JP7251827B2 - 幹細胞の挙動調節用ナノコイル-基板複合体、その製造方法、及びそれを利用した幹細胞の付着及び分化調節方法 - Google Patents
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Description
|L1-L0|>10nm
式1で、L1は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
L0は磁場が印加されないナノコイルの長さである。
[式1]
|L1-L0|>10nm
式1で、L1は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
L0は磁場が印加されないナノコイルの長さである。
[式1]
|L1-L0|>10nm
式1で、L1は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
L0は磁場が印加されないナノコイルの長さである。
[式1]
|L1-L0|>10nm
式1で、L1は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
L0は磁場が印加されないナノコイルの長さである。
[式1]
|L1-L0|>10nm
式1で、L1は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
L0は磁場が印加されないナノコイルの長さである。
製造例
ナノコイルの製造
気孔直径が200nmの陽極酸化アルミニウム(AAO)の多孔性テンプレートを用いて電着して製造した。まず、陽極酸化アルミニウム多孔性テンプレートの片面に電子ビーム蒸発器を用いて銀(Ag)を蒸着した。金属イオン前駆体溶液で硫酸コバルト七水和物(CoSO4・7H2O、0.08M)と硫酸鉄七水和物(FeSO4・7H2O、0.08M)を脱イオン水に混合して用意した。CoFeナノコイルを生産するためにオキシ硫酸バナジウム(IV)(VOSO4・xH2O)とL-アスコルビン酸(0.06M)を前記金属イオン前駆体溶液に添加した。その後、硝酸を前駆体溶液に添加してpH2.5に調整した後、陽極酸化アルミニウムテンプレートの気孔に注入し、20mA/cm2の所定の電流密度を1分間印加してCoFeナノコイルを蒸着した。CoFeナノコイルが蒸着されたナノテンプレートを1MのNaOHで45℃で30分間反応させてナノテンプレートを除去した後脱イオン水で洗浄してCoFeナノコイルを製造した。洗浄されたCoFeナノコイルは基板に結合する前に1mLの脱イオン水に懸濁した。
陰性荷電されたチオール化されたRGDペプチド(CDDRGD、GL Biochem)を添加しないことを除いて製造例1と同じ方法でナノコイルを製造した。
実施例
ナノコイル-基板複合体製造
アミノカプロン酸(aminocaproic acid)は製造例で製造したナノコイルの天然酸化物層と反応するものと知られたアミングループに基づいて磁気CoFeナノコイルの表面にカップリングするのに使われた。1mLのナノコイルと1mLの6mMアミノカプロン酸溶液の混合溶液を室温で12時間撹拌した後、遠心分離して脱イオン水で洗浄した。22mm×22mmの平面の細胞培養グレード硝子基板をアミン化させてナノコイルの表面にカルボキシレート基が基板上のアミン基に結合されるようにする。まず、基板を塩酸及びメタノールを1:1で混合した混合物で30分間洗浄し、脱イオン水で洗浄した。洗浄された基板を硫酸で1時間活性化させて脱イオン水で洗浄した。基板を暗室で3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)及びエタノール(1:1)で1時間アミン化してエタノールで洗浄した後、100℃で1時間乾燥した。1mLの脱イオン水でアミノカプロン酸が結合されたナノコイルを0.5mLの20mMのN-エチル-N`-(3-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)(EDC)及び0.5mLの20mMのN-ヒドロキシスクシンイミド(N-hydroxysuccinimide、NHS)を含む脱イオン水1mLで3時間EDC/NHS反応を通じて活性化させ、その後、脱イオン水で洗浄した。
前記比較制造例1で製造したナノコイルを用いたことを除いて同じ方法でナノコイル-基板複合体を製造した。
実験例1
本発明によるナノコイルの形態と化学的特性を確認するために、製造されたナノコイルを対象に走査電子顕微鏡(Scanning Electron Microscope、SEM)、高角度環状暗視野走査透過型電子顕微鏡(HAADF-STEM)、高分解能透過型電子顕微鏡(HR-TEM)及び高分解能走査透過電子顕微鏡(HR-STEM)で撮影し、エネルギー分散型X線分光法(Energy dispersive X-ray spectroscopy、EDS)、電子エネルギー損失分光法(Electron energy loss spectroscopy、EELS)、振動試料型磁力計測定(Vibrating-sample magnetometry、VSM)及びX線回折分析(X-ray diffraction、XRD)を利用して分析し、その結果は図2及び図7に示した。
本発明によるナノコイル-基板複合体の特性を確認するために、ナノコイル-基板複合体を対象に電界放出走査電子顕微鏡で撮影し、フーリエ変換赤外線分光分析(Fourier-transform infrared spectroscopy、FT-IR)を実施し、原子間力顕微鏡(Atomic force microscope、AFM)で撮影し、その結果は図8~図11に示した。
本発明によるナノコイル-基板複合体に磁場を印加することによって幹細胞の付着に及ぼす影響を確認するために以下のような実験を行い、その結果は図12~図16に示した。
本発明によるナノコイル-基板複合体を利用した遠隔及び可逆的二重モードスイッチングである「ON」(伸長)及び「OFF」(収縮)が幹細胞の骨形成分化に対して及ぼす効果を調べるための実験を次のように実行し、その結果は図17~24に示した。
本発明によるナノコイル-基板複合体を利用して磁場印加によるナノコイルの伸長及び収縮に対して生体内幹細胞の付着及び機械的形質導入を調節するということを確認するために実験を実施し、その結果は、図25及び図26に示した。
Claims (19)
- 基板、基板と化学結合されたナノコイル、及び前記ナノコイルと化学結合されたインテグリンリガンドペプチドを含み、
前記ナノコイルは螺旋形のナノワイヤで構成され、一つ以上の金属元素を含み、
前記ナノコイルは100nm~20μmの長さを有し、
前記ナノコイルは磁場の印加有無によって可逆的に長さが下記式1:
[式1]
|L1-L0|>10nm
(式1で、L1は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
L0は磁場が印加されないナノコイルの長さである)
の範囲内で変化することを含む、幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル-基板複合体。 - 前記金属元素はコバルト(Co)、鉄(Fe)及びニッケル(Ni)の中の一つ以上の元素を含むことを特徴とする請求項1に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル-基板複合体。
- 前記ナノワイヤは断面が円形のワイヤ形態で備えられ、直径は5nm~30nmであり、
前記ナノコイルの螺旋形外径の平均長さは50nm~200nmであることを特徴とする請求項1に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル-基板複合体。 - 前記印加される磁場は100mT~7Tの大きさであることを特徴とする請求項1に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル-基板複合体。
- 前記インテグリンリガンドペプチドは複数個が前記ナノコイルに互いに離隔されて結合され、互いに隣合うインテグリンリガンドの間の平均間隔は1~10nmであることを特徴とする請求項1に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル-基板複合体。
- 磁場の印加時に、前記ナノコイルの互いに隣合う螺旋は離隔され、互いに隣合う螺旋の間のピッチ(pitch)は1nm~100nmであることを特徴とする請求項1に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル-基板複合体。
- 前記インテグリンリガンドペプチドはチオール化されたインテグリンリガンドペプチドを含み、
前記インテグリンリガンドペプチドのチオール基と螺旋形のナノコイルとポリエチレングリコールリンカーによって結合された構造であることを特徴とする請求項1に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル-基板複合体。 - 前記ナノコイルはカルボン酸塩が置換されて基板と結合された構造であることを特徴とする請求項1に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル-基板複合体。
- 前記基板はナノコイルが結合されない基板の表面が非活性化されたことを特徴とする請求項1に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル-基板複合体。
- 一つ以上の金属元素を含む溶液を電着してナノコイルを用意するステップと、
前記ナノコイルと第1懸濁液とを混合して前記ナノコイルにカルボン酸塩置換基を置換するステップと、
カルボン酸塩が置換された前記ナノコイルを含む溶液に表面が活性化された基板を担持して前記ナノコイルが結合された基板を製造するステップと、
前記ナノコイルが結合された基板をポリエチレングリコールリンカーを含む溶液に担持して前記ナノコイルの末端にリンカーを結合するステップと、
インテグリンリガンドペプチド(RGD)を含む第2懸濁液と前記ナノコイルが結合された前記活性化された基板を混合して前記ナノコイルにインテグリンリガンドペプチドを結合するステップと、を含むことを特徴とする幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル-基板複合体の製造方法であって、
前記ナノコイルは磁場の印加有無によって可逆的に長さが下記式1:
[式1]
|L1-L0|>10nm
(式1で、L1は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
L0は磁場が印加されないナノコイルの長さである)、
の範囲内で変化することを含む、方法。 - ナノコイルを用意するステップで金属元素を含む溶液はコバルト(Co)、鉄(Fe)及びニッケル(Ni)の中の一つ以上の金属元素を含むことを特徴とする請求項10に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル-基板複合体の製造方法。
- カルボン酸塩置換基を置換するステップで、前記第1懸濁液はカルボン酸塩置換基を含むアミノ酸誘導体を含み、
前記アミノ酸誘導体がナノコイルの表面に結合することを特徴とする請求項10に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル-基板複合体の製造方法。 - インテグリンリガンドペプチドを結合するステップで、前記第2懸濁液はチオール化されたインテグリンリガンドペプチドを含むことを特徴とする請求項11に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル-基板複合体の製造方法。
- ナノコイルが結合された基板を製造するステップは、基板を酸性溶液の中に浸漬させて基板の表面を活性化させた後表面が活性化された基板をアミノシラン溶液の中に担持して表面をアミン化させた基板を用いることを特徴とする請求項11に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル-基板複合体の製造方法。
- ナノコイルにインテグリンリガンドペプチドを結合するステップ以後にポリエチレングリコール誘導体を含む溶液にナノコイルが結合された基板を担持してナノコイルが結合されない基板の表面を非活性化させるステップをさらに含むことを特徴とする請求項11に記載の幹細胞の付着及び分化調節用ナノコイル-基板複合体の製造方法。
- 請求項1~9の中の何れか一項による幹細胞の細胞付着及び分化調節用ナノコイル-基板複合体に培養液を処理した後20mT~7Tの磁場を印加して幹細胞の細胞付着及び分化を調節するステップを含み、
前記ナノコイルは磁場の印加有無によって可逆的に長さが下記式1
[式1]
|L1-L0|>10nm
(式1で、L1は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
L0は磁場が印加されないナノコイルの長さである)、
の範囲内で変化することを含む、幹細胞の付着及び分化調節方法。 - 幹細胞の付着及び分化を調節するステップはナノコイル-基板複合体に磁場の印加有無によって可逆的にナノコイルの長さを変化させて生体内または生体外の請求項16に記載の幹細胞の付着及び分化調節方法。
- 幹細胞の付着及び分化を調節するステップは、ナノコイル-基板複合体に磁場を印加しない場合、幹細胞の付着及び機械感知分化が低下されることを現す請求項16に記載の幹細胞の付着及び分化調節方法。
- 幹細胞の付着及び分化を調節するステップは、ナノコイル-基板複合体に磁場を印加する場合、幹細胞の付着及び機械感知分化が促進されることを現すことを特徴とする請求項16に記載の幹細胞の付着及び分化調節方法。
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