CN115957379A - 一种神经修复膜及其制备方法和应用 - Google Patents
一种神经修复膜及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种神经修复膜及其制备方法和应用。所述神经修复膜包括内层、中间层和外层，内层为单轴有序排列的静电纺丝纤维层，外层为无规的静电纺丝纤维层，中间层为含生物活性粒子的静电喷雾颗粒层，生物活性粒子在中间层结构表面上的沉积密度呈梯度分布。本发明通过调控纺丝纤维拓扑结构，同时结合梯度活性粒子结构，实现活性粒子的缓慢释放和长期释放，从而高效地结合各项促进周围神经修复的诱导信号，调控引导周围神经再生过程中活性粒子从近端向远端释放，促进轴突从近端向远端伸展，加快周围神经修复过程。本发明制备的神经修复膜可剪裁成不同大小以匹配受损神经尺寸，提高周围神经损伤的修复效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，进一步地说，是涉及一种神经修复膜及其制备方法和应用。
背景技术
周围神经损伤是临床常见的致残性疾病。随着现代社会机械化进程，每年约有200万新增病例，周围神经损伤的修复是亟待解决的临床医学问题。自体移植是临床治疗周围神经缺损的“金标准”，然而自体移植来源有限，对供区损害、尺寸不匹配和二次手术等限制了其应用。因此，人工合成的神经修复移植物被开发，希望能够作为自体移植的临床替代方案。目前国内临床上可用的神经修复移植物主要起引导周围神经修复的作用，修复完成后保留在体内或发生降解(如：I型胶原人工神经鞘管，北京天新福医疗器材有限公司；神桥，广州中大医疗器械有限公司；周围神经修复移植物，江苏益通生物科技有限公司)。这些产品不但物理导向信号差，而且生物活性低，鲜有活性粒子的加载或负载浓度均一，缺乏神经再生所需的生化信号，导致周围神经损伤的修复效果差。此外，临床使用的神经修复移植物全为管状，直径与长度固定，导致其有时无法很好的与受损神经相匹配。
因此，开发能够模拟细胞外基质组成与结构，提供修复周围神经损伤所需的微环境，尺寸可调节的人工神经修复移植物，对于修复周围神经损伤具有极大的意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种神经修复膜及其制备方法和应用。
本发明制备了一种加载梯度密度活性粒子的三层结构神经修复膜。通过调控纺丝纤维拓扑结构(单轴有序排列的纤维层)，同时结合梯度活性粒子结构(静电喷雾颗粒层)，通过活性粒子的缓慢释放、持续释放和趋触性原理，高效地结合各项促进周围神经修复的诱导信号，促进轴突从近端向远端伸展，有效地加快周围神经修复并提高修复效果。梯度分布利用细胞的趋触性从而促进细胞沿低浓度向高浓度定向迁移，相较于构筑均匀浓度的活性因子层，更利于神经再生，且该神经修复膜可剪裁成不同尺寸以匹配受损神经的大小，提高修复效果。
本发明的目的之一是提供一种神经修复膜。
所述神经修复膜包括内层、中间层和外层；
所述内层为单轴有序排列的静电纺丝纤维层；
所述外层为无规的静电纺丝纤维层；
所述中间层为含生物活性粒子的静电喷雾颗粒层。
本发明优选的一种实施方式中，
所述生物活性粒子在中间层结构表面上的沉积密度呈梯度分布，生物活性粒子在中间层结构表面沉积浓度由近到远依次递减；
所述神经修复膜的长度为5mm～100mm，宽度为5mm～50mm；优选地，长度为15mm～100mm，宽度为10mm～50mm。
本发明的目的之二是提供一种神经修复膜的制备方法，包括：
(1)将可溶解的脂肪族聚酯和天然高分子聚合物M1的混合物、或可溶解的脂肪族聚酯加入到溶剂A中，充分溶解后得到溶液，将溶液进行静电纺丝，得到单轴有序排列的静电纺丝纤维膜N1；
(2)将天然高分子聚合物M2加入溶剂B，溶解后得到壳层溶液；将活性因子加入溶剂C得到核层溶液；将壳层溶液和核层溶液静电喷雾到步骤(2)得到的静电纺丝纤维膜N1上，得到含有静电喷雾颗粒层的静电纺丝纤维膜N2；
(3)以步骤(2)得到的静电纺丝纤维膜N2作为接收器，在静电喷雾颗粒层上，将步骤(1)得到的溶液作为纺丝液，通过静电纺丝沉积无规纤维，制得所述神经修复膜。
本发明优选的一种实施方式中，
所述可溶解的脂肪族聚酯为聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚氨酯、聚丙交酯中的至少一种；和/或，
所述天然高分子聚合物M1和天然高分子聚合物M2分别独立地选自胶原蛋白、明胶、壳聚糖、淀粉、纤维素、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白中的至少一种；和/或，
所述溶剂A、溶剂B分别独立地选自六氟异丙醇、三氟乙醇、三氯甲烷、甲醇、二氯甲烷、N，N'-二甲基甲酰胺、乙酸、水中的至少一种；和/或，
所述溶剂C为乙酸、水、乙醇、甲醇、生理盐水中的至少一种；和/或，
所述活性因子为神经生长因子、神经营养素-3、脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子、转化生长因子β、神经节苷脂、血管内皮生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子中的至少一种。
本发明优选的一种实施方式中，
步骤(1)，
天然高分子聚合物M1与可溶解的脂肪族聚酯的质量比不大于100：1；优选为不大于40：1；
所述溶液的质量浓度为4％～20％；优选为6％～16％；
溶液采用转动速度为800rpm～3000rpm的辊筒作为接收器，，优选为1000～2000rpm的辊筒作为接收器；
推进速率为0.1mL/h～10mL/h，优选为1mL/h～3mL/h；
电压为8kV～30kV，优选为14kV～24kV；
接收距离为10cm～30cm；
纺丝时间为10min～720min，优选为300min～720min。
本发明优选的一种实施方式中，
步骤(2)，
所述壳层溶液的浓度为5mg/mL～100mg/mL，优选为20mg/mL～50mg/mL；
所述核层溶液的浓度为5μg/mL～2mg/mL，优选为50μg/mL～1.5mg/mL；
静电纺丝纤维膜N1的质量、与壳层溶液和核壳溶液的体积之和的用量比为1g静电纺丝纤维膜：(5～50)mL溶液；优选为1g静电纺丝纤维膜：(15～40)mL溶液；
壳层溶液和核层溶液的体积比为(2～5)：1；优选为(2～4)：1。
本发明优选的一种实施方式中，
步骤(2)，
壳层溶液和核层溶液同轴静电喷雾，同时使用移动挡板；所述移动挡板的长为1cm～20cm，宽为0.5cm～10cm；优选长为1.5cm～10cm，宽为1cm～5cm；；
所述移动挡板的移动速度为1cm/h～30cm/h，优选为3cm/h～10cm/h；
移动挡板大小能完全遮挡纺丝膜N1，挡板通过移动，可以使纺丝膜N1不同位置暴露在静电喷雾的时间不同，从而使沉积在纺丝膜N1不同位置上的静电喷雾颗粒密度不同，通过调节挡板的速度可以调节纺丝膜N1暴露在静电喷雾的时间，从而改变颗粒的沉积密度梯度；
壳层溶液的推进速率为0.1mL/h～10mL/h，优选为1mL/h～5mL/h；
核层溶液的推进速率为0.1mL/h～5mL/h，优选为0.3mL/h～2.5mL/h；
电压为10kV～30kV，优选为20kV～30kV；
接收距离为10cm～35cm，优选为12cm～15cm；
喷雾时间为1min～360min，优选为10min～60min。
本发明优选的一种实施方式中，
步骤(3)，
所述溶液采用转动速度为100rpm～400rpm的辊筒作为接收器；
推进速率为0.1mL/h～10mL/h，优选为0.2mL/h～6mL/h；
电压为8kV～30kV，优选为15kV～30kV；
接收距离为10cm～30cm，优选为18cm～30cm；
纺丝时间为10min～720min，优选为180min～720min。
本发明的目的之三是提供一种上述制备方法制得的神经修复膜。
本发明的目的之四是提供一种神经修复膜在修复周围神经损伤中的应用。
本发明具体可采用以下技术方案：
制备方法具体包括以下步骤：
步骤(1)、将可溶解的脂肪族聚酯或者可溶解脂肪族聚酯和天然高分子聚合物M1加入到溶剂A中，充分溶解，得到溶液；
步骤(2)、将得到的溶液使用具有转速范围为100rpm～3000rpm高速转动的滚辊筒进行静电纺丝后，得到的有序排列结构的静电纺丝纤维膜N1；
步骤(3)、天然高分子聚合物M2加入溶剂B得到壳层溶液；生长因子加入溶剂C得到核层溶液；
步骤(4)、使用移动速度为1cm/h～30cm/h的挡板，长1cm～20cm，宽为0.5cm～10cm，5mg/mL～100mg/mL壳层溶液，5μg/mL～2mg/mL核层溶液，同轴静电喷雾到步骤(2)得到的有序排列结构的静电纺丝纤维膜上，沉积由近端向远端粒子密度轴向梯度减少的生物活性物质粒子，得到负载静电喷雾颗粒的静电纺丝纤维膜N2；
步骤(5)、电喷结束后，将步骤(4)得到的负载同轴静电喷雾颗粒的纤维膜作为接收器，将步骤(1)得到的溶液作为纺丝液，通过静电纺丝沉积无规纤维，形成三层结构的纤维膜，制得所述加载梯度密度活性粒子的神经修复膜。将神经修复膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发。
制得的神经修复膜包括内层、中间层和外层，内层为有序排列纤维层，中间层为具有梯度密度的生物活性粒子的静电喷雾颗粒层，外层为静电纺丝纤维层。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明提供的神经修复膜具有单轴排列的纤维层和密度梯度的生物活性物质的静电喷雾颗粒层，改善了现有神经修复移植物物理导向作用差，缺少生化信号及多种信号协同问题。本发明提供的神经修复膜可以促进细胞招募与迁移，含有促进周围神经修复的微粒调控不同细胞的行为，介导细胞的迁移、增殖、分化，能加快轴突由近端向远端伸展，并提升周围神经损伤的修复效果。
静电喷雾颗粒层的生物活性物质呈梯度分布，利用细胞的趋触性从而促进细胞沿低浓度向高浓度定向迁移，相较于构筑均匀浓度的活性因子层，更利于神经再生，且该神经修复膜可剪裁成不同尺寸以匹配受损神经的大小，提高修复效果。
附图说明
图1为本发明制备的神经修复膜的结构示意图；
1为内层，2为中间层，3为外层；
图2为制备沉积密度呈梯度分布的中间层的静电喷雾步骤示意图；
图3为实施例1的步骤(1)制得的有序排列纤维的SEM图；
图4为实施例1的步骤(3)制得的无规纤维的SEM图；
图5为实施例1制得的神经修复膜负载酸性成纤维细胞生长因子的释放曲线图；
图6为雪旺细胞在对比例1制得的神经修复膜上的迁移行为图；
图7为雪旺细胞在实施例1制得的神经修复膜上的迁移行为图；
图8为鸡胚背根神经节在对比例1制得的的神经修复膜的伸展情况图；
图9为鸡胚背根神经节在实施例1制得的神经修复膜的伸展情况图；
图10为雪旺细胞在实施例2制得的神经修复膜上的迁移行为图；
图11为鸡胚背根神经节在实施例3制得的神经修复膜的伸展情况图；
图12为雪旺细胞在实施例4制得的神经修复膜上的迁移行为图；
图13为雪旺细胞在实施例5制得的神经修复膜上的迁移行为图；
图14为雪旺细胞在实施例6制得的神经修复膜上的迁移行为图。
具体实施方式
下面结合具体附图及实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明的进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明内容对本发明做出的一些非本质的改进和调整仍属本发明的保护范围。
实施例中所用原料均为常规市购原料。
本发明用的主要原料见表1
表1
| 聚乳酸-羟基乙酸共聚物 | 26780-50-7 | Sigma-Aldrich |
| 聚乳酸 | 26100-51-6 | Sigma-Aldrich |
| 聚己内酯 | 24980-41-4 | Sigma-Aldrich |
| 壳聚糖 | 9012-76-4 | Sigma-Aldrich |
| 胶原蛋白 | 9007-34-5 | Sigma-Aldrich |
| 神经生长因子 | P00197 | Solarbio |
| 血管内皮生长因子 | P00063 | Solarbio |
| 脑源性神经营养因子 | P00062 | Solarbio |
| 人碱性成纤维细胞生长因子 | P00032 | Solarbio |
测试方法：
生长因子释放：将制备得到的神经修复膜剪裁为4mm*12mm大小，加入1mL的PBS缓冲液，实验的平行样品三组；浸泡1、3、5、7、12、18、24、40和60天后，在相同的时间节点时取样，在60天后的实验结束，采用ELISA试剂盒进行检测1、3、5、7、12、18、24、40和60天后PBS中释放的酸性成纤维细胞生长因子含量，得到释放曲线。
雪旺细胞迁移：雪旺细胞接种前，将神经修复膜用细胞培养基洗涤三次。然后，将灭菌的聚二甲基硅氧烷条置于样品上左侧留下宽度为0.5cm的区域接种雪旺细胞。细胞粘附4小时后，去除条带以允许细胞向前迁移。再孵育三天后，分别对细胞进行染色。将细胞固定在3％戊二醛溶液中10分钟，用0.1％Triton X-100渗透5分钟，然后在室温下用3％BSA溶液封闭1小时。之后，将样品在含有Alexa Fluor 488溶液中在4℃下孵育3h，然后在室温下分别浸入Alexa Fluor 555鬼笔环肽和4'，6-二脒-2-苯基吲哚的溶液中20和5min。每个操作后用PBS溶液洗涤三次。染色后，在激光共聚焦扫描显微镜下对样品进行观察拍摄。
背根神经节培养：背根神经节放入不同神经纤维膜上，加入1-3mL的背根神经节培养液养于60mm培养皿或者24孔板中，观察1-5天的背根神经节的轴突伸展情况，定期换液，共培养5天。倒掉培养液，用PBS冲洗3次后，加入使溶液没过纤维膜即可的3.7％甲醛溶液对背根神经节细胞进行固定45min后，加入的3％BSA溶液30-60min后，加入anti-neurofilament 200与PBS溶液比例为1：200在4℃下过夜，在室温下Alexa Fluor 488goatanti-mouse IgG与PBS溶液比例为1：200浸泡60min，DAPI溶液浸润10min在室温下进行避光处理，每两步骤之间用PBS冲洗3-5次。染色完成后，激光共聚焦扫描显微镜进行观察拍摄。
测试用的鸡胚背根神经节提取自8-12天的鸡胚胎；雪旺细胞为大鼠雪旺细胞，购自中国科学院细胞库。
实施例1
步骤(1)：取聚己内酯溶于二氯甲烷中，室温磁力搅拌24h，得到质量浓度为12％的溶液；用溶液进行静电纺丝，用转速为1000rpm的辊筒作为接收器，溶液推进速率为1.0mL/h，电压15kV，接收距离为25cm，纺丝360min，得到单轴有序排列的聚己内酯纳米纤维膜；
步骤(2)：取胶原蛋白溶解于乙酸水溶液中，室温磁力搅拌24h后充分混合，得到壳层溶液，浓度为20mg/mL；取人碱性成纤维细胞生长因子加入到去离子水中，充分搅拌溶解得核层溶液，浓度为50μg/mL，聚己内酯纤维膜与壳层溶液和核壳溶液之和的用量比为1g：40mL；壳层溶液和核层溶液的体积比为3：1；使用移动速度为10cm/h的挡板，长10cm，宽为3cm，更换纺丝液为壳层溶液和核层溶液，更换单轴纺丝针头为同轴针头；步骤(1)中得到的单轴有序排列的聚己内酯纳米纤维膜作为接收器，进行同轴静电喷雾，壳层电喷溶液推进速率为3.0mL/h，核层电喷溶液推进速率为1.0mL/h，电压25kV，接收距离为15cm，喷雾10min，沉积由近端向远端粒子密度轴向梯度减少的生物活性物质粒子，得到负载梯度静电喷雾颗粒的静电纺丝纤维膜；
步骤(3)：电喷结束后，将步骤(4)得到的负载同轴静电喷雾颗粒的纤维膜作为接收器，将步骤(1)得到的溶液作为纺丝液，通过静电纺丝沉积无规纤维，溶液采用转动速度为100rpm的辊筒作为接收器，推进速率为0.5mL/h，电压为22kV，接收距离为25cm，纺丝时间为300min；得到所述三层结构的神经修复膜。制得将神经修复膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发。
神经修复膜的长为10cm，宽为3cm。
对比例1
与实施例1的区别为：步骤(2)不使用挡板；
其他条件均与实施例1相同，得到负载均一静电喷雾颗粒的神经修复膜。
实施例2
步骤(1)：取质量比为40：1的聚乳酸和明胶溶于三氟乙醇中，室温磁力搅拌20h，得到质量浓度为8％的溶液；用溶液进行静电纺丝，用转速为1500rpm的辊筒作为接收器，溶液推进速率为3.0mL/h，电压14kV，接收距离为13cm，纺丝480min，得到单轴有序排列的聚乳酸纳米纤维膜；
步骤(2)：取纤连蛋白溶解于三氟乙醇中，室温磁力搅拌24h后充分混合，得到壳层溶液，浓度为35mg/mL；取血管内皮生长因子、神经生长因子(质量比1：1)加入到去离子水中，充分搅拌溶解得核层溶液，核层浓度为1000μg/mL，聚乳酸纤维膜与壳层溶液和核壳溶液之和的用量比为1g：30mL；壳层溶液和核层溶液的用量比为3：1；使用移动速度为5cm/h的挡板，长2.5cm，宽为2cm，更换纺丝液为壳层溶液和核层溶液，更换单轴纺丝针头为同轴针头；步骤(1)中得到的单轴有序排列的聚乳酸纳米纤维膜作为接收器，进行同轴静电喷雾，壳层电喷溶液推进速率为5mL/h，核层电喷溶液推进速率为2.5mL/h，电压30kV，接收距离为14cm，喷雾30min，得到负载静电喷雾颗粒的聚乳酸纤维膜；同轴静电喷雾到步骤(1)得到的有序排列结构的静电纺丝纤维膜上，沉积由近端向远端粒子密度轴向梯度减少的生物活性物质粒子，得到负载静电喷雾颗粒的静电纺丝纤维膜；
步骤(3)：电喷结束后，将步骤(2)得到的负载同轴静电喷雾颗粒的纤维膜作为接收器，将溶液作为纺丝液，通过静电纺丝沉积无规纤维，溶液采用转动速度为400rpm的辊筒作为接收器，推进速率为6mL/h，电压为25kV，接收距离为30cm，纺丝时间为360min；得到所述三层结构的神经修复膜。将神经修复膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发。
神经修复膜的长为2.5cm，宽为2cm。
实施例3
步骤(1)：取聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于体积比为4：1的三氯甲烷和N，N'-二甲基甲酰胺中，室温磁力搅拌8h，得到质量浓度为10％的溶液；用溶液进行静电纺丝，用转速为1500rpm的辊筒作为接收器，溶液推进速率为2.5mL/h，电压18kV，接收距离为28cm，纺丝420min，得到单轴有序排列的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米纤维膜；
步骤(2)：取胶原蛋白溶解于无菌水溶液中，室温磁力搅拌24h后充分混合，得到壳层溶液，浓度为30mg/mL；取脑源性神经营养因子、人碱性成纤维细胞生长因子(质量比为1：1)加入到去离子水中，充分搅拌溶解得核层溶液，核层溶液浓度为100μg/mL，聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维膜与壳层溶液和核壳溶液之和的用量比为1g：20mL；壳层溶液和核层溶液的用量比为4：1；使用移动速度为4cm/h的挡板，长4cm，宽为3cm，更换纺丝液为壳层溶液和核层溶液，更换单轴纺丝针头为同轴针头；步骤(1)中得到的单轴有序排列的聚己内酯纳米纤维膜作为接收器，进行同轴静电喷雾，壳层电喷溶液推进速率为1.6mL/h，核层电喷溶液推进速率为0.4mL/h，电压25KV，接收距离为12cm，喷雾60min，得到负载静电喷雾颗粒的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维膜；同轴静电喷雾到步骤(1)得到的有序排列结构的静电纺丝纤维膜上，沉积由近端向远端粒子密度轴向梯度减少的生物活性物质粒子，得到负载静电喷雾颗粒的静电纺丝纤维膜；
步骤(3)：电喷结束后，将步骤(4)得到的负载同轴静电喷雾颗粒的纤维膜作为接收器，将溶液作为纺丝液，通过静电纺丝沉积无规纤维，溶液采用转动速度为200rpm的辊筒作为接收器，推进速率为2.5mL/h，电压为20kV，接收距离为18cm，纺丝时间为210min；得到所述三层结构的神经修复膜。将神经修复膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发。
神经修复膜的长为4cm，宽为3cm。
实施例4
步骤(1)：取质量比为40：1的壳聚糖和聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于体积比为7：3的乙酸和二氯甲烷中，室温磁力搅拌18h，得到质量浓度为8％的溶液；用溶液进行静电纺丝，用转速为1800rpm的辊筒作为接收器，溶液推进速率为3.0mL/h，电压16kV，接收距离为20cm，纺丝720min，得到单轴有序排列的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米纤维膜；
步骤(2)：取胶原蛋白、层粘连蛋白(质量比1：1)溶解于无菌水溶液中，室温磁力搅拌20h后充分混合，得到壳层溶液，壳层溶液浓度为25mg/mL；取神经生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子(质量比为1：1)加入到去离子水中，充分搅拌溶解得核层溶液，核层溶液浓度为200μg/mL，聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维膜与壳层溶液和核壳溶液之和的用量比为1g：40mL；壳层溶液和核层溶液的用量比为2.5：1；使用移动速度为3cm/h的挡板，长1.5cm，宽为1cm，更换纺丝液为壳层溶液和核层溶液，更换单轴纺丝针头为同轴针头；步骤(1)中得到的单轴有序排列的纳米纤维膜作为接收器，进行同轴静电喷雾，壳层电喷溶液推进速率为2.5mL/h，核层电喷溶液推进速率为1.0mL/h，电压28kV，接收距离为15cm，喷雾60min，得到负载静电喷雾颗粒的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维膜；同轴静电喷雾到步骤(1)得到的有序排列结构的静电纺丝纤维膜上，沉积由近端向远端粒子密度轴向梯度减少的生物活性物质粒子，得到负载静电喷雾颗粒的静电纺丝纤维膜；
步骤(3)：电喷结束后，将步骤(4)得到的负载同轴静电喷雾颗粒的纤维膜作为接收器，将溶液作为纺丝液，通过静电纺丝沉积无规纤维，溶液采用转动速度为200rpm的辊筒作为接收器，推进速率为0.2mL/h，电压为16kV，接收距离为20cm，纺丝时间为720min；得到所述三层结构的神经修复膜。
将神经修复膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发。神经修复膜的长为1.5cm，宽为1cm。
实施例5
步骤(1)：将质量比为20：1壳聚糖和聚己内酯溶于体积比为1：1的乙酸和三氟乙醇中，室温磁力搅拌24h，得到质量浓度为14％的溶液；用溶液进行静电纺丝，用转速为1200rpm的辊筒作为接收器，溶液推进速率为1.0mL/h，电压24kV，接收距离为25cm，纺丝360min，得到单轴有序排列的壳聚糖/聚己内酯纳米纤维膜；
步骤(2)：取质量比为9：1的明胶和胶原蛋白溶解于无菌水溶液中，室温磁力搅拌20h后充分混合，得到壳层溶液，壳层溶液浓度为50mg/mL；取血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子、人碱性成纤维细胞生长因子(质量比1：1：1)加入到去离子水中，充分搅拌溶解得核层溶液，核层溶液浓度为1500μg/mL，壳聚糖纤维膜与壳层溶液和核壳溶液之和的用量比为1g：21mL；壳层溶液和核层溶液的用量比为3：1；使用移动速度为8cm/h的挡板，长8cm，宽为5cm，更换纺丝液为壳层溶液和核层溶液，更换单轴纺丝针头为同轴针头；步骤(1)中得到的单轴有序排列的壳聚糖/聚己内酯纳米纤维膜作为接收器，进行同轴静电喷雾，壳层电喷溶液推进速率为3mL/h，核层电喷溶液推进速率为1mL/h，电压27kV，接收距离为13cm，喷雾60min，得到负载静电喷雾颗粒的壳聚糖/聚己内酯纤维膜；同轴静电喷雾到步骤(1)得到的有序排列结构的静电纺丝纤维膜上，沉积由近端向远端粒子密度轴向梯度减少的生物活性物质粒子，得到负载静电喷雾颗粒的静电纺丝纤维膜；
步骤(3)：电喷结束后，将步骤(4)得到的负载同轴静电喷雾颗粒的纤维膜作为接收器，将溶液作为纺丝液，通过静电纺丝沉积无规纤维，溶液采用转动速度为120rpm的辊筒作为接收器，推进速率为3mL/h，电压为24kV，接收距离为20cm，纺丝时间为720min；得到所述三层结构的神经修复膜。
将神经修复膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发。神经修复膜的长为8cm，宽为5cm。
实施例6
步骤(1)：取质量比为1：1的聚氨酯和聚乳酸溶于体积比为1：1的六氟异丙醇和三氟乙醇中，室温磁力搅拌30h，得到质量浓度为12％的溶液；用溶液进行静电纺丝，用转速为2000rpm的辊筒作为接收器，溶液推进速率为2.5mL/h，电压18kV，接收距离为24cm，纺丝720min，得到单轴有序排列的聚氨酯/聚乳酸纳米纤维膜；
步骤(2)：取质量比为4：1的明胶和胶原蛋白溶解于无菌水溶液中，室温磁力搅拌20h后充分混合，得到壳层溶液，浓度为45mg/mL；取神经生长因子、脑源性神经营养因子、人碱性成纤维细胞生长因子(质量比为1：1：1)加入到去离子水中，充分搅拌溶解得核层溶液，核层溶液浓度为480μg/mL，聚氨酯/聚乳酸纤维膜与壳层溶液和核壳溶液之和的用量比为1g：21mL；壳层溶液和核层溶液的用量比为4：1；使用移动速度为6cm/h的挡板，长3cm，宽为2.5cm，更换纺丝液为壳层溶液和核层溶液，更换单轴纺丝针头为同轴针头；步骤(1)中得到的单轴有序排列的聚氨酯/聚乳酸纳米纤维膜作为接收器，进行同轴静电喷雾，壳层电喷溶液推进速率为3.2mL/h，核层电喷溶液推进速率为0.8mL/h，电压27kV，接收距离为15cm，喷雾30min，得到负载静电喷雾颗粒的聚氨酯/聚乳酸纤维膜；同轴静电喷雾到步骤(1)得到的有序排列结构的静电纺丝纤维膜上，沉积由近端向远端粒子密度轴向梯度减少的生物活性物质粒子，得到负载静电喷雾颗粒的静电纺丝纤维膜；
步骤(3)：电喷结束后，将步骤(4)得到的负载同轴静电喷雾颗粒的纤维膜作为接收器，将溶液作为纺丝液，通过静电纺丝沉积无规纤维，溶液采用转动速度为200rpm的辊筒作为接收器，推进速率为6mL/h，电压为28kV，接收距离为25cm，纺丝时间为180min；得到所述三层结构的神经修复膜。
将神经修复膜在通风橱中室温放置3天，使残余溶剂充分挥发。神经修复膜的长为2.5cm，宽为1.5cm。
图1为本发明制备的神经修复膜的结构示意图，从图中可以看出，从上至下分别为内层、中间层和外层，内层为单轴有序排列的静电纺丝纤维层，中间层是含生物活性粒子的静电喷雾颗粒层，外层是无规的静电纺丝纤维层。
图2为制备沉积密度呈梯度分布的中间层的静电喷雾步骤示意图，通过移动的档板，制得梯度分布的沉积密度，生物活性粒子在中间层结构表面沉积浓度由近到远依次递减。
从图3、图4可以看出，实施例1的外层为无规纤维，内层为有序排列纤维。
图5为实施例1与对比例1制得的神经修复膜负载酸性成纤维细胞生长因子的释放曲线图，从图中可以看出静电喷雾技术可以实现活性因子的加载和释放，加载量相同的情况下，负载梯度静电喷雾颗粒的神经修复膜更利于神经的再生。
图6为雪旺细胞在对比例1制得的负载均一静电喷雾颗粒的神经修复膜上的迁移行为图，图7为雪旺细胞在实施例1制得的负载梯度静电喷雾颗粒的神经修复膜上的迁移行为图，从图7中可以看出利用细胞的趋触性从而促进细胞沿低浓度向高浓度定向迁移，相较于图6中的构筑均匀浓度的活性因子层，更利于神经再生。
图8为鸡胚背根神经节在对比例1制得的负载均一静电喷雾颗粒的神经修复膜的伸展情况图，图9为鸡胚背根神经节在实施例1制得的负载梯度静电喷雾颗粒的神经修复膜的伸展情况图，从图9中可以看出利用细胞的趋触性从而促进轴突沿低浓度向高浓度定向伸展，相较于图8中的构筑均匀浓度的活性因子层，更利于神经再生。
图10、图12～14分别为雪旺细胞在实施例2、实施例4～6制得的负载梯度静电喷雾颗粒的神经修复膜上的迁移行为图，从图中可以看出利用细胞的趋触性从而促进细胞沿低浓度向高浓度定向迁移；图11为鸡胚背根神经节在实施例3制得的负载梯度静电喷雾颗粒的神经修复膜的伸展情况图，从图11中可以看出利用细胞的趋触性从而促进轴突沿低浓度向高浓度定向伸展。
实施例1～6制得的神经修复膜具有单轴排列的纤维层和密度梯度的生物活性物质的静电喷雾颗粒层，静电喷雾颗粒层的生物活性物质呈梯度分布，利用细胞的趋触性从而促进细胞沿低浓度向高浓度定向迁移，相较于构筑均匀浓度的活性因子层，更利于神经再生，可以促进细胞招募与迁移，含有促进周围神经修复的微粒调控不同细胞的行为，介导细胞的迁移、增殖、分化，能加快轴突由近端向远端伸展，并提升周围神经损伤的修复效果。
Claims (10)
1.一种神经修复膜，其特征在于：
所述神经修复膜包括内层、中间层和外层；
所述内层为单轴有序排列的静电纺丝纤维层；
所述外层为无规的静电纺丝纤维层；
所述中间层为含生物活性粒子的静电喷雾颗粒层。
2.如权利要求1所述的神经修复膜，其特征在于：
所述生物活性粒子在中间层结构表面上的沉积密度呈梯度分布；和/或，
所述神经修复膜的长度为5mm～100mm，宽度为5mm～50mm；优选地，长度为15mm～100mm，宽度为10mm～50mm。
3.一种如权利要求1或2所述的神经修复膜的制备方法，其特征在于所述方法包括：
(1)将可溶解的脂肪族聚酯和天然高分子聚合物M1的混合物、或可溶解的脂肪族聚酯加入到溶剂A中，充分溶解后得到溶液，将溶液进行静电纺丝，得到单轴有序排列的静电纺丝纤维膜N1；
(2)将天然高分子聚合物M2加入溶剂B，溶解后得到壳层溶液；将活性因子加入溶剂C得到核层溶液；将壳层溶液和核层溶液静电喷雾到步骤(2)得到的静电纺丝纤维膜N1上，得到含有静电喷雾颗粒层的静电纺丝纤维膜N2；
(3)以步骤(2)得到的静电纺丝纤维膜N2作为接收器，在静电喷雾颗粒层上，将步骤(1)得到的溶液作为纺丝液，通过静电纺丝沉积无规纤维，制得所述神经修复膜。
4.如权利要求3所述的神经修复膜的制备方法，其特征在于：
所述可溶解的脂肪族聚酯为聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚氨酯、聚丙交酯中的至少一种；和/或，
所述天然高分子聚合物M1和天然高分子聚合物M2分别独立的选自胶原蛋白、明胶、壳聚糖、淀粉、纤维素、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白中的至少一种；和/或，
所述溶剂A、溶剂B分别独立地选自六氟异丙醇、三氟乙醇、三氯甲烷、甲醇、二氯甲烷、N，N'-二甲基甲酰胺、乙酸、水中的至少一种；和/或，
所述溶剂C为乙酸、水、乙醇、甲醇、生理盐水中的至少一种；和/或，
所述活性因子为神经生长因子、神经营养素-3、脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子、转化生长因子β、神经节苷脂、血管内皮生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子中的至少一种。
5.如权利要求3所述的神经修复膜的制备方法，其特征在于：
步骤(1)，
天然高分子聚合物M1与可溶解的脂肪族聚酯的质量比不大于100：1；优选为不大于40：1；和/或，
所述溶液的质量浓度为4％～20％；优选为6％～16％；和/或，
所述溶液采用转动速度为800rpm～3000rpm，优选为1000～2000rpm的辊筒作为接收器；和/或，
推进速率为0.1mL/h～10mL/h，优选为1mL/h～3mL/h；和/或，
电压为8kV～30kV，优选为14kV～24kV；和/或，
接收距离为10cm～30cm；和/或，
纺丝时间为10min～720min，优选为300min～720min。
6.如权利要求3所述的神经修复膜的制备方法，其特征在于：
步骤(2)，
所述壳层溶液的浓度为5mg/mL～100mg/mL，优选为20mg/mL～50mg/mL；和/或，
所述核层溶液的浓度为5μg/mL～2mg/mL，优选为50μg/mL～1.5mg/mL；和/或，
静电纺丝纤维膜N1的质量、与壳层溶液和核壳溶液的体积之和的用量比为1g静电纺丝纤维膜：(5～50)mL溶液；优选为1g静电纺丝纤维膜：(15～40)mL溶液；和/或，
壳层溶液和核层溶液的体积比为(2～5)：1；优选为(2～4)：1。
7.如权利要求3所述的神经修复膜的制备方法，其特征在于：
步骤(2)，
壳层溶液和核层溶液同轴静电喷雾，同时使用移动挡板；所述移动挡板的长为1cm～20cm，宽为0.5cm～10cm；优选长为1.5cm～10cm，宽为1cm～5cm；；和/或，
所述移动挡板的移动速度为1cm/h～30cm/h，优选为3cm/h～10cm/h；和/或，
壳层溶液的推进速率为0.1mL/h～10mL/h，优选为1mL/h～5mL/h；和/或，
核层溶液的推进速率为0.1mL/h～5mL/h，优选为0.3mL/h～2.5mL/h；和/或，
电压为10kV～30kV，优选为20kV～30kV；和/或，
接收距离为10cm～35cm，优选为12cm～15cm；和/或，
喷雾时间为1min～360min，优选为10min～60min。
8.如权利要求3所述的神经修复膜的制备方法，其特征在于：
步骤(3)，
所述溶液采用转动速度为100rpm～400rpm的辊筒作为接收器；和/或，
推进速率为0.1mL/h～10mL/h，优选为0.2mL/h～6mL/h；和/或，
电压为8kV～30kV，优选为15kV～30kV；和/或，
接收距离为10cm～30cm，优选为18cm～30cm；和/或，
纺丝时间为10min～720min，优选为180min～720min。
9.一种如权利要求3～8之一所述方法制得的神经修复膜。
10.一种如权利要求1～2之一或如权利要求3～8之一所述方法制得的神经修复膜在修复周围神经损伤中的应用。
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