CN103249433A

CN103249433A - 生物功能化的刺激应答型可溶性peg水凝胶

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Publication number: CN103249433A
Application number: CN2011800555616A
Authority: CN
Inventors: T·施泰因贝格; W·韦伯; R·居贝利; P·托马基迪; D·莱尔德
Original assignee: Universitaetsklinikum Freiburg; Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Current assignee: Universitaetsklinikum Freiburg; Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Priority date: 2010-11-19
Filing date: 2011-11-18
Publication date: 2013-08-14
Also published as: PL2455104T3; EP2455104B1; JP2013544248A; ES2423798T3; DK2455104T3; EP2455104A8; WO2012065751A1; RU2013127669A; US20130315996A1; US8980278B2; EP2648758A1; EP2455104A1

Abstract

本发明涉及生物功能化的刺激应答型可溶性PEG水凝胶。本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶包含PEG聚合物的基质，其经修饰含有至少一种多功能融合蛋白质，该多功能融合蛋白质优选地包含作为组分的底物结合肽（SBP），优选地重复的RGD-结合肽和/或ZZ结合结构域，优选地用于纯化的标签，以及至少一个N-和/或C-端连接体。本发明还涉及本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶在治疗病变中、在外科敷料中的用途，用于创伤处理、用于软组织和硬组织再生、用于在口腔中治疗创伤、用于眼科学领域、用于牙周缺陷领域等。本发明还描述了治疗此类疾病的方法。此外，本发明提供了包含本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶和任选地其他组分的药盒。

Description

生物功能化的刺激应答型可溶性PEG水凝胶

本发明涉及生物功能化的刺激应答型可溶性PEG水凝胶。本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶包含PEG聚合物的基质，其经修饰而含有至少一个多功能融合蛋白质，该多功能融合蛋白质优选地包含作为组分的底物结合肽（SBP），优选地重复的RGD-结合肽和/或ZZ结合结构域，优选地用于纯化的标签，以及至少一个N-和/或C-端连接体。本发明还涉及本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶在治疗病变、在外科敷料中的用途，用于创伤处理、用于软组织和硬组织再生、用于在口腔中治疗创伤、用于眼科学领域、用于牙周缺陷领域等。本发明还描述了治疗此类疾病的方法。此外，本发明提供了包含本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶和任选地其他组分的药盒。

生物系统如皮肤、结缔组织或者骨架系统中的骨骼都是复杂的系统，所述生物系统的再生和/或修复都在时间和空间可控的程序（orchestration）下发生。无数的信号和细胞在空间和时间中发挥作用，以愈合创伤，例如在组织再生期间取代皮肤的损坏部分，或者诱导或支持骨骼的生长等。在许多这样的情况下，不得不填满空腔，以防止软组织和/或硬组织的损失或者以防止显著的减少或者甚至空腔的崩塌。然而，用于构建适合于此类处理的运载体或基质的许多现有生物材料的效力受到缺少能互补这些生物系统的固有动力学的多功能结构的局限。

在该上下文中，已知多种物理、化学和生物信号都协作地和/或协同地发挥作用，来影响体外和体内组织再生期间细胞的功能。为了成功设计用于促进组织再生的生物材料，因此必须周到考虑靶细胞/组织与这些环境信号之间的相互作用。重要的因素通常是可溶性生长因子、细胞-细胞和细胞-材料相互作用，以及微环境的机械特性（参见例如Lin和Anseth，ExpertReview，“PEG hydrogels for the controlled Release of Biomolecules inRegenerative Medicine”，Pharmaceutical Research，第26卷，第3期，2009年3月）。

考虑到这些需求，生物活性分子的递送以及合适的运载体的寻找已经成为大量研究的主题，因为靶分子是多种多样的，包括用于加速组织再生的低分子量药物、核酸、肽、生长因子和激素，以及蛋白质。

该领域一个有希望的方法是使用所谓的水凝胶。水凝胶代表一类具有同时携带细胞和生物分子的诸多优点的材料。还存在允许通过系统性改变凝胶的物理和化学结构，来密切控制释放特性的多种可能（参见例如C.C.Lin和A.T.Metters。Hydrogels in controlled release formulations：Network design and mathematical modeling。Adv.Drug Deliv.Rev。58：1379–1408（2006））。归因于其可变的特性，已经将水凝胶用于允许制备所谓合成的“应答刺激型”聚合物，其类似于天然组织和组织模型的结构。基于其化学和物理特性，已经将这些合成的“应答刺激型”聚合物冠以不同的名称，例如‘应答刺激'聚合物、‘聪明'聚合物、‘环境敏感型'聚合物或‘智能（intelligent）'聚合物（参见Brawa等人，Biomed.Mater.4（2009）022001（第15页））。这些应答刺激型聚合物的不同特性使得它们能经受由于环境的小改变引发的其微结构的快速改变（从亲水状态至疏水状态）。发生的宏观改变是可逆的；因此，当引发剂去除时，该系统能回复其初始状态。可以进一步将驱动这些改变的常见刺激归类为外部刺激或内部刺激。外部控制系统依赖于在不同的刺激发生装置的帮助下产生的外部施加的刺激，其最终导致脉冲的药物递送。内部调控系统也已知为自身调控装置，其中释放速度在没有任何外部干预的情况下，受反馈机制的控制，所述反馈机制在体内产生，以控制聚合物网络的结构改变并表现出期望的药物释放。“应答刺激型”聚合物的刺激可以例如是溶剂、pH、温度、电流、磁场或机械应力的改变。对这些刺激的应答可以表现为形状、表面特征、溶解度的改变，以及复杂分子装配的形成或者溶液至凝胶转变（sol-to-gel transition）（参见Brawa等人，Biomed.Mater.4（2009）022001（第15页））。

可以用作为合成的“应答刺激型”聚合物的水凝胶可以基于合成的聚合物，例如聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVA）、聚(N-异丙基丙烯酰胺)（poly(NiPAAm)）。已经将此类水凝胶用于多种再生性应用（参见例如N.A.Peppas,P.Bures，W.Leobandung和H.Ichikawa。Hydrogels inpharmaceutical formulations。Eur.J.Pharm.Biopharm.50：27–46（2000））。

在该上下文中，Schmaljohann等人（Schmaljohann，D.，Nitschke，M.，Schulze，R.，Werner，C.，Eichhorn，K.-J.，“Patterning ofstimuli-responsive hydrogels”，Polymer Preprints45，380-381，2004年12月）公开了基于聚(NiPAAm-co-PEGMA)前体的热应答水凝胶。显示该材料表现出细胞粘着和分离行为的温度诱导性改变。

同样地，Voit等人（Voit，B.；Schmaljohann，D.;Gramm，S.，Nitschke，M.，Werner，C.，“Stimuli-responsive polymer layers for advanced cellculture technologies”，International Journal of Materials Research98，646-650，2007年8月）公开了由聚（N-异丙基丙烯酰胺）组成的一系列接枝共聚物，其在聚合物骨架和聚乙二醇侧链中作为热应答组分。表面固定的水凝胶在32-35℃（相当于可溶性聚合物的较低临界溶解温度）表现出部分崩塌至完全膨胀的转变。发现水凝胶包被的支持物允许细胞粘着、铺展和增殖，并允许完整细胞层或多种细胞类型快速地且有效地进行温度依赖性分离。

然而，温度敏感型凝胶，即使适合于一些基于细胞的体外应用，但并不适合于体内施用，因为需要在将刺激应答型水凝胶施用给待治疗的患者期间或之后，在患者内或者在施用位点提供温度刺激。当使用刺激应答型水凝胶时，会发生类似的问题，所述刺激应答型水凝胶的刺激选自溶剂、pH、电流、磁场或机械应力的改变。此类温度敏感型或pH敏感型水凝胶例如描述于WO2009/144569和WO2010/068728中。

还可以通过交联形成适合作为刺激应答型水凝胶的水凝胶。由于分子量的表观或实际的增加（这通常导致凝胶的形成），交联提供了修饰凝胶以表现出更高粘度的合适方法。可以通过形成共价键化学地或者通过形成例如氢键或离子相互作用物理地实现交联。显而易见，还可以化学地和物理地实现交联。亲水性聚合物的化学交联是获得水凝胶的一般且常用的途径。为了能施用或者加工这些凝胶，将预聚物溶解在水中，并然后聚合，导致水凝胶原位地形成。水凝胶化（Hydrogellation）方法通常基于丙烯酸或甲基丙烯酸大分子单体的使用，其在（生物医学）应用中不是优选的，归因于其固有毒性，并且因为其通常需要辅助性、潜在有害的聚合作用引发剂。此外，化学交联的水凝胶缺少可逆性，并受限于其降解特性，因为聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯是不可生物溶解的。

例如，美国专利号5,410,016公开了基于聚乙二醇与聚（DL-丙交酯）的共聚物的水凝胶，其含有原位交联的侧翼（pendant）丙烯酸酯功能。WO01/44307公开了基于用原位化学交联的侧翼丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯基团修饰的聚乙烯醇的水凝胶。因此，根据这些现有技术参考，通过从含反应基团的可水处理性预聚物开始，可以获得不可逆的交联的水凝胶。

一种另外的交联方法显示于US2009/0117656中，其使用可逆的二硫键来相互连接合成的聚合物链，例如水溶性聚合物，包括聚氨基酸、糖类、聚酯、聚酰胺、聚醚、乙烯基聚合物及其共聚物（参见例如US2009/0117656）。为此，可以将反应性化合物，例如胱胺、胱氨酸、2-羟乙基二硫化物、3,3'-二硫代二丙酸（DTDP）、谷胱甘肽二硫化物、3,3'-二硫代丙酰肼（3,3'-dithiopropiohydrazide）及其衍生物等可用作为交联剂。然后，在用反应性化合物修饰合成的聚合物后，通常通过在水性介质中自组装来形成肽。

这种类型的另一方法涉及从用同-、单-和双功能活性分子，例如在其末端具有一个或两个半胱氨酸的肽交联丙烯酰化糊精制备的葡聚糖聚合物的水凝胶（参见US2007/0167354）。更精确地，US2007/0167354公开了用于诱导细胞迁移的基质，其中两种肽与基质共价连接，第一种肽可通过天然蛋白酶，例如通过组织基质金属蛋白酶（MMP）切割，并且第二种肽包含亲细胞肽，例如RGD肽。这两种肽促进细胞诱导的粘附和水凝胶的酶促降解。关于总体可用的交联，通过改变这两种肽的组成百分比，可以通过凝胶调控细胞粘着和迁移的程度。然而，该方法也使用了在生物医学应用中并不优选的丙烯酸或甲基丙烯酸大分子单体。

特定形式的交联的水凝胶代表所谓的肝素-功能化水凝胶。Nie等人（参见Ting Nie，Aaron Baldwin，Nori Yamaguchi，Kristi L.Kiick，“Productionof heparin-functionalized hydrogels for the development of responsive andcontrolled growth factor delivery systems”，Journal of Controlled Release122（2007）287–296）报道了有关肝素化材料的非共价组装，作为应答型可逆的且可注射的药物递送系统的途径，其主要关注于蛋白质递送和模拟ECM的材料的产生。在该上下文中，可以将用肝素结合肽功能化的聚乙二醇起始聚合物与肝素直接混合，以形成具有可调特性的粘弹性溶液，或者可以与起始聚乙二醇-肝素缀合物混合，以形成能通过水凝胶侵蚀递送生长因子的非共价水凝胶。此类侵蚀策略，尽管是被动的，但可以通过生长因子与肝素化大分子的共释放，提供改善生长因子活性的独特机会。Nie等人还报道了能通过与二聚的肝素结合生长因子，例如血管内皮生长因子（VEGF）相互作用形成弹性水凝胶的PEG-肝素缀合物。重要地，这些水凝胶能在暴露于VEGF受体VEGFR-2后，进行受体介导的VEGF释放和水凝胶侵蚀，并给予VEGFR-2在控制血管内皮细胞增殖和迁移中的主要作用，这些结果提示了在血管和创伤愈合治疗中靶向递送药物的重要策略。

肝素功能化水凝胶的一个另外的实例公开于Kim等人（2007）中，其使用肝素功能化的水凝胶用于结合和递送生长因子。更明确地，Kim等人（2007）报道了通过肝素与肝素结合肽或生长因子之间的相互作用非共价组装水凝胶，以及通过被动的或受体介导的基质侵蚀，从这些基质中递送生长因子。在该上下文中，当与起始PEG混合，用肝素结合肽修饰时，用肝素修饰的四臂起始聚乙二醇（PEG）显示出可以形成水凝胶。所使用的肽衍生自肝素相互作用蛋白质（HIP）、抗凝血酶III（ATIII）或血小板因子4（PF4ZIP）。此类经修饰的聚合物主要通过非共价静电相互作用形成水凝胶，并且该水凝胶可以装载治疗相关的生长因子。

通过选择不同的肝素结合肽和聚合物组成可以控制此类肝素功能化水凝胶的机械强度。此外，基质中带电荷的肝素的分布也可以协助将生长因子均匀掺入到递送运载体中。有利地，凝胶中毒性交联剂的缺少，以及其非侵入性施用（例如，通过注射）的潜力，允许其在多种临床和治疗应用中使用。此外，在这些水凝胶网络的组装中，可以将生长因子，例如血管内皮生长因子（VEGF）用作为交联剂，因为它们每一分子提供了两个交联点。在靶位点施用时，可以通过与其受体结合，并随后通过受体介导的内吞作用，从凝胶中去除生长因子，这可能会引起由于物理交联点的丢失造成的侵蚀，并可能在理论上允许消除聚合物基质（如果使用合适分子量的PEG分子）。取决于在基质中所使用的期望的生长因子，可以将该递送系统灵活地应用于许多靶点；在理论上，还可以将多个生长因子用于单个基质，以允许在多个时标上进行递送和侵蚀，其取决于生长因子对肝素的亲和力。然而，即使该系统提供了一些期望的和有利的特性，但其只涉及生长因子在体外或体内的提供。并没有涉及组织的生长，以及将特定的因子或细胞掺入到该水凝胶中。

交联的水凝胶的另一特定形式显示于WO2009/146929中。WO2009/146929公开了使用聚合物的特定交联水凝胶（特定的第一多肽以及与第一多肽相同或不同的特定多肽结合配偶体）。两种多肽都可以与聚合物共价地或者非共价地结合，并允许基于第一多肽与多肽结合配偶体之间的相互作用形成水凝胶。在WO2009/146929中使用的特定多肽为例如，GyrB、FKBP、FRB、F_M、ToxT、DHFR和Cyp。然而，尽管WO2009/146929已经允许掺入药物和效应物质，此类化合物通常在相当短的时限内浸出。此外，此类水凝胶不完全支持将细胞包含在基质上或者甚至包含于基质中。因此，WO2009/146929的凝胶更不适合于长期治疗或者至少需要重复施用，例如在支持或重构组织期间，例如在手术后或者一般地用于组织生长或者组织生长的补充。关于这点，事实上本领域已知只有少许系统允许组织的生长（尽管并非足够有效），以及将细胞包含在基质上或者甚至包含在基质中，并应用此类基质。

在不同的水凝胶中，关于剪裁凝胶特性（tailoring gel property），非离子亲水性PEG凝胶系统似乎提供了用于该目的的许多可能。另外地将非离子亲水性PEG凝胶系统看作是无毒的，并且表现出较好的生物相容性。因此，在过去几十年，广泛地讨论了这些聚乙二醇（PEG）水凝胶，作为用于控制药物递送的基质，以及用于促进组织再生的细胞递送载体。因此，就控制递送而言，正确设计的PEG水凝胶在指导细胞功能中发挥着重要的作用，所述细胞功能对存活、粘附、增殖、基质合成、分泌特性，以及甚至分化是重要的。该目标以及该目的的设计原理是双倍的：提供装载的治疗剂的局部和延长释放，扩大了治疗效果并减少了副反应以及保存了治疗剂的生物学活性。为了实现这些目标，不得不仔细考虑几个关键因素，包括靶细胞和组织的生理环境、凝胶作用和分子装载/释放机制、待递送的治疗剂的分子特性，以及与聚合水凝胶的可能相互作用。

PEG水凝胶提供了独特的适当位置作为携带细胞的基质，因为它们在合适的聚合条件下对细胞是高度生物相容的。通过与其他大分子共聚合，可以引入多个功能部分，以抑制或促进细胞存活和功能。例如，可以将结合整联蛋白的肽Arg-Gly-Asp（或RGD）引入，作为另外的生物惰性PEG水凝胶内的侧官能团，以促进贴壁依赖细胞如成骨细胞的存活（J.A.Burdick和K.S.Anseth。Photoencapsulation of osteoblasts in injectableRGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering。Biomaterials.23：4315–4323（2002））。

然而，即使PEG水凝胶环境一般是高度兼容的（permissible），并允许协助营养物的扩散，但这种特性通常阻碍了局部递送和靶向包被细胞的可溶性因子的治疗效力，因为惰性凝胶网络对于共同包裹的治疗剂是同等可渗透的。因此，在水凝胶系统的设计中，将PEG水凝胶网络内的生物活性分子在时间和空间上呈递给包被细胞的方法仍是最主要的挑战，并是目前大量研究的主题。

总之，近年来已经公开了许多有利的且有希望的方法。然而，似乎还没有一种方法可以以容易且快速的方法提供这样的水凝胶，所述水凝胶具有体内应用的好的适用性并具有足够的柔性，用于有效结合并释放多种因子和/或细胞给水凝胶。此外，似乎还没有一种水凝胶可以另外地适合作为用于体外和/或体内应用的某种细胞和/或组织的基质，用于待治疗患者中细胞向内生长和/或组织再生的目的。

因此，本发明提出的目的是提供新的手段，优选地新的刺激应答型可溶性PEG水凝胶基质，以及产生刺激应答型可溶性PEG水凝胶基质的方法，所述刺激应答型可溶性PEG水凝胶基质表现出体内应用的好的适用性和足够的柔性，以容易且快速的方式有效地结合和释放多种因子和/或细胞至水凝胶。

通过所附权利要求的主题解决了该目的。

根据第一个特定的实施方案，通过刺激应答型可溶性PEG水凝胶解决了本发明提出目的，所述刺激应答型可溶性PEG水凝胶包含PEG聚合物的基质，其经修饰而含有至少一个多功能融合蛋白质，该多功能融合蛋白质优选地包含作为组分的底物结合肽（SBP），优选地重复的RGD结合肽和/或ZZ结合结构域，优选地用于纯化的标签，以及至少一个N-和/或C-端连接体。

有利地，本发明的刺激应答型可溶性PEG水凝胶可以成本有效地产生，并提供极大的可变性。其可以基于用底物结合肽（SBP）共价接枝的可药用聚乙二醇聚合物制备。通过如本文中所定义的底物结合肽（SBP）的相互作用，优选地通过特定的底物或者通过底物结合肽（SBP）与其特定底物的结合，例如通过香豆霉素二聚化两个GyrB亚基或者通过GyrB与香豆霉素的结合来容易地实现凝胶形成。在GyrB的情况下，过量添加拮抗化合物或者底物，例如新生霉素，允许调整水凝胶的溶解性。将例如以重复的RGD结合肽（RGD_n）（也写作RGD_n或(RGD)_n）形式的细胞粘着基序掺入到融合蛋白质序列中，允许水凝胶上的细胞生长。例如通过ZZ结合结构域在水凝胶中包埋的生长因子，例如FGF-7（成纤维细胞生长因子-7或KGF，角质形成细胞生长因子）可以通过诱导剂新生霉素，以剂量应答方式控制释放时间。

根据第一个实施方案，用于修饰PEG基质的PEG聚合物的本发明的多功能融合蛋白质优选地包含作为组分的底物结合肽（SBP），优选地重复的RGD结合肽（如(RGD_n)，还定义为RGD_n或(RGD)_n）和/或ZZ结合结构域，优选地用于纯化的标签，以及至少一个N-和/或C-端连接体。

通常，本发明的多功能融合蛋白质的底物结合肽（SBP）可以是选自能与其特定的底物或者与相同的或不同的底物结合肽（SBP）结合的蛋白质或多肽的蛋白质或多肽。在本发明的上下文中，该底物结合肽（SBP）可以选自蛋白质或多肽，其例如通过特定的底物相互作用或者直接结合特定的底物。因此，当至少两个此类底物结合肽（SBP）任选地通过特定底物与PEG聚合物结合时，由于“交联”单个PEG聚合物链，从而允许形成复杂分子组装或溶液至凝胶转变和水凝胶形成。备选地，水凝胶的形成可能在底物结合肽（SBP）（其已与PEG聚合物结合）与其特定底物的结合时，其同样地与其他PEG聚合物结合。因此，合适的底物结合肽（SBP）可以选自肽，其优选地具有形成同型多聚体或异型多聚体，例如同型二聚体或异型二聚体或者甚至同型三聚体或异型三聚体等的倾向。备选地，合适的底物结合肽（SBP）可以选自蛋白质或多肽，其优选地与特定的底物特异性结合。更优选地，在两种情况下，在特定底物的添加或去除（或取代）时，可以再次诱导或解除两种或多种底物结合肽（SBP）经由特定底物的相互作用或者底物结合肽（SBP）与其特定底物的相互作用。该特定的底物可以例如是核酸分子、肽、小的有机分子等，并优选地被如本文中所定义的底物结合肽（SBP）特异性结合。对于本发明的目的，将不具有特定底物或者通过与特定底物结合形成同型或异型多聚体趋势的两种或多种底物结合肽（SBP）（的组合或者底物结合肽（SBP）与其特定底物的组合称为“结合配偶体”。

因此，上述含义内的结合配偶体（其中至少两个或多个底物结合肽（SBP）相互作用）优选地不受其限制地选自，例如底物结合肽（SBP）-底物结合肽（SBP）组合或者底物结合肽（SBP）-特定的底物组合。优选地，在两种情况下，底物结合肽（SBP）代表了本发明多功能融合蛋白质的组分，并赋予其与整个多功能融合蛋白质的结合特性。此类底物结合肽（SBP）-底物结合肽（SBP）组合或者底物结合肽（SBP）-特定的底物组合可以不受其限制地选自，例如肝素结合蛋白质（HBP）-肝素结合蛋白质（HBP）、肝素结合蛋白质（HBP）-肝素、GyrB-GyrB（旋转酶亚基B）、FKBP–FRB（FK-结合蛋白质-脂质激酶蛋白质同源物FRAP（FKBP-雷帕霉素相关的蛋白质）的结构域（FRB））、F_M-F_M（FK-结合蛋白质的F36M突变）、ToxT-ToxT（霍乱弧菌（V.cholerae）的ToxT蛋白质）、DHFR–DHFR（二氢叶酸还原酶）、FKBP–FKBP（FK-结合蛋白质）、FKBP–Cyp（FK-结合蛋白质-亲环蛋白）和Cyp–Cyp（亲环蛋白）。此类结合配偶体还可以是至少两个上述底物结合肽（SBP）的同型多聚体或异型多聚体。相应的特定底物可以不受其限制地选自，例如肝素、香豆素抗生素（对于GyrB-GyrB）、雷帕霉素或FK506及衍生物（例如rapalogs、mTOR抑制剂）（对于FKBP–FRB和F_M）、环孢菌素及衍生物（对于Cyp）、FK506（对于FKBP–FRB和F_M）、virtstatin（对于ToxT），以及氨甲蝶呤及其衍生物（例如抗叶酸剂）（对于DHFR–DHFR）和/或选自小的有机化合物，例如分子量在100至5,000g/mol之间，特别地100至2,000g/mol之间的化合物。

根据特定的方面，底物结合肽（SBP）可以选自具有形成二聚体倾向的底物结合肽（SBP）。此类底物结合肽（SBP）的特定实例优选地不受其限制地选自，例如GyrB、F_M、ToxT、FKBP和DHFR。允许诱导这些底物结合肽（SBP）二聚化的特定底物可以不受其限制地选自，香豆素抗生素、雷帕霉素及衍生物、virstatin、FK1012和氨甲蝶呤及其衍生物。这些特定的底物还可以选自这样的化合物，其允许诱导和/或解除这些底物结合肽（SBP）之间的相互作用，并从而中和两个结合配偶体之间的相互作用，因为中和例如以竞争的方式导致两个底物结合肽（SBP）的相互作用的实质降低。当实质性过量使用时，此类化合物例如是如上所述的特定底物，或者优选地相同种类二聚化化合物的其他不同代表，例如香豆素抗生素、雷帕霉素及衍生物和氨甲喋呤、抗叶酸剂及其衍生物，以及FK506。

如本文中所定义的底物结合肽（SBP）的结合配偶体和作为其特定底物的核酸是例如E–ETR（MphR(A)蛋白质及其大肠杆菌的操纵基因ETR）、PIP–PIR（始旋链霉菌（Streptomyces pristinaespiralis）的PIP蛋白质及其操纵基因PIR）、TetR–tetO（Tn10-衍生的四环素抑制物TetR及其操纵基因tetO）、ArgR–argO（精氨酸应答抑制物及其操纵基因argO）、ArsR–arsO（砷应答抑制物及其操纵基因arsO），以及HucR–hucO（尿酸应答抑制物及其操纵基因hucO）。其他此类配对物是RamosJ.L.等人（Microbiol MoI Biol Rev69，326-56，2005），Martinez-BuenoM.等人（Bioinformatics20，2787-91，2004）描述的配对物，以及在数据库BacT调节物中列出的配对物（http://www.bactregulators.org/）。这些序列都以其整体明确并入本文作为参考。当使用此类底物结合肽（SBP）作为本发明的多功能融合蛋白质的组分时，特定底物与如本文中所用的PEG聚合物优选地结合。当使用此类结合配偶体时，适合于解除相互作用和因此本发明的刺激应答型可溶性PEG水凝胶的特定化合物是例如，大环内酯抗生素（对于E-ETR）、链阳性菌素抗生素（对于PIP-PIR）、四环素抗生素（对于TetR-tetO）、精氨酸（对于ArgR-argO）、重金属（对于ArsR-arsO），以及尿酸（对于HucR-hucO）。

如本文中所定义的底物结合肽（SBP）的结合配偶体和作为其特定底物的小分子是例如，GyrB-香豆素抗生素、FKBP–mTOR抑制剂、FRB–mTOR抑制剂、F_M–mTOR抑制剂、Cyp-环孢霉素、Cyp-子囊霉素、DHFR-抗叶酸剂、链霉抗生物素蛋白-生物素类似物、抗生物素蛋白-生物素类似物、neutravidin-生物素类似物、类固醇激素受体-类固醇激素及其类似物，以及ToxT–virstatin（在每一实例中都表示为“底物结合肽-特定底物”）。在特定底物是小分子的情况下，小分子优选地具有优选<5,000g/mol，特别地100至5,000g/mol之间的分子量。在该上下文中，香豆素和氨基香豆素抗生素可以包括例如，新生霉素、氯新生霉素、香豆霉素和二氢新生霉素。环孢霉素或子囊霉素可以是例如，环孢霉素A（NEORAL(R)）、ISAtx-247、FK506（他克莫司）、FK778、ABT-281或ASM981。mTOR抑制剂可以是例如，雷帕霉素或其衍生物，如西罗莫司（RAPAMUNE(R)）、Deforolimus、Temsirolimus、Zotarolimus、依维莫司（Certican(R)）、CCI779、ABT578、biolimus-7、biolimus-9、rapalog，如AP23573、硫唑嘌呤、campath1H、S1P受体调节物，如FTY720或其类似物。Rapalogs还可以另外包括相对于雷帕霉素具有一个或多个以下修饰的雷帕霉素的变体：脱甲基化、在C7、C42和/或C29处去除或取代甲氧基；在C13、C43和/或C28处去除、衍生或取代羟基；在C14、C24和/或C30处还原、去除或衍生酮基；用5元脯氨酰环取代6元哌啶酸环；以及在环己基环上备选取代或者用经取代的环戊基环取代环己基环。考虑的其他修饰显示于美国专利号5,525,610；5,310,903和5,362,718的背景部分，以及美国专利号5,527,907中。还考虑了C28羟基的选择性差向异构化（WO01/14387）。还考虑了如在WO03/064383和WO05/16252中所述的含有多种含磷部分的雷帕霉素类似物的用途。考虑的其他rapalogs描述于美国专利号6,984,635、美国专利号6,649,595和美国专利号7,091,213中。抗叶酸剂例如可以包括与DHFR等结合的化合物，例如氨甲蝶呤、三甲氧苄二氨嘧啶、二氨基嘧啶，如溴莫普林和依匹曾林或iclaprim。考虑的其他DHFR抑制剂是那些在Hawser S.等人，Biochemical Pharmacology71，941-948，2006中所述的DHFR抑制剂。最后，生物素类似物例如可以包括，与链霉抗生物素蛋白、neutravidin或抗生物素蛋白等结合的化合物，例如生物素、HABA、脱硫生物素、亚氨基生物素或二氨基生物素。优选地，可以将作为如本文中所定义的底物结合肽（SBP）的特定底物的上述小分子进行适合于结合如本文中所用的PEG聚合物的衍生化作用，用于本发明的刺激应答型可溶性PEG水凝胶。该衍生化作用包括将胺、酰胺、硫羟、羟基、醛、叠氮化物、炔烃、酮、环氧化物或羧基引入到特定底物中。

在本发明的上下文中，特别优选的底物结合肽（SBP）及其组合和它们的特定底物优选地选自以下底物结合肽（SBP）及其特定底物的组合：GyrB–GyrB以及作为其特定底物的氨基香豆素抗生素（例如香豆霉素、新生霉素等）、F_M-F_M和FKBP–FRB以及作为其特定底物的雷帕霉素、FK506及其衍生物AP21998和AP22542等，更优选地使用GyrB–GyrB、F_M-F_M和/或FKBP–FRB的组合，最优选地GyrB-GyrB和/或F_M-F_M。

根据非常特定的备选方案，作为本发明的发明性多功能融合蛋白质的组分的底物结合肽（SBP）可以是GyrB。在本发明上下文中，GyrB优选地是衍生自来自大肠杆菌的DNA旋转酶的蛋白质，并与其底物特异性结合，优选地选自氨基香豆素抗生素，包括例如新生霉素、氯新生霉素、香豆霉素和二氢新生霉素，优选地香豆霉素。香豆霉素是具有两个GyrB结合位点的长氨基香豆素分子，并发现可用作为抗生素。其IUPAC分类名为[(3R,4S,5R)-5-羟基-6-[2-羟基-3-[[4-[[2-羟基-7-[(3R,4S,5R)-3-羟基-5-甲氧基-6,6-二甲基-4-(5-甲基-1H-吡咯-2-羰基)氧环氧乙烷-2-基]氧-8-甲基-4-氧代色烯-3-基]氨甲酰基]-3-甲基-1H-吡咯-2-羰基]氨基]-8-甲基-4-氧代色烯-7-基]氧-3-甲氧基-2,2-二甲基环氧乙烷-4-基]5-甲基-1H-吡咯-2-羧酸。由于香豆霉素包含GyrB的两个结合位点，所以香豆霉素允许在同一时间通过同时结合两个GyrB亚基来二聚化两个GyrB亚基。使用香豆霉素二聚化GyrB，可以将这种特定特性用于交联与GyrB蛋白质或者肽相互偶联的两个底物。通过加入例如抗生素新生霉素，可以将形成的“二聚体”载体再次溶解成其两个单体GyrB亚基，所述新生霉素是另一种氨基香豆素抗生素，具有IUPAC分类名4-羟基-3-[4-羟基-3-(3-甲基丁-2-烯基)苯甲酰氨基]-8-甲基香豆素-7-基3-O-氨基甲酰-5,5-二-C-甲基-α-l-呋喃来苏糖苷。新生霉素仅包含GyrB的一个结合位点。因此，通过添加香豆霉素，可以将GyrB/香豆霉素系统用于有效交联用含GyrB亚基的本发明多功能融合蛋白质修饰的PEG聚合物，从而仅仅基于蛋白质-底物-蛋白质相互作用，导致PEG聚合物的凝胶化和刺激应答型可溶性PEG水凝胶的形成。当加入抗生素新生霉素或者其他氨基香豆素抗生素时，该刺激应答型可溶性PEG水凝胶也可以再次特异性溶解，因为这些氨基香豆素抗生素以竞争的方式特异性取代香豆霉素，并从而中断蛋白质-底物-蛋白质相互作用。

在本发明的上下文中，作为本发明底物结合肽（SBP）的GyrB选自来自大肠杆菌的DNA旋转酶亚基B，更优选地选自来自大肠杆菌的DNA旋转酶亚基B的N-末端序列，甚至更优选地选自根据SEQ ID NO:2（也参见图5）的来自大肠杆菌的DNA旋转酶亚基B的N-末端序列或者与根据SEQ ID NO:2的序列显示出至少50、60、70或80%，优选地至少90%，更优选地至少95%和甚至更优选地至少97.5%同一性的氨基酸序列，或者可以由根据SEQ ID NO:1（也参见图5）的核酸序列编码或与SEQ ID NO:1的序列显示出至少50、60、70或80%，优选地至少90%，更优选地至少95%和甚至更优选地至少97.5%同一性的核酸序列编码。

根据进一步非常特定的备选方案，本发明的底物结合肽（SBP）可以是肝素结合蛋白质（HBP）。该肝素结合蛋白质可以选自例如（人）肝素结合生长因子1（HBGF-1）、（人）肝素结合生长因子2（HBGF-2）、（人）肝素结合生长因子2（HBGF-2，Genbank NM_002006）、FGF4（Genbank NM_002007）、azurocidin（Genbank NM_001700）或37kDa的阳离子抗微生物蛋白质（CAP37）等。如以前所定义的肝素结合蛋白质（HBP）优选地是本发明多功能融合蛋白质的一部分，并一般地结合肝素作为底物。因此，如以前所定义的肝素结合蛋白质（HBP）允许两个或多个肝素结合蛋白质与一个（或多个）作为底物的肝素分子二聚化或者甚至多聚化。因此，通过添加肝素，可以将该肝素结合分子（如果包含于本发明的多功能融合蛋白质中）用于有效交联用含有肝素结合蛋白质的融合蛋白质修饰的PEG聚合物，从而仅仅基于蛋白质-底物-蛋白质相互作用，导致PEG聚合物的凝胶化和刺激应答型可溶性PEG水凝胶的形成。当加入竞争底物，例如过量（即足以饱和肝素结合蛋白质的每一肝素结合位点的量）时，还可以再次特异性降解该刺激应答型可溶性PEG水凝胶。当加入竞争性肝素结合蛋白质，例如任一上述肝素结合蛋白质或例如肝素结合蛋白质受体2（HBPR2）（其特异性结合用于多聚化的肝素）时，还可以特异性溶解刺激应答型可溶性PEG水凝胶。当加入该竞争底物和/或肝素结合蛋白质时，中断了蛋白质-底物-蛋白质相互作用，并且凝胶将被降解。

根据进一步非常特定的备选方案，本发明底物结合肽（SBP）（及其各个底物）选自脂笼蛋白家族的任何成员或者选自其他合适的结合特定底物的蛋白质，特别地选自以下蛋白质/底物组合的任一蛋白质：FluA–荧光素、DigA–生物素-地高辛–缀合物、水杨酸结合蛋白质2（SABP2）–水杨酸或者选自相互相互作用的蛋白质如FKBP42和PGP1，其与作为竞争剂的槲皮素相互作用。可以将这些蛋白质/底物组合用于提供本发明生物功能化刺激应答型可溶性PEG水凝胶，使用经许可用于人类使用并且不会对人类机体有害的刺激，可以形成和/或溶解所述生物功能化刺激应答型可溶性PEG水凝胶。

脂笼蛋白家族包含200个成员以上（Darren R.Flower，“The lipocalinprotein family：structure and function。”The Biochemical journal318（1996）1-14，对于其中引用的脂笼蛋白家族成员和在Darren R.Flower（1996）（上述）中所定义的序列，将所述文献明确并入本文作为参考），主要的成员是FluA和DigA。大多数脂笼蛋白是用于小的不可溶或化学敏感有机化合物的贮藏或转运蛋白质。尽管序列同一性很低，但家族成员的整体结构高度保守。然而，形成结合袋的环区显著不同，并可以在不影响整体蛋白质结构的情况下，将其进一步改造，以获得对某些配体特异的底物（Steffen Schlehuber，“Anticalins:promising tools for clinicaldiagnostics。”cli-online.com（2004））。

在本发明的上下文中，将FluA优选地理解为具有对荧光素高度底物特异性的人造脂笼蛋白。通常将脂笼蛋白用作为在生理上重要的化合物的贮藏或转运蛋白质。蛋白质家族的多个成员都由通过环区连接的8个β-桶-链组成。环区是非常不同的，并形成了底物结合袋。通过组合随机和合理诱变，改造并改进了FluA。因此，人造FluA对荧光素的底物亲和力为1nM（Beste，G.Schmidt，F.S.Stibora，T.；Skerra，A.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America1999，96，1898-903Beste等人1999；Vopel等人2005；Vopel，S.

H.；Skerra，A.Biological chemistry2005，386，1097-104）。可以用在大肠杆菌中过表达并用荧光素标记的FluA共价接枝可药用的聚乙二醇聚合物（参见图25）。通过FluA与另一蛋白质荧光素标记（优选地如本文中所定义的其他FluA分子结合的荧光素标记）结合来实现水凝胶形成。游离的荧光素的添加优选地通过与FluA的结合位点竞争相互作用，导致水凝胶的剂量依赖性溶解。优选地，FluA选自根据SEQ ID NO:55（还参见图18）的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:54或55显示出至少50、60、70或80%，优选地至少90%，更优选地至少95%和甚至更优选地至少97.5%同一性的氨基酸序列，或者可以由SEQ ID NO:54（还参见图18）的核酸序列或与SEQ ID NO:54的序列显示出至少50、60、70或80%，优选地至少90%，更优选地至少95%和甚至更优选地至少97.5%同一性的核酸序列编码。

此外，在本发明的上下文中，将DigA优选地理解为人造脂笼蛋白，然而其包含针对地高辛的改造的亲和力。其衍生自后胆色素结合蛋白质（BBP）（与FluA一样来自欧洲粉蝶（Pieris brassicae）的天然脂笼蛋白）。可以对地高辛实现大约31nM的底物亲和力（Steffen Schlehuber，GeraldBeste，Arne Skerra。“A novel type of receptor protein,based on thelipocalin scaffold，with specificity for digoxigenin。”Journal of MolecularBiology297（2000）1105-20）。图26描述了水凝胶的形成和溶解。基本机制与FluA-荧光素所述的基本机制相同。简言之，可用DigA共价地接枝可药用聚乙二醇聚合物。通过添加生物素-地高辛-缀合物和链霉抗生物素蛋白可以驱动水凝胶形成，而DigA高亲和地与地高辛结合，并且链霉抗生物素蛋白结合生物素。在本申请的上下文中，将这种结构视为底物结合肽（SBP）（DigA）与其底物（生物素-地高辛-缀合物和链霉抗生物素蛋白）结合。通过添加将竞争生物素结合位点的游离生物素可以实现溶解。生物素参与多种代谢反应，并因此可以高剂量施用。优选地，DigA选自SEQ ID NO:57（还参见图19）的序列或者与SEQ ID NO:57显示出至少50、60、70或80%，优选地至少90%，更优选地至少95%和甚至更优选地至少97.5%同一性的氨基酸序列，或者可以由SEQ ID NO:56（还参见图19）的核酸序列或者与SEQ ID NO:56的序列显示出至少50、60、70或80%，优选地至少90%，更优选地至少95%和甚至更优选地至少97.5%同一性的核酸序列编码。

此外，SABP2属于SABP2/SABP2-样家族。该家族包括不结合水杨酸的几个成员。一些成员显示出针对胁迫相关激素，如茉莉酸或脱落酸的亲和力。此外，序列分析从动物中鉴定了分类为SABP2L蛋白质的几种植物羟腈裂合酶和卵磷脂（磷脂酰胆碱）胆固醇酰基转移酶。

在本发明的上下文中，水杨酸结合蛋白质2（SABP2）优选地来源于烟草，并在植物系统获得性抗性（SAR）（其相当于动物中的免疫应答）中发挥着重要作用。SAR提供了对微生物病原体的长效广谱抗性。SABP2是对水杨酸具有高亲和力（SA；K_d=90nM）的水杨酸甲酯（MeSA）酯酶，其作用为其酯酶活性的反馈抑制剂（Farhad Forouhar，Yang Yue，Dhirendra Kumar，Yang Chen，Eyal Fridman，Sang Wook Park，YiwenChiang，等人“Structural and biochemical studies identify tobacco SABP2as a methyl salicylate esterase and implicate it in plant innateimmunity。”Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America102（2005）1773-8）。图27描述了如何将SABP2用于水凝胶形成。在大肠杆菌中过表达SABP2，并纯化为同型二聚体，导致每一蛋白质分子具有2个SA结合位点（参见Farhad Forouhar等人，2005，上述）。用3-氨基-SA接枝可药用聚乙二醇聚合物。通过在活性位点结合聚乙二醇化的3-氨基-SA驱动水凝胶形成。添加游离SA，从结合袋中取代3-氨基-SA，并因此导致水凝胶的溶解。可以以乙酰水杨酸（阿司匹林）形式将SA施用给患者，因为SA是阿司匹林主要的代谢物。每天可以摄入多达8g的阿司匹林。优选地，SABP2选自SEQ ID NO:59（还参见图20）的氨基酸序列、选自SEQ ID NO:61（还参见图21）的氨基酸序列或者选自与SEQ ID NO:59或61的序列显示出至少50、60、70或80%，优选地至少90%，更优选地至少95%和甚至更优选地至少97.5%同一性的氨基酸序列或者由SEQ ID NO:58（还参见图20）的核酸序列、SEQ ID NO:60（还参见图21）的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:58或60的序列显示出至少50、60、70或80%，优选地至少90%，更优选地至少95%和甚至更优选地至少97.5%同一性的核酸序列编码。SEQ ID NO:61（氨基酸序列）包含以前所定义的SABP2的序列中的S81A突变。SEQ ID NO:60是编码核酸序列。

此外，大多数FKBP家族成员结合FK506并表现出肽-脯氨酰顺反异构酶（PPIase）活性（Kang,Cong Bao，Ye Hong，Sirano Dhe-Paganon，Ho Sup Yoon。“FKBP family proteins：immunophilins with versatilebiological functions。”Neuro-Signals16（2008）318-25）。FKBP42是FK506结合蛋白质。PGP1属于多药物抗性蛋白质家族或者P-糖蛋白（完全大小ABC转运蛋白的亚组）。ABC转运蛋白涉及解毒和离子调控过程，以及植物生长过程（Enrico Martinoia，Markus Klein，Markus Geisler，LucienBovet，Cyrille Forestier，

Kolukisaoglu，Bernd

Burkhard Schulz。“Multifunctionality of plant ABC transporters-morethan just detoxifiers。”Planta214，（2002）345-355）。

在本发明的上下文中，蛋白质FKBP42优选地是拟南芥（Arabidopsis）FK506结合蛋白质（FKBP42），其与拟南芥多药物抗性-样ABC转运蛋白AtPGP1的C端结构域相互作用。两种蛋白质对植物生长都是重要的。例如，AtPGP1参与生长素运输和生长素介导的发育。已经显示，相互作用依赖于一级氨基酸序列，并且糖基化并不是必需的（RodolpheBouchard，Karla Billion，Markus Geisler，Joachim Berger，Beate Saal，Nathalie Frangne，Zsuzsanna Koncz-ka，“TWISTED DWARF1，a UniquePlasma Membrane-anchored Immunophilin-like Protein，Interacts withArabidopsis Multidrug Resistance-like Transporters AtPGP1 andAtPGP19。”Molecular Biology of the Cell14（2003）4238–4249）。此外，Bailly等人

Valpuri Sovero，Vincent Vincenzetti，DianaSantelia，Dirk Bartnik，Bernd W Koenig，Stefano Mancuso，EnricoMartinoia和Markus Geisler。“Modulation of P-glycoproteins by auxintransport inhibitors is mediated by interaction with immunophilins。”TheJournal of biological chemistry283（2008）21817-26）测定，可以通过类黄酮槲皮素破坏相互作用（IC50为～200nM）。通过将FKBP42和AtPGP1与可药用聚乙二醇结合，来实现水凝胶形成（参见图28）。添加槲皮素破坏了蛋白质-蛋白质相互作用，并从而溶解水凝胶。槲皮素是抗氧化剂，并对人健康具有许多有益作用。通常将每天三次400-500mg的口服剂量用于临床实践（Gideon Rodan，“Mechanisms of Action ofBisphosphonates。”Annual Review of Pharmacology and Toxicology38（1998）375-388）。优选地，FKBP42由SEQ ID NO:62（还参见图22）的核酸序列编码，或者选自其编码的氨基酸序列，或者选自与SEQ ID NO:62的核酸序列显示出至少50、60、70或80%，优选地至少90%，更优选地至少95%和甚至更优选地至少97.5%同一性的核酸序列或者其编码的氨基酸序列，或者可以选自SEQ ID NO:64（还参见图22）的氨基酸序列，或者选自与SEQ ID NO:64显示出至少50、60、70或80%，优选地至少90%，更优选地至少95%和甚至更优选地至少97.5%同一性的氨基酸序列，或者可以由SEQ ID NO:63（还参见图22）的核酸序列或与SEQ ID NO:63的序列显示出至少50、60、70或80%，优选地至少90%，更优选地至少95%和甚至更优选地至少97.5%同一性的核酸序列编码。SEQ ID NO:64（氨基酸序列）包含编码以前所定义的SEQ ID NO:62的氨基酸序列的氨基酸1-163。SEQ ID NO:63是相应的编码核酸序列。

同样优选地，AtPGP1选自SEQ ID NO:66（还参见图23）的氨基酸序列、选自SEQ ID NO:68（还参见图24）的氨基酸序列或者选自与SEQID NO:66或68显示出至少50、60、70或80%，优选地至少90%，更优选地至少95%和甚至更优选地至少97.5%同一性的氨基酸序列、或者由SEQ ID NO:65（还参见图23）的核酸序列、SEQ ID NO:67（还参见图24）的核酸序列或者与SEQ ID NO:65或67的序列显示出至少50、60、70或80%，优选地至少90%，更优选地至少95%和甚至更优选地至少97.5%同一性的核酸序列编码。SEQ ID NO:68（氨基酸序列）包含以前定义的SEQ ID NO:66的氨基酸序列的氨基酸980–1286。SEQ ID NO:67是相应的编码核酸序列。

可以将AtPGP1和FKBP42二者都用作为底物结合蛋白质（SBP）或者用作为本发明上下文中的底物。精确地，可以将FKBP42用作为本发明上下文中的底物结合蛋白质，并将AtPGP1与该底物结合蛋白质（SBP）用作为底物。备选地，可以将AtPGP1用作为本发明上下文中的底物结合蛋白质，并将FKBP42与该底物结合蛋白质（SBP）用作为底物。添加槲皮素破坏了蛋白质-蛋白质相互作用，并因此溶解水凝胶。在两种情况下，用作为底物的蛋白质优选地提供为二聚体，其中可以通过用连接体，优选地用本文中所提供的连接体，更优选地肽连接体连接两个此类蛋白质或者通过使用化学交联剂合适地交联这些蛋白质，来提供该二聚体。为了制备此类蛋白质，可以在制备单体蛋白质之后，例如通过细菌表达，表达单体（单链）蛋白质或者通过细菌表达，表达具有编码的肽连接体（位于一个阅读框内两个编码的底物蛋白质之间）的二聚体蛋白质之后，或者通过二聚化或交联单体蛋白质（例如使用化学交联方法或肽连接体），来制备这些二聚体。肽连接体优选地选自4个、5个、5个至10个或者10个至约25个氨基酸的短连接体肽。连接体通常富含甘氨酸（用于柔性），以及丝氨酸或苏氨酸（用于可溶性），并可以位于任意合适的位置，优选地在本文中所使用的单体蛋白质的N-端或C-端。备选地，该连接体可以是如本文中所定义的PEG，如本文中所定义的多臂PEG或者无分支的PEG，优选地选自如本文中所定义的PEG。

这些蛋白质，特别是脂笼蛋白、FluA、DigA、SABP2、AtPGP1和FKBP42都优选地仅代表其相应的蛋白质家族，优选地脂笼蛋白家族、SABP2/SABP2-样家族、FKBP家族等。因此，在本发明上下文中合适的底物结合蛋白质（或者根据需要，合适的底物）可以另外包含所述蛋白质家族的其他成员。这些蛋白质家族的其他成员优选地包含这些蛋白质的同源物，例如（其他）植物同源物，以及优选地在上述定义的范围内，与任何这些更特别鉴定的蛋白质（脂笼蛋白、FluA、DigA、SABP2、AtPGP1和FKBP42）表现出序列同一性的同源物。因此，在各个水凝胶设定中，可以通过该家族的其他成员及其各个结合配偶体替换该蛋白质。

根据另外优选的方面，本发明多功能融合蛋白质的底物结合肽（SBP）可以是抗体片段，优选地抗体的单链可变片段（scFv），优选地能结合底物，所述底物可以另外地被相同类型的抗体的另一单链可变片段（scFv）结合。在该上下文中，抗体的单链可变片段（scFv）优选地是用4个、5个、5个至10个或者10个至约25个氨基酸的短连接体肽连接的免疫球蛋白的重链（V_H）和轻链（V_L）可变区的融合蛋白质。连接体通常富含甘氨酸（用于柔性），以及丝氨酸或苏氨酸（用于溶解性），并可以用V_L的C-端连接V_H的N-端或者反之亦然。该蛋白质保留了原始免疫球蛋白的特异性，尽管去除了恒定区，并引入了连接体。在本发明上下文中，特别优选的单链可变片段（scFv）可以包含针对造影剂的特异性，通常用于医学，更优选地用于诊断医学等。在该上下文中，其中特别优选的造影剂是，荧光素、荧光素衍生物、FITC（异硫氰酸荧光素）或其衍生物等，然后可以将其用作为如本文中所定义的相应底物结合肽（SBP），特别地具有该特异性的单链可变片段（scFv's）的底物。示例性单链可变片段（scFv）可以是例如，如在Vaughan等人1996（参见Vaughan等人，（1996），Nat.Biotechnol14（3），S.309–314）中公布的命名为FITC-E2的针对荧光素的scFv。该scFv可以在已建立的表达系统中重组地产生为C-端6个组氨酸标记的形式，例如如Pedrazzi等人，（1997），FEBS Lett415（3），S.289–293所述，其显示出在大肠杆菌的周质中表达，或者如Rippmann等人，（1998），Appl.Environ.Microbiol64（12），S.4862–4869所述，其显示出在奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）的L-型细胞中表达。在大肠杆菌或奇异变形杆菌中表达是特别优选的。优选的蛋白质序列可以是如在图33中所示产生的scFv的氨基酸序列（SEQ ID NO:69）（在去除周质信号序列后描述的序列）或者是与SEQ ID NO:69的序列表现出至少50、60、70或80%，优选地至少90%，更优选地至少95%和甚至更优选地至少97.5%同一性的氨基酸序列。

此外，由该底物结合蛋白质和相应地由包含特定scFv片段（用作为如前所定义的SBP）的多功能融合蛋白质结合的底物可以是例如，荧光素、FITC或其衍生物。此外，这种底物可以与牛血清白蛋白（BSA）或胺修饰的多臂PEG衍生物结合。然后，可以将任一该底物或底物构建体用于形成本发明生物功能化刺激应答型可溶性PEG水凝胶。可以将底物或底物构建体表示为BSA-荧光素、BSA-FITC、PEG-荧光素、PEG-FITC等，然后在本发明的概念内将其用作为交联剂与PEG偶联的本发明多功能融合蛋白质接触。作为多聚体，优选地使用多臂PEG-VS，其可以用scFv或者如本文中所定义的相应多功能融合蛋白质功能化，例如携带半胱氨酸（例如在C-端，如GyrB水凝胶所示）。

此外，可以用荧光素、FITC或其衍生物直接修饰本发明多功能融合蛋白质的scFv，以使其可以交联其自身。备选地或另外地，可以将如本文中所定义的生长因子用于形成融合蛋白质，该多功能融合蛋白质内具有scFv。可以将此类生长因子掺入到如本文中所定义的融合蛋白质中。

对于本发明多功能融合蛋白质，与scFv类似的合适蛋白质的其他实例包括骆驼/鲨鱼抗体、AdNectins、蛋白质Z结构域（参见本文）、darpins、anticalins等。

此外，用于修饰本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的多功能融合蛋白质可以包含重复的RGD结合肽，优选地具有式(RGD_n)，也定义为RGD_n或(RGD)_n。通常，多功能融合蛋白质的该重复RGD-结合肽（式(RGD_n)，也定义为RGD_n或(RGD)_n）可以是含至少一个RGD-肽序列，优选地至少两个RGD-肽序列或者甚至3个、4个、5个或者更多RGD-肽序列的肽，即n可以是1、2、3、4、5或甚至更多，优选地，n是1至5、1至4、1至3、2至5、2至4、2或3或3至5、3至4或4至5。在该上下文中，RGD肽序列通常是以优选的所示顺序含三个（连续）氨基酸RGD（其是“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”的单字母氨基酸密码缩写）的序列。优选地通过如上所定义的整数n确定重复的数目。该RGD序列通常表示整联蛋白识别胞外基质蛋白质的序列的一部分。在该上下文中，整联蛋白已知为介导细胞和围绕它的组织，例如其他细胞或胞外基质（ECM）之间连接的受体。整联蛋白还在细胞信号传递中发挥作用，并因此限定细胞形状、移动，并调节细胞周期。通常，可用于本发明目的以允许细胞通过整联蛋白与多价融合蛋白质结合的RGD序列来源于ECM蛋白质或包含RGD肽序列的肽或者合成的序列，在每一种情况下都包含氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（以单字母氨基酸密码的“RGD”）。Hersel等人（2003）（参见Hersel等人，Biomaterials24（2003），4385-4415）综述并列出了可以掺入本发明多功能融合蛋白质中的此类细胞特异性粘附序列。在Hersel等人（2003，上述）中涉及该特定RGD肽序列和如本文中所公开的特定RGD序列的各个公开优选地以其整体并入本文作为参考。甚至更优选地，此类RGD序列可以选自但不限于以下氨基酸序列的至少一个：

RGD（或RGD_n或(RGD)_n）（SEQ ID NO:3）、RGDS（SEQ ID NO:4）、(RGDS)_n（SEQ ID NO:5），其中n优选地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或者甚至以上、GRGD（SEQ ID NO:6）、RGDV（SEQ ID NO:7）、RGDT（SEQ ID NO:8）、GRGDG（SEQ ID NO:9）、GRGDS（SEQID NO:10）、GRGDY（SEQ ID NO:11）、GRGDF（SEQ ID NO:12）、YRGDS（SEQ ID NO:13),YRGDG（SEQ ID NO:14）、YGRGD（SEQ IDNO:15）、GRGDSP（SEQ ID NO:16）、GRGDSG（SEQ ID NO:17）、GRGDSP（SEQ ID NO:18）、GRGDSY（SEQ ID NO:19）、GRGDVY（SEQ ID NO:20）、GRGDSPK（SEQ ID NO:21）、CGRGDSPK（SEQID NO:22）、CGRGDSY（SEQ ID NO:23）、YAVTGRGDS（SEQ ID NO:24)（RGD模拟的酪氨酸支架）、AcCGGNGEPRGD（SEQ ID NO:25）、YRAY-NH₂（SEQ ID NO:26）、AcGCGYGRGDSPG（SEQ ID NO:27）、RGDSPASSKP（SEQ ID NO:28）、AcGRGDSPASSKG（SEQ ID NO:29），

或者可以选自环状RGD序列，例如如

βAXEPRGDNYRC（SEQ ID NO:30），其中X表示经修饰的氨基酸Dap（2,3-二氨基丙酸），βA表示b-丙氨酸，并且该环状RGD序列具有以下结构：

KRGDf（SEQ ID NO:31），其中f表示苯丙氨酸的D氨基酸变体，并且其中该环状RGD序列具有以下结构：

GPenGRGDSPCA（SEQ ID NO:32），其中Pen表示青霉素，并且其中该环状RGD序列具有以下结构：

vRGDE（SEQ ID NO:33），其中v表示缬氨酸的D-氨基酸变体，并且其中该环状RGD序列具有以下结构：

或者可以选自与SEQ ID NO3至33的任一序列表现出至少80%，优选地至少90%，更优选地至少95%，和甚至更优选地至少97.5%同一性的氨基酸序列。

此外，用于修饰本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的PEG聚合物的本发明多功能融合蛋白质可以包含至少一个N-和/或C-端连接体。因此，连接体可以位于本发明多功能融合蛋白质的N-末端、C-末端或者N-末端和C-末端。通过共价键或（强且特异的）非共价键，可以将该N-和/或C-端连接体用于将本发明多功能融合蛋白质与如本文中所定义的PEG聚合物结合（或者（另外地）与如本文中所定义的其他组分结合）。在本发明的理解中，（强且特异的）非共价键是在生理条件下具有低于10⁵M的解离常数的键。在本发明上下文中，合适的连接体优选地包括或含有，例如形成螯合物的实体，如与多价金属离子结合的NTA和多组氨酸、氨基酸、含硫羟部分，例如如经硫羟修饰的或含硫羟的氨基酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、任一其他含硫羟部分、与马来酰亚胺偶联的硫羟、乙烯砜部分、肽序列、肽键、卤素标签（Los G.V.等人，Methods MoI Biol.356，195-208，2007）、SNAP-标签或CLIP-标签（Gautier A.等人，Chem Biol.15，128-36，2008）或者谷氨酰胺转移酶反应键（参见Ehrbar M.等人，Biomaterials29，1720-9，2008）。为此，在引入到本发明多功能融合蛋白质中之前，优选地已经相应地修饰了本发明所使用更多PEG聚合物，以允许该连接体与本发明多功能融合蛋白质共价或者非共价结合。

在本发明多功能融合蛋白质包含仅一个连接体（例如在本发明多功能融合蛋白质的N-或C-末端）的情况下，优选地将连接体用于本发明多功能融合蛋白质与PEG聚合物的共价结合，优选地通过共价键结合。在用于修饰本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的PEG聚合物的本发明多功能融合蛋白质包含两个连接体（例如在本发明多功能融合蛋白质的N-或C-末端）的情况下，优选地将第一连接体用于本发明多功能融合蛋白质与PEG聚合物的共价结合（优选地通过共价键），并且优选地将第二连接体用于其它组分与本发明多功能融合蛋白质的共价结合（优选地通过共价键）。

根据非常特定的方面，本发明多功能融合蛋白质的连接体选自或含有含硫羟的部分，例如如经硫羟修饰的或者含硫羟的氨基酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、任一其他含硫羟部分、与马来酰亚胺偶联的硫羟、乙烯砜部分等。当使用含硫羟部分时，优选地共价地发生与PEG聚合物或其他组分的结合，并优选地通过硫醚键。为此，优选地在引入到本发明多功能融合蛋白质中之前，例如已经相应修饰了本发明所使用的PEG聚合物（或其他组分），以允许含硫羟部分与本发明多功能融合蛋白质的相应反应基团共价结合，例如通过硫醚键。还可以将至少一个N-和/或C-端含硫羟部分用于其他组分与本发明多功能融合蛋白质的共价结合，例如通过硫醚键。在本发明多功能融合蛋白质仅包含一个含硫羟部分，例如半胱氨酸部分的情况下，优选地将含硫羟部分用于本发明多功能融合蛋白质与PEG聚合物通过硫醚键的共价结合。在用于修饰本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的PEG聚合物的本发明多功能融合蛋白质包含两个含硫羟部分的情况下，即在本发明多功能融合蛋白质的N-和C-末端，优选地将第一含硫羟部分用于本发明多功能融合蛋白质通过硫醚键与PEG聚合物的共价结合，并且优选地将第二含硫羟部分用于其他组分通过硫醚键与本发明多功能融合蛋白质的共价结合。在该上下文中，该其他组分可以是如本文中所定义的细胞、如本文中所定义的蛋白质、如本文中所定义的融合蛋白质、如本文中所定义的其他PEG聚合物或者如本文中所定义的其他组分，其中优选地在制备该连接之前，已经相应地修饰了所述其他组分，以允许例如通过硫醚键与本发明多功能融合蛋白质的含硫羟部分共价结合。

根据另一特定方面，本发明多功能融合蛋白质的连接体可以选自或含有如在下表中所定义的共价连接体。优选地，连接体可以选自一个或多个例如，胺、含硫羟部分（例如硫羟、半胱氨酸）、赖氨酸、谷氨酰胺、N-端半胱氨酸、胺、或羧基等。为此，优选地例如通过N-羟基琥珀酸亚胺（NHS）（在胺类的情况下）、如上所述通过马来酰亚胺或乙烯砜（在含硫羟部分（例如硫羟、半胱氨酸）的情况下）、例如用谷氨酰胺（在赖氨酸的情况下）、例如用赖氨酸（在谷氨酰胺的情况下）、例如用硫酯（在N-端半胱氨酸的情况下）、例如用醛（在胺的情况下）、例如用胺（在羧基的情况下）等相应地修饰PEG聚合物。在本文中，共价连接可以使用本领域技术人员已知的任何化学方法实施，如例如在Lottspeich undEngels2006，第6.1和6.3.1章（参见Lottspeich，Friedrich；Engels，JoachimW.（2006）：Bioanalytik.2.Aufl.München，Heidelberg：Elsevier，Spektrum，Akad.Verl.）中所概述。

不受其限制，在下表中列出了连接体的特定实例和如本文中所定义的PEG聚合物优选的功能化：

本发明多功能融合蛋白质还含有用于纯化的标签（纯化标签或标签），即加入到本发明多功能融合蛋白质中的一段氨基酸序列，其能通过其独特的亲和力回收融合蛋白质。优选地，将纯化标签加入到融合蛋白质或肽的N-或C-端（或者其附近，例如当从N-或C-末端测定时，作为融合肽的第二组分），以确保其可接近性，并不会干扰融合蛋白质或肽的不同组分的蛋白质折叠。本发明的上下文中，纯化标签包含例如His₆-标签、FLAG-标签、HA-标签、MYC标签等。在该上下文中，His标签优选地是由6个组氨酸（His）残基组成的标签（His₆-标签），其允许本发明多功能融合蛋白质通过与镍柱或钴柱亲和来回收。FLAG标签优选地包含例如序列DYKDDDDK（SEQ ID NO:34）或者其他序列，并允许用特定抗体回收本发明多功能融合蛋白质。本发明的上下文中，HA标签通常是具有来源于流感蛋白质血细胞凝集素（HA）的表位：例如YPYDVP（SEQ ID NO:35）的融合物，并允许用HA抗体回收。最后，MYC标签通常是具有来源于人原癌蛋白质MYC的表位：例如ILKKATAYIL（SEQ ID NO:36）、EQKLISEEDL（SEQ ID NO:37）的融合物，并允许用MYC抗体回收。其他纯化标签是技术人员已知的，并可以采用且合适地用于本发明多功能融合蛋白质的上下文中。

用于修饰本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的PEG聚合物的多功能融合蛋白质还可以包含其他结合结构域，例如ZZ结构域，其允许结合F_c-结构域，并因此通过F_c-结构域将其他（肽或蛋白质）组分与ZZ结构域缀合。适合于本发明目的的此类ZZ-结构域可以选自例如在载体pEZZ-18，GE healthcare中定义的或者在Ishikawa-Sakurai等人（2004）（参见Ishikawa-Sakurai等人，Human Molecular Genetics，2004，第13卷，第7期693–702）中定义的ZZ结构域，优选地根据AKHQAKCNICKECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGR的序列（SEQID NO:38）或者AKHQAKCNICKECPIVGFRYRSLKHFNYDVCQSCFFSGR（SEQ IDNO:39）的序列、展示营养不良蛋白的ZZ-结构域（SEQ ID NO:38）和utrophin的ZZ-结构域（SEQ ID NO:39）或者(M)AQHDEAVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLL

AEAKKLNDAQAPKVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKVDANSS的序列（SEQ ID NO:40）（还参见图7的氨基酸1或2至129））或者与SEQ ID NO38至40任一个的序列表现出至少80%，优选地至少90%，更优选地至少95%和甚至更优选地至少97.5%同一性的氨基酸序列。

通过混合组分，并优选地在如本文中所定义的范围内改变待结合的组分的浓度，可以发生如本发明所定义的本发明多功能融合蛋白质（和任选地特定底物或任意其他化合物）与如本文中所定义的PEG聚合物的结合。这优选地允许组分彼此相互作用，并从而形成键。

除如上所定义的此类连接体（其适合于将结合本发明多功能融合蛋白质，任选地特定底物或任意其他组分与PEG聚合物连接，并从而交联聚合物以形成PEG水凝胶）外，可以将其他（交）联剂引入本发明刺激应答型PEG水凝胶中、引入因此所使用的PEG聚合物中或者引入如本发明所定义的多功能融合蛋白质中。这允许进一步（化学）交联本发明刺激应答型PEG水凝胶。合适的交联剂是例如，显示出结合另一分子的至少两个位点的任一相同功能或不同功能的化合物，如在BioconjugateTechniques（Greg T.Hermanson的第二版，Academic Press，2008）中所述的交联剂。

当针对本发明多功能融合蛋白质的N-和/或C-末端测定时，用于修饰PEG聚合物的本发明多功能融合蛋白质的组分可以位于融合蛋白质的每一位置。然而，优选地，本发明多功能融合蛋白质允许由于与其特定底物相互作用或者底物结合肽（SBP）与其特定底物的结合，有效地多聚化底物结合肽（SBP），以及平行地有效地结合细胞。此外，其应当允许任选地结合其他分子，例如通过其他结合序列。

因此，本发明多功能融合蛋白质可以含有但不限于例如以至少一种以下顺序（N-至C-端（定义为N-或-C））的底物结合肽（SBP）、如上所定义的重复RGD结合肽，以及至少一个N-和/或C-端连接体：

等。

此外，本发明多功能融合蛋白质可以例如以至少一种以下顺序（N-至C-端（定义为N-或-C））含有但不限于底物结合肽（SBP）、重复的RGD结合肽，以及至少一个N-和/或C-端连接体和用于纯化的标签：

等。

本发明多功能融合蛋白质还可以例如以至少一种以下顺序（N-至C-端（定义为N-或-C））含有但不限于底物结合肽（SBP）、重复的RGD结合肽，以及至少一个N-和/或C-端连接体、如本文中所定义的ZZ结合结构域和任选地用于纯化的标签：

或

或

等。

另外地或备选地，用于修饰PEG聚合物的至少一个多功能融合蛋白质可以包含作为组分的如上所定义的底物结合肽（SBP）、优选地如上所定义的ZZ结构域、优选地如上所定义的用于纯化的标签，以及至少一个N-和/或C-端连接体。因此，本发明多功能融合蛋白质可以例如以至少一种以下顺序（N-至C-端（定义为N-或-C））含有但不限于作为组分的如上所定义的底物结合肽（SBP）、优选地如上所定义的ZZ结构域、优选地如上所定义的用于纯化的标签，以及至少一个N-和/或C-端连接体：

等。

同样另外地，可以使用至少一个多功能融合蛋白质修饰的如本文中所定义的PEG聚合物，所述融合蛋白包含作为组分的优选地如上所定义的ZZ结构域、优选地如上所定义的用于纯化的标签，以及至少一个N-和/或C-端连接体。因此，本发明多功能融合蛋白质可以不受其限制地例如以至少一种以下顺序（N-至C-端（定义为N-或-C））含有作为组分的如上所定义的ZZ结构域、优选地如上所定义的用于纯化的标签，以及至少一个N-和/或C-端连接体:

等。

如本发明所定义的至少一个多功能融合蛋白质的不同组分优选地相互直接连接或者通过间隔区连接。如果多功能融合蛋白质的不同组分通过间隔区连接，那么间隔区优选地是肽间隔区。肽间隔区通常具有1-20个，优选地1-10个氨基酸，更优选地1-5，甚至更优选地1-3个氨基酸长度。在一些情况下，肽间隔区序列可以甚至更长，包含21-50个氨基酸。肽间隔区可以由多种氨基酸序列组成。因此，该肽间隔区优选地在如本发明所定义的多功能融合蛋白质的至少两个组分之间，更优选地在如本发明所定义的多功能融合蛋白质的3个、4个、甚至5个或全部组分之间通过肽键插入。优选地，肽间隔区在待连接的多功能融合蛋白质的单个组分之间引入一些结构柔性。引入该间隔区，例如通过具有含多个甘氨酸或脯氨酸残基和任选地丝氨酸残基，优选地肽间隔区序列内至少30%，更优选地至少40%和甚至更优选地至少60、70、75、80、85、90或者甚至95或100%脯氨酸和/或甘氨酸残基，以及任选地肽间隔区序列内1-10、1-20、1-30或1-40%丝氨酸残基的肽间隔区，例如显示出如(SGGG)_n（SEQ ID NO:41）、(SGGGG)_n（SEQ ID NO:42）或(SGGGGG)_n（SEQ ID NO:43），其中n优选地为1、2、3、4、5等的序列的间隔区，来实现结构柔性。此外，根据需要，该间隔区可以为多功能融合蛋白质的其他组分提供足够距离。不考虑其结构（肽间隔区），间隔区优选地可以是免疫学活性的。本领域技术人员可以容易地选择和制备合适的间隔区。

如本文中所定义的特别优选的本发明多功能融合蛋白质可以选自根据pRG107（编码核酸序列：SEQ ID NO:44，蛋白质序列：SEQ ID NO:45）、pRG111（编码核酸序列：SEQ ID NO:46，蛋白质序列：SEQ ID NO:47）或pRG116（编码核酸序列：SEQ ID NO:48，蛋白质序列：SEQ ID NO:49）的多功能融合蛋白质或者与SEQ ID NO45、47或49的任一序列表现出至少80%，优选地至少90%，更优选地至少95%，以及甚至更优选地至少97.5%同一性的氨基酸序列或者由与SEQ ID NO44、46或48的任一序列表现出至少80%，优选地至少90%，更优选地至少95%，以及甚至更优选地至少97.5%同一性的核酸序列编码的氨基酸序列（还参见图6、7和8）。

为了测定如本文中所定义的两个肽或蛋白质序列的同一性百分比，可以比对序列，以随后互相比较。因此，例如可以将缺口插入到第一序列的序列中，并比较第二序列相应位置处的组分。通常，如果在第一序列中的位置被第二序列中的位置处相同的组分占据，这两个序列在该位置处是相同的。两个序列的同一性百分比是相同位置数除以位置总数的函数。可以使用数学算法测定两个序列的同一性百分比。可以使用的数学算法的优选但非限制性实例是Karlin等人（1993），PNAS USA，90：5873-5877或Altschul等人（1997），Nucleic Acids Res.，25：3389-3402的算法。该算法整合在BLAST程序中。可以通过该程序鉴定在一定程度上与本发明所述序列相同的序列。还可以将该程序类似地应用于核酸序列。

本发明还提供了编码如上所定义的多功能融合蛋白质的核酸序列、载体序列，特别是表达载体，以及用此类核酸序列转染的细胞。核酸序列可以是DNA、RNA、单链的、双链的、环状的和/或线性的。

通常可以使用本领域众所周知的并且编码多功能融合蛋白质或其序列的表达载体或表达质粒，使用例如合成方法、细菌表达方法或者使用技术人员已知的任何其他方法，制备本发明多功能融合蛋白质。通常在细菌表达系统，例如大肠杆菌、奇异变形杆菌等中表达可用于水凝胶形成的在本发明上下文中特别优选的多功能融合蛋白质。

可以将本发明多功能融合蛋白质的任一上述备选物用于修饰PEG聚合物，并形成本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶，例如包含作为组分的底物结合蛋白质（SBP）、优选地重复的RGD结合肽，例如(RGD_n)或RGD_n或(RGD)_n和/或ZZ结合结构域、优选地用于纯化的标签，以及至少一个N-和/或C-端半胱氨酸部分的多功能融合蛋白质，或者包含作为组分的如上所定义的底物结合肽（SBP）、优选地如上所定义的ZZ结构域、优选地如上所定义的用于纯化的标签，以及至少一个如上所定义的N-和/或C-端半胱氨酸部分的多功能融合蛋白质等。

取决于本发明所定义的不同多功能融合蛋白质的类型和/或量，更精确地取决于在每一不同多功能融合蛋白质中含有的特定连接体的数目，可以影响本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的交联程度。另外地，可以相应地修改在本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶中的其他组分的含量、组分如与本发明多功能融合蛋白质内如本文中所定义的RGD序列结合的细胞的含量，或者其他组分如其他组分（肽或蛋白质）通过其F_c-结构域与ZZ结构域的结合。

修饰了本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的交联程度的特别优选的本发明多功能融合蛋白质是如上所定义的多功能融合蛋白质，以及甚至更优选地选自下列：

a)如本文中所定义的多功能融合蛋白质，其具有仅一个如上所定义的连接体；

b)如本文中所定义的多功能融合蛋白质，其具有两个如上所定义的连接体；

c)具有仅一个如上所定义的连接体的如本文中所定义的多功能融合蛋白质与具有两个如上所定义的连接体的如本文中所定义的多功能融合蛋白质的组合。

特别优选地是包含如前所定义的本发明多功能融合蛋白质的其他本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶。

在本上下文中，高度优选的是具有仅一个如上所定义的连接体的如本文中所定义的多功能融合蛋白质与具有两个如上所定义的连接体的如本文中所定义的多功能融合蛋白质的组合，尽管可以单独地使用仅具有如上所定义的一个连接体的如文本中所定义的多功能融合蛋白质，以及具有两个连接体的如本文中所定义的多功能融合蛋白质。

优选地，选项c)中所定义的多功能融合蛋白质可以选自任一上述多功能融合蛋白质，更优选地选自具有仅一个如上所定义的连接体，并含有底物结合蛋白质（SBP）、RGD序列如(RGD_n)或RGD_n或(RGD)_n，任选地用于纯化的标签和N-或C-端连接体的如本文中所定义的多功能融合蛋白质与具有两个如上所定义的连接体，并含有底物结合蛋白质（SBP）、RGD序列如(RGD_n)或RGD_n或(RGD)_n，任选地用于纯化的标签和N-末端和C-端连接体的如本文中所定义的多功能融合蛋白质的混合物或组合。

在该上下文中，具有仅一个如上所定义的连接体的如本文中所定义的示例性多功能融合蛋白质可以选自但不限于以下至少之一：

更优选地选自

或者选自

此外，具有两个如上所定义的连接体的如本文中所定义的示例性多功能融合蛋白质可以不受限制地选自以下之一：

更优选地选自

或者选自

在任一本文中所定义的示例性多功能融合蛋白质中，N-端位置和C端位置可以相互交换，即其中颠倒了示例性多功能融合蛋白质的组分的顺序。此外，在任一这些示例性多功能融合蛋白质中，还可以用ZZ结构域取代RGD结构域。

根据本发明的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶包含PEG聚合物的基质，其经修饰含有至少一个如上所定义的多功能融合蛋白质。如本文中所定义，将PEG定义为聚乙二醇（PEG），一种广泛应用于工业生产和医学的聚醚化合物。PEG也已知为聚环氧乙烷（PEO）或聚氧乙烯（POE），优选地取决于其分子量。PEG、PEO或POE有时可以同义使用，并指环氧乙烷的低聚物或多聚物。三种名称在化学上是同义的，尽管PEG在历史上倾向于指具有低于20,000g/mol分子量的低聚物和多聚物，PEO指具有20,000g/mol以上分子量的多聚物，并且POE指任意分子量的多聚物。PEG和PEO通常是液体或者低熔点固体，取决于其分子量。PEG通过聚合环氧乙烷制备，并且在300g/mol至10,000,000g/mol的宽分子量范围都是可市售的。尽管具有不同分子量的PEG和PEO用于不同的应用，并且具有不同的物理特性例如粘度，归因于链长作用，其化学特性几乎是相同的。取决于用于聚合方法的引发剂，不同形式的PEG也是可得到的，最常见的PEG是单功能甲醚PEG（甲氧基聚乙二醇），缩写为mPEG。低分子量PEG还可得到为纯的低聚物，称为单分散的、均一的或者分离的。还可以得到具有不同几何形状的PEG。分枝状或星状PEG具有从中央核心基团散发的约3-100个PEG链（臂）。梳状PEG具有通常接枝到聚合物骨架的多个PEG链。可以将任一此类PEG聚合物用于如上所定义的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶。在本发明上下文中，术语“PEG”或“PEG聚合物”优选地包含任一以上定义的聚合物，更优选地如前所定义的PEG、PEO和POE聚合物。

因此，在本发明上下文中，用于如上所定义的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的PEG聚合物优选地选自如上所定义的PEG聚合物、PEO聚合物和/或POE聚合物，优选地在约300g/mol至10,000,000g/mol的分子量内，更优选地在约300-50,000Da的分子量内，甚至更优选地在约300-38,000Da的分子量内等，最优选地在约10-50kDa的分子量内，例如在约20-约40kDa的分子量内，在约30-约40kDa的分子量内，例如在约35-约40kDa的分子量内，例如37.5kDa。更优选地，用于如上所定义的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的PEG聚合物可选自如上所定义的任一PEG聚合物，并优选地具有不同的几何形状，例如如本文中所定义的具有从中央核心基团散发的约3-10个PEG链的分枝状PEG或者例如具有从中央核心基团散发的约10-100个PEG链的星状PEG。甚至更优选地，用于如上所定义的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的PEG聚合物可选自如在本文中所定义的任一此类PEG聚合物，更优选地选自具有如上所定义的分子量的PEG聚合物，并且优选地，具有如本文中所定义的不同的几何形状，例如如具有从中央核心基团散发的约3-约100个PEG链（臂），优选地具有从中央核心基团散发的约3-约50个、3-约30个或3-约20个PEG链（臂）的星状PEG。特别优选地用于如上所定义的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的星状PEG可以是如上所定义的PEG聚合物，其具有从中央核心基团散发的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15或者更多的链（臂），即为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15臂星状PEG聚合物。此类PEG聚合物还称为多臂星状PEG，例如3-15多臂星状PEG。

在本发明的上下文中，可以修饰用于如上所定义的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的PEG聚合物，以允许与如本文中所定义的本发明多功能融合蛋白质共价地或者非共价地键合。该共价或非共价键合优选地如上所定义。在优选的情况下，该键合是共价键。更优选地，该键合是硫醚键。可以通过如上所定义的本发明多功能融合蛋白质，例如半胱氨酸的含SH-或硫羟部分与乙烯砜部分或者允许硫醚键形成的任何其他部分反应，来形成硫醚键。为此，在与乙烯砜部分或者其他部分反应之前，已经使用还原剂，优选地TCEP还原如上所定义的本发明多功能融合蛋白质的含SH-或硫羟部分。该步骤防止硫羟部分反应形成二硫键，并允许形成硫醚键。在本上下文中，用于本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的PEG聚合物优选地提供了至少一个用于硫醚键的游离的乙烯砜部分或者允许形成硫醚键的任一其他部分。因此，可以在交联之前，修饰本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶，以引入该修饰。修饰可以例如从如上所定义的PEG聚合物的PEG-OH聚合物开始，优选地从如上所定义的多臂星状PEG开始。示例性修饰反应显示如下：

根据一个特定方面，可以通过磺化如上所定义的PEG聚合物的PEG-OH聚合物，优选地如上所定义的多臂星状PEG发生该修饰，通常产生星状-PEG-乙烯砜（PEG-VS）。根据非常特定的方法，可以根据Lutolf等人（2003）（参见Lutolf MP，Hubbell JA.，2003，Synthesis andphysicochemical characterization of end-linked poly(ethyleneglycol)-co-peptide hydrogels formed by Michael-type addition。Bio-macromolecules4（3）：713-22），从8臂PEG-OH（Shearwate聚合物，Huntsville，AL）开始合成多臂星状PEG乙烯砜（PEG-VS）：可以例如通过用过量的乙烯砜偶联PEG-OH来合成多臂PEG-VS（Aldrich，Buchs，瑞士）。作为实例，可以将PEG-OH溶解在溶剂，例如二氯甲烷中，或者在一些情况下，可以通过例如在甲苯中共沸蒸馏，例如在开始反应前使用迪安斯达克榻分水器（Dean Stark trap）干燥PEG。向溶解在二氯甲烷中的PEG，可以优选地在氩气中，优选地使用加入相对于OH基团例如4-6倍，例如5倍摩尔数过量的NaOH。氢形成后，然后可以加入摩尔数超过OH基团，优选地50-100倍的二乙烯基砜。通常在室温，优选地在氩气下恒定搅拌来实施反应优选地1-3天，例如2-3天或者甚至3天。然后通常优选地用浓缩的酸，例如乙酸中和反应溶液，过滤并减少至小体积。然后可以通过将剩余的溶液加入到冰冷的乙醚中来沉淀PEG。然后可以通过过滤回收聚合物，用例如乙醚洗涤，并优选地在真空下干燥。然后将干燥的聚合物溶解在含氯化钠的去离子水中，并用二氯甲烷萃取。可以用碳酸钠干燥该溶液，并通过蒸发减少体积。最后，可以再沉淀产物并例如用乙醚洗涤，以去除全部残留的二乙烯砜。可以在真空下干燥终产物，并在惰性气体，例如氩气下，优选地在20℃储存。可以用¹H NMR(CDCl₃)确认衍生化。通过NMR显示的端基转变的程度优选地为90-99%，更优选地为95-98%。此外，可以将凝胶渗透层析用于确认起始物质（PEG-OH）和末端功能化的PEG-VS具有相同分子量分布。

还可以通过如上所述的任一键合或者其他可能的化学连接，例如通过酰胺形成（例如羧酸、磺酸、胺类等）、通过迈克尔加成（例如顺丁烯二酰亚胺部分、不饱和羰基等）、通过点击化学（例如叠氮化物或炔烃）、通过烯/炔烃methatesis（例如烯烃或炔烃）、亚胺或腙形成（醛或酮、肼、羟胺、胺）、络合反应（抗生物素蛋白、生物素、G蛋白）或允许Sn型取代反应的组分（例如卤代烷、硫羟、醇、胺、肼、酰肼、磺酸酯、氧化磷酸硒盐）或者可用于其他组分连接的其他化学部分来将其他化学部分与如本文中所定义的PEG聚合物连接。还可以将此类其他可能化学连接用于如本文中所定义的其他组分，例如本发明多功能融合蛋白质、其他组分、细胞等与如本文中所述的PEG聚合物的共价连接。

在本发明的上下文中，也可以修饰用于如上所述的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的PEG聚合物，以允许通过任一修饰与如本文中所定义的本发明多功能融合蛋白质共价结合，所述修饰选自但不限于在本发明多功能融合蛋白质的连接体的上下文中所述的修饰及其所示的PEG修饰/功能化。此类PEG修饰/功能化可以包括例如，用N-羟基琥珀酸亚胺（NHS），优选地用包含胺的连接体功能化，其中N-羟基琥珀酸亚胺（NHS）通常与蛋白质的胺基团反应，并产生稳定的酰胺键；用马来酰亚胺，优选地用包含如上所述的硫羟（例如半胱氨酸）的功能化；用乙烯砜（VS），优选地用包含硫羟（例如半胱氨酸）的连接体的功能化，其中乙烯砜通常在迈克尔型加成反应中在稳定的硫醚键形成下与硫羟反应；用谷氨酰胺，优选地用包含赖氨酸的连接体的功能化，其中反应通常是谷氨酰胺转移酶反应；用赖氨酸，优选地用包含谷氨酰胺的连接体的功能化，其中反应通常是谷氨酰胺转移酶反应；用硫酯，优选地用包含N-端半胱氨酸的连接体的功能化，其中反应通常是天然的化学连接；用醛，优选地包含胺的连接体的功能化，其中反应通常是希夫碱反应；用羧基，优选地用包含胺的连接体的功能化，其中反应通常由EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺）介导，并形成酰胺键；用胺，优选地用包含羧基的连接体的功能化，其中反应通常是由EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺）介导的反应，并形成酰胺键等。

在本发明多功能融合蛋白质或得到的本发明生物功能化刺激应答型可溶性PEG水凝胶包含作为底物结合蛋白质的scFv片段的情况下，还可以例如通过掺入如本文中所定义的生长因子或者如本文中所定义的其他（治疗性）分子/蛋白质，优选地通过以下方法之一来修饰得到的本发明生物功能化刺激应答型可溶性PEG水凝胶：物理包埋、用FITC对分子的功能化并混合到水凝胶中、通过如本文中所定义的ZZ结构域介导的Fc标签化的分子、通过与scFv相同的化学物或连接体将生长因子与水凝胶偶联和/或具有scFv的融合蛋白质的形成。此外，可以通过添加所选的任一小分子、肽或蛋白质靶标修饰该水凝胶，所述小分子、肽或蛋白质靶标如下获得：选择结合各个分子的scFv，并以类似于固定化荧光素或FITC的方式(例如可以通过结合生物素的scFv和生物素修饰的聚合物（例如生物素-多臂-PEG）介导的交联)来固定化聚合物上的靶分子。

此外，通过制备本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶，优选地如上所定义的刺激应答型可溶性PEG水凝胶的方法，进一步解决了本发明提出的目的。通常，可以根据以下步骤制备包含如上定义的PEG聚合物基质的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶。

a)提供如本文中所定义的至少一个多功能融合蛋白质

b)将步骤a)的至少一个多功能融合蛋白质与用于如上所定义的底物结合蛋白质（SBP）的底物混合；

c)将步骤b)获得的混合物加入到如本文中所定义的PEG聚合物中，并从而优选地形成PEG水凝胶。

在用于制备本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的方法的步骤a)中，提供了至少一个多功能融合蛋白质。如上所讨论，可以通过选择性地使用如本发明所定义的不同多功能融合蛋白质的特定类型和/或量，更精确地通过使用具有如本文中所定义的仅一个或两个连接体，例如一个或两个含硫羟部分、半胱氨酸或同型半胱氨酸的如本文中所定义的多功能融合蛋白质，可以影响本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶交联的程度。可以容易地理解，具有仅一个连接体的如在本文中所定义的多功能融合蛋白质通常会导致与具有两个连接体的如本文中所定义的多功能融合蛋白质不同的交联类型。

因此，在用于制备本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的方法的步骤a)中，可以提供如本文中所定义的不同的本发明多功能融合蛋白质，以不仅引入不同的功能性，并优选地修饰本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶交联的类型和程度。因此，在用于制备本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的方法的步骤a)中，优选地可以使用

b)如本文中所定义的多功能融合蛋白质，其具有两个如上所定义的连接体；和/或

c)具有仅一个如上所定义的连接体的如本文中所定义的多功能融合蛋白质，和具有两个如上所定义的连接体的如本文中所定义的多功能融合蛋白质。

高度优选地是选项c)，即具有仅一个如上所定义的连接体的如本文中所定义的多功能融合蛋白质与具有两个如上所定义的连接体的如本文中所定义的多功能融合蛋白质的混合物或组合。

在该上下文中，不受其限制地，对于用于制备具有仅一个如上所定义的连接体的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶方法的步骤a)，如本文中所定义的示例性多功能融合蛋白质可以最优选地例如选自如下：

此外，不受其限制地，对于用于制备具有两个如上所定义的连接体的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶方法的步骤a)，如本文中所定义的示例性多功能融合蛋白质可以最优选地例如选自如下：

优选地，在本发明方法的步骤a)中使用的具有仅一个连接体的多功能融合蛋白质与具有两个连接体的多功能融合蛋白质的摩尔比率优选地为约20-约1、约10-约1、约5至约1、约4-约1、约3-约1、约2-约1、约1-约1、约1-约2、约1-约3、约1-约4、约1-约5、约1-约10或者甚至约1-约20。更优选地，具有仅一个连接体的多功能融合蛋白质与具有两个连接体的多功能融合蛋白质的摩尔比率为约10-约1、约5-约1、约4-约1、约3-约1、约2-约1或者约1-约1，最优选地约5-约1。

此外，在用于制备本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的方法的步骤a)中提供的这些多功能融合蛋白质的蛋白质终浓度（优选地在水凝胶形成之前的溶液中）可以不受其限制地为约1-约500μg/μl、约10-约300μg/μl、约20-约250μg/μl、约30-约200μg/μl、约40-约175μg/μl、约50-约150μg/μl，更优选地约60-约140μg/μl、约70-约130μg/μl、约80-约120μg/μl或者约90-约110μg/μl。

除交联的程度外，可以相应地修饰本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶中其他组分的含量，例如与本发明多功能融合蛋白质内如本文中所定义的RGD序列结合的细胞或者例如通过F_c-结构域与ZZ结构域结合的其他肽或蛋白质组分。因此，还优选地是将包含如上所定义的ZZ结构域的此类本发明多功能融合蛋白质另外地引入到本发明PEG水凝胶中。

因此，在用于制备本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的方法的步骤a)中，可以另外地提供含如本文中所定义的ZZ结构域的此类本发明多功能融合蛋白质。通常，可以将含如本文中所定义的ZZ结构域的任何多功能融合蛋白质用于该目的。在本上下文中，不受其限制，对于用于制备含ZZ结构域的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的方法的步骤a)，如本文中所定义的示例性多功能融合蛋白质优选地选自以下之一：

如果将包含如上所定义的ZZ结构域的本发明多功能融合蛋白质掺入到本发明PEG水凝胶中，在用于制备本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的本发明方法的步骤a)中提供的（全部）多功能融合蛋白质的蛋白质终浓度可以与如上已经定义的范围几乎相同。然而，优选地，可以单独地，例如不受其限制地测定包含ZZ结构域的本发明多功能融合蛋白质的蛋白质终浓度，所述蛋白质终浓度为约0.001-约100μg/μl、约0.001-约50μg/μl、约0.001-约25μg/μl、约0.001-约20μg/μl、约0.001-约10μg/μl、约0.001-约5μg/μl，更优选地约0.01-约2.5μg/μl或者约0.1-约2μg/μl。

取决于如本发明所定义的不同的多功能融合蛋白质的类型和/或量，更明确地取决于在不同的多功能融合蛋白质中含有的特定连接体的数目，可以影响本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶交联的程度。此外，可以相应地修饰本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶中其他组分的含量,例如组分如与本发明多功能融合蛋白质内如本文中所定义的RGD序列结合的细胞的含量或者其他组分例如其他肽或蛋白质组分通过F_c-结构域与ZZ结构域的结合。

在用于制备本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的本发明方法的步骤b)中，将步骤a)提供的至少一个多功能融合蛋白质与如上所定义的用于底物结合蛋白质（SBP）的底物相互混合。

用于如上所定义的底物结合蛋白质（SBP）的特定底物可以是如本文中所定义的任一合适底物，其可以被至少一个，优选地至少两个如上所定义的底物结合蛋白质（SBP）结合，以允许二聚化或多聚化共价结合的PEG聚合物或者通过底物结合蛋白质（SBP）仅仅特定结合底物。例如，用于如上所定义的底物结合蛋白质GyrB的特定底物是抗生素香豆霉素，其可以与（一个或）两个GyrB亚基结合。此外，如上所定义的肝素结合蛋白质（HBP）可以结合作为其底物的肝素，其中优选地至少一个，优选地至少两个肝素结合蛋白质（HBP）可以与相同的底物结合。同样地，可以使用如上所定义的任何其他底物结合蛋白质（SBP）。因此，在用于制备本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的本发明方法的步骤b)中，必须使用与其底物相等的或者甚至超过两倍摩尔过量的或者甚至超过更多摩尔过量的底物结合蛋白质（SBP）。换言之，肝素结合蛋白质（HBP）与其底物的摩尔比率优选地为1:1或2:1或者甚至更多。作为特定的实例，所使用的含GyrB的多功能融合蛋白质与其底物香豆霉素之间的摩尔比率优选地为约2:1。同样地，所使用的含肝素结合蛋白质（HBP）的多功能融合蛋白质与其底物之间的摩尔比率优选地为约2:1或者甚至1:1。

步骤b)中获得的混合物优选地在混合后温育，以允许彻底混合并优选地使混合物的组分相互作用。特别地，温育可以允许底物结合蛋白质（SBP）与其特定底物的结合，例如以允许各自含GyrB亚基的一个或两个或两个以上多功能融合蛋白质与其特定底物（抗生素香豆霉素）结合，或者例如以允许都含肝素结合蛋白质的一个或两个多功能融合蛋白质与其特定底物肝素结合。

在用于制备本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的方法的步骤c)中，可以优选地将步骤b)中提供的，即至少一种如本文中所定义的多功能融合蛋白质和用于底物结合蛋白质（SBP）的如上所定义的底物的混合物同时或者在不同时间点以交替的方式（例如，先加入至少一种如本文中所定义的多功能融合蛋白质并然后加入用于底物结合蛋白质（SBP）的底物，或者反之亦然）加入到如本文中所定义的PEG聚合物中。通常在约15℃-约50℃，更优选地在约15℃-约40℃，例如在约室温（RT，例如约20-25℃，例如20℃或25℃）或者在约37℃，实施将步骤b)提供的混合物加入到如本文中所定义的PEG聚合物中。如上所定义，可以修饰PEG聚合物，以包含含硫羟部分或者允许硫醚键形成的任何其他部分，例如乙烯砜部分，或者可以修饰PEG聚合物，以包含任何进一步的功能化以结合如本文中所定义的连接体。

如本文中所定义的多功能融合蛋白质（含底物结合蛋白质（SBP））与本发明方法的步骤c)中提供的PEG聚合物的反应（用于连接体的硫醚形成或者其他功能化）部分的摩尔比率优选地为约1:1，例如约0.75:1-约1:0.75之间、约0.8:1-约1:0.8之间、约0.85:1-约1:0.85之间、约0.9:1-约1:0.9之间、约0.95:1-约1:0.95之间或者约1:1。优选地，PEG聚合物的浓度可以为0.5–15%之间，例如约0.5-约5%、约2.5-约7.5%之间、约5-约10%之间、约7.5-约12.5%之间或者约10-约15%之间（w/v或v/v或w/w），或者可以在任意两个这些值形成的范围中。

用于制备本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的本发明方法的步骤c)的水凝胶形成优选地在湿润气体中实施，以防止干燥和因此新形成的PEG水凝胶的皱缩。

根据本发明方法非常优选的备选方案，可以通过例如在本发明方法的第一步骤a)中提供至少一个本发明多功能融合蛋白质来制备本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶。至少一个本发明多功能融合蛋白质通常优选地以约10-约1、约5-约1、约4-约1、约3-约1、约2-约1、约1-约1，例如约5-约1的摩尔量，优选地以约60-约140μg/μl、约70-约130μg/μl、约80-约120μg/μl或者约90-约110μg/μl，例如约100μg/μl的蛋白质终浓度包含具有一个连接体的如上所定义的一个本发明多功能融合蛋白质和优选地包含两个如上所定义的连接体的其他本发明多功能融合蛋白质。对于其他修饰，可以以约0.001-约10μg/μl、约0.001-约5μg/μl，更优选地约0.01-约2.5μg/μl或者约0.1-约2μg/μl，例如1μg/μl的终浓度，在步骤a)期间加入含如本文中所定义的ZZ结构域的多功能融合蛋白质。在非常优选的备选方案的第二步b)中，如果将GyrB用作为多功能融合蛋白质中的底物结合蛋白质，那么优选地以SBB：底物为约2:1的摩尔比率，将蛋白质溶液与底物结合蛋白质（SBP）的底物），例如与香豆霉素（Sigma Aldrich，St.Louis，MO，货号C9270，在DMSO中50mg/ml）优选地混合。优选地在约15℃-约40℃，例如在RT或者在37℃优选地温育约1小时后，将如本文中所定义的PEG聚合物加入到非常优选的备选方案的第三步c)中。含底物结合蛋白质（SBP）的如本文中所定义的多功能融合蛋白质与PEG聚合物的反应（用于连接体的硫醚形成或者其他功能化）部分优选地为约1:1的摩尔比率。然后优选地在湿润气体中，通过优选地在约15℃-约40℃，例如在RT（室温）或在37℃温育步骤c)获得的混合物优选地约5-15小时，来优选地实现水凝胶形成。

备选地，还可以通过如上所定义的备选步骤制备本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶，例如包括

a)提供如本文中所定义的至少一个多功能融合蛋白质和如本文中所定义的PEG聚合物，其中如本文中所定义的至少一个多功能融合蛋白质优选地与如本文中所定义的PEG聚合物（共价）结合；

b)将步骤a)获得的如本文中所定义的至少一个多功能融合蛋白质和PEG聚合物与用于如本文中所定义的底物结合蛋白质（SBP）的底物混合，并从而优选地形成PEG水凝胶。

对于步骤a)、b)和c)，反应条件如上所述是同样优选的。此外，优选地使用摩尔比率和如前第一种方法步骤c)所定义的反应条件，将如本文中所定义的至少一个多功能融合蛋白质和如本文中所定义的PEG聚合物优选地相互共价连接。

根据其他备选方案，还可以通过交替如上所定义的步骤制备本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶，例如

a)提供如本文中所定义的至少一个多功能融合蛋白质和如本文中所定义的PEG聚合物，其中用于如本文中所定义的底物结合蛋白质（SBP）的底物已经与PEG聚合物结合；

对于步骤a)、b)和c)，反应条件如上所述同样是优选的。

可以通过掺入其他组分，选自例如细胞、蛋白质、多肽、抗生素、抗体、抗微生物聚合物和非固醇类临床许可的消炎剂，例如(i)乙酰水杨酸，(ii)芳基丙酸，(iii)芳基乙酸，(iv)吲哚乙酸，(v)氨基苯甲酸和昔康类，以及选择性COX-2抑制剂，来进一步修饰如上所定义的和优选地如上述本发明所制备的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶。

可以掺入到本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶中的蛋白质可以不受其限制地选自例如生长因子。在本上下文中，不受其限制，生长因子可以选自例如肾上腺髓质素（AM）、自分泌运动因子、骨形成蛋白（BMP）、表皮生长因子（EGF）、促红细胞生成素（EPO）、成纤维细胞生长因子（FGF），例如FGF-7、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、生长分化因子-9（GDF9）、肝细胞生长因子（HGF）、肝细胞瘤衍生生长因子（HDGF）、肝素结合生长因子（HBGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、促移行因子、myostatin（GDF-8）、神经生长因子（NGF）和其他神经营养因子、血小板衍生生长因子（PDGF）、血小板生成素（TPO）、血小板反应蛋白（TPS）、转化生长因子α（TGF-α）、转化生长因子β（TGF-β）、血管内皮生长因子（VEGF）、胎盘生长因子（PlGF）、[(胎牛生长激素)]（FBS）、IL-3和IL-6的IL-1-辅因子（活化T细胞）、IL-2-T-细胞生长因子（刺激IL-1合成、活化B-细胞和NK细胞）、IL-3（刺激产生全部非淋巴样细胞）、IL-4（用于活化B细胞、休眠T细胞和肥大细胞的生长因子）、IL-5（诱导活化的B细胞和嗜酸性粒细胞的分化）、IL-6（刺激Ig合成，浆细胞的生长因子）、IL-7（前B细胞的生长因子）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、制管张素（抑制新血管形成）等。特别优选的生长因子是例如FFG-7，更优选地如SEQ ID NO:50（还参见图9，氨基酸1-106）所定义的生长因子。甚至更优选地，可以掺入到本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的如上所定义的蛋白质选自这样的融合蛋白质，其包含如上所定义的生长因子、任选地如上所定义的连接体，优选地如上所定义的F_c-结构域，以及任选地如上所定义的用于纯化的标签。最优选地，该融合蛋白质选自SEQ ID NO:52的序列（在本文中称为FGF-7-Fc-His）或者与SEQ ID NO:52的序列表现出至少50、60、70或80%，优选地至少90%，更优选地至少95%和甚至更优选地至少97.5%同一性的氨基酸序列（还参见图9）。备选地，该融合蛋白质由SEQID NO:51的核酸序列或者与SEQ ID NO:51的序列表现出至少50、60、70或80%，优选地至少90%，更优选地至少95%和甚至更优选地至少97.5%同一性的核酸序列编码（也参见图9）。

可以掺入到本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶中的如上所定义的蛋白质可以例如通过掺入的如上所定义的本发明多功能融合蛋白的ZZ结构域与PEG水凝胶结合。为此，待掺入的蛋白质通常与ZZ结构域的结合配偶体，例如Fc-结构域如SEQ ID NO:53的Fc-结构域或者与SEQ ID NO:53的序列表现出至少50、60、70或80%，优选地至少90%，更优选地至少95%和甚至更优选地至少97.5%同一性氨基酸序列（还参见图9，氨基酸123-354）融合。

待掺入到本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶中的蛋白质可以另外地与特定的蛋白酶识别序列融合，所述特定的蛋白酶识别序列优选地位于如上所定义的蛋白质与如上所定义的ZZ结构域的结合配偶体之间。该方法允许将蛋白质掺入到本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶中，并基于特定的引发剂，从本发明水凝胶中特定地释放特定蛋白质，例如特定生长因子。该引发剂可以是蛋白酶，其具有特定的蛋白酶识别序列、用于连接如上所定义的蛋白质和如上所述ZZ结构域的结合配偶体的氨基酸序列。此类蛋白质识别序列可以是对内源产生的蛋白酶如基质金属蛋白质（MMP，例如在Ehrbar等人（2007）Biomaterials28，3856-3866中所述）或者是对连同水凝胶施用一起或者在另一时间点外部加入的蛋白酶特异的。因此，在这方面使用的蛋白酶可以包括此类内源产生的蛋白酶或基质金属蛋白酶，或者优选地选自例如因子Xa、胱天蛋白酶或者烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶。

同样地，待掺入到本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的本发明蛋白质可以是如上所述的蛋白酶。

可以在形成本发明水凝胶之前或者与形成本发明水凝胶平行或者通过用（已经形成的）如本文中所定义的PEG水凝胶温育蛋白质，将该蛋白质掺入到本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶中。温育可以优选地在约15℃-约40℃，例如在RT或在37℃发生。此外，温育可以优选地在约60-约140ng/μl、约70-约130ng/μl、约80-约120ng/μl或者约90-约110ng/μl，例如约100ng/μl的蛋白质终浓度发生。

可以用于掺入到本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶中的细胞可以不受其限制地选自，例如干细胞，如人干细胞、成体干细胞、胚胎干细胞、改造的或未改造的干细胞、原始的或者永生化的（细胞系）干细胞、优选地间充质干细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞、全部结缔组织的成纤维细胞，例如牙龈和/或皮肤和角膜成纤维细胞，其单独或者与牙周韧带成纤维细胞一起，角质形成细胞，例如牙龈角质形成细胞和来自口腔和上呼吸消化道，以及来自皮肤和眼表面的角质形成细胞、中枢神经系统的细胞、神经元细胞、血管和角膜组织的内皮细胞、周细胞、肌细胞、脂肪细胞、星形细胞、黑素细胞等。如上所定义的细胞优选地是自体细胞，即来源于待治疗的患者的细胞。

有利地，本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶可以在特定刺激时溶解/降解。此类特定刺激可以是例如，添加如上所定义的底物结合蛋白质（SBP）的特定底物或拮抗剂。作为实例，如果GyrB包含在用于交联PEG水凝胶的多功能融合蛋白质中，那么可以在添加特定的抗生素新生霉素时降解PEG水凝胶。可以想象，例如通过将底物或者如上所定义的底物结合蛋白质（SBP）的拮抗剂缓慢地施用给本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶，可以以时间交错的方式发生溶解/降解。溶解/降解通常在本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的应用部位进行。

此外，根据另外特定的实施方案，通过将本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶用作为药物、医学装置或医学产品，解决了本发明提出的目的。特别是其化学组成，其通过整联蛋白序列调整其生物活性和仿生学参数，并掺入特定的靶生长因子的可能性，使得本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶在多种临床应用中成为重要的且有用的工具。有利地，可以将本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶用于多种临床应用。

不受其限制，优选地以药物、医学装置或医学产品形式的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的此类临床应用包括，例如在植入学、皮肤病学和上呼吸消化道癌（例如在耳鼻喉学或耳鼻喉医学期间），以及口腔（例如口腔和上颌面手术期间）创伤领域的治疗，以及牙槽骨扩大治疗。更明确地，本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的此类临床应用包括，例如在再生医学、口腔医学和牙科学领域中的创伤敷料、组织支持或组织再生应用。在此类应用中，可以治疗皮肤病学领域内的慢性溃疡型创伤，以及再生医学领域的创伤，特别是在手术切除上呼吸消化道癌（例如在耳鼻喉学或耳鼻喉医学期间）发生的创伤，以及口腔（例如口腔和上颌面手术期间）和牙槽骨扩大的创伤作为屏障功能。在溃疡型创伤（其通常在糖尿病患者下肢末端的下部发生）的情况下，可以在经照射的细胞分裂失活的皮肤成纤维细胞存在的情况下，在本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶上体外培养自体角质形成细胞，直到获得预成型的上皮细胞。此类自体角质形成细胞通常来源于例如毛根外鞘，并因此容易得到。随后，将已经用此类自体细胞培养的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶优选地施用在优选地该细胞所来源的同一患者的预处理创伤上。通常以这样的密度和大小发生将本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶施用在优选地患者的预处理创伤上，所述密度和大小优选地启动创伤的愈合，并优选地允许细胞受到来自周围组织和液体的营养物的支持。本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的施用还支持创伤的闭合，这归因于PEG凝胶的直接和系统降解，并导致特定蛋白质，例如角质形成细胞促进生长因子如EGF或FGF-7（KGF）的释放。对于如上所述的上呼吸消化道癌（例如在耳鼻喉科学或耳鼻喉医学期间），用本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶应用的角质形成细胞通常来源于所谓的“前臂皮瓣（forearm flap）”。在这种情况下，移去一部分前臂内侧的完整皮肤的一块，并在体外培养结缔组织的成纤维细胞和上皮角质形成细胞。因为患此类肿瘤的患者通常遭受受损的创伤愈合，并因此表现出相应的有问题的肉芽组织，所以在“交替地”施用含上皮细胞和成纤维细胞的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶下，有利地发生了此类患者和外科敷料的治疗。

此类“交替的”本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶可以在一种或两种不同的如上所定义的刺激应答型可溶性PEG水凝胶作为“夹层”含有上皮细胞和成纤维细胞。可以例如通过首先在表面（将其称为“下表面”）预培养如本文中所定义的细胞如成纤维细胞，而在1天的时间延迟，接种另一细胞，例如角质形成细胞，培养在水凝胶的“上表面”。两种细胞类型通过可扩散的生长因子的相互作用一般随时间产生了层化的上皮形成或者组织形成，但两种细胞类型缺少直接的细胞-细胞接触。有利地，此类“交替的”本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶也称为“夹层”刺激应答型可溶性PEG水凝胶，优选地为预形成的（上皮）组织提供了营养，在上皮组织的情况下，特别地归因于成纤维细胞通过可扩散的生长因子的相互作用。使用该方法，对于纯的预形成的上皮，上皮闭合下的创伤愈合表现出更好的结果。在这种情况下，可以将血管生长因子如VEGF掺入到本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶中，在凝胶降解时，所述生长因子积极地影响了创伤组织或肉芽组织的新血管形成。

本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶优选地以药物、医学装置或医学产品形式的其他有利的临床应用包括拔牙后在待治疗的患者中的牙槽嵴预防。此类应用在口腔医学和牙科学中决定性地促进了牙移植物在美学和功能上的成功应用。在德国，每年拔出了一千四百万颗以上的牙齿。在拔牙或脱牙后，脱落牙齿的支持骨或多或少地存在一定程度的坍塌（萎缩）。因此，在这该上下文中可以观察到不同程度的骨丢失或萎缩。在牙槽骨萎缩的情况下，可能会影响美观。甚至更糟，植入学和进一步假体康复的前提受损。因此，通常需要改善功能和美观的扩大措施，并因此常常增加了有关侵入性手术方法的花费和手术负担。因此，在拔牙或脱牙之后直接特定地应用本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶是一种避免此类支出和随后的治疗足够并且划算的工具。

本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶优选地以药物、医学装置或医学产品形式的其他有利的临床应用包括，在待治疗的患者中治疗人角膜的疾病。可以在治疗角膜，即上皮、结缔组织/成纤维细胞，和内皮的疾病中实施此类应用。在角膜缘的疾病（“角膜缘干细胞不足”）中，结缔组织（结膜）的携带血管的浑浊上皮细胞（cloudy epithelium）长到了透明角膜中，通常导致受影响的患者的失明。此类疾病的常规治疗通常需要替换角膜缘干细胞（其代表透明角膜上皮细胞的前体细胞）。在单侧角膜缘疾病的情况下，可以通过将来自未受影响眼睛的活的角膜缘组织转移到受影响眼睛，来实施治疗。在双侧的情况下，该治疗不可行，并且问题更多。在这些情况下，假定至少在一只眼睛中仍保留了角膜缘功能，那么可以将汇合的细胞层培养在基于小细胞样品的合适载体基质，如本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶上。然后可以将汇合的细胞层转移至受影响的眼睛。直到现在，才将人羊膜或纤维蛋白凝胶用作为载体基质，其中培养自提取的细胞样品的增殖细胞（干细胞）的数目代表了该离体外培养的最关键方面。不幸地，长期观察显示，在目前所使用的两种载体基质，即人羊膜或纤维蛋白凝胶上，干细胞的数目很少。该失败的原因最可能是因为这些载体基质都没有给此类干细胞提供最佳的胞外环境的事实。因此，这些干细胞不能形成最佳细胞生长所需的生态位。在本上下文中，由于本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的各个可适应性特性（其可以针对这些干细胞的需求进行设计），所以所述水凝胶提供了最佳的环境。

本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶优选地以医学装置形式的其他有利的临床应用包括角膜的内皮疾病的治疗。在本上下文中，特定的应用是例如Fuchs'角膜内皮营养不良的治疗。在这种疾病以及本文中的其他疾病中，由于凋亡导致浑浊角膜，发生了角膜内皮细胞的急剧减少。当前的治疗包括角膜移植，包括移植或替换全部角膜层。备选的治疗包括通过特定地移植来自供体的内皮细胞层来替换患病细胞。因为移植物质不是HLA相同的材料，所以可能排斥该组织移植物，导致内皮细胞层的显著损伤。在该上下文文中，本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶提供如下可能性：从待治疗的患者中提取内皮细胞，并与上文类似地通过在适合的载体基质例如基于小细胞样品的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶上培养汇合的细胞层，来富集这些内皮细胞。再次，由于本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的各个可适应性特性（其可以针对这些干细胞的需求进行设计），所以其为这些细胞提供了最佳的环境。然后，可以将细胞和作为载体的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶一起转移到角膜的后部，并因此避免移植物的排斥。

此外，可以将药物、医学装置或医学产品形式的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶用于，例如烧伤敷料、止血贴，用于病变的治疗，用于创伤治疗的手术敷料，用于软组织和硬组织再生，例如用于移植学领域，用于口腔中例如由于肿瘤疾病导致的创伤的治疗，用于眼科学领域，用于牙周缺损领域，包括牙周韧带等，用于制备用于整体或者部分再生或重构损伤的或病变的或者去除的组织，特别是肌肉、心肌、结缔组织、骨、腱或韧带、肝组织、肾脏组织、角膜组织、真皮或表皮组织、关节软骨组织的细胞移植物，用于制备用于整体或部分再生或重构神经元组织，特别是中枢神经系统组织、神经组织，例如由于帕金森病或脊髓损伤或者肿瘤病理学或阿尔茨海默氏病损伤的神经元组织、神经组织，例如手术操作后去除或者切除的神经元组织的作为神经元细胞的中枢神经系统细胞的移植物。此外，可以将本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶用作为用于体外、体内和/或离体外应用的药物递送装置、细胞基质，用于制备组织模型和作为细胞移植基质。

此外，根据另一个特定的实施方案，通过在治疗疾病、疾病状态或者一般地如本文中所定义的治疗中使用本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶，解决了本发明提出的目的。更优选地，可以将本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶用于制备药物、医疗器械或药物产品，用于治疗如上所定义的疾病。

此外，根据最后的特定实施方案，通过包含本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶，优选地掺入到如上所定义的PEG水凝胶中的其他组分，以及任选地使用说明的药盒，优选地药盒套药包，解决了本发明提出的目的。可以将此类药盒用于治疗疾病，疾病状态或者一般地如本文中所定义的和如上所述的治疗。药盒优选地包含在套药包的不同部分中的不同组分，例如一个部分包含本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶，并且至少一个或多个部分包含一种或多种其他组分。

在本发明中，如果没有另外指明，备选方案和实施方案的不同特征可以相互组合。此外，如果没有特定说明，不应将术语“包含”理解为“由……组成”的含义。然而，在本发明上下文中，根据需要，可以用术语“由……组成”替换术语“包含”。

附图

下图更详细地说明了前述方法，并不旨在限制其权利要求的范围。

图1：显示了具有RGD序列的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶，以及在相差显微镜下人牙龈成纤维细胞在水凝胶上的铺展和接种细胞的特定形态。可以看出，在24小时的温育时间内，牙龈成纤维细胞在具有RGD序列的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶上连续地铺展，产生了连续生长的细胞层。特别地，对于牙龈成纤维细胞，可以观察到细胞生长的显著增加，这维持了其天然的纺锤形态。相反，接种在不具有RGD序列的刺激应答型可溶性PEG水凝胶上的细胞在24小时的温育时间内并不显示出连续的细胞生长。这些细胞被凝胶排斥，并随后经历凋亡。

图2：显示了具有RGD序列的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶，以及在鬼笔环肽染色后人牙龈成纤维细胞和角质形成细胞在水凝胶上的铺展及由此形成的肌动蛋白丝。可以看出，在24小时的温育时间内，牙龈成纤维细胞和角质形成细胞在具有RGD序列的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶上连续地铺展，产生了连续生长的细胞层。特别地，对于牙龈成纤维细胞，可以观察到细胞生长的显著增加，这维持了其天然的纺锤形态。相反，接种在不具有RGD序列的刺激应答型可溶性PEG水凝胶上的牙龈细胞在24小时的温育时间内并不显示出连续的细胞生长和细胞的肌动蛋白丝的正确形成。这些细胞被凝胶排斥，并随后经历凋亡。

图3：显示了具有RGD序列的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶，以及在整联蛋白-βb1染色后人牙龈成纤维细胞和角质形成细胞在水凝胶上的粘附和细胞与RGD序列的结合（粘着斑的形成）。可以看出，在24小时的温育时间内，牙龈成纤维细胞在具有RGD序列的本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶上连续地铺展，产生了主要由于整联蛋白受体亚基β1与水凝胶内掺入的RGD序列的适当细胞粘着造成的连续生长的细胞层。特别地，对于牙龈成纤维细胞，可以观察到细胞生长的显著增加，这维持了其天然的纺锤形态。相反，接种在不具有RGD序列的刺激应答型可溶性PEG水凝胶上的细胞在24小时的温育时间内并不显示出连续的细胞生长，并且没有粘着斑。这些细胞被凝胶排斥，并随后经历凋亡。

图4：显示当使用本发明多功能融合蛋白中的GyrB修饰下面的PEG凝胶时，本发明刺激应答型可溶性PEG水凝胶的示例性形成。通过加入底物香豆霉素诱导PEG水凝胶的形成，而使用抗生素化合物新生霉素，可以再次以可控的方式降解PEG水凝胶。

图5：显示了GyrB的核酸序列和相应的氨基酸序列（氨基酸1-220）。

图6：显示了本发明多聚融合蛋白质pRG107的核酸序列和相应的氨基酸序列。所述亚基如下：

AA1：甲硫氨酸开始

AA2：用于偶联到PEG-VS的半胱氨酸1

AA3-221：GyrB（1-220）

AA222-233：双-GRGDSP-基序

AA234-239：六组氨酸标签

AA240：用于偶联PEG-VS的半胱氨酸2

图7：显示了本发明多聚融合蛋白质pRG111的核酸序列和相应的氨基酸序列。所示亚基如下：

AA1-129：来源于pEZZ-18（市售载体，GE healthcare）的ZZ-结合结构域

AA130-349：GyrB（1-220）

AA350-355：六组氨酸标签

AA356：用于偶联PEG-VS的半胱氨酸

图8：显示了本发明多聚融合蛋白质pRG116的核酸序列和相应的氨基酸序列。所示亚基如下：

亚基：

AA1-220：GyrB（1-220）

AA221-232：双-GRGDSP-基序

AA233-238：六组氨酸标签

AA239：用于偶联PEG-VS的半胱氨酸2

图9：显示了融合蛋白质FGF-7-Fc-His的核酸序列和相应的氨基酸序列。所示亚基如下：

亚基：

AA1-106：FGF-7（=KGF）

AA107-122：丝氨酸-甘氨酸连接体

AA123-354：Fc结构域

AA355-360：六组氨酸标签

图10：描述了实验设定的成熟结构简图，简图显示了具有和不具有RGD的水凝胶的定位和接种的细胞类型。

图11：显示在（不具有）RGD的水凝胶上培养48小时后的牙龈成纤维细胞的倒置显微镜相差图像。细胞生长界限穿过了围绕细胞培养底物的水凝胶的更有利的塑料表面。在–RGD水凝胶表面上几乎没有细胞生长可能。

图12：描述了在+RGD的水凝胶上培养48小时后的牙龈成纤维细胞的倒置显微镜相差图像，水凝胶的边缘时不是可辨别的。48小时培养时间后，有利的+RGD水凝胶表面介导了完全的细胞覆盖。

图13：提供了牙龈角质形成细胞在（不具有）–RGD水凝胶上48小时后的倒置显微镜相差图像。细胞生长边界清楚表明，对于牙龈角质形成细胞，即使细胞培养塑料基质也是比–RGD水凝胶表面更好的生长表面。只有单个细胞能粘附于细胞排斥表面。

图14：显示了牙龈角质形成细胞在+RGD水凝胶上48小时后的倒置显微镜相差图像。细胞生长和增殖在岛状细胞群中进行，天然的细胞形态学表明牙龈角质形成细胞有利的环境（+RGD水凝胶）。

图15：显示用DAB辣根过氧化物酶沉积法免疫组织化学染色细胞角蛋白19的牙龈角质形成细胞。细胞的染色模式表明，在+RGD水凝胶上细胞完全铺展，并因此与水凝胶表面形成了合适的细胞粘着。相反，培养在-RGD水凝胶表面的稀疏分布的细胞显示，几乎没有细胞铺展，并且描绘了非天然的球状细胞形态学。

图16：示例了用DAB辣根过氧化物酶沉积法免疫组织化学染色在含RGD序列的水凝胶上接种的牙龈角质形成细胞的细胞角蛋白19的结果的更高放大倍数的图像。更高的放大倍数强调了完全的细胞铺展和细胞的胞质中细胞特异性角蛋白19的分布。

图17：显示了用DAB辣根过氧化物酶沉积法免疫组织化学染色整联蛋白β3的牙龈成纤维细胞（亮光区域是由于重叠的半透明水凝胶造成的光效果）。在+RGD水凝胶表面培养的细胞表现出完全的细胞铺展，以及与凝胶表面合适的细胞粘着。相反，在–RGD水凝胶表面接种的细胞分布稀疏，表现出非天然的形态学，并且细胞分支恰好表明没有可用的细胞粘着点。

图18：描述了FluA–荧光素（FluA_A45I_R95K_S114R）的核酸序列（上面的序列）（SEQ ID NO:54）和氨基酸序列（下面的序列）（SEQ IDNO:55）。

图19：描述了DigA（DigA_16）的核酸序列（上面的序列）（SEQ IDNO:56）和氨基酸序列（下面的序列）（SEQ ID NO:57）。

图20：描述了水杨酸结合蛋白质2（SABP2）的核酸序列（上面的序列）（SEQ ID NO:58）和氨基酸序列（下面的序列）（SEQ ID NO:59）。

图21：描述了水杨酸结合蛋白质2（SABP2S81A）的核酸序列（上面的序列）（SEQ ID NO:60）和氨基酸序列（下面的序列）（SEQ ID NO:61）。

图22：描述了拟南芥FK506结合蛋白质（FKBP42）的核酸序列（上面的序列）（SEQ ID NO:62），拟南芥FK506结合蛋白质（FKBP42（氨基酸1-163））的核酸序列（中间的序列）（SEQ ID NO:63），拟南芥FK506结合蛋白质（FKBP42（氨基酸1-163））的氨基酸序列（下面的序列）（SEQ ID NO:64）。

图23：描述了拟南芥多抗性样ABC转运蛋白AtPGP1的核酸序列（上面的序列）（SEQ ID NO:65）和氨基酸序列（下面的序列）（SEQ ID NO:66）。

图24描述了拟南芥多抗性样ABC转运蛋白AtPGP1（氨基酸980-1286）的核酸序列（上面的序列）（SEQ ID NO:67）和氨基酸序列（下面的序列）（SEQ ID NO:68）。

图25：显示了基于FluA对荧光素的亲和力的刺激敏感型水凝胶。

图26：显示了基于DigA对地高辛的亲和力的刺激敏感型水凝胶。

图27：显示了基于SABP2对水杨酸的亲和力的刺激敏感型水凝胶。

图28：显示了基于通过槲皮素破坏FKBP42与AtPGP1的蛋白质-蛋白质相互作用的刺激敏感型水凝胶。

图29：显示了测试具有RGD序列的水凝胶（上图）和不具有RGD的水凝胶（下图）的频率依赖的粘弹性特性的实施例7的结果，其中结果已经以赫兹（Hz）表示。

图30：显示了测试具有RGD序列的水凝胶（上图）和不具有RGD的水凝胶（下图）的频率依赖的粘弹性特性的实施例7的结果，其中结果已经以角频率w（rad/秒）表示。

图31：显示了在合成的体液中GyrB-PEG水凝胶的溶解动力学的结果。

图32：显示了如实施例1中所述的具有GyrB和多臂PEG的本发明水凝胶的长期稳定性测试（贮藏于4℃）结果。

图33：描述了示例性用于实验部分的scFv的氨基酸序列（SEQ ID NO:69）。该scFv片段直接针对荧光素及其衍生物（参见Vaughan等人，（1996），Nat.Biotechnol14（3），S.309–314）。例如通过在大肠杆菌的周质中表达（参见Rippmann等人，（1998），Appl.Environ.Microbiol64（12），S.4862–4869）、在奇异变形杆菌的L-型细胞中表达，在所述的已建立的表达系统中（参见Pedrazzi等人，（1997），FEBS Lett415（3），S.289–293），将scFv重组地产生为C-端六组氨酸标记的形式。描述了去除周质信号序列后，所产生的scFv的氨基酸序列。

图34：显示了实施例10的scFv水凝胶的确认。结果，可以发现，用1mM荧光素温育水凝胶，导致了水凝胶的溶解，以及掺入的蛋白质释放进入上清液中（1天后使用Bradford方法定量），而不用荧光素（0mM）温育不会导致显著的水凝胶溶解和蛋白质释放（1天后使用Bradford方法定量）。

实施例

以下实施例更详细地说明了前述发明，并不旨在限制其权利要求的范围。

实施例1：聚合物合成和修饰

根据Lutolf MP，Hubbell JA.2003，Synthesis and physicochemicalcharacterization of end-linked poly(ethylene glycol)-co-peptide hydrogelsformed by Michael-type addition.Bio-macromolecules4（3）：713-22）从8-臂PEG-OH(Shearwater polymers,Huntsville,AL)起始，合成8-臂-聚乙二醇-乙烯砜（PEG-VS，分子量37.5kDa）:

通过用过量的二乙烯砜（Aldrich，Buchs，瑞士）偶联PEG-OH合成多臂PEG-VS。将PEG-OH（大约5g）直接溶解在300mL干的二氯甲烷（以前在分子筛上干燥）中，或者在一些情况下，在开始反应前，使用迪安斯达克榻分水器(Dean Stark trap)在甲苯中通过共沸蒸馏干燥PEG。为了在二氯甲烷中溶解PEG，在氩气下，以超过OH基团5倍摩尔的量加入NaH。氢形成后，以超过OH基团50-至100-倍摩尔的量非常快速地加入二乙烯砜。在氩气下，在室温恒定搅拌实施反应。然后用浓缩的乙酸中和反应溶液，经滤纸过滤直到透明，并通过旋转蒸发减少至小体积（约10mL）。通过将剩余的溶液逐滴加入到冰冷的乙醚中来沉淀PEG。通过过滤回收聚合物，用乙醚洗涤，并在真空下干燥。然后将干的聚合物溶解在200mL含大约5g氯化钠的去离子水中，并用200mL二氯甲烷萃取三次。用碳酸钠干燥该溶液，并通过旋转蒸发再次减少体积。最后，再沉淀产物，并用乙醚彻底洗涤，以去除全部剩余的二乙烯砜。在真空下干燥终产物，并储存在-20℃的氩下。用¹H NMR（CDCl₃）:3.6ppm（PEG骨架）、6.1ppm（d,1H,＝＝CH₂）、6.4ppm（d,1H,＝＝CH₂）和6.8ppm（dd,1H,-SO₂CH＝＝）确认衍生作用。发现通过NMR所示端基转变的程度为95-98%。将凝胶渗透层析用于确认起始物质（PEG-OH）和末端功能化的PEG-VS具有相同分子量分布。

实施例2-示例性本发明多功能融合蛋白质的产生

克隆并表达了以下示例性多功能融合蛋白质（在本文中也测定为GyrB变体）：

质粒pRG116含有大肠杆菌旋转酶B的N端序列（氨基酸1-220），紧接着是两个RGD序列（2×GRGDSP）、用于纯化的六组氨酸标签和用于与PEG-VS偶联的半胱氨酸残基。

质粒pRG107含有pRG116之外的N端半胱氨酸残基。

质粒pRG111含有2个合成的来自A蛋白的结合Fc的Z结构域（ZZ，来源于载体pEZZ-18，GE healthcare），紧接着是大肠杆菌旋转酶B的N端序列（氨基酸1-220）、用于纯化的六组氨酸标签和用于与PEG-VS偶联的半胱氨酸残基。

将相应的GyrB表达质粒（pRG107、pRG111、pRG116）转化到大肠杆菌BL21STAR^TM（DE3）（Invitrogen，Carlsbad，CA，货号C601003），并在37℃用1mM IPTG在OD₆₀₀=1诱导蛋白质产生3小时。在PBS（每1000ml初始培养体积40ml，50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、10mM咪唑，pH8.0）中重悬细胞沉淀，使用弗氏压碎器（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）破裂，并通过在30,000×g离心30分钟去除细胞碎片。将澄清的细胞裂解物上样在NTA-琼脂糖Superflow柱（Qiagen，Hilden，德国，货号30210）上，然后用10个柱体积的PBS、10个柱体积的洗涤缓冲液（50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、20mM咪唑，pH8.0）洗涤，并用2个柱体积的洗脱缓冲液（50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、250mM咪唑，pH8.0）洗脱。为了洗脱，加入500mM EDTA pH8至10mM的终浓度。

实施例3-水凝胶组装

在将本发明多功能融合蛋白质与PEG-VS聚合物偶联之前，可以使用还原剂，优选地用TCEP还原本发明多功能融合蛋白质。该步骤防止硫羟部分与二硫键反应，并且对于本发明多功能融合蛋白质与PEG-VS的偶联是必须的。本发明多功能融合蛋白质与还原剂反应后，优选地纯化本发明多功能融合蛋白质，以去除或者至少基本上去除还原剂，以防止在偶联反应期间，还原剂如TCEP干扰还原的多功能融合蛋白质和/或PEG-VS聚合物。

在本上下文中，将超过20倍摩尔数的TCEP（三-(2-羧基乙基)膦盐酸盐，Sigma Aldrich，St.Louis，MO，货号C4706)）加入到相应的蛋白质洗脱物中，并在室温温育1小时。随后，通过在大小排阻柱（Thermo FisherScientific，Waltham，MA，货号43233）上的两次分离，将还原的蛋白质样品的缓冲液交换成PBS、2mM EDTA pH8，并在连续的氮气氛下，通过超滤（10kDa MWCO，Sartorius，

德国，货号VS0202）浓缩至150μg/μl的浓度。

通过将5摩尔量的还原GyrB₁₁₆与1摩尔量的还原GyrB₁₀₇混合至100μg/μl的蛋白质终浓度，来制备水凝胶。加入还原的GyrB₁₁₁至1μg/μl的终浓度。然后，以GyrB:香豆霉素=2:1的摩尔比率，用香豆霉素（SigmaAldrich，St.Louis，MO，货号C9270，DMSO中的50mg/ml）混合蛋白质溶液。室温温育1小时后，以GyrB:VS基团=1:1的摩尔比率加入PEG-VS。通过在37℃，在湿润空气中温育10小时来实现水凝胶形成。

实施例4-生长因子掺入

在哺乳动物细胞（HEK293-T）中，用C-端六组氨酸和Fc标签产生生长因子。通过其Fc亚基，通过与GyrB₁₁₁的ZZ结构域结合，将生长因子掺入到水凝胶中。添加导致水凝胶溶解的新生霉素时，还可以释放生长因子。

实施例5-细胞粘着实验

为了评价所研发的RGD功能化水凝胶的最佳细胞粘着能力，以每一水凝胶5×10⁴个细胞密度，接种口腔的两种细胞类型：人牙龈成纤维细胞（hGF）和永生化人牙龈角质形成细胞（IHGK），并在标准的细胞培养条件下培养24小时。通过相差显微镜（PCM）进行细胞生长行为和形态学的记录。实验设置包括培养在具有或不具有PGD功能化的水凝胶上的两种不同细胞类型的比较。在不具有RGD序列的水凝胶上的PCM显示出hGF和IHGK的非典型形态学。如其形态学所示，两种细胞类型都显示出与水凝胶表面更少的附着，并显示出很低的增殖速率，其通过只有小细胞岛的形成证实（图1，左列）。明显相反，在具有RGD序列（RGD功能化）的水凝胶上的细胞行为表明，这种类型的修饰产生了研究下的细胞类型更舒适的环境。更详细地，hGF和IHGK显示出其天然细胞形态学，并且与在不具有RGD序列的水凝胶上生长的细胞相反，它们表现出增殖速率的剧烈增加，这通过由PCM模式所揭示的几乎完全的细胞毯所证实（图1，右列）。为了证实合适的细胞粘着和规则的细胞形态学，用多聚甲醛固定在两种水凝胶构型（+/-RGD）上培养的hGF和IHGK，并进行免疫染色方案。为了阐述细胞形态学，用特异性插入细胞骨架的肌动蛋白丝的染料（鬼笔环肽）处理细胞。水凝胶构型（+/-RGD）上的hGF和IHGK的红色荧光染色模式的比较证实了来自相差显微镜的观察结果，并显示在不具有RGD序列的水凝胶上的不规则近圆形细胞形态学（图2，左列）。相反，在具有+RGD序列水凝胶上培养的hGF和IHGK再次表现出其规则的细胞形态学，其通过观察在细胞周边肌动蛋白丝定位的被突出显示（图2，右列）。

RGD序列是胞外基质的细胞粘着点，并且是基质分子I型胶原和纤连蛋白的成分。细胞可以通过某些整联蛋白亚基，包括整联蛋白亚基β1，与这些RGD序列粘着。因此，分析了接种在两种水凝胶构型（+/-RGD）上的hGF和IHGK中整联蛋白亚基β1的分布。整联蛋白β1特异性绿色荧光信号分布的比较再次显示，在+RGD水凝胶构型上细胞周边的积累表明了合适的细胞粘着、粘着斑形成和规则的细胞形态学的发展（图3，右列）。相反，培养在–RGD水凝胶构型上的细胞中整联蛋白β1的分布显示，细胞在表面不能找到合适的粘着点，并因此保留为不规则的近圆形形态（图3，左列）。此外，整联蛋白β1特异性绿色荧光信号仍然非常弱，表明由于缺少粘着点，减少的整联蛋白β1表达（图3，左列）。总之，对于hGF和IHGK的增殖和粘着，将RGD序列掺入到水凝胶中代表了本发明医学装置的优化。

实施例6-使用本发明水凝胶的其他细胞粘着实验

目的

为了观察在如实施例1所制备的具有和不具有RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）的本发明水凝胶上接种的牙龈成纤维细胞和牙龈（或角膜）角质形成细胞的形态学改变、增殖和生长特性。

方法

水凝胶

用于本实施例的水凝胶按照实施例1所述的方法，通过用如在前述实施例中所定义和制备的旋转酶-B蛋白质功能化“起始”PEG（聚乙二醇）分子产生。GyrB参与细菌内的DNA的折叠，并被抗生素新生霉素靶向。因此，当将旋转酶-B功能化的起始-PEG分子与香豆霉素（一种在概念上类似于新生霉素二聚体并用于连接邻近的旋转酶-B蛋白质以形成3D凝胶网络的分子）混合时，产生了水凝胶。将将新生霉素（一种拥有针对旋转酶-B部分的竞争性亲和力的分子）加入到水凝胶中，可以溶解水凝胶。可以将RGD序列掺入到水凝胶中，以提供用于细胞粘着水凝胶的结合位点。

场相差倒置显微术

将1×10⁵个牙龈成纤维细胞（GF）和牙龈角质形成细胞（GK）细胞接种在12孔板的2ml培养基中，其中每孔含有40μL的水凝胶，其中一半水凝胶拥有RGD序列（+RGD)），一半水凝胶不拥有（-RGD）。将细胞温育48小时，然后将倒置显微镜用于检测汇合和形态学。

免疫组织化学染色

辣根过氧化物酶沉淀法

在12孔板中制备6个–RGD和4个+RGD水凝胶（每个40uL）。将GF和GK细胞以每孔1×10⁵个细胞接种在凝胶上，并温育24个小时。然后吸出介质，并用2mL PBS.洗涤凝胶两次。如下表1中所示制备用于染色的抗体溶液。

表1-用于在+和–RGD水凝胶上染色细胞的一级抗体

将细胞在12孔板中用4%甲醛（稀释在PBS中）固定20分钟。然后用2mL PBS洗涤凝胶3次。随后从孔的底部刮取水凝胶，并倒置在放置在～2平方厘米的石蜡膜上的50μL抗体溶液上。放置水凝胶1小时，以浸泡在1°抗溶液中，然后通过刮刀将其轻轻抬出溶液，并倒置在另一张石蜡膜上。随后用500μL PBS溶液洗涤水凝胶3次。然后，将100μL合适的2°抗体（兔、山羊）用移液到水凝胶上，并放置40分钟。然后，吸出2°抗体，并用500μL PBS洗涤水凝胶3次。将100μL预制备的DAB溶液（在1mL DAB稀释剂中的20μL DAB）移液到水凝胶上，并放置10分钟。去除DAB溶液后，用水洗涤水凝胶3次，并用甘油固定在盖片上。

角膜角质形成细胞和牙龈成纤维细胞的F-肌动蛋白的鬼笔环肽-罗丹明免疫组织化学染色

如图10中所示，排列接种在12孔硅酮板中如实施例1所制备的水凝胶（40μL）。使用角膜角质形成细胞（C-K）代替牙龈角质形成细胞。在水凝胶的上部，以7×10³个细胞/每孔接种GF和C-K细胞，等同于在200μL的培养基中3.5×10⁴个细胞/每孔。让细胞生长5天，然后在进一步处理前，用倒置显微镜检测并拍照细胞。

从含水凝胶的孔的上部吸去培养基，并用200μL PBS洗涤水凝胶2次，然后用200μL4%甲醛固定细胞半小时。去除甲醛后，用200μL PBS洗涤水凝胶两次，并然后用未稀释的牛血清白蛋白（BSA）处理3小时。然后，吸去BSA，并用200μL PBS洗涤水凝胶2次。然后用1:40稀释的30μL罗丹明-鬼笔环肽处理每一水凝胶上的细胞20分钟。随后，吸出罗丹明-鬼笔环肽溶液，并用200μL PBS溶液洗涤孔内的水凝胶3次。然后用30μL300nM DAPI染色细胞10分钟，并随后用200μL PBS洗涤3次。然后从载玻片中去除与其连接的硅酮孔结构，在Vectorshield中固定水凝胶，并将载玻片放置在水凝胶的上部。使用具有60×油物镜的荧光显微镜观察并拍照样品。

牙龈角质形成细胞和牙龈成纤维细胞的整联蛋白αV和整联蛋白β1免疫组织化学染色

如在图10中所示，将水凝胶放置在硅酮孔中。将细胞（牙龈成纤维细胞和牙龈角质形成细胞）以200μL培养基中每孔7×10³个细胞接种在水凝胶上。温育细胞24个小时，在倒置显微镜下检查，并使用倒置显微镜拍照。然后，如下表2中所示，用抗体免疫组织化学染色细胞。

表2-用一级抗体染色的细胞类型

HPV-16GK	GF
		αV整联蛋白	β1整联蛋白

染色方案：去除培养基，并用200μL PBS洗涤每孔两次。然后，用4%多聚甲醛（PF）固定细胞半小时。去除PF，并用PBS洗涤细胞两次。然后去除PBS，并将200μL BSA移液到细胞上，并放置1小时。去除BSA，并用PBS洗涤凝胶。将一级抗体1:50稀释在PBT（PBS和Tween）中，并将二级抗体以1:300稀释。将30μL的每一一级抗体移液到凝胶上，并在4℃放置过夜。

结果

场相差倒置显微术

在水凝胶上的细胞的倒置显微图像显示，当与–RGD水凝胶比较时，在+RGD水凝胶上更好的增殖和/或粘着。这显示在图11中，其中–RGD显示在左上方。可以清楚的看出，与水凝胶周边的孔表面比较，缺少生长在水凝胶表面的成纤维细胞。这与+RGD水凝胶形成了鲜明的对比，其中如图12中所示，观察到了连续的细胞层，并且不可辨识水凝胶边缘。

这种生长和/或粘着模式反映在牙龈角质形成细胞的外形中。与凝胶表面稀疏的细胞密度显著相反，水凝胶的边缘排列了几乎汇合的角质形成细胞层。这显示在图13中，并且与图14对比，图14中生长在水凝胶上的细胞并不与在平板表面上生长的那些细胞一样密集，但比在-RGD水凝胶表面上生长的那些细胞显著更多。

免疫组织化学沉淀染色-辣根过氧化物酶

如图15显示+RGD和–RGD水凝胶（分别为左和右）的显微镜图像所示，细胞角蛋白19免疫组织化学染色揭示了在+RGD水凝胶和–RGD水凝胶上生长的那些牙龈角质形成细胞的形态学的强烈对比。

图16中牙龈角质形成细胞的K19染色的更高放大倍数照片更详细地显示了角蛋白19蛋白质的分布。

下图17所示，使用DAB试剂盒辣根过氧化物酶系统的牙龈成纤维细胞的整联蛋白β3的免疫组织化学染色显示了在+RGD水凝胶和-RGD水凝胶上生长的细胞之间形态学的显著差异。与-RGD水凝胶上具有不规则形态学的仅少数细胞的外观对比，在+RGD水凝胶上具有几乎完整的细胞层。

如图2中所示，在荧光显微镜下显示了牙龈成纤维细胞和角膜角质形成细胞的细胞内的经鬼笔环肽-罗丹明染色F-肌动蛋白丝。对于两种类型，与那些在-RGD水凝胶上生长的细胞比较，在+RGD水凝胶上生长的细胞表现出显著更膨胀的形态学。

在20x/0,75Plan Apo Objective下实施荧光显微术。由于显著的非特异性背景荧光，很难取得高质量的图像清晰度。尽管如此，如图3中所示，整联蛋白β1染色显示，与-RGD细胞比较，在+RGD水凝胶上培养的细胞的形态学、增殖和铺展明显不同。

GK细胞上整联蛋白αV免疫组织化学染色在+RGD和–RGD水凝胶上培养的细胞之间显示出与在对GF细胞的整联蛋白β1所观察到的那些染色类似的差异。图3中可以明显看出这种差异。

讨论

所产生的本发明PEG水凝胶的全部形式的特征显示，牙龈成纤维细胞和牙龈角质形成细胞（在一个分析中-角膜角质形成细胞）都可以在+RGD水凝胶上粘着并增殖。在牙龈成纤维细胞的情况下，如通过缺少图12中所示的水凝胶和平板底物之间的分界线所示，增殖速率与与平板底部的细胞的增殖速率类似。如图13和图14中所示，对于牙龈角质形成细胞，情况并非如此，其中在-RGD水凝胶的边缘周围观察到了比在+RGD水凝胶上生长的细胞更密集的细胞层。然而，还可以通过考虑水凝胶的形状来解释这种现象，所述形状是凸出的盘状。由于受限于与PEG物质粘着的能力，因此，沉降时，许多细胞从–RGD水凝胶滑落，导致在水凝胶周边的平板表面的细胞浓缩效应。相比，细胞对+RGD水凝胶的粘着对细胞整体的密度分布具有平衡作用。使用DAB辣根过氧化物酶方法染色的细胞角蛋白18（K19）在对比在+RGD和–RGD水凝胶上培养的GK之间的形态中是有用的。在此，我们可以看出，与具有球形细胞的稀疏的–RGD水凝胶比较，在+RGD水凝胶上许多细胞具有正常的形态。K19在正角化的角质形成细胞中并不是正常表达的，但可见于非角化的上皮基细胞（参见

和J.G.Rheinwald（1996），“A Limited Role for Retinoic Acidand Retinoic Acid Receptors RAR[agr]and RAR[beta]in RegulatingKeratin19Expression and Keratinization in Oral and Epidermalkeratinocytes。”107（3）：428-438），以及正常的和良性的增生性非角化基底粘膜细胞（参见Lindberg，K.和J.G.Rheinwald（1989）

，American Journal of Pathology134（1）：89-98）。在HPV-16永生化的外宫颈和包皮角质形成细胞中存在细胞角蛋白19表达增加（参见Sun，Q.，K.Tsutumi，等人（1993），International Journal of Cancer54：656-662），以及在HPV-16永生化的牙龈角质形成细胞中存在胚胎角蛋白K19（参见Oda，D.，L.Bigler，等人（1996），Experimental Cell Research10（1）：164-169）的一些证据。在当前所示的结果中观察到的K19的表达与这些作者的观察一致。类似地，在+RGD水凝胶上GF细胞的细胞粘着蛋白质整联蛋白β3的染色显示，在水凝胶的表面上几乎完全的蛋白质覆盖，表明了全面的细胞粘着。然而，–RGD水凝胶显示出具有高度不规则形态学的极少细胞。GF和角膜角质形成细胞上F-肌动蛋白的罗丹明-鬼笔环肽染色再次突出了+RGD和–RGD水凝胶上细胞之间的差异，其中+RGD上的那些细胞在整个细胞中表现出正常的F-肌动蛋白分布。GK的免疫组织化学染色显示，来自+RGD水凝胶上的细胞的粘着蛋白αV比–RGD上的细胞显示出显著更强的信号。αVβ6整联蛋白由粘膜创伤环境中和继代培养后体外的角质形成细胞表达（参见Haapasalmi，K.，K.Zhang，等人（1996）。“keratinocytes in Human Wounds Express[agr]v[beta]6Integrin。”106（1）：42-48）。尽管观察到了大量的背景荧光，但与–RGD水凝胶比较，整联蛋白β1染色也显示出在+RGD水凝胶上显著更多的这种黏着蛋白。已经显示，整联蛋白β1在牙龈成纤维细胞中表达，并且对于与釉基质蛋白的粘着是重要的（参见Van Der Pauw，M.T.M.，V.Everts，等人（2002），Journal of Periodontal Research37（5）：317-323），而已经显示其代谢和分布受香烟烟雾中尼古丁影响，可能导致更弱的牙周附着（参见Snyder，H.，G.Caughman，等人（2002），Journal ofPeriodontology J Periodontol73（5）：505-10）。

结论

与不具有RGD的水凝胶和与细胞培养板比较，证明用旋转酶-B和香豆霉素形成的具有RGD序列的本发明自释放型PEG水凝胶是一种非常良好的细胞培养基质。

实施例7-具有RGD序列的水凝胶和不具有RGD的水凝胶的粘弹性特性的测试

在其他测试中测试了如根据实施例1制备的具有RGD序列的本发明PEG-水凝胶和相比较的不具有PEG-RGD的水凝胶的粘弹性特性（参见图29-30）。对于机械水凝胶表征，在两个硅酮化的盖玻片之间制备水凝胶板（40μl体积，1mm高），并在合成的体液中膨胀1小时。在20℃，使用具有20mm平行的不锈钢板和0.5mm间隙大小的模块化高级流变测定系统II（Thermo Scientific），在小张力振荡剪切实验中获得存储模件和损耗模件（storage and loss moduli）（G'和G''）。在恒定张力（20%）模式中，进行测量作为频率的函数（从0.1到10Hz），以获得力学谱。在本上下文中，图29显示了具有RGD序列（上图）和相比较的不具有RGD的水凝胶（下图）的频率依赖性粘弹性特性的测试结果，其中结果以赫兹（Hz）表示。图30显示了具有RGD序列（上图）和不具有RGD的水凝胶（下图）的频率依赖性粘弹性特性的测试结果，其中以角频率ω（rad/秒）表示结果。两个测试都证实了根据实施例1制备的具有和不具有RGD序列的本发明PEG水凝胶的凝胶样特性。

实施例8-GyrB-PEG水凝胶在合成的体液中的溶解动力学

在进一步的实施例中，研究了本发明GyrB-PEG水凝胶在合成的体液中依赖于不同浓度的新生霉素的溶解动力学（参见图31）。为了去除未结合的组分，首先在4℃，在合成的体液中温育水凝胶24小时。然后，将水凝胶转移至含相应浓度的新生霉素的合成的体液中，并在4℃温育。通过使用Bradford方法，定量上清液中释放的蛋白质，来监测水凝胶溶解。结果证实了本发明GyrB-PEG水凝胶的剂量可调节的溶解动力学。本发明GyrB-PEG水凝胶是根据实施例1制备的具有RGD序列的本发明PEG-水凝胶。

实施例9-水凝胶的长期稳定性（贮藏于4℃）

此外，研究了根据实施例1制备的具有RGD序列的本发明PEG-水凝胶的水凝胶长期稳定性（贮藏于4℃）。为此，在4℃，将凝胶温育在体液中24个小时。然后，将水凝胶转移至合成的体液，并在4摄氏度储存25天。在25天后，加入1mM新生霉素，导致了水凝胶的完全溶解，如通过使用Bradford方法，在上清液中定量释放的蛋白质所监测。不用新生霉素温育不会导致水凝胶溶解。结果，根据实施例1制备的水凝胶在长期储存时间期间是稳定的，并然后仍然可以用新生霉素溶解（参见图32）。

实施例10-scFv水凝胶的产生

简介

本实施例的水凝胶设计基于用单链可变片段（scFv）接枝的分支状聚合物，所述单链可变片段（scFv）与荧光素（眼科学中常见的造影剂）及其一些衍生物如异硫氰酸荧光素（FITC）特异性结合。通过由FITC修饰的牛血清白蛋白（BSA）介导的scFv蛋白质的交联，来实现凝胶形成。荧光素的加入允许水凝胶的剂量和时间可调节的溶解。

聚合物合成

作为本实施例的上下文中所使用的聚合物，将聚(AAm-co-Ni²⁺-NTA-AAm)用作为相应的PEG聚合物的特性的评估。首先制备该聚合物。聚(AAm-co-Ni²⁺-NTA-AAm)的合成已经描述于（参见Ehrbar等人，（2008），Nat Mater7（10），S.800–804)）中。相应的本发明PEG聚合物的制备如下。

蛋白质产生

此外，产生了scFv片段。这些scFv针对荧光素，并且已经在公布的Vaughan等人1996（参见Vaughan等人，（1996），Nat.Biotechnol14（3），S.309–314）中命名为FITC-E2。对于产生，在如下所述的已建立的表达系统中，将scFv重组地产生为C-端六组氨酸标记的形式：

-（Pedrazzi等人，（1997），FEBS Lett415（3），S.289–293），在大肠杆菌的周质中表达；

-（参见Rippmann等人，（1998），Appl.Environ.Microbiol64（12），S.4862–4869），在奇异变形杆菌的L-型细胞中表达。

所产生的scFv的蛋白质序列显示于图33中（SEQ ID NO:69）（去除了周质信号序列之后）。

将表达后的细胞沉淀重悬在PBS（每1000ml初始培养体积40ml，50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、10mM咪唑，pH8.0）中，使用弗氏压碎器（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）破碎，并通过在30,000×g离心30分钟去除细胞碎片。将澄清的细胞裂解物上样在NTA-琼脂糖Superflow柱（Qiagen，Hilden，德国，货号30210）上，然后用10个柱体积的PBS、10个柱体积的洗涤缓冲液（50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、20mM咪唑，pH8.0）洗涤，并用2个柱体积的洗脱缓冲液（50mMNaH₂PO₄、300mM NaCl、250mM咪唑，pH8.0）洗脱。在大小排阻柱（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，货号43233）上，通过2次分离，将蛋白质洗脱物的缓冲液交换成50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、10mM咪唑，pH8.0，并通过超滤（10kDa MWCO，Sartorius，

德国，货号VS0202）浓缩至40mg/ml。

FITC-BSA产生

将牛血清白蛋白（BSA，Sigma Aldrich，St.Louis,MO，货号05479，在100mM碳酸钠缓冲液中的1mg/ml pH9）与10×摩尔过量的异硫氰酸荧光素（FITC，Sigma Aldrich，St.Louis，MO，货号F3651，在无水DMSO中的1mg/ml）混合，并在4℃温育12小时。通过添加NH₄Cl至50mM的终浓度，终止反应。随后，在大小排阻柱（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，货号43233）上，通过2×分离，将缓冲液交换成50mMNaH₂PO₄，300mM NaCl，10mM咪唑，pH8.0，并通过超滤（10kDaMWCO，Sartorius，德国，货号VS0202）浓缩至100mg/ml。如通过分别在495nm和280nm测量吸光度所测定，偶联的FITC与BSA的所得摩尔比率为2.9到1。

水凝胶组装

将5个体积的经纯化的scFv（在50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、10mM咪唑，pH8.0中的40mg/ml）加入到1个体积的FITC-BSA（在50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、10mM咪唑，pH8.0中的100mg/ml）和2个体积的聚(AAm-co-Ni²⁺-NTA-AAm)（在50mM NaH₂PO₄、300mMNaCl、10mM咪唑，pH8.0中的0.6%w/v溶液）中，并通过轻微搅拌混合。立即形成了水凝胶，并且进一步在湿润的空气中室温温育12小时。

scFv水凝胶的确认

为了去除未结合的组分，首先将水凝胶在1ml的50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、10mM咪唑，pH8.0中室温温育24个小时。然后，将水凝胶转移至分别含1mM荧光素（和作为对照的0mM荧光素）的1ml的50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、10mM咪唑，pH8.0中。1天后，使用Bradford方法定量上清液中释放的蛋白质（参见图34）。

Claims

1.刺激应答型可溶性PEG水凝胶，其包含PEG聚合物的基质，所述PEG聚合物经修饰含有至少一个多功能融合蛋白质，所述多功能融合蛋白质包含作为组分的底物结合肽（SBP）、重复的RGD结合肽、至少一个N-和/或C-端连接体，以及优选地用于纯化的标签，其中所述至少一个多功能融合蛋白质与所述PEG聚合物共价结合。

2.权利要求1的刺激应答型可溶性PEG水凝胶，其中所述PEG聚合物是多臂Star-PEG聚合物，优选地3-15臂的Star-PEG聚合物。

3.权利要求1或2的刺激应答型可溶性PEG水凝胶，其中所述底物结合蛋白质（SBP）选自来自大肠杆菌的DNA旋转酶亚基B（GyrB）的N-端序列、选自根据SEQ ID NO:2的来自大肠杆菌的DNA旋转酶亚基B的N-端序列或者与SEQ ID NO:2的序列显示出至少80%，优选地至少90%，更优选地至少95%，以及甚至更优选地至少97.5%同一性的氨基酸序列，或者选自蛋白质FKBP、F_M、ToxT、DHFR、Cyp、E、PIP、TetR、ArgR、ArsR、HucR、FRB、链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、neutravidin、类固醇激素受体、类固醇激素、肝素结合蛋白质、脂笼蛋白家族成员、FluA、根据SEQ ID NO:55的FluA、DigA、根据SEQ ID NO:57的DigA、SABP2、根据SEQ ID NO:59或61的SABP2或者根据SEQ ID NO:64的FKBP42或者根据SEQ ID NO:69的scFv片段或者编码这些底物结合肽（SBP）的核酸或者与这些序列显示出至少80%，优选地至少90%，更优选地至少95%，以及甚至更优选地至少97.5%同一性的序列。

4.权利要求1-3中任一项的刺激应答型可溶性PEG水凝胶，其中所述重复的RGD结合肽具有式(RGD)_n，其中n为1、2、3、4或5，并且其中所述RGD序列选自SEQ ID NO:3-33任一个的氨基酸序列，或者与SEQID NO:3-33任一个的序列显示出至少80%，优选地至少90%，更优选地至少95%，以及甚至更优选地至少97.5%同一性的氨基酸序列。

5.权利要求1-4中任一项的刺激应答型可溶性PEG水凝胶，其中所述PEG聚合物经修饰以允许通过硫醚键与至少一个多功能融合蛋白质共价连接（交联）。

6.权利要求1-5中任一项的刺激应答型可溶性PEG水凝胶，其中所述连接体选自或者含有含硫羟部分、经硫羟修饰的或者含硫羟的氨基酸、半胱氨酸、N-端半胱氨酸、同型半胱氨酸、与马来酰亚胺偶联的硫羟、乙烯砜部分、肽序列、肽键、卤素标签、SNAP-标签、CLIP-标签、谷氨酰胺转移酶反应键、氨基酸或者形成螯合物的实体NTA或与多价金属离子结合的多组氨酸，或者可以选自或含有赖氨酸、谷氨酰胺、胺或羧基。

7.权利要求1-6中任一项的刺激应答型可溶性PEG水凝胶，其中所述用于纯化的标签选自His₆-标签、FLAG-标签、HA-标签或MYC标签。

8.权利要求1-7中任一项的刺激应答型可溶性PEG水凝胶，其中所述多功能融合蛋白质包含作为组分的底物结合肽（SBP）、重复的RGD结合肽（RGD_n）、用于纯化的标签，以及至少一个N-和/或C-端连接体部分。

9.权利要求1-8中任一项的刺激应答型可溶性PEG水凝胶，其中所述PEG水凝胶用包含作为组分的底物结合肽（SBP）、ZZ结构域、用于纯化的标签和至少一个N-和/或C-端连接体的融合蛋白质和/或包含作为组分的生长因子，任选地连接体，任选地F_c-结构域，以及任选地用于纯化的标签的融合蛋白质进一步修饰。

10.权利要求1-9中任一项的刺激应答型可溶性PEG水凝胶，其中掺入到所述刺激应答型可溶性PEG水凝胶的细胞选自干细胞、人干细胞、成体干细胞、胚胎干细胞、经改造的或未改造的干细胞、原代或者永生化的干细胞、间充质干细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞、来源于结缔组织的成纤维细胞、单独的牙龈、皮肤或角膜的成纤维细胞，或者与牙周韧带成纤维细胞一起的牙龈、皮肤或角膜的成纤维细胞、牙周韧带成纤维细胞、角质形成细胞、牙龈角质形成细胞、来自口腔和上呼吸消化道、皮肤或眼表面的角质形成细胞、中枢神经系统的细胞、神经元细胞、血管和角膜组织的内皮细胞、周细胞、肌细胞、脂肪细胞、星形细胞和黑素细胞。

11.权利要求1-10中任一项的刺激应答型可溶性PEG水凝胶，其中掺入到所述刺激应答型可溶性PEG水凝胶的其他组分选自细胞、蛋白质、多肽、生长因子、蛋白酶、抗生素、抗体、抗微生物聚合物和非固醇类临床许可的消炎剂，例如(i)乙酰水杨酸，(ii)芳基丙酸，(iii)芳基乙酸，(iv)吲哚乙酸，(v)氨基苯甲酸和昔康类的衍生物，以及选择性COX-2抑制剂。

12.制备权利要求1-11中任一项所述的刺激应答型可溶性PEG水凝胶的方法，包括以下步骤：

a)提供如本文中所定义的至少一个多功能融合蛋白质和权利要求1-11中任一项所定义的PEG聚合物，其中所述至少一个多功能融合蛋白质优选地与所述PEG聚合物共价结合；

b)将步骤a)获得的如本文中所定义的所述至少一个多功能融合蛋白质和PEG聚合物与如权利要求1-11中任一项所定义的所述底物结合蛋白质（SBP）的底物混合，并从而形成所述PEG水凝胶。

13.权利要求1-11中任一项所定义的多功能融合蛋白质。

14.权利要求1-11中任一项的刺激应答型可溶性PEG水凝胶，其用作药物、医学装置或医学产品。

15.权利要求1-11中任一项的刺激应答型可溶性PEG水凝胶，用于在移植学、皮肤病学中在耳鼻喉学或耳鼻喉用药期间，治疗上呼吸消化道癌，用于治疗口腔的创伤、用于在口腔和上颌面手术期间治疗口腔中由于肿瘤疾病导致的创伤、牙槽骨扩大覆盖、用于拔牙后牙槽嵴预防、用于治疗牙周缺损，包括牙周韧带、用于治疗眼科学领域的疾病、用于在待治疗的患者中治疗（人）角膜的疾病，优选地角膜的内皮或上皮层，以及用于治疗Fuchs角膜内皮营养不良、用于烧伤敷料、止血贴，用于病变的治疗，用于手术敷料、用于创伤治疗，用于软组织和硬组织再生，用于移植学领域，用于制备用于整体或部分再生或重构受损的或者病态的或者去除的组织的细胞移植物，用于制备用于整体或部分再生或重构神经元组织的中枢神经系统细胞，如神经元细胞的植入物，或者用作为体外、体内和/或离体应用的药物递送装置或细胞基质。

16.药盒，优选地套药包，其包含权利要求1-11中任一项定义的所述刺激应答型可溶性PEG水凝胶、任选地用于掺入到权利要求1-11之一所定义的所述PEG水凝胶中的其他组分，以及任选地使用说明。