结果来看，本发明软骨复合支架含有丰富的糖胺多糖和II型胶原，二者是正常软骨中的正常组分。DCB材料构成大孔结构，大孔中填充dECM，形成相互交织的网络微环境，与天然软骨结果更相仿。
3、采用二甲基亚甲基蓝(DMMB)比色法测定软骨复合支架的糖胺多糖含量，具体实验步骤依据GENEMD糖胺多糖(GAG)总含量二甲基亚甲基蓝(DMMB)比色法定量检测试剂盒(美国GenMed Scientifics公司)说明书进行。
软骨复合支架(B)与正常软骨(A)的糖胺多糖(sGAG)定量检测结果如图4显示，二者之间没有统计学差异(P>0.05)，说明软骨复合支架中含有丰富的sGAG成分，和正常软骨更接近；也说明在制备过程中GAG的损失较少，较大限度地保留了软骨的蛋白多糖、透明质酸、硫酸软骨素等成分，使软骨复合支架可较好地仿生正常软骨的外基质成分，为细胞迁移、粘附和生长提高良好的微环境。
4、利用羟脯氨酸法测量软骨复合支架中胶原蛋白(Collagen)的含量，具体实验步骤依据羟脯氨酸定量试剂盒(南京建成)说明书进行。
软骨复合支架(B)与正常软骨(A)的总胶原定量分析结果如图5显示，表明软骨复合支架中保留了绝大部分的胶原成分。
5、脱钙松质骨和软骨复合支架压缩力学测试采用BOSE5100生物力学试验机进行，包括：制备6mm×6mm×6mm的立方体样品；样品在实验前用蒸馏水浸润；在压缩实验时，首先压缩5％，压缩速率为2mm/min，压缩10个循环后进行正式实验，最大压缩10％，压缩速率为2mm/min；根据应力-应变曲线计算压缩弹性模量。
表1
Figure BDA0002426511840000201
生物力学性能是软骨复合支架的一个重要的评价指标。由表1可知，软骨复合支架的压缩弹性模量可达到3.104MPa～6.664MPa，平均为5.086MPa。软骨复合支架的压缩弹性模量适当高于正常软骨的压缩弹性模量(约1MPa～3MPa)，能够提供较好的力学支撑。
脱钙松质骨的压缩弹性模量可达到0.6767MPa～1.849MPa。表明，脱钙松质骨不仅具有较高的机械强度，而且钙含量较低，能获得较高的诱导细胞增殖和分化功能，进一步促进软骨组织再生。
6、软骨复合支架吸水率测定：称量软骨复合支架初始重量W0，浸于去离子水中，室温(25℃)下放置10min取出，悬挂在桌面上1min至没有水滴滴落，称重W1。根据以下公式计算吸水率：吸水率＝(W1-W0)/W0。
表2
编号 W<sub>0</sub>/mg W<sub>1</sub>/mg ΔW/mg 吸水率
1 10.74 82.71 71.97 6.701
2 15.08 131.42 116.34 7.715
3 16.36 129.01 112.65 6.886
4 16.74 150.09 133.35 7.966
5 12.16 115.96 103.8 8.536
6 10.70 92.24 81.54 7.621
平均值 / / / 7.571
由表2可知，软骨复合支架的吸水率可达到6.701～8.536，平均吸水率为7.571。表明软骨复合支架具有良好的吸水性，有利于组织液和细胞的长入。
7、将软骨复合支架与新西兰家兔第4代脂肪间充质干细胞(ADSCs)共培养7天后，用活/死细胞染色试剂盒(美国invitrogen公司的R37601)染色，用荧光共聚焦显微镜(德国Leica TCS SP8X)观察，细胞存活率通过活细胞/总细胞×100％计算，评估软骨复合支架的生物相容性。
死/活染色结果如图6显示，软骨复合支架上脂肪间充质干细胞绝大多数显示活细胞，仅有少量死细胞；同时可见脂肪间充质干细胞均匀的分布在支架中。通过对细胞存活率计算结果显示，细胞存活率达到了87.59％，说明软骨复合支架具有良好的生物相容性。
8、将软骨复合支架与新西兰家兔第4代脂肪间充质干细胞共培养7天后，用2.5％的戊二醛溶液(美国Sigma公司)固定等预处理后，在扫描电子显微镜下观察，评估软骨复合支架的生物相容性。
扫描电镜结果如图7所示，可见脂肪间充质干细胞在软骨复合支架上粘附、生长，细胞之间相融接触分泌了大量的细胞外基质，说明本发明的软骨复合支架具有良好的生物相容性。
9、软骨复合支架浸提液制备及CCK-8细胞毒性实验：根据ISO10993-12：2009标准，将软骨复合支架浸入DMEM/F12(50:50)低糖培养基中，浸提比为3cm2/mL，于37℃条件下温育72h。然后取浸提液用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤；于浸提液中加入10％(体积/体积)的FBS和1％(体积/体积)的双抗(青霉素-链霉素溶液(100X)，中国Solarbio公司)，获得软骨复合支架的浸提液培养基。
将新西兰家兔第四代脂肪间充质干细胞接种至96孔板(美国Corning公司提供)，每孔含2×103个细胞。每组有5个平行样本，对应加入100μL浸提液培养基，于37℃、5％CO2培养箱内培养1、4、7天后，分别加入10μL的CCK-8试剂(日本Dojindo公司提供)，继续孵育2h后，用EPOCH TAKE 3酶标仪(美国Bio Tek公司)测量450nm处的吸光度A值。以含10％(体积/体积)的FBS的DMEM/F12(50:50)低糖培养基培养细胞作为对照。
CCK-8检测结果如图8显示，随时间推移，软骨复合支架浸提液培养的细胞数量呈递增趋势，各时间点的实验组与对照组比较均无统计学差异(P>0.05)，说明本发明的软骨复合支架无细胞毒性。
10、取2个软骨复合支架放入到0.5mL含有0.5％重量/体积牛血清白蛋白的PBS溶液中，于37℃恒温摇床中，以60rpm的速度震荡，于1、2、3、4、7、14、21天取缓释液，并使用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，简称ELISA)测定上清液的光密度(optical density，OD)值(采用美国R&D公司的ELISA试剂盒，具体实验步骤依据说明书进行)，根据标准曲线方程分别计算缓释液中TGF-β3的浓度。
软骨复合支架的累计因子释放结果如图9显示，在最初的一周内，软骨复合支架可累计缓释将近30ng的生长因子，随后进入缓慢释放期，可以累积长达三周。软骨复合支架通过初期的短暂突释，可使软骨局部缺损区域达到有效因子浓度，然后进行缓慢的线性释放，以维持其有效浓度，有利于生长因子发挥其生物学效应。同时说明本发明的软骨复合支架具有良好的生长因子控释作用，可以负载并且控释生长因子，以促进软骨再生。
11、软骨复合支架的Transwell迁移实验使用美国康宁公司的3422型transwell小室，实验步骤按照产品说明书进行。设置3组测试：
阴性组：DMEM/F12(50:50)低糖培养基。
阳性组：含10％(体积/体积)FBS的DMEM/F12(50:50)低糖培养基。
实验组：DMEM/F12(50:50)低糖培养基和一个软骨复合支架(直径3.5mm，厚度2mm)。
取出24孔板，将DMEM/F12(50:50)低糖培养基加入到下室和上室，放入37℃、5％CO2细胞培养箱过夜孵育，然后移除培养基。下室加入软骨复合支架，然后将24孔板插入transwell小室，再将0.1mL新西兰家兔第四代脂肪间充质干细胞加入到上室中，20000个/孔，放入到37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育24h。用棉签小心地刮掉上室中的非迁移细胞并用PBS洗涤，使用4％多聚甲醛固定下侧出现的迁移细胞，固定30min后，用0.1％结晶紫(美国Sigma-Aldrich公司提供)进行细胞染色20min。总共计算每个孔的随机5个视野(放大倍数：200×)中的细胞以计算平均数。随后，使用Image-Pro Plus 6.0软件(美国MediaCybernetics公司)来定量迁移的细胞。
Transwell迁移实验结果如图10和图11显示，与阴性组(A)相比，阳性组(B)和实验组(C)具有显著促进脂肪间充质干细胞迁移的作用(***：P<0.001；****：P<0.0005)，更有效的发挥了TGF-β3的强大细胞募集能力，显著促进干细胞的迁移，从而能够提高缺损软骨组织的再生修复效果。
以上结果表明，本发明实施例的软骨复合支架，具有疏松多孔的结构，具有成分和结构双仿生的特点，细胞相容性良好，力学强度高，并且能够通过缓释细胞因子发挥其生物学效应，促进间充质干细胞的迁移，并且营造有利于细胞粘附、增殖、分化和成熟的微环境，促进无血管区的缺损软骨组织的再生修复，提高再生修复效果。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (14)

1.一种软骨复合支架的制备方法，其特征在于，包括：
提供脱钙松质骨，包括松质骨脱脂步骤和松质骨脱钙步骤，所述松质骨脱钙步骤中，采用8％～12％重量/体积的乙二胺四乙酸脱钙液对脱脂后的所述松质骨进行浸泡脱钙，脱钙的温度为33℃～37℃，时间为600h～680h，其中每隔120h～170h更换一次脱钙液，所述脱钙液的pH为7～7.3；
使包含基质材料的浆料填充于所述脱钙松质骨的孔中，经干燥后，得到初始支架，所述基质材料包括脱细胞细胞外基质；
对所述初始支架进行交联处理，以使所述基质材料交联复合于所述脱钙松质骨，得到三维多孔的支架；
使包含生长因子的溶液浸润于所述支架的孔中，经干燥后，所述生长因子通过与所述基质材料之间的亲和作用固定于所述支架，得到软骨复合支架，所述亲和作用包括配位键和弱共价键中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述基质材料的颗粒粒径为100nm～10μm；和/或，
所述包含基质材料的浆料中含2％～4％重量/体积的所述基质材料。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包含生长因子的溶液中含1μg/mL～500μg/mL的所述生长因子。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述交联处理所使用的交联剂包括碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或多种；
所述交联处理的温度为2℃～6℃，时间为18h～24h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干燥均为冷冻干燥。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
使用无菌的磷酸缓冲盐溶液对所述支架进行浸泡处理；
使用三蒸水对浸泡处理后的所述支架进行清洗，并干燥。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述松质骨脱钙步骤中，脱钙在振荡速度为40rpm～80rpm。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述松质骨脱脂步骤中，采用氯仿和甲醇的体积比为1:2～2:1的混合液对所述松质骨进行浸泡脱脂，脱脂的温度为33℃～37℃，时间为20h～26h。
9.根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于，在所述松质骨脱钙步骤之前，还包括：采用75％体积分数的乙醇溶液振荡清洗脱脂后的松质骨，其中清洗的温度为33℃～37℃；清洗的时间为42h～48h，其中每隔4h～6h更换一次乙醇溶液；震荡速度为40rpm～80rpm。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述松质骨取自管状骨。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基质材料包括脱细胞细胞外基质，所述脱细胞细胞外基质的制备方法包括：
对包含细胞外基质的组织进行无菌处理；
对无菌的所述组织进行湿法粉碎，获得悬浮浆料；
采用低渗联合冻融的方法和/或差速离心法对所述悬浮浆料进行脱细胞处理，获得所述脱细胞细胞外基质。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生长因子包括血小板源性生长因子-AA、血小板源性生长因子-AB、血小板源性生长因子-BB、转化生长因子-β1、转化生长因子-β3、胰岛素样生长因子1、胰岛素样生长因子2、胰岛素样生长因子结合蛋白3、胰岛素样生长因子结合蛋白5、骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白4、表皮生长因子、肝素结合的表皮生长因子、转化生长因子-α、成纤维细胞生长因子2、血管内皮细胞生长因子-A和肝细胞生长因子中的一种或多种。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和作用还包括氢键、静电作用和疏水性相互作用中的一种或多种。
14.一种根据权利要求1-13任一项所述方法制备的软骨复合支架，包括：
支架，包括脱钙松质骨和交联复合于所述脱钙松质骨的孔中的基质材料，所述支架为三维多孔结构体，所述基质材料包括脱细胞细胞外基质；
生长因子，所述生长因子通过与所述基质材料之间的亲和作用固定于所述支架中，所述亲和作用包括配位键和弱共价键中的一种或多种。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111808808A (zh) * 2020-08-04 2020-10-23 北京臻溪谷医学研究中心（有限合伙） 一种间充质干细胞在脱细胞异体真皮支架上的培养方法及其应用
CN112245395A (zh) * 2020-11-20 2021-01-22 佳木斯大学 一种医用软骨修复剂及其制备方法
CN115382021B (zh) * 2022-09-22 2024-01-05 诺一迈尔（苏州）医学科技有限公司 一种复合人工软骨支架及其制备方法
CN115581812A (zh) * 2022-09-29 2023-01-10 中国人民解放军总医院第一医学中心 软骨支架及其制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101574540A (zh) * 2008-05-09 2009-11-11 中国人民解放军总医院 组织工程骨/软骨双层支架及其构建方法和应用
CN101979105A (zh) * 2010-11-11 2011-02-23 昆明医学院第一附属医院 一种用于软骨缺损修复的组织工程支架材料及其制备方法
CN102977391A (zh) * 2012-12-03 2013-03-20 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种在组织工程支架上定量装载生长因子的方法及其应用
CN103785065A (zh) * 2014-01-24 2014-05-14 北京大清生物技术有限公司 一种软骨再生支架材料的制备方法
CN103877615A (zh) * 2014-03-18 2014-06-25 北京大学第三医院 一种软骨组织工程支架及其制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101574540A (zh) * 2008-05-09 2009-11-11 中国人民解放军总医院 组织工程骨/软骨双层支架及其构建方法和应用
CN101979105A (zh) * 2010-11-11 2011-02-23 昆明医学院第一附属医院 一种用于软骨缺损修复的组织工程支架材料及其制备方法
CN102977391A (zh) * 2012-12-03 2013-03-20 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种在组织工程支架上定量装载生长因子的方法及其应用
CN103785065A (zh) * 2014-01-24 2014-05-14 北京大清生物技术有限公司 一种软骨再生支架材料的制备方法
CN103877615A (zh) * 2014-03-18 2014-06-25 北京大学第三医院 一种软骨组织工程支架及其制备方法

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