CN111936560B - 用于刺激神经再生、骨生成和血管生成的水凝胶 - Google Patents

用于刺激神经再生、骨生成和血管生成的水凝胶 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种可用于促进神经再生、骨生成和血管生成的水凝胶。

Description

用于刺激神经再生、骨生成和血管生成的水凝胶
本发明涉及一种可用于促进神经再生(neurotization)、骨生成和血管生成的水凝胶。
背景技术
在再生医学和组织工程领域中，外周神经系统甚至直到今天仍在骨组织再生的背景下给予较少考虑。然而，生物学、实验和临床数据证实了骨骼重建的主要事件即其新血管生成、其神经分布(innervation)及新骨形成之间的相互作用。
由本发明人的团队获得的最新生物学数据(Silva等，Cell Death and Disease,2017Dec 13；8(12):3209)通过感觉神经元和间充质细胞的二维共培养模型，证实了这两种细胞类型之间的通讯对骨生成的影响。然而，目前尚没有可以以实验或治疗的方式将这些观察结果付诸实践的三维材料或基质，以期开发出专门用于骨再生的新型创新材料。
在此背景下，发明人已经开发了一种新的水凝胶，所述新的水凝胶能够召集神经元、特别是感觉神经元，并且能够容纳其他细胞类型、更特别是形成骨的细胞和内皮细胞。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种水凝胶，所述水凝胶包含：
i)包含至少一个烯基化残基的弹性蛋白样多肽；和
ii)能够召集神经元和/或内皮细胞的肽，特别是IKVAV肽。
根据一个特定实施方式，根据本发明所述的水凝胶包含：
i)包含至少一个烯基化残基、特别是烯基化甲硫氨酸的弹性蛋白样多肽；
ii)能够召集神经元和/或内皮细胞的肽，特别是IKVAV肽；和
iii)交联聚合物，特别是具有硫醇末端基团的交联聚合物。
根据一个特定实施方式，所述弹性蛋白样多肽是包含至少出现一次序列VPGMG的多肽。非限制性地，所述弹性蛋白样肽具体来说可以是MGTELAAASEFTHMW[VPGMG]20(ELP20)、MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]5(ELPM20)或MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]10(ELPM40)多肽。
根据一个特定实施方式，所述肽是IKVAV肽，特别是式Cys-{β-Ala}-Ile-Lys-Val-Ala-Val-{β-Ala}-Cys的IKVAV肽。
在另一种变化形式中，所述交联聚合物、特别是具有硫醇末端基团的交联聚合物是多臂聚合物。更特别的是，所述交联聚合物可以是4臂聚乙二醇，特别是具有硫醇末端基团的4臂聚乙二醇，特别是平均分子量在10至30kDa之间的4臂聚乙二醇PEG，更特别是平均分子量在10至30kDa之间的包含具有硫醇末端基团的4个臂的4臂PEG。所述4臂聚乙二醇、特别是所述具有硫醇末端基团的4臂聚乙二醇，特别来说可以具有20kDa的平均分子量。在本发明的情形中，所述平均分子量是以重量计的分子量。
在一个特定实施方式中，所述具有硫醇末端基团的交联聚合物、所述包含烯基化甲硫氨酸残基的弹性蛋白样多肽和IKVAV肽以等摩尔的硫醇/烯烃比存在于所述水凝胶中。
根据另一个特定实施方式，所述水凝胶的浓度以密度计在5至15％(w/v)之间，特别是7至8％(w/v)之间。
在另一个实施方式中，所述水凝胶的储能模量G'在1至5之间，优选地在1至1.5kPa之间。
根据本发明所述的水凝胶还可以包含至少一种生物活性药剂，特别是至少一种生长因子。
本发明的另一方面涉及本申请中所描述的水凝胶，其用作药物。
根据另一方面，本发明涉及本申请中所描述的水凝胶，其用于骨再生方法中。
另外，本发明还涉及一种体外细胞培养方法，所述方法包括将细胞在本申请中所定义的水凝胶中进行培养。
附图说明
图1.A)水凝胶的组分和生产方法的示意图；B)示出了ELPM40+PEG水凝胶的照片。比例尺＝1mm。
图2.在37℃下各种不同终浓度下的ELPM40+PEG水凝胶的流变学性质研究。在图中注明了每种浓度下的弹性模量(G’)。
图3.(A)ELPM40+PEG、(B)ELPM40+25％IKVAV、(C)ELPM40+25％VKAIV、(D)ELPM40+50％IKVAV、(E)ELPM40+50％VKAIV的扫描电子显微术，示出了这些水凝胶的孔眼结构。F)孔径的定量：25％的粘附肽组合物与其他组合物相比具有更小的孔眼。
图4.通过在与蛋白酶K(0.5U/mL)温育7h后测定溶液中的游离胺而进行的水凝胶的降解的体外分析。
图5.内皮细胞(EC)、骨髓间充质基质细胞(BMSC)和感觉神经元(SN)的代谢活性。所有水凝胶组合物都允许三种细胞类型的附着和培养。
图6.内皮细胞在(A)ELPM40+PEG、(B)ELPM40+25％IKVAV、(C)ELPM40+25％VKAIV、(D)ELPM40+50％IKVAV和(E)ELPM40+50％VKAIV中培养后7天的形态。在所有组合物中，所述细胞能够进入水凝胶和在其中迁移并形成各种不同的结构。
图7.与(A)ELPM40+PEG、(B)ELPM40+25％IKVAV、(C)ELPM40+25％VKAIV、(D)ELPM40+50％IKVAV和(E)ELPM40+50％VKAIV结合的BMSC。使用所有的水凝胶组合物，所述细胞表现出球形形态。(F)浸没在ELPM40+50％IKVAV水凝胶中的细胞的详情，显示出了两个相连的核(由白色箭头指示)，表明所述细胞可以在所述凝胶内增殖。
图8.在(A)ELPM40+PEG、(B)ELPM40+25％IKVAV、(C)ELPM40+25％VKAIV、(D)ELPM40+50％IKVAV和(E)ELPM40+50％VKAIV中培养的感觉神经元的形态和扩散。比例尺100μm。(F)为所有水凝胶组合物测量的神经突起的平均长度。
图9.与各种不同水凝胶组合的在骨生成培养基中培养7天的BMSC中的基因表达。所述表达相对于用作对照的ELPM40+PEG组合物来表示。
图10.内皮细胞在ELPM40+PEG、ELPM40+25％IKVAV、ELPM40+25％VKAIV、ELPM40+50％IKVAV和ELPM40+50％VKAIV组合物中培养7天后的Tek基因表达。
图11.在11和26天后ELPM40+50％IKVAV和ELPM40+50％VKAIV组合物的皮下评估。(A)分析组织学切片以确定：i)炎性潜力(HE)，ii)诱导血管生成的能力(CD31免疫组织化学)和iii)神经分布(微管蛋白βIII免疫组织化学(β3T))。对于HE和CD31来说比例尺＝50μm。示出了CD31和β3T染色的放大，比例尺＝20μm。(B)在ELPM40+50％和ELPM40+50％VKAIVIKVAV组合物的植入区周围的区域中形成的血管的定量。
发明详述
本发明涉及一种能够促进神经再生、骨生成和血管生成的生物相容性水凝胶。这种水凝胶的特征在于它包含：包含至少一个烯基化甲硫氨酸残基的弹性蛋白样多肽；和能够召集神经元和/或内皮细胞的肽，特别是IKVAV肽。更特别的是，根据本发明所述的水凝胶的特征在于它包含：i)包含至少一个烯基化甲硫氨酸残基的弹性蛋白样多肽，和ii)能够召集神经元和/或内皮细胞的肽，特别是IKVAV肽，以及iii)交联聚合物，特别是具有硫醇末端基团的交联聚合物。
特别的是，根据本发明所述的水凝胶可以通过具有硫醇末端基团的交联聚合物来形成。在本发明的情形中，术语“具有硫醇末端基团的交联聚合物”意指在形成所述水凝胶之前，也就是说在与所述弹性蛋白样肽发生接触之前，具有至少一个游离SH硫醇官能团的聚合物。根据一个特定实施方式，当所述硫醇/烯烃比为等摩尔时或者当所述硫醇/烯烃比大于1(硫醇多于烯烃)时，所述水凝胶中具有硫醇末端基团的聚合物在与ELP反应后不再具有游离SH硫醇官能团。根据另一个实施方式，当所述硫醇/烯烃比小于1(硫醇不足或烯烃过量)时，所述水凝胶中具有硫醇末端基团的聚合物在与ELP反应后可以具有游离SH硫醇官能团。所述聚合物选自允许形成在对细胞无毒的意义上生物相容的水凝胶的聚合物。允许氧气和营养物以及二氧化碳和代谢废物的扩散也是有利的，以便饲养细胞并使其能够存活。所述水凝胶溶液的聚合物可以是天然来源的例如细胞外基质蛋白，或者是合成来源的例如聚乙二醇(PEG)、聚噁唑啉(POx)或聚肌氨酸(PSar)。根据一个实施方式，所述交联聚合物更特别的是多臂聚合物，特别是具有至少三个臂、更特别是至少四个臂的直链聚合物或多臂聚合物，对于所述多臂直链聚合物来说，可在其每个末端处包含硫醇基团。因此，所述交联聚合物更特别来说可以是多臂聚合物，特别是具有至少三个臂、更特别是至少四个臂的直链聚合物或多臂聚合物，所述多臂直链聚合物在其每个末端处包含硫醇基团。根据一个特定实施方式，所述多臂聚合物是4臂聚合物，其特别来说可以在其每个臂的末端处包含硫醇基团。可以特别提到的是直链的或包含3或4个臂或超过4个臂、更特别是4个臂的聚乙二醇(或PEG)类型的聚合物。根据一个实施方式，使用直链的或包含3或4个臂或超过4个臂、更特别是4个臂的聚乙二醇(或PEG)类型的聚合物，所述直链PEG的每个末端包含硫醇基团或者所述多臂PEG的每个臂在其末端处包含硫醇基团。在一个实施方式中，所述水凝胶包含4臂PEG，每个臂在其末端处包含硫醇基团，所述PEG的平均分子量在1至100kDa之间，更特别是10至30kDa之间，甚至更特别地所述PEG具有20kDa的平均分子量。
根据本发明所述的水凝胶的第二组分是包含至少一个烯基化甲硫氨酸残基的弹性蛋白样多肽(ELP)。这种类型的多肽、通过遗传工程生产它们的方法以及它们的纯化，对于本领域技术人员来说是已知的，所述技术人员特别来说可以参考国际申请WO2017021334以及Petitdemange等人(Biomacromolecules.2017Feb 13；18(2):544-550)和Petitdemange等人(Bioconjug Chem.2017May 17；28(5):1403-1412)的文章。在本发明的情形中，术语“烯基化甲硫氨酸残基”意味着所述甲硫氨酸残基的侧链被共价键合到包含烯烃基团的基团，也就是说在两个碳原子之间包含至少一个双键的基团。优选地，术语“烯烃基团”是指在键合到所述甲硫氨酸残基的基团中存在-CH＝CH2基团。根据一个特定实施方式，所述甲硫氨酸基团被键合到式(I)的基团：
根据一个实施方式，烯基化ELP的通过式(I)的基团的合成，可以使用烯丙基缩水甘油醚，按照在Petitdemange等人(Bioconjug Chem.2017May 17；28(5):1403-1412)中描述的程序，通过甲硫氨酸侧链处的化学选择性硫代烷基化来进行。
根据一个实施方式，在本发明的情形中使用的烯基化ELP包含至少出现一次的氨基酸序列VPGMG，在所述序列中甲硫氨酸残基被烯基化。
在一个实施方式中，所述烯基化ELP具有式(II)的结构
Z-[VPGXG]n-OH(II)
其中：
Z是包含1至20个氨基酸的肽；
X表示甘氨酸残基、缬氨酸残基或烯基化甲硫氨酸残基，特别是式(III)的烯基化甲硫氨酸残基：
n是1至200之间、更特别是10至200之间、甚至更特别是15至50之间、特别是20至40之间的整数；并且
其中位置X中的缬氨酸/烯基化甲硫氨酸的摩尔比在0:1至10:1之间，更特别地在1:1至5:1之间，所述比更特别地为3:1。
根据一个实施方式，X表示甘氨酸残基或烯基化甲硫氨酸残基，特别是式(III)的烯基化甲硫氨酸残基。
根据另一个优选实施方式，X表示缬氨酸残基或烯基化甲硫氨酸残基，特别是式(III)的烯基化甲硫氨酸残基。
根据一个实施方式，n是30至50之间、特别是35至45之间的整数，更特别地，n等于35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45。更特别地，n等于40。
根据一个特定实施方式，Z是氨基端末端处的氨基酸残基是甲硫氨酸的肽。
根据一个特定实施方式，Z不包含氨基酸序列IKVAV。根据另一个实施方式，包含在Z中的紧邻[VPGXG]n单元上游的氨基酸对应于MW二肽。特别的是，Z可以由所述MW二肽组成或者可以包含该二肽。举例来说，下文描述的ELP20肽包含序列Z，其中所述MW二肽在序列MGTELAAASEFTHMW中的C-端末端处。
根据一个实施方式，所使用的ELP是式Z-[VPGXG]n的肽，其中X是烯基化甲硫氨酸。
根据另一个实施方式，所使用的ELP是式Z-[VPGXG]n的肽，其中位置X中的缬氨酸/烯基化甲硫氨酸的摩尔比在0:1至10:1之间，更特别地在1:1至5:1之间，所述比更特别为3:1。
根据另一个实施方式，所使用的ELP是式Z-[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]x的肽，特别是MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]x，其中x是2至15之间、更特别地5至10之间的整数。
根据一个实施方式，所使用的ELP源自于选自在WO2017021334中描述的肽MGTELAAASEFTHMW[VPGMG]20(ELP20)、肽MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]5(ELPM20)或肽MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]10(ELPM40)的肽，所述肽包含至少一个烯基化甲硫氨酸残基。
根据一个特定实施方式，所述ELP具有下述结构：
更特别是结构MW[VPGVGVPGMaG(VPGVG)2]10(ELP-M(烯烃)-40)，其中Ma表示上述式(III)的烯基化甲硫氨酸残基。
根据上文描述的所有ELP的一个变化的实施方式，所述ELP的氨基端甲硫氨酸是烯基化甲硫氨酸，特别是上述式(III)的烯基化甲硫氨酸。举例说明，所述ELP特别来说可以具有下述结构：
在一个实施方式中，这种结构可以任选地根据下式来表示：
所述水凝胶的组分iii)是能够召集神经元和/或内皮细胞的肽。特别来说，作为能够召集内皮细胞的肽，可以提到的是源自于纤连蛋白的肽REDV、RGD和GRGDSP，源自于层粘连蛋白的IKLLI、IKVAV、PDSGR和YIGSR，和源自于I型胶原蛋白的肽DGEA。作为能够召集神经元细胞的肽，特别来说可以提到的是源自于层粘连蛋白的肽YIGSR、RNIAEIIKDI和IKVAV。根据一个特定实施方式，所述能够召集神经元和/或内皮细胞的肽是IKVAV肽，也就是说包含源自于层粘连蛋白A的氨基酸序列IKVAV的肽。在一个特定实施方式中，包含在本发明的水凝胶中的所述能够召集神经元和/或内皮细胞的肽，是在其每个末端处包含半胱氨酸残基的肽，特别是包含序列IKVAV的肽。所述半胱氨酸残基可以直接地或通过间隔物共价键合到氨基酸序列IKVAV。根据一个特定实施方式，所述半胱氨酸残基通过间隔物、特别是肽间隔物或假肽间隔物键合到所述能够召集神经元和/或内皮细胞的肽，特别是IKVAV肽。所述间隔物特别来说可以是氨基酸或氨基酸序列(特别是二肽或三肽)，特别是β氨基酸，更特别是β-Ala氨基酸。因此，根据一个特定实施方式，所述能够召集神经元和/或内皮细胞的肽是式Cys-{间隔物}-Ile-Lys-Val-Ala-Val-{间隔物}-Cys的IKVAV肽，特别是式Cys-{β-Ala}-Ile-Lys-Val-Ala-Val-{β-Ala}-Cys的肽。
所述水凝胶的组分的量可以在很大程度上变化，只要所述得到的水凝胶促进神经再生、骨生成和/或血管生成即可。根据一个特定实施方式，所述各种不同组分的量遵守10:1至1:10之间、特别是5:1至1:5之间、特别是2:1至1:2之间的硫醇/烯烃摩尔比。根据一个特定实施方式，所述硫醇/烯烃比是等摩尔(即它对应于1:1的摩尔比)。应该理解，所述硫醇基团存在于所述交联聚合物上和/或所述能够召集神经元和/或内皮细胞的肽、特别是如上所述的IKVAV肽上。因此，所述水凝胶可以包含可变量的每种组分，并在同时遵守上文定义的比。例如，由IKVAV肽携带的硫醇基团可以占由所述IKVAV肽和交联聚合物提供的所有硫醇基团的10至75mol％，更特别地占由所述IKVAV肽和交联聚合物提供的所有硫醇基团的20至60mol％，特别是25至50mol％。根据一个特定实施方式，由IKVAV肽携带的硫醇基团占由所述IKVAV肽和交联聚合物提供的所有硫醇基团的25mol％。根据另一个特定实施方式，由IKVAV肽携带的硫醇基团占由所述IKVAV肽和交联聚合物提供的所有硫醇基团的50mol％。
也可以选择所述水凝胶的组分的比例，以便获得具有适合于细胞，特别是神经元、骨骼或内皮细胞，特别是神经元细胞的发育的流变学性质的水凝胶。因此，本发明使得可以非常精细地调节所述水凝胶的结构以适应必须促进其发育的细胞类型。根据一个实施方式，所述水凝胶的刚性对应于包含在下述范围内的储能模量G'参数：1kPa<G’<5kPa，特别地1kPa<G’<1.5kPa。
根据另一个特定实施方式，水凝胶的浓度以密度计在约5至约15％(w/v)之间，特别是在约7至约8％(w/v)之间，更特别地该密度等于约7.5％(w/v)。
此外，根据本发明所述的水凝胶具有微孔性，并且可以包含平均孔径在特别是5至20μm之间、更特别是在10至17μm之间的范围内的孔眼。
根据一个特定实施方式，本发明的水凝胶可以包含一种或多种其他要素、用于靶向其他功能的其他肽序列或特别是用于进一步刺激神经再生、骨生成和/或血管生成的生物活性药剂例如生长因子。然而，根据一个特定实施方式，所述水凝胶不含生长因子，或仅以相对于所述水凝胶的总重量0至10重量％，更特别是以重量计相对于所述水凝胶的重量0至5重量％、更特别是0至1重量％、特别是0至0.1重量％的量包含它们。正如将在下文看到的，所述水凝胶也可用作细胞疗法载体。因此，如上所定义的水凝胶还可以包含治疗上感兴趣的细胞例如干细胞，特别是被诱导朝向感兴趣的谱系的干细胞、造血干细胞、源自于骨髓或脂肪组织的间充质基质干细胞、神经元干细胞或用于刺激细胞通讯过程的不同谱系细胞的混合物。在一个特定实施方式中，所述细胞是将人类胚胎干细胞排除在外的干细胞。在所述水凝胶形成后，通过使所述细胞与所述水凝胶发生接触并培养足够的时间(特别是至少1、2、3、4、5、6或至少7天)以便所述细胞可以在所述水凝胶中定殖，将所述细胞引入到所述水凝胶中。
根据本发明所述的水凝胶还可以包含矿物组分特别是羟基磷灰石或磷酸钙的纳米粒子(特别是以10至40％(w/v)之间的量)，以便提高所述水凝胶的成骨潜力。
本发明的水凝胶可以通过将这些各个组分i)至iii)和任何其他可选要素例如生长因子进行混合来生产。选择组分i)至iii)和这些组分i)至iii)的量，以便制备具有适合于用户所致力于解决的问题的物理和承载性质的水凝胶。有利情况下，通过交联形成水凝胶在刺激物例如温度或pH调节的作用下或通过交联剂、特别是光敏交联剂(或光引发剂)来进行。因此，举例来说，可以提到的是通过光引发剂例如特别是以0.5％(w/v)的密度用于混合物中的Irgacure 2959化合物，并通过UV-可见光(λ＝305–405nm，特别是305nm)激活来诱导光聚合。在另一种变化形式中，所述光引发剂特别来说可以选自苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸锂(LAP)和核黄素。在所述混合物中LAP的浓度可以在0.005％至0.5％(w/v)的范围内，并且其光引发可以在365至475nm之间的波长下触发。
根据一个方面，本发明涉及一种通过包含下述步骤的方法可获得或获得的水凝胶：
(a)将下述组分混合：
i)包含至少一个烯基化甲硫氨酸残基的弹性蛋白样多肽，和
ii)能够召集神经元和/或内皮细胞的肽，特别是IKVAV肽，和任选的(iii)具有硫醇末端基团的交联聚合物；和
iv)聚合引发剂，特别是光引发剂(和任选的另一种组分例如一种或多种生长因子)；并且
b)施加刺激物、特别是光辐射、特别是UV辐射，以便激活所述聚合。
有利的是，正如上文指出的，可以非常精细地定义所述水凝胶的流变学性质。此外，本发明人能够显示，根据本发明所述的水凝胶是可降解的并具有孔眼结构。最后，本发明人能够证明这种水凝胶适合于培养非常不同的细胞类型，即神经元、间充质细胞、骨细胞、内皮细胞或其祖细胞，这些细胞可以在所述水凝胶的结构内迁移，并且它没有细胞毒性效应。因此，它将对开发适用于组织再生的工具有用的所有有利特性汇集在一起。
因此，根据本发明所述的水凝胶能够有效地承载各种不同细胞类型的体外培养物。因此，根据一个特定实施方式，本发明涉及一种新的三维承载物，其能够在体外容纳对骨再生来说感兴趣的各种不同细胞，特别是神经元、骨或内皮细胞。因此，本发明为本领域技术人员提供了特别有利的3D细胞培养系统，其允许细胞在有利的环境中发育，并且也可以研究各种不同细胞类型彼此之间的相互作用。这个参数对于研究可需要各种不同细胞类型之间的复杂对话的再生现象来说是重要的。具体来说，本发明的承载物可用于容纳骨形成和内皮细胞，并且用于在包括将细胞在如上所定义的承载物中进行培养的体外细胞培养方法中研究血管生成、骨生成和神经再生效应。此外，根据本发明所述的承载物的用途可以包括向所述培养物添加药剂例如生长因子或具有生物学效应或潜在地能够具有生物学效应(候选药剂)的任何其他药剂，用于确定它对一个或多个参数和细胞应答例如细胞的生长、静止的诱导、细胞死亡、蛋白质分泌或其他分子或离子(特别是钙离子、钾离子)或某些基因的表达的影响。
根据另一方面，本发明的水凝胶使用在治疗方法中，特别是用作植入物。特别来说，所述水凝胶被用于再生医学治疗方法中。它可以特别用于刺激组织、特别是骨组织的神经分布，并且可以特别用于骨工程。有利的是，根据本发明所述的水凝胶促进神经再生，特别是在再生的环境中。更特别来说，根据本发明所述的水凝胶可以被有利地用于召集和刺激感觉神经系统，更特别地用于促进骨再生。也可以利用根据本发明所述的水凝胶以便优化或恢复组织的血管化和神经分布。
根据另一个实施方式，所述水凝胶可以用作细胞疗法载体。因此，将如上所定义的水凝胶之前用治疗上感兴趣的细胞定殖，例如通过干细胞，特别是被诱导成感兴趣的谱系的干细胞、造血干细胞、源自于骨髓或脂肪组织的间充质基质干细胞、神经元干细胞或不同谱系细胞的混合物。这种水凝胶可用于通过细胞或组织再生的治疗方法中。
根据本发明所述的水凝胶也可用于改良植入物系统，用于改善它们的生物相容性和它们的整合。
实施例
ELP-M(烯烃)-40肽的生产
Petitdemange等人的文章(Biomacromolecules.2017Feb 13；18(2):544-550.doi:10.1021/acs.biomac.6b01696.Epub 2017Jan 27.PubMed PMID:28075561)描述了用于MX[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]10肽(ELPM40)的表达载体的构建、它在大肠杆菌中的表达、它从细菌裂解液的分离、它的纯化和它的表征。
使用烯丙基缩水甘油醚，通过ELPM40肽的甲硫氨酸侧链的化学选择性硫代烷基化来生产具有下述结构的ELP-M(烯烃)-40肽的方法：
描述在Petitdemange等人(Bioconjug Chem.2017May 17；28(5):1403-1412.doi:10.1021/acs.bioconjchem.7b00082.Epub 2017Apr 18.PubMed PMID:28381088)中。
在所述实验部分的剩余部分中，术语ELPM40被用于表示所述ELP-M(烯烃)-40肽。
复合水凝胶的开发
水凝胶的生产
生产的水凝胶以等摩尔的硫醇/烯烃比含有ELPM40肽、具有硫醇末端基团的PEG(SH-PEG，20kDa；JenKem，USA)和Cys-{β-Ala}-Ile-Lys-Val-Ala-Val-{β-Ala}-Cys(IKVAV)粘附肽或随机版本的Cys-{β-Ala}-Val-Lys-Ala-Ile-Val-{β-Ala}-Cys(VKAIV)。光聚合使用Irgacure 2959光引发剂(0.5％w/v)，并在硫醇-烯烃反应后暴露到波长为305nm的UV光8分钟来进行。图1示出了由此获得的水凝胶的示意图。
测试了ELP和PEG的各种不同重量比，以便获得最佳的刚性和感觉神经元附着和神经突起生长。简单来说，将SH-PEG用所述粘附肽以各种不同的比例进行替换。所述测试的组合物如下：
(i)ELPM40+PEG，其中100％(mol)的硫醇基团被所述SH-PEG占据，
(ii)ELPM40+25％IKVAV或VKAIV，其中25％(mol)的硫醇基团被所述粘附肽占据，和
(iii)ELPM40+50％IKVAV或VKAIV，其中50％(mol)的硫醇基团被所述粘附肽占据。
流变学性质
在PBS中浸泡24h后，通过测量弹性(G’)和损耗(G”)模量的频率依赖性来评估所述水凝胶的流变学性质。在各种不同的水凝胶浓度即5％、7.5％、10％和15％(w/v)下对ELPM40+PEG组合物进行频率扫描。测量在37℃下进行。
可以显示，弹性模量与所述水凝胶的终浓度成正比提高(图2)。
通过扫描电子显微术进行的结构分析
通过冷冻扫描电子显微术进行分析，以确定在各种不同浓度下产生的水凝胶的孔径并可视化它们的结构。
所有所述水凝胶组合物均具有孔眼结构(图3A-E)，并且孔径在10.49±1.61μm(ELPM40+25％IKVAV)至16.39±2.81μm(ELPM40+50％IKVAV)的范围内。包含25％粘附肽的水凝胶组合物与在其他条件下获得的组合物相比具有更小的孔径(图3F)。
水凝胶的体外降解分析：
将15μL水凝胶在150μL蛋白酶K溶液(0.5U/mL)(Amresco，#0706)在含有1mM EDTA、5mM CaCl2和0.5％(v/v)Triton X-100的50mM Tris碱缓冲液(pH 8.0)中，在37℃下温育7h。使用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)，按照在Gilbert等，J Biomed Mater Res 1990,24,1221中描述的程序，确定以每1000个氨基酸中存在的游离胺基的数目(n/1000)表示的游离胺基的含量。所述游离胺基的含量使用对于三硝基苯基赖氨酸来说14600L/mol/cm的摩尔吸收系数来计算(Wang等，Biochim Biophys Acta 1978,544,555)。
在与蛋白酶K温育后，可以为所有水凝胶组合物检测溶液中的游离伯胺(图4)，表明交联过程不干扰体外降解性质。这对于具有生物医学应用的材料来说是一种重要性质。各种不同的细胞类型必须能够进入所述水凝胶的结构并在其中迁移。最常见的细胞迁移机制是以缓慢速率消化所述水凝胶结构的蛋白酶的分泌，从而使所述水凝胶能够被所述细胞定殖。
使用原代细胞的生物学评估
细胞和培养物的分离：
原代感觉神经元(SN)按照Malin等，Nat Protoc 2007,2,152描述的程序，从6至10周龄的Wistar大鼠的背根神经节(DRG)获得。
从6至10周龄Wistar大鼠分离骨髓来源的间充质基质细胞(BMSC)。简单来说，将所述动物的股骨和胫骨取出并在其端部切开以暴露出骨髓。将所述骨转移到1.5mL试管中，然后以1500x g离心30s，以便从中排出骨髓。然后将获得的沉淀物重悬浮在增补有10％(v/v)胎牛血清(PANTM-Biotech，Aidenbach，Germany)和1％(v/v)青霉素/链霉素的具有低葡萄糖含量的DMEM(Gibco)中，然后通过16G和21G针头4到6次。然后将所述获自股骨和胫骨的内含物接种到75cm2的摇瓶中，并在加湿培养箱(37℃和5％CO2)中温育。每周两次更换培养基，以便除去非贴壁细胞。将贴壁细胞培养直至90％合生，然后转移到具有更大表面积的容器中。使用所述细胞最多传代P3。当将它们与所述水凝胶组合时，将BMSC在骨生成培养基中进行培养，所述骨生成培养基对应于增补有10-9M地塞米松(Sigma-Aldrich)、10mMβ-磷酸甘油酯(Sigma-Aldrich)和50μg/mL抗坏血酸(Sigma-Aldrich)的上述培养基。
骨髓来源的内皮干细胞(EC)从Cell Biologics(目录号RA-6221)获得。将所述细胞在用明胶(2％)包被的板上，在含有试剂盒中的所有增补剂和5％(v/v)胎牛血清(GibcoLife Technologies,Karlsruhe,Germany)的EGM-2MV培养基(Lonza-Verviers,France)中培养，并在37℃下，在含有5％CO2的加湿气氛中温育。当所述细胞达到90％合生时，将它们转移到另一个用明胶(2％)包被的板上。
由于它们在组织工程中的优点，在本发明的水凝胶上研究了三种细胞类型：(i)BMSC是由于它们的成骨细胞分化潜力，(ii)EC是因为它们在血管生成中的主要作用，(iii)感觉神经元是为了证实神经组织在所述水凝胶中附着和允许神经突起生长的能力。
每种细胞类型在将其在本发明的水凝胶中培养之前进行表征。
每种细胞类型在水凝胶中的细胞代谢活性：
利用基于刃天青的使用的试验来确定所述细胞的代谢活性(O'Brien等，Eur JBiochem 2000,267,5421)。简单来说，将所述细胞在96孔板中以20000个细胞/cm2的密度接种在7.5％(w/v)的水凝胶中。向每个孔添加150μL含有刃天青(0.01mg/mL)的细胞培养基，并将微孔板在37℃温育3h。然后将100μL上清液转移到另一个96孔微孔板中并测量荧光(exc＝530nm，em＝590nm，Victor X3，Perkin Elmer)。在第4和7天测量所述代谢活性(n＝5)。
图5呈现了得到的结果。所述水凝胶允许测试的各种不同原代细胞的附着和培养而没有细胞毒性效应。对于EC来说，与相应的随机肽对照相比在ELPM40+25％IKVAV水凝胶中代谢活性更高。对于SN来说，ELPM40+50％IKVAV水凝胶与ELPM40+PEG组合物相比诱导了更高的代谢活性。
其他实验也显示，包含连接到PEG的另一个ELP序列的水凝胶在皮下植入到小鼠中时不诱导炎性应答。
含有细胞的水凝胶的共聚焦显微术：
将BMSC、EC和SN细胞以20000个细胞/cm2的浓度接种在水凝胶中并培养7天。
在培养后，将SN在4℃下用4％(w/v)甲醛固定30分钟，在4℃下用0.1％(v/v)的triton X-100通透化30分钟，并用1％(w/v)BSA阻断1h。使用抗βIII微管蛋白第一抗体来检测所述细胞。对于BMSC和EC来说，将肌动蛋白微丝用与Alexa Fluor 568偶联的鬼笔环肽标记。使用共聚焦显微镜(SPE，Leica Microsystems)可视化所述SN的形态。使用ImageJ软件和“简单神经突起示踪”工具对神经突起长度进行定量。通过追踪从胞体到可见末端的路径来测量神经突起，然后将长度转换为μm。
在培养7天后，EC穿透所述水凝胶，并在其中形成稳定的分支结构(图6)。这些结构对于将氧气和营养物输送到血管化组织来说是重要的。可以观察到在ELPM40+50％IKVAV水凝胶和包含随机肽的两种组合物中形成所述分支结构。尽管所述粘附肽的随机序列不具有与IKVAV肽相同的粘附功能，但是在含有所述随机肽的水凝胶组合物中，与ELPM40+50％IKVAV组合物相比没有观察到形态差异。这种现象可能是由于赖氨酸残基引起的正电荷增加而造成的。
对于所有组合物来说，当将BMSC与所述水凝胶组合时，它们发育成球状聚集体(图7)。我们的研究显示，对于ELPM40+50％IKVAV组合物来说，一些BMSC进入所述水凝胶的结构并形成分支。一些细胞是双核的，在所述两个核之间具有离散的连接，表明所述细胞可以在凝胶内分裂(图7F)。
对于SN来说，取决于水凝胶组合物，所述细胞表现出不同的行为(图8)。在ELPM40+PEG中，所述细胞形成较大的聚集体，并且神经突起未分散在所述水凝胶的结构中，而是围绕细胞体(图8A)。当将IKVAV序列添加到所述水凝胶组合物时，神经突起可以扩散。在ELPM40+50％IKVAV组合物中，与其他组合物相比，所述细胞采用更分散的分布，具有巨大且分支的神经突起的复杂网络(图8D)。神经突起长度的测量证实了这种形态观察。事实上，在ELPM40+50％IKVAV组合物中培养的SN能够形成更长的神经突起(图8F)。
重要的是要注意，在本研究中使用的培养基不含生长因子(特别是NGF)，其目的是为了分析所述水凝胶对神经突起的结构和扩展的特定影响。根据我们的结果，在ELPM40+50％IKVAV组合物中平均神经突起长度为266.44±63.95μm，这与在以2D进行的其中培养基增补有NGF的其他研究中测得的长度相当。
在水凝胶中在BMSC中表达的骨特异性标志物的分子分析：
使用Plus Micro试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)，按照制造商的流程从BMSC提取总RNA。使用Maxima反转录酶试剂盒(Thermo ScientificTM，Thermo FisherScientific，Waltham,MA,USA)，按照制造商的流程将100ng从4个孔获得的总RNA反转录成cDNA。使用CFX ConnectTM实时PCR检测系统(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)进行RT-PCR反应，并使用CFX ManagerTM软件3.0版(Bio-Rad Laboratories)进行分析。使用的引物如下(SEQ ID NO：1至12)：
Runx2 F：5'CCTTCCCTCCGAGACCCTAA 3'和R：5'ATGGCTGCTCCCTTCTGAAC 3'，
Sp7 F：5'TGCTTGAGGAAGAAGCTCACTA 3'和R：5'GGGGCTGAAAGGTCAGTGTA 3'，
Ctnnb1(βcat)F：5'GAAAATGCTTGGGTCGCCAG 3'和R：5'CGCACTGCCATTTTAGCTCC 3'，
Bsp1(Opn)F：5'GAGTTTGGCAGCTCAGAGGA 3'和R：TCTGCTTCTGAGATGGGTCA 3'，
Smad1 F：5'ATGGACACGAACATGACGAA 3'和R：5'GCACCAGTGTTTTGGTTCCT 3'，
Rplp0 F：5'CACTGGCTGAAAAGGTCAAGG 3'和5'GTGTGAGGGGCTTAGTCGAA 3'，以及
Tek F：5'CCACAGATAGAGGATTTGCCAG 3'和R：5'AAGTCATTTGGTTGGAGCACTG 3'。
所述表达使用阈值循环(Ct)值来定量，并且mRNA表达水平按照2-DDCt方法来计算。
为了确定所述水凝胶组合物是否可以支持BMSC的骨生成分化，分析了一组早期分化(Runx2和Sp7)和晚期分化(Opn)的骨生成标志物，并且也分析了与骨生成信号传导途径的触发相关联的基因(Smad1和βcat)。此外，分析了分别诱导血管化和成骨细胞分化的对于骨修复过程来说关键的因子，即vegfa和bmp2(图9)。
在骨生成培养基中培养7天后，与ELPM40+PEG相比在ELPM40+50％IKVAV组合物中观察到Runx2和Sp7表达的提高，并且与随机肽对照相比，在ELPM40+50％IKVAV组合物中Opn表达提高(图9)。在分析能够触发骨生成分化的信号传导途径时，与ELPM40+PEG相比，在ELPM40+50％IKVAV中Smad1和βcat的表达提高，表明这两个信号传导途径在与这些水凝胶相关的BMSC分化中发挥作用。因此，这些结果显示所述ELP肽可以代表促进BMSC骨生成的非常好的基质。此外，在本研究中测试的所有基因的表达水平相对于IKVAV肽的浓度都以剂量依赖性方式提高。触发骨生成分化和在其各个不同阶段直接起作用的基因的过表达，支持了ELPM40+50％IKVAV组合物在BMSC朝向骨生成谱系的分化中的作用。与ELPM40+PEG或ELPM40+50％VKAIV相比，使用ELPM40+50％IKVAV组合物时Vegfa血管生成因子的表达提高。在ELPM40+25％存在下，Bmp2表达提高。有趣的是，与ELPM40+PEG组合物相比，使用ELPM40+50％IKVAV组合物时所研究的所有基因的表达均提高，并且这种提高与IKVAV浓度成正比。
为了确定本发明的水凝胶的促血管生成潜力，将大鼠骨髓原代内皮细胞在各种不同的水凝胶组合物中培养。在培养7天后，评估在血管形成期间发挥作用的Tek的表达(图10)。与含有PEG或随机VKAIV肽的组合物相比，使用包含50％IKVAV的组合物时观察到Tek的过表达(p<0.05)。
最后，将ELPM40+50％IKVAV或VKAIV组合物皮下植入(图11)。正如缺乏多核巨细胞所示，未触发任何主要的炎性信号。当在植入区域周围的区域中对血管进行定量时，在植入26天后，与含有VKAIV肽的组合物相比，使用含有IKVAV的组合物观察到更高的血管密度，血管密度随时间增加。这些结果得到在体外和内皮细胞基因表达中获得的数据的支持，表明在含有50％IKVAV的组合物中Tek的表达提高。
总之，生产了基于ELP-M(烯烃)-40、SH-PEG和包含IKVAV粘附序列的合成肽的功能性水凝胶。这些水凝胶的优点是具有可精细修改的流变学性质。为了本研究的需要，所选的水凝胶具有适于SN生长的重量浓度。此外，这些水凝胶在体外可降解并具有孔眼结构。
生物评估显示，本发明的水凝胶支持EC、BMSC和SN细胞的培养，那些细胞在培养7天后能够在所述水凝胶结构内部迁移，并且没有观察到所述水凝胶的细胞毒性效应。对于血管化潜力而言，EC能够在包含50％粘附肽的组合物中形成稳定的分支结构。对于骨生成潜力而言，在所有组合物中BMSC的形态为球形组织类型，并且当将所述细胞在ELPM40+50％IKVAV组合物中培养时，对骨生成分化来说重要的一组基因被过表达。最后，对于神经再生潜力而言，在ELPM40+50％IKVAV组合物中培养的SN表现出更复杂的神经突起网络和更大的神经突起长度，后者与在增补有NGF的培养基中进行的其他神经突起培养中获得的长度可比拟，所述NGF是已知促进神经突起扩张的生长因子。
本申请中呈现的数据显示，所提出基于特定水凝胶的策略表现出对生物医学应用来说有利的特征，所述水凝胶是开发的第一种在不存在其他细胞因子或生长因子的情况下允许血管化、骨生成和神经再生的承载物。
序列表
<110> 波尔多大学（UNIVERSITE DE BORDEAUX）等
<120> 用于刺激神经再生、骨生成和血管生成的水凝胶
<130> B2699PC00
<160> 29
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 1
ccttccctcc gagaccctaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 2
atggctgctc ccttctgaac 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 3
tgcttgagga agaagctcac ta 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 4
ggggctgaaa ggtcagtgta 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 5
gaaaatgctt gggtcgccag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 6
cgcactgcca ttttagctcc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 7
gagtttggca gctcagagga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 8
tctgcttctg agatgggtca 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 9
atggacacga acatgacgaa 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 10
gcaccagtgt tttggttcct 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 11
cactggctga aaaggtcaag g 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 12
gtgtgagggg cttagtcgaa 20
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 基序肽
<400> 13
Val Pro Gly Met Gly
1 5
<210> 14
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> ELP20
<220>
<221> 重复序列
<222> (16)..(20)
<223> 20个重复
<400> 14
Met Gly Thr Glu Leu Ala Ala Ala Ser Glu Phe Thr His Met Trp Val
1 5 10 15
Pro Gly Met Gly
20
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> ELPM20
<220>
<221> 重复序列
<222> (3)..(17)
<223> 5个重复
<220>
<221> 重复序列
<222> (13)..(17)
<223> 2个重复
<400> 15
Met Trp Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly Val Pro Gly Val
1 5 10 15
Gly
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> ELPM40
<220>
<221> 重复序列
<222> (3)..(17)
<223> 10个重复
<220>
<221> 重复序列
<222> (13)..(17)
<223> 2个重复
<400> 16
Met Trp Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly Val Pro Gly Val
1 5 10 15
Gly
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽IKVAV
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> bAla
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> bAla
<400> 17
Cys Ala Ile Lys Val Ala Val Ala Val
1 5
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽IKVAV
<400> 18
Ile Lys Val Ala Val
1 5
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽VKAIV
<400> 19
Val Lys Ala Ile Val
1 5
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> X = 甘氨酸或烯基化甲硫氨酸
<400> 20
Val Pro Gly Xaa Gly
1 5
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 21
Met Gly Thr Glu Leu Ala Ala Ala Ser Glu Phe Thr His Met Trp
1 5 10 15
<210> 22
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 22
Arg Glu Asp Val
1
<210> 23
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 23
Gly Arg Gly Asp Ser Pro
1 5
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 24
Ile Lys Leu Leu Ile
1 5
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 25
Pro Asp Ser Gly Arg
1 5
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 26
Tyr Ile Gly Ser Arg
1 5
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 27
Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile
1 5 10
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> amorce
<400> 28
ccacagatag aggatttgcc ag 22
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> amorce
<400> 29
aagtcatttg gttggagcac tg 22

Claims (17)

1.一种水凝胶，所述水凝胶包含：
i)包含至少一个烯基化残基并包含至少出现一次VPGMG序列的弹性蛋白样多肽；
ii)能够召集神经元和/或内皮细胞的IKVAV肽；和
iii)在所述水凝胶形成之前具有硫醇末端基团的交联聚合物。
2.根据权利要求1所述的水凝胶，其中所述肽ii)是式Cys-{β-Ala}-Ile-Lys-Val-Ala-Val-{β-Ala}-Cys的IKVAV肽。
3.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于所述弹性蛋白样多肽是MGTELAAASEFTHMW[VPGMG]20(ELP20)多肽、MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]5(ELPM20)多肽或MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]10(ELPM40)多肽。
4.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于所述具有硫醇末端基团的交联聚合物是多臂聚合物。
5.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于所述交联聚合物是具有硫醇末端基团的4臂聚乙二醇。
6.根据权利要求5所述的水凝胶，其中所述具有硫醇末端基团的4臂聚乙二醇以重量计平均分子量在10至30kDa之间。
7.根据权利要求6所述的水凝胶，其中所述具有硫醇末端基团的4臂聚乙二醇以重量计平均分子量为20kDa。
8.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于所述具有硫醇末端基团的交联聚合物、包含烯基化甲硫氨酸残基的弹性蛋白样多肽和IKVAV肽以等摩尔的硫醇/烯烃比存在。
9.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于所述水凝胶的浓度以密度计在5至15％(w/v)之间。
10.根据权利要求9所述的水凝胶，其特征在于所述水凝胶的浓度以密度计在7至8％(w/v)之间。
11.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于所述水凝胶的储能模量G'在1至1.5kPa之间。
12.根据权利要求1至11中的任一项所述的水凝胶，所述水凝胶还包含至少一种生物活性药剂。
13.根据权利要求12所述的水凝胶，其中所述水凝胶还包含至少一种生长因子。
14.一种能够容纳感兴趣的细胞的三维承载物，其特征在于所述三维承载物包含根据权利要求1至13中的任一项所述的水凝胶。
15.根据权利要求1至13中的任一项所述的水凝胶或根据权利要求14所述的承载物，其用作药物。
16.根据权利要求1至13中的任一项所述的水凝胶或根据权利要求14所述的承载物，其用于骨再生方法中。
17.一种体外细胞培养方法，所述方法包括将细胞在权利要求1至13中的任一项中所定义的水凝胶中或根据权利要求14所述的承载物中进行培养。
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