JP2021137004A - 幹細胞の細胞付着・分化促進用ナノリガンド、及びこれを用いた幹細胞の細胞付着・分化を促進する方法 - Google Patents

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Khatua Chandra
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Gun-Hyu Bae
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Hyo-Jun Choi
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Sun-Hong Min
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Abstract

【課題】幹細胞の細胞付着・分化促進用ナノリガンドと、当該ナノリガンドを用いて幹細胞の細胞付着・分化を促進する方法を提供する。【解決手段】磁性ナノ粒子を含むコアと、前記コアを包み込むように設けられ、インテグリン結合リガンドペプチドを含むコーティング層と、前記コアと前記コーティング層の間に備えられるリンカーと、を含み、前記インテグリン結合リガンドペプチドは、負に荷電されたことを特徴とする、幹細胞の細胞付着・分化促進用ナノリガンド。ナノリガンドを含む基板に磁場を印加することにより、ナノリガンドのスライドを時間的・空間的に制御するに留まらず、可逆的な制御をも可能とし、磁場ベースの時空間的制御により体外・体内での幹細胞の付着や分化を効率的に調整することができる。【選択図】図１

Description

本発明は、幹細胞の細胞付着・分化促進用ナノリガンド、及び当該ナノリガンドを用いた幹細胞の細胞付着・分化を促進する方法に関し、具体的には、当該ナノリガンドを用いて幹細胞の付着や分化の遠隔制御を行う方法に関する。
幹細胞は、自己再生による増殖が可能であり、骨、脂肪、筋肉、心筋、血管、軟骨など様々な細胞に分化する能力を有する。近年、これらの特性を活用して損傷を受けた組織、臓器を再生するために幹細胞、或いは幹細胞から分化した細胞の移植する技術が幅広く研究されている。その上、幹細胞が特定の細胞に分化できるように補助する生体材料の研究も活発に行われている。
このように、幹細胞の再生効果を効率的に制御するための方法として、リガンドの提示による体内技術が開示されている。しかしながら、従来の体内におけるナノリガンド提示はほぼ静的で、たとえ動的であってもリアルタイムの遠隔制御による
巨視的なリガンド密度の可逆的変化を引き起こせないという短所があった。
韓国公開特許第２０１８−００１７７０４号公報
本発明が解決しようとする課題は、基板と静電的に結合して移動できるナノリガンドを提供し、当該ナノリガンドを用いて、リアルタイムの遠隔制御により巨視的なナノリガンド密度の可逆的変化を引き起こし、幹細胞の付着や分化を促進する方法を提供することである。
本発明は、磁性ナノ粒子を含むコアと、
コアを包み込むように設けられ、インテグリン結合リガンドペプチドを含むコーティング層と、
コアと前記コーティング層の間に備えられるリンカーと、を含み、
インテグリン結合リガンドペプチドは、負に荷電されたことを特徴とする、幹細胞の細胞付着・分化促進用ナノリガンドを提供する。
更に本発明は、磁性ナノ粒子を含むコアを用意するステップと、
コアをリンカーを含む第１の懸濁液と混合してリンカーが結合されたコアを製造するステップと、
リンカーが結合されたコアをインテグリン結合リガンドペプチド（ＲＧＤ）を含む第２の懸濁液と混合するステップと、を含む、上述の幹細胞の細胞付着・分化促進用ナノリガンドの製造方法を提供する。
更に本発明は、上述の幹細胞の細胞付着・分化促進用ナノリガンドを含む溶液に表面が活性化された基板を担持してナノリガンド提示基板を製造するステップと、
ナノリガンド提示基板に幹細胞を処理した後、外部の磁場を印加し、幹細胞の付着・分化を調整するステップと、を含む、幹細胞の付着・分化を促進する方法を提供する。
本発明による幹細胞の細胞付着・分化促進用ナノリガンドは、磁性ナノ粒子に負に荷電されたリガンドをコーティングしたもので、基板との静電結合により基板上で容易に移動できる。
更に、本発明による幹細胞の細胞付着・分化を促進する方法は、当該ナノリガンドを含む基板に磁場を印加することにより、ナノリガンドのスライドを時間的・空間的に制御するに留まらず、可逆的な制御をも可能とし、磁場ベースの時空間的制御により体外・体内での幹細胞の付着や分化を効率的に調整することができる。
本発明の一実施例による幹細胞の細胞付着・分化促進用ナノリガンド、及びこれを用いた幹細胞の細胞付着・分化方法を示した模式図である。 本発明の一実施例による幹細胞の細胞付着・分化方法を図式化した図である。 本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドの透過型電子顕微鏡像（ＴＥＭ）である（スケールバー：２０ｎｍ）。 本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドの特性を示したもの。（ａ）は、サイズ分布を有する磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）とアミノ−シリカ被覆ＭＮＰの動的光散乱画像、（ｂ）は、代表的なアミノ−シリカ被覆ＭＮＰの高角散乱環状暗視野走査透過型電子顕微鏡（Ｈｉｇｈ−ａｎｇｌｅ ａｎｎｕｌａｒ ｄａｒｋ−ｆｉｅｌｄ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＨＡＡＤＦ−ＳＴＥＭ）画像である（スケールバー：２０ｎｍ）。 本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドの振動サンプル磁力計ヒステリシス（Ｖｉｂｒａｔｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ ｍａｇｎｅｔｏｍｅｔｅｒ ｈｙｓｔｅｒｅｓｉｓ）である。 本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドのフーリエ変換赤外スペクトル画像である。 本発明の一実施例による基板とスライド可能なナノリガンドの静電結合（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を図式化した画像である。 本発明の一実施例にマイクロスケールとナノスケールのナノリガンドのスライドに対するＩｎ ｓｉｔｕ可逆的時空間操作（Ｉｎ ｓｉｔｕ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）を撮像した走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像、並びに原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像である。（ａ）及び（ｂ）は、正に荷電された基板とナノリガンドの画像、（ｃ）及び（ｄ）は、低速度ＳＥＭ撮像（Ｔｉｍｅ−ｌａｐｓｅ ＳＥＭ ｉｍａｇｉｎｇ）の結果、（ｅ）は、ＡＦＭ走査によるナノリガンドのスライドにおけるナノスケールの変位を示したものである。 比較例として永久磁石無しで撮影した、Ｉｎ ｓｉｔｕナノリガンドのスライドの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像である。 本発明の一実施例によるスライドナノリガンドのＩｎ ｓｉｔｕ制御におけるインテグリンβ１（ｉｎｔｅｇｒｉｎβ１）結合の調整に関する。（ａ）は基板の「左下」に永久磁石があるスライドナノリガンドの概略図、（ｂ）は基板の「左側」、「中間」、「右側」でスライドナノリガンドに結合されたインテグリンβ１クラスタに対する免疫蛍光の共焦点画像（スケールバー：５０μｍ）、（ｃ）は基板の「左側」、「中央」、「右側」でインテグリンβ１クラスタの染色強度を示したグラフでである。 本発明の一実施例によるナノリガンドのスライドのＩｎ ｓｉｔｕ制御実験結果を示した画像である。（ａ）は、インテグリンβ１結紮と、ヒト中葉幹細胞（ｈＭＳＣｓ）の焦点付着を調整できるか否かを調査した免疫蛍光画像、（ｂ）は、ナノリガンドのスライドの時間規制切り替えが幹細胞の付着を調整できるか否かを調査した免疫蛍光画像である（スケールバー：５０μｍである）。 本発明の一実施例による基板の「左下」に位置する永久磁石の下でｈＭＳＣを培養した４８時間後、付着細胞の密度、面積、焦点付着数、縦横比を計算したグラフである。 比較例として、ＲＧＤリガンドや永久磁石がない状態でスライド可能なナノリガンドを介在して幹細胞の付着を実験した結果である。（ａ）は、ＲＧＤ又は永久磁石を持たず幹細胞を培養して４８時間後の、ビンキュリン、Ｆ−アクチン、核に対する免疫蛍光の共焦点画像、（ｂ）は、付着細胞密度と細胞の面積を計算したグラフである。 本発明の一実施例によるマクロスケールナノリガンド提示の時間規制切り替え（ｔｉｍｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）に対する幹細胞の免疫蛍光の共焦点画像である。 本発明の一実施例によるマクロスケールナノリガンド提示の時間的切り替えに対する付着細胞密度、細胞の面積、焦点付着数を計算したグラフである。 本発明の一実施例によるナノリガンドのスライドの時空間の可逆変換に対する付着性細胞密度、細胞の面積、縦横比を計算したグラフである。 本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドのＩｎ ｓｉｔｕ磁気引力Ｉｎ ｓｉｔｕ ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ）の、幹細胞の機械感受性介在分化（ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｎｇ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）に対する免疫蛍光画像である。（ａ）は、磁石のある場合における、幹細胞でＦ−アクチン、核・ＡＬＰ発現を有するＲＵＮＸ２とＹＡＰに対する免疫蛍光、（ｂ）は、Ｆ−アクチンと核を有するＴＡＺ、インテグリンβ１、ＦＡＫ、ＲｈｏＡ、ＲＯＣＫ阻害下のＹＡＰ（Ｙ２７６３２）、磁気条件下の幹細胞からミオシンII阻害（ブレビスタチン）下のビンキュリンに対する免疫蛍光である。 比較例として、ＲＧＤリガンド及び永久磁石のない場合における、免疫蛍光の共焦点画像である。 本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドの磁気引力に対する幹細胞の機械的形質導入・分化実験の結果であって、幹細胞を培養した後、核と細胞質のＲＵＮＸ２蛍光比、アルカリホスファターゼ陽性細胞及び核と細胞質のＹＡＰ蛍光比を計算したグラフである。 本発明の一実施例によるナノリガンドのスライドのＩｎ ｓｉｔｕ時間的制御実験の免疫蛍光の共焦点画像、並びに、核と細胞質のＲＵＮＸ蛍光比を計算したグラフである。（ａ）は、永久磁石を基板の左下に位置させる（「ＯＮ」）、或いは基板から除去（「ＯＦＦ」）て、幹細胞の培養から７日後のＲＵＮＸ２、Ｆ−アクチン、核の免疫蛍光の共焦点画像、（ｂ）は、核と細胞質のＲＵＮＸ２蛍光比を計算したグラフである。 本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドの時間規制制御による機械形質導入に関する実験の結果である。（ａ）は、永久磁石を基板の左下に位置させる（「ＯＮ」）、或いは基板から除去（「ＯＦＦ」）て、培養２日後のＲＵＮＸ２、Ｆ−アクチン、核の免疫蛍光の共焦点画像である。「ＯＮ」・「ＯＦＦ」の条件を（ＹＡＰ）の培養２日間連続的に適用する、或いは培養１２時間後に切り替えた。幹細胞は、基板の「左側」の中心と「右側」の中心から撮像した。スケールバーは５０μｍを示す。（ｂ）は、核と細胞質のＹＡＰ蛍光比を計算したグラフである。データは、平均±標準誤差（ｎ＝３０）と表される。統計学的に有意な差は、異なるアルファベットで表示される。 本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドに対して基板の「左下」に位置する永久磁石で幹細胞を培養してから７日後、ＲＵＮＸ２とＡＬＰの遺伝子発現プロファイルである。 本発明の一実施例によるスライド可能なナノリガンドの磁気引力（ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ）に対する免疫蛍光画像から計算した結果を示したものである。（ａ）は、図１７ｂに示したＴＡＺに対する免疫蛍光の共焦点画像から得た、核と細胞質ＴＡＺとの蛍光比の定量である。（ｂ）は、Ｆ−アクチンと核を有するｐ−ＦＡＫに対する免疫蛍光の共焦点画像である。図４ｂに図示された（ｃ）ＲＯＣＫ阻害（Ｙ２７６３２を有する）の下、核と細胞質のＹＡＰ蛍光比と、（ｄ）ミオシンII阻害（ブレビスタチンを有する）の細胞面積を計算したグラフである。 本発明の一実施例に係るスライド可能なナノリガンドのスライドナノリガンド引力の磁気制御（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ）実験の結果である。（ａ）は、ナノリガンドの磁気制御の実験を図式化した画像、（ｂ）は、磁石と共に（「ＯＮ」）、或いは磁石無しに（「ＯＦＦ」）皮下移植後のスライド可能なリガンド提示基板に注入された幹細胞のアクチン及び核を持つ人間特異的ＨｕＮｕに対する免疫蛍光の結果である。（ｃ）は、体内に付着した細胞密度と面積の定量を示す。
以下、本発明をより具体的に説明するために、本発明による好ましい実施例を、添付の図面を参照しながらより詳しく説明する。ただし本発明は、本願で説明している実施例に限られず、他の形態で具体化されてもよい。
本発明による幹細胞の付着・分化のナノリガンドは、遠隔、時空間的、可逆的制御性を有する物質で、体内での細胞付着を調整するために、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）リモデリングを模倣することができる。ここで、当該ナノリガンドはアミン官能基化され、ポリエチレングリコールリンカーと、負に荷電されたＲＧＤリガンドと結合された、超常磁性ナノ物質を有するスライド可能なナノリガンドである。本発明による幹細胞の付着・分化を促進する方法は、可逆的なスライド性（ｓｌｉｄａｂｉｌｉｔｙ）を表すために、静電気的相互作用を最適化することにより、スライド可能なナノリガンドを量で荷電された基板に結合させた。そこで本発明は、スライド可能なナノリガンドを磁気的に引き付け、マクロスケールのナノリガンド密度を調整し、マクロスケールとＩｎ ｓｉｔｕナノスケールナノリガンドのスライドの撮像を可能としている。また、本発明は、スライド可能なナノリガンド引力のＩｎ ｓｉｔｕ磁気の制御により時空間的・可逆的な制御と、体外・体内条件下での幹細胞付着を容易にできる。更に本発明は、スライド可能なナノリガンドのＩｎ ｓｉｔｕ磁気の引力により、幹細胞の機械感受性を介在する（ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｎｇ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）分化を刺激する。これらの細胞外マトリックスを模倣する時空間・可逆的なナノリガンド変異の遠隔制御により、体内で様々な細胞の回復プロセスを調整することに優れた、幹細胞の付着・分化を促進する方法を提供する。
本発明は、磁性ナノ粒子を含むコアと、コアを包み込むように設けられ、インテグリン結合リガンドペプチドを含むコーティング層と、コアと前記コーティング層の間に備えられるリンカーと、を含み、インテグリン結合リガンドペプチドは、負に荷電されたことを特徴とする、幹細胞の細胞付着・分化促進用ナノリガンドを提供する。
図１は、本発明による幹細胞の細胞付着・分化促進用ナノリガンド、及びこれを用いた幹細胞の細胞付着・分化方法を示した模式図である。
図１から、本発明のナノリガンドは磁性ナノ粒子を含むコアと、とコア上に結合されてインテグリン結合リガンドペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）を含むコーティング層と、を含み、インテグリン結合リガンドペプチドは、負に荷電されたインテグリンペプチドであることがわかる。具体的には、コア上に結合されたインテグリン結合リガンドペプチドは、コアをミセル構造のように取り囲んでもよい。これにより、ナノリガンドの表面電荷は、負電荷を帯びることができる。
また、図３は、本発明による幹細胞の細胞付着・分化促進用ナノリガンドの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像であり、ナノリガンドのサイズを把握できる。具体的には、ナノリガンドは３０〜６０ｎｍの直径を有してもよい。ナノリガンドの直径が３０ｎｍ未満の場合、ナノリガンドの移動を制御しづらく、６０ｎｍを超えるの場合、幹細胞の付着効率が低下してしまう。より具体的には、当該ナノリガンドは、直径が３０〜５０ｎｍ、或いは３５〜４５ｎｍであってもよい。
磁性ナノ粒子は、磁性を帯びるナノ粒子であれば特に限定されない。例えば、ナノリガンドは５〜３０ｎｍの直径を有してもよい。磁性ナノ粒子の直径が５ｎｍ未満の場合、粒子の大きさが小さすぎて損失（ｌｏｓｓ）が多く、効率が低下してしまう。３０ｎｍを超える場合、ナノリガンドの直径が大きいため、幹細胞の付着効率が低下する問題が生じ得る。より具体的には、当該磁性ナノ粒子は、直径が５〜１５ｎｍ、或いは１０〜２０ｎｍであってもよい。上記のような磁性ナノ粒子を含むことにより、本発明のナノリガンドは、磁場を用いて、幹細胞の付着や分化を促進することができる。
また、磁性ナノ粒子は、シリカ表面に結合されていてもよい。具体的には、磁性ナノ粒子は、アミノ−シリカが表面に結合されていてもよい。シリカの種類は、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）と（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）のうちいずれか一つ以上であってもよい。
例えば、本発明のナノリガンドは、コアとコーティング層との間をリンカーで連結した構造であり、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系リンカーであってもよい。具体的には、ポリエチレングリコール系リンカーは、マレイミド−ポリエチレングリコール−ＮＨＳエステル（Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ）であってもよい。上記のようなリンカーを含むことで、コアとコーティング層との結合力を高め、ナノリガンドの耐久性を向上させることができる。
当該コーティング層は、コア、又はコアに結合されたリンカーに結合されてもよく、コアを取り囲んでもよい。具体的には、コーティング層は、インテグリン結合リガンドペプチド（ＲＧＤ）を含み、当該インテグリン結合リガンドペプチドは、負に荷電されてもよく、負に荷電されたチオール化インテグリン結合リガンドペプチドを含んでもよい。上記のように負に荷電されたインテグリン結合リガンドペプチドを含むことで、本発明のナノリガンドの表面は負に荷電され、これにより、基板との静電結合によって基板上での移動が自由となる。これらの特徴により、当該ナノリガンドは、「スライド可能なナノリガンド」とも呼ばれ、基板上でのナノリガンドのスライドを介して幹細胞の付着と分化を促進させることができる。
更に本発明は、磁性ナノ粒子を含むコアを用意するステップと、
コアをリンカーを含む第１の懸濁液と混合してリンカーが結合されたコアを製造するステップと、
リンカーが結合されたコアをインテグリン結合リガンドペプチド（ＲＧＤ）を含む第２の懸濁液と混合するステップと、を含む、上述の幹細胞の細胞付着・分化促進用ナノリガンドの製造方法を提供する。
当該コアを用意するステップでは、磁性ナノ粒子をシラン溶液と撹拌してシランがコーティングされたコアを形成してもよい。具体的には、コアを用意するステップは、磁性ナノ粒子をアミノ−シラン溶液と撹拌してアミノ−シランがコーティングされたコアを形成してもよい。シラン溶液に含まれているシランの種類は、シリカの種類は、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）と（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）のうちいずれか一つ以上であってもよい。
具体的には、リンカーが結合されたコアを製造するステップは、当該コアと、リンカーを含む懸濁液を、暗条件下で１０時間〜２０時間、或いは１０時間〜１５時間攪拌して行ってもよい。これにより、リンカーが結合されたコアが得られる。このとき、永久磁石を用いながら溶媒で２回以上洗浄し、リンカーが結合されたコアを得てもよい。当該溶媒は、ジメチルホルムアルデヒド（ＤＭＦ）やジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のいずれか１つ以上を含んでもよい。
当該リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系リンカーであってもよい。具体的には、ポリエチレングリコール系リンカーは、マレイミド−ポリエチレングリコール−ＮＨＳエステル（Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ）であってもよい。上記のようなリンカーをコアに結合させることで、コアとコーティング層との結合力を高め、ナノリガンドの耐久性を向上させることができる。
更に、第２の懸濁液と混合するステップは、リンカーと結合されたコアをインテグリン結合リガンドペプチド（ＲＧＤ）を含む懸濁液に暗条件下で１０時間〜２０時間、或いは１０時間〜１５時間撹拌することで行ってもよい。この時、永久磁石を用いながら溶媒で洗浄し、負に荷電されたインテグリン結合リガンドペプチドが結合された磁性ナノ粒子（ナノリガンド）を得ることができる。当該溶媒は、ジメチルホルムアルデヒド（ＤＭＦ）やジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のいずれか１つ以上を含んでもよい。
ここで、インテグリン結合リガンドペプチドと攪拌するプロセスにより、コア上にコーティング層を形成してもよい。具体的には、上記のインテグリン結合リガンドペプチドは、負に荷電されていてもよく、負に荷電されたチオール化インテグリン結合リガンドペプチドであってもよい。上記のように負に荷電されたインテグリン結合リガンドペプチドでコア上にコーティング層を形成することで、本発明のナノリガンドの表面は負に荷電され、これにより、基板との静電結合によって基板上での移動が自由となる。これらの特徴により、当該ナノリガンドは、「スライド可能なナノリガンド」とも呼ばれ、基板上でのナノリガンドのスライドを介して幹細胞の付着と分化を促進させることができる。
更に、本発明は、上述した幹細胞の付着・分化促進用ナノリガンドを含む溶液に、表面が活性化された基板を担持して、ナノリガンド提示基板を製造するステップと、ナノリガンド提示基板を培養液で処理した後、外部の磁場を印加し、幹細胞の付着・分化を調整するステップと、を含む、幹細胞の付着・分化を促進する方法を提供する。
図１及び図２は、本発明の一実施例による幹細胞の付着・分化方法を図式化した図である。図１及び図２に図示されているように、正に荷電された基板上に表面が負に荷電されたナノリガンドを静電結合し、磁場を印加することで、磁場が印加される部分において幹細胞の付着や分化を促進、或いは活性化することができる。具体的には、基板とナノリガンドが静電結合によって結合されているため、磁場が印加されている位置に応じてナノリガンドが移動（スライド）し、これにより、磁場が印加される部分においてナノリガンドの密度を調整して、所望の部位に幹細胞の付着や分化を促進させることができるという利点がある。
具体的には、ナノリガンド提示基板を製造するステップは、基板の表面を酸性溶液に浸漬させるステップと、浸漬済みの基板をアミノシラン溶液に担持して基板の表面を活性化させるステップと、活性化された基板に対して室温で超音波を以って処理を施すステップと、を含んでもよい。当該基板の表面を酸性溶液に浸漬させるステップでは、塩酸と硫酸のうちいずれか１つ以上を含む酸性溶液に３０分〜２時間、或いは３０分〜１時間浸漬させてもよい。これにより、当該基板の表面に水酸化基を結合させ、アミノ基との結合が容易になるよう、基板の表面活性化を効果的に行うことができる。
当該基板の表面を活性化させるステップは、暗条件下で、アミノシラン溶液に基板を担持し、基板の表面を活性化させてもよい。アミノシラン溶液は、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を含んでもよい。このとき、基板の表面を活性化させるということは、基板の表面を正に帯電させるということであり、具体的には、基板上にアミン基を結合させて活性化させることができる。上記のようにアミノ−シラン溶液に浸漬して、基板の表面を活性化させ、基板の表面を正に帯電させると、当該基板は、ナノリガンドと静電気の引力により結合することができる。
また、超音波を以って処理を施すステップでは、ナノリガンドを含む溶液に表面が活性化された基板を担持して、ナノリガンド提示基板を製造してもよい。具体的には、ナノリガンドを含む溶液に、表面が活性化された基板を精製水の中に入れて超音波処理を施し、室温で３０分〜２時間、或いは３０分〜１時間、担持して行った。
幹細胞の付着・分化を調整するステップは、体内及び体外にナノリガンド提示基板を位置させた後、１００〜７００ｍＴの磁場を１２時間〜４８時間印加して行ってもよい。具体的には、幹細胞の付着・分化を調整するステップは、体内及び体外にナノリガンド提示基板を位置させた後、１００〜６００ｍＴ、２００〜６００ｍＴ、或いは３００〜５５０ｍＴの磁場を１２時間〜３６時間、２４時間〜２６時間、或いは１２時間〜２４時間、印加して行ってもよい。上記のように、ナノリガンド提示基板に磁場を印加することにより、基板上に位置するナノリガンドに幹細胞の付着を促進させ、付着した幹細胞の分化を促進させてもよい。
また、幹細胞の付着・分化を調整するステップは、基板に印加される磁場の位置を変えて行ってもよい。具体的には、１００〜６００ｍＴ、２００〜６００ｍＴ、或いは３００〜５５０ｍＴの磁場を印加しながら、基板に印加される磁場の位置を変え、幹細胞の付着や分化を空間的に制御してもよい。例えば、基板の一部分に磁場を印加して基板上のナノリガンドの密度を調整し、基板上の所望の部分だけ幹細胞の付着や分化を促進させてもよい。
また、幹細胞の付着・分化を調整するステップは、基板の下端に印加される磁場の位置を変えて行ってもよい。具体的には、１００〜６００ｍＴ、２００〜６００ｍＴ、或いは３００〜５５０ｍＴの磁場を印加しながら基板に印加される磁場の位置を時間に応じて変え、幹細胞の付着や分化を時間的且つ空間的に制御してもよい。より具体的には、基板の各部分ごとに磁場を個別的に印加して基板上に位置するナノリガンドの密度を時間に応じて調整し、基板上の各部分の幹細胞の付着や分化の促進の程度を調整してもよい。例えば、基板の左側には、１２時間〜２４時間磁場を印加し、基板の右側には、２４時間〜３６時間磁場を印加した場合には、基板の左側と右側にて付着又は分化した幹細胞の量が異なり得る。
以下、本発明の実施例を説明する。しかしながら下記の実施例は本発明の好ましい一実施例に過ぎず、本発明の請求の範囲が下記の実施例に限られる訳ではない。
［製造例］
製造例１
スライド可能なナノリガンド（ｓｌｉｄａｂｌｅ ｎａｎｏ−ｌｉｇａｎｄ）の製造
１）磁性コアの製造（ＭＮＰ）
スライド可能なナノリガンドのＩｎ ｓｉｔｕ可逆的制御のために、スライド可能なナノリガンドの磁性コアを下記のように製造した。エタノール約８０ｍＬ、脱イオン水（ＤＩ）６０ ｍＬ、ヘプタン１４０ ｍＬをまず混合した。当該混合物に、不活性環境下で３６．５ ｇ（１２０ｍｍｏｌ）のオレイン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｏｌｅａｔｅ）と１０．８ｇ（４０ｍｍｏｌ）の塩化鉄（III）六水和物（ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ）を７０℃で４時間に渡って添加した。完全に混合した後、オレイン酸鉄（ｉｒｏｎ−ｏｌｅａｔｅ）を含有するヘプタン層を別々に採取した。脱イオン水で洗浄した後、ヘプタンを蒸発させた。約５．７ｇ（２０ｍｍｏｌ）のオレイン酸と２００ｇの１−オクタデセンを混合し、乾燥したオレイン酸鉄３６ｇ（４０ｍｍｏｌ）を添加した。この混合溶液を、約５分間１００℃、その後、約３０分間３２０℃で維持した。反応後の、混合物溶液は、室温に冷却させ、永久磁石を用いて採取したものをエタノールで３回洗浄した後、磁性コアを保存するためにヘプタンに分散させた。
２）磁気コアのアミノ−シリカの機能化（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）（アミノ − シリカコーティングＭＮＰ）
ヘプタンから約３０ｍｇの磁性コアナノ粒子を２５ｍＬのシクロヘキサンに分散させ、５ｍＬのトリトン−Ｘ（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）、５ｍＬの１−ヘキサノール、０．５ｍＬのＮＨ４ＯＨ、１ｍＬの脱イオン水を順次添加した。当該混合溶液を３０分間攪拌してエマルジョンを安定化させた。このエマルジョンに、１２．５μＬのテトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）をゆっくりと添加し、１０分間攪拌した。その後、６．２５ｍＬの（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）をエマルジョンに添加し、１６時間攪拌した。反応の後、２５ｍＬのアセトンを、当該エマルジョンに迅速に添加し、永久磁石を用いて、アセトンとジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄し、ナノ粒子を採取した。アミノ−シリカコーティングＭＮＰを１ｍＬのＤＭＦに分散させた。
３）スライド可能なナノリガンドの製造
スライド可能なナノリガンドのナノアセンブリを完成するために、アミノ−シリカコーティングＭＮＰをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーと順次グラフトしてナノリガンドのスライド性を向上させ、負に荷電されたＲＧＤリガンドでグラフトした。ＰＥＧリンカーはまた、細胞の吸収を防止する役割を果たす。１ｍＬのＤＭＦでアミノ−シリカコーティングＭＮＰ約２０ｍｇは５ｍｇのマレイミド−ポリ（エチレングリコール）−ＮＨＳエステル（Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ；Ｍｎ＝５０００ Ｄａ、Ｂｉｏｃｈｅｍｐｅｇ）に添加し、更に２μＬのＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を添加した。当該懸濁液を、暗条件下で１６時間攪拌した後、永久磁石を用いてＤＭＦとジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で洗浄した（それぞれ３回ずつ）。１ｍＬのＤＭＳＯでアミノ−シリカコーティングＰＥＧ化ＭＮＰを負に荷電されたチオール化ＲＧＤペプチド（ＣＤＤＲＧＤ、ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ）０．５ｍｇに添加し、０．２％ＤＩＰＥＡと１０ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（Ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＴＣＥＰ）を続いて添加した。当該混合溶液を、暗条件下で１６時間攪拌し、永久磁石を用いて採取し、水と３回ＤＭＳＯで洗浄した後、基板に静電結合する前にＤＭＳＯに維持させた。
比較製造例１
負に帯電されたチオール化ＲＧＤペプチド（ＣＤＤＲＧＤ、ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ）を添加していないことを除いて、製造例１と同様の方法で「Ｎｏ ＲＧＤ」ナノリガンドを製造した。
［実施例］
実施例１
スライド可能なナノリガンド、並びに当該ナノリガンドと基板との組み合わせ
上記の製造例で製造したスライド可能なナノリガンドを基板に可逆的に結合させるために、培養グレードガラスカバースリップ（ｃｕｌｔｕｒｅ−ｇｒａｄｅ ｇｌａｓｓ ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｓ、２２ｍｍ×２２ｍｍ）を使用した。負に荷電されたスライド可能なナノリガンドを結合する前に、ガラス基板を正電荷を帯びるようにアミノ化した。基板を塩酸とメタノールの１：１混合物に３０分間浸漬させ、任意の有機汚染物を除去した後、脱イオン水で３回洗浄した。当該基板を硫酸に１時間浸漬させて表面に水酸化基を活性化させ、脱イオン水で３回洗浄した。活性化された基板は、暗条件下でＡＰＴＥＳとエタノールの１：１混合物で１時間処理して、基板を官能基化し、アミン基を提供した。アミノ官能基化が施された基板をエタノールで３回洗浄し、１００℃で１時間乾燥させた。ＤＭＳＯにスライド可能なナノリガンドの懸濁液をＤＭＳＯで１：２０に希釈した後、これを正に荷電されたアミノ官能基化基板に添加した。スライド可能なナノリガンドに超音波処理を施し、室温で１時間、基板に静電的に結合させた後、ＤＭＳＯで３回洗浄し、脱イオン水で３回洗浄してスライド可能なナノリガンドを有する基板を得た。
［実験例］
実験例１
本発明によるスライド可能なナノリガンドの形態を確認するため、スライド可能なナノリガンドを対象に透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、動的光散乱・高角散乱環状暗視野走査透過型電子顕微鏡（ＨＡＡＤＦ−ＳＴＥＭ）分析を行い、その結果図３及び図４に示した。
また、スライド可能なナノリガンドの性質及び化学的結合特性を確認するため、スライド可能なナノリガンドを対象に振動サンプル磁力測定とフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）を行い、その結果を図５及び図６に示すた。
具体的には、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）実験は、スライド可能なナノリガンドのサイズや形の特性を確認するため、Ｔｅｃｎａｉ ２０（ＦＥＩ、ＵＳＡ）を用いて、ＴＥＭ撮像を行った。
また、高角散乱環状暗視野走査透過型電子顕微鏡（ＨＡＡＤＦ−ＳＴＥＭ）は、代表的なスライド可能なナノリガンドのサイズや形状の特性を確認するためのもので、ＨＡＡＤＦ−ＳＴＥＭ撮像は１ｎｍのプローブサイズ、２０μｍコンデンサ開口（ｃｏｎｄｅｎｓｅｒ ａｐｅｒｔｕｒｅ）、Ｚ比のための８０−１５０ｍｒａｄ収集角度を有するＪＥＯＬ２１００Ｆを使用して行われた。
更に、動的光散乱（ＤＬＳ）分析は、スライドナノリガンドの組立工程でサイズ分布プロファイル（流体力学的直径、ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｄｉａｍｅｔｅｒ）を定量するために、ＤＬＳ測定（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ９０ Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を行った。
また、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）は、スライド可能なナノリガンドの変形から連続する化学的変化の特性を確認するため、ＧＸ１（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、ＵＳＡ）を用いて行われた。化学的結合特性の変化の分析を経たサンプルを分析する前に、凍結乾燥させ、ＫＢｒペレットで密度高くパッキングした。
振動サンプル磁気測定（Ｖｉｂｒａｔｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ ｍａｇｎｅｔｏｍｅｔｒｙ、ＶＳＭ）は、ナノリガンドの可逆的スライド性（超常磁性）の特性を確認するために、スライド可能なナノリガンドの磁性コアは、印加された磁場の下、室温でＶＳＭ測定（ＥＶ９；Ｍｉｃｒｏｓｅｎｓｅ）に適用された。対応する磁気モーメント（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｍｏｍｅｎｔ）は、スライド可能なナノリガンドで磁性コアに乾燥重量に正規化した後、ヒステリシスループ（ｈｙｔｅｒｅｓｉｓ ｌｏｏｐ）に表示された。
図３は、スライド可能なナノリガンドのナノスケール画像であって、透過型電子顕微鏡画像でもあり、スケールバーは２０ｎｍである。図４の（ａ）は、サイズ分布を有する磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）とアミノ−シリカコーティングＭＮＰの動的光散乱の結果であり、（ｂ）は、アミノ−シリカコーティングＭＮＰの高角散乱環状暗視野走査透過型電子顕微鏡（ＨＡＡＤＦ−ＳＴＥＭ）画像で、スケールバーは２０ｎｍである。
図３及び図４から、約４０±５ｎｍのスライド可能なナノリガンドの均一な球状の形状が確認できる。
図５は、スライド可能なナノリガンドの振動サンプル磁力計ヒステリシスであり、図６は、一実施例のスライド可能なナノリガンドのフーリエ変換赤外スペクトル画像である。具体的には、ＭＮＰ、シリカコーティングＭＮＰ、ＲＧＤリガンド提示ＰＥＧグラフトシリカ被覆ＭＮＰ（ＲＧＤ−ＰＥＧ−シリカコーティングＭＮＰ、スライド可能なナノリガンドに相当）のフーリエ変換赤外スペクトル画像である。
図５で、２０ｅｍｕ／ｇのＭｓで超常磁性を確認した。これにより、本発明によるスライド可能なナノリガンドは、超常磁性特性を以って可逆的スライドが可能である。この特性は、時間的且つ可逆的にナノリガンドのスライドの磁気操作に非常に重要である。
図６を見ると、Ｆｅ−Ｏ結合は、超常磁性酸化鉄コアナノ粒子にて６９９ｃｍ−１の吸収ピーク値で検出された。Ｓｉ−Ｏ結合は、シリカシェルから１１６８ｃｍ−１の吸収ピーク値で検出された。スライド可能なナノリガンドでは、ＰＥＧリンカー（Ｍｎ＝５０００Ｄａ）は、先行技術で証明されているように、スライド特性を向上させるに留まらず、細胞による吸収を抑制し、ＣＤＤＲＧＤは１１５２ｃｍ−１の吸収ピークでＣ＝Ｏ結合を、１６３５ｃｍ−１の吸収ピークでアミド（ａｍｉｄｅ）結合を表した。このようなＴＩＲ分析から、スライド可能なナノリガンドの組み立てが成功的であることが確認された。
実験例２
本発明によるスライド可能なナノリガンドのＩｎ ｓｉｔｕ可逆的・時空間的制御を実証するために、スライド可能なナノリガンドを対象に走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮影し、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）イメージングを行い、その結果を図８及び図９に示した。
具体的には、図７に図示されているように、本発明は、静電的にマクロスケールのナノリガンドの提示を制御するために、ナノリガンドのスライドのＩｎ ｓｉｔｕ時空間的制御のための正に荷電された基板にスライド可能なリガンドを結合させた。ナノリガンドと基板との静電結合によりナノリガンドが可逆的なスライドできるようにした。
ここで、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）は、スライド可能なナノリガンドの基板との静電結合と、マクロスケールのナノリガンド提示のＩｎ ｓｉｔｕ可逆的・時空間的制御の特徴を確認するために、ＳＥＭ撮像（ＦＥ−ＳＥＭ、ＦＥＩ、Ｑｕａｎｔａ２５０ＦＥＧ）を行った。スパッタコータ（ｓｐｕｔｔｅｒ ｃｏａｔｅｒ）を用いて基板を乾燥させ、白金コーティングを施した。基板と結合されたスライド可能ナノリガンドの密度は、十の画像からＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアによって計算され、平均±標準誤差で図示された。マクロスケールのリガンド密度のＩｎ ｓｉｔｕ可逆的・時空間的制御のために、永久磁石（２７０ｍＴ）を１２時間は基板の左下に位置させ、１２時間は右下に位置させた後、左下に位置させた。マクロスケールのリガンド密度で時空間的変化を測定し、その結果を図８に示した。
また、Ｉｎ ｓｉｔｕ磁気原子間力顕微鏡（Ｉｎ ｓｉｔｕ ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＡＦＭ）は、基板上にスライド可能なナノリガンドのＩｎ ｓｉｔｕ２Ｄ・３Ｄ画像の特徴を確認するため、ＡＦＭ撮像（Ａｓｙｌｕｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＸＥ−１００Ｓｙｓｔｅｍ）が行われた。当該撮像は、５−３Ｎ／ｍのばね定数（ｓｐｒｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔ）と９６〜１７５ ｋＨｚの共振周波数（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を有するＡＦＭカンチレバー（ｃａｎｔｉｌｅｖｅｒ）（Ｎａｎｏｓｅｎｓｏｒｓ、ＳＳＳ−ＳＥＩＨＲ−２０）を用いて、２５℃にて空気モードのＡＣで行った。ＡＦＭ撮像は、スライド可能なナノリガンドのナノスケールのＩｎ ｓｉｔｕ運動（ｍｏｔｉｏｎ）を特定するために走査領域の反対側で磁石の存在又は不在下で、走査領域は同じとして連続的に行った。比較例の実験として、継続的に磁石がない状態で同じ走査領域での連続的なＡＦＭ撮像は、連続的なＡＦＭ走査によってスライド可能ナノリガンドの無視できるナノスケールの動きを特定するために行われており、その結果は図８及び図９に示した。
図８は、マクロスケールとナノスケールのナノリガンドのスライドのＩｎ ｓｉｔｕ可逆的時空間操作（Ｉｎ ｓｉｔｕ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）の画像である。図８ａ〜ｂによると、正に荷電されたアミノ官能基化基板は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）と３Ｄ原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によって証明されるように、負に荷電されたスライド可能なナノリガンドと最適に均一的に結合されている。また、マクロ的にナノリガンドの密度はμｍ２ 当たり約１７±３ナノリガンド粒子であると計算された。本発明は、スライド可能なナノリガンドの凝集が生じることなく、ナノリガンドのスライドのＩｎ ｓｉｔｕ時空間的制御に最適であるため、マクロスケールのリガンド密度を適用し、従ってナノリガンドの可逆的な運動を可能にして幹細胞の焦点付着と機械的形質導入を著しく変化させた。
図８ｃ〜ｄは時空間的制御実験のＳＥＭ撮像の結果であり、永久磁石を基板の左下に位置させてスライド可能なナノリガンドを左に引き付けた後、右側に切り替え、それぞれ１２時間ごとに左側に戻した。低速度ＳＥＭ撮像（Ｔｉｍｅ−ｌａｐｓｅ ＳＥＭ ｉｍａｇｉｎｇ）は、それぞれ１２時間、２４時間、３６時間の時点で、左側、右側、左側では相当高いナノリガンド粒子密度を表し、これによってナノリガンドのスライドの時空間的可逆性を完全に確認することができた。
図８ｅは時空間的制御実験の比較例として、スキャン領域の反対側で磁石が存在、又は不在する同様の領域で連続のＩｎ ｓｉｔｕ磁気ＡＦＭスキャンによるナノリガンドのスライドのナノスケールの変位を図示した。図８ｅによると、スライド可能なナノリガンドは、磁石のない場合に明確に確認されており、磁石に沿って移動されている。
図９は、比較例の実験であって、同一のスキャンにおいて磁石の不在下で撮影した、ナノリガンドのスライドのＩｎ ｓｉｔｕ原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像である。図９によると、二つの異なる画像でスライド可能なナノリガンドに沿って黒い点線が描かれる。スケールバーは５０μｍであった。磁石がない場合、同じスキャン領域で連続ＡＦＭ撮像により、スライド可能なナノリガンドのナノスケールの動きが確認されたが、無視できるほどであった。
実験例３
本発明によるスライド可能なナノリガンドを用いた遠隔制御方法は、マクロスケールのナノリガンド提示の時空間的な可逆的調整による、幹細胞の付着の調整に及ぼす影響を確認するために、ナノリガンドのスライドのＩｎ ｓｉｔｕ制御がインテグリン
Figure 2021137004
結紮と人間の中葉幹細胞（ｈＭＳＣｓ）の焦点付着を調整できるか否かを調べた。
スライド可能なナノリガンドのインテグリンβ１の結合実験を、次のように行った。インテグリンβ１とのＩｎ ｓｉｔｕスライドナノリガンドの結合効率を評価するために、スライドナノリガンド提示基板は、基板の「左下」に位置づけられた永久磁石で１２時間、４℃にてリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）における５０μｇ／ｍＬのインテグリンβ１で培養した。培養された基板は、１０分間室温にて４％（ｗ ／ ｖ）パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定し、スライドナノリガンドに結合されたインテグリンβ１を検査するためにインテグリンβ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）について免疫蛍光的で染色し、その結果を図１０に示した。
また、ナノリガンドのスライドのＩｎ ｓｉｔｕ制御の下、幹細胞の付着や分化のインビトロ調整実験は、以下のように行った。幹細胞の付着に対してナノリガンドのスライドＩｎ ｓｉｔｕの影響を調査するために、本発明のスライド可能なナノリガンドを含む基板は、ＵＶ光で滅菌し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で３７℃にて１時間ブロックして、非特異的細胞付着を最小限に抑えた。人間の中葉幹細胞（ｈＭＳＣｓ、ｐａｓｓａｇｅ５、Ｌｏｎｚａ）を５０００ｃｅｌｌ／ｃｍ２の密度で処理された基板上に位置させ、３７℃および５％ＣＯ２で高濃度のグルコースＤＭＥＭ、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、および５０Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを含有基礎培地で培養した。幹細胞の付着は、基板の「左下」に位置する永久磁石（２７０ｍＴ）で調査され、左側に向かうナノリガンドのスライドを促進させた。付着した幹細胞を基板の様々な（左側、中央、右側）の中心から撮像し、その結果を図１１及び図１２に示した。
図１０は、スライドナノリガンドのＩｎ ｓｉｔｕ制御におけるインテグリンβ１（ｉｎｔｅｇｒｉｎβ１）結合の調整に関する。（ａ）は基板の「左下」に永久磁石があるスライドナノリガンドの概略図、（ｂ）は基板の「左側」、「中間」、「右側」でスライドナノリガンドに結合されたインテグリンβ１クラスタに対する免疫蛍光の共焦点画像である。スケールバーは５０μｍで、免疫蛍光の共焦点画像は赤色の矢印で示される。（ｃ）は基板の「左側」、「中央」、「右側」でインテグリンβ１クラスタの染色強度を示したグラフでである。データは、平均±標準誤差（ｎ＝３０）と表される。統計的に有意な差がある比較群は、他のアルファベット文字で記載した。
図１１は、本発明の一実施例によるナノリガンドのスライドのＩｎ ｓｉｔｕ制御実験結果を示した画像で、スライド可能なナノリガンドの時空間可逆的引力（ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ）は、幹細胞の付着を促進することが分かる。磁石の静的位置（ａ）と切り替え位置（ｂ）からの幹細胞のビンキュリン、Ｆ−アクチン、核の免疫蛍光画像である。スケールバーは５０μｍである。
図１２は、基板の「左下」に位置する永久磁石と共にｈＭＳＣを培養して４８時間後、付着細胞の密度、面積、焦点付着数、縦横比を計算されたグラフであって、スライドナノリガンドの引力によってマクロスケールのリガンド提示のＩｎ ｓｉｔｕ操作（ｉｎ ｓｉｔｕ ｍａｎｅｕｖｅｒｉｎｇ）は、幹細胞の焦点付着を促進することが分かる。図３ａに図示されている免疫蛍光の共焦点画像に基づいて計算を行った。データは平均±標準誤差（ｎ＝３０）と表される。統計的に有意な差がある比較群には、他のアルファベット文字が割り当てられた。
図１１ａ〜ｃ、図１１ａ、図１２によると、スライド可能なナノリガンドの磁気引力により、免疫蛍光染色は、左側（磁石）のＦＡ複合体でビンキュリン（ｖｉｎｃｕｌｉｎ）が明確に発現するほか、非常に高いインテグリンβ１の結紮効能、高密度を有する幹細胞付着、より広い焦点付着（ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ）が現れた。
また、比較実験として比較製造例１のナノリガンドを磁場が存在する基板で実験し（「Ｎｏ ＲＧＤ」群）の製造例１のナノリガンドを磁場がない基板で実験し（「Ｎｏ ｍａｇｎｅｔ」グループ）は、その結果を図１３に示した。
図１３は、比較例として、ＲＧＤリガンドや永久磁石がない状態でスライド可能なナノリガンドを介在して幹細胞の付着を実験した結果である。（ａ）は、ＲＧＤ又は永久磁石を持たず幹細胞を培養して４８時間後の、ビンキュリン、Ｆ−アクチン、核に対する免疫蛍光の共焦点画像である。幹細胞は、基板の「左側」、「中央」、「右側」の中心から撮像した。スケールバーは５０μｍであった。（ｂ）は、付着細胞密度と細胞の面積を計算したグラフ、データは平均±標準誤差（ｎ＝３０）と表される。同じアルファベットは比較された群との非統計的差を示す。
図１３によると、幹細胞付着のナノリガンドスライドを介在する調整の提示は、「Ｎｏ ＲＧＤ」群と「Ｎｏ ｍａｇｎｅｔ」群に対して有効でないが、「Ｎｏ ＲＧＤ」群は、効率的なブロックによって幹細胞の最小非ＲＧＤ特異的付着性を示す。これにより、スライド可能なナノリガンド介在性幹細胞付着のＩｎ ｓｉｔｕ制御には、ＲＧＤリガンドと磁場（永久磁石）が必要であることがわかる。
また、本発明によるスライド可能なナノリガンドがナノリガンドのスライドの時間規制切り替えにより幹細胞の付着を調整することができるか否かを調べた。
幹細胞の付着に対するマクロスケールのナノリガンド提示の時間規制切り替え効果は、「ＯＮ」と「ＯＦＦ」の切り替えにより永久磁石を基板の左側の下に位置づける（「ＯＮ」）、或いは、基板から永久磁石を除去する（「ＯＦＦ」）ことにより、確認した。幹細胞の付着に対するナノリガンドのスライドの時空間可逆的調整の効果は、基板の「左下」から「右側」へ、続いて「左側」に、永久磁石の位置が２つの反対側に切り替えて確認した。
図１４は、一実施例によるマクロスケールナノリガンド提示の時間規制切り替え（ｔｉｍｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）に対する幹細胞の免疫蛍光の共焦点画像である。具体的には、左側（磁石側）と右側（磁石ではない側）である場合、基板の左下に位置づけられた（「ＯＮ」）、或いは、基板から除去された（「ＯＦＦ」）永久磁石で培養した幹細胞の２時間又は４８時間後の、ビンキュリン、Ｆ−アクチン、核の免疫蛍光の共焦点画像である。「ＯＮ」・「ＯＦＦ」の条件を培養後４８時間連続して適用する、或いは培養１２時間後に切り替えた。上記の画像は、基板の左側の中央から得られた。スケールバーは５０μｍであった。これにより、本発明のスライド可能なナノリガンドは、マクロスケールの時間規制切り替え（ｔｉｍｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）により幹細胞の付着力を調整することが分かる。
図１５は、一実施例によるマクロスケールナノリガンド提示の時間的切り替えに対する付着細胞密度、細胞の面積、焦点付着数を計算したグラフである。具体的には、永久磁石を基板の左下に置く（「ＯＮ」）、或いは、基板から除去し（「ＯＦＦ」）、１２時間又は４８時間培養幹細胞の後、基板の左側にある付着細胞の密度、細胞の面積、焦点付着数を計算した。「ＯＮ」・「ＯＦＦ」の条件を培養後４８時間連続して適用する、或いは培養１２時間後に切り替えた。図１４に図示されている左側（磁石側）と右側（磁石ではない側）に対する免疫蛍光の共焦点画像に基づいて計算し、データは平均±標準誤差（ｎ＝３０）と表される。統計的に有意な差がある比較群には、他のアルファベット文字が割り当てられた。
図１４及び図１５を見ると、永久磁石を基板の左下に置くか（「ＯＮ」）、或いは４８時間、基板の近くに置かなかった（「ＯＦＦ」）。また、磁石を先に配置し、１２時間後に磁石を除去し（「ＯＮ−ＯＦＦ」）、或いは、最初は磁石を配置せず、１２時間後に磁石を配置した（「ＯＦＦ−ＯＮ」）。その結果、基板の左側（磁石側）で、幹細胞の付着は、「ＯＮ」の条件の下で著しく現れた。驚くべきことに、１２時間後に磁石を置いたとき、付着細胞密度が６６％、細胞面積が５１％、焦点付着数が５９％と大幅に増加し、幹細胞の付着は、４８時間（「ＯＦＦ−ＯＮ」）で急激に向上した。これは、ナノリガンドが、選択された時点で、磁石に引き寄せられ得ることを示唆する。また、１２時間後に磁石が除去されたとき、幹細胞の付着は、４８時間に更に増加することなくそのまま維持された（「ＯＮ−ＯＦＦ」）。これは、磁石側に引き寄せられたナノリガンドが基板と同じ側に残り得ることを示唆する。
更に、本発明につき、幹細胞の付着を調整するために、ナノリガンドのスライドの時空間的・可逆的な調整を調べた。図８ｃ〜ｄからも分かるように、１２時間ごとに磁石の位置を変えて、それぞれ１２時間、２４時間、３６時間の時点で左側、右側、左側でより高い細胞付着を観察した。
図１６は、一実施例によるナノリガンドのスライドの時空間の可逆変換に対する付着性細胞密度、細胞の面積、縦横比を計算したグラフである。図１１ｂに示された基板の「左側及び右側」で１２時間、２４時間、３６時間の幹細胞培養後、ビンキュリン、Ｆ−アクチン、核の免疫蛍光の経時共焦点画像を用いて、基板の「左側」と「右側」における付着性細胞の密度、面積、縦横比を計算した。永久磁石の位置は、基板の「左下」、「右下」、「左下」で、それぞれ１２時間３回に渡って２つの反対側の間で切り替えられ、データは平均±標準誤差（ｎ＝３０）と表される。従って、ナノリガンドのスライドの時空間可逆的切り替えにより、幹細胞の付着を制御できることが分かる。
図１１ｂ及び図１６によると、ナノリガンドのスライドの時空間可逆的切り替えは、幹細胞の付着を制御するもので、図１１ｂに図示されているように、基板の「左側」及び「右側」で幹細胞を１２時間、２４時間、３６時間培養した後、ビンキュリン、Ｆ−アクチン、核の免疫蛍光の経時共焦点画像を用いて、基板の「左側」及び「右側」にて付着性細胞の密度、面積、縦横比を計算する。永久磁石の位置は、基板の「左下」、「右下」、「左下」で、それぞれ３時間〜１２時間に渡って２つの反対側の間で切り替えられた。これにより、本発明によるスライド可能なナノリガンドをスライドすることにより、細胞付着の時空間可逆性を実証し、細胞付着の組織浸透性・磁場介在性時空可逆的制御は、光を用いて体内適用に対するに非常に有望な戦略を提示することができる。
実験例４
本発明によるスライド可能なナノリガンドにつき、Ｉｎ ｓｉｔｕ時間的制御による機械感受性介在の幹細胞の分化の変化を確認するために、下記のような実験を行った。
インテグリン結紮介在付着・成熟ＦＡの形成を有する幹細胞の増殖は、幹細胞の分化を促進することができる機械感受性信号を活性化させる。そこで、本発明は、機械感受性介在分化のモデルとして幹細胞の骨形成分化を調べた。幹細胞の分化の遠隔制御は、組織再生法の体内の適用における利点を提供する。
幹細胞の機械的形質導入介在分化は、ＲＯＣＫ阻害（５０μＭのＹ２７６３２）、又は、ミオシンＩＩ阻害（１０μＭのブレビスタチン）の下で、基板の「左下」に永久磁石を配置することにより調査した。磁石を適用せずＲＧＤリガンド、又はナノリガンドのないナノ粒子を有する基板は、幹細胞の付着に対する磁気（ｍａｇｎｅｔｉｃａｌｌｙ）制御を受けたナノリガンドのスライドの効果を追加で確認するために用いられた。ナノリガンドのスライドの下で付着幹細胞の分化は、骨形成誘導培地培養で行った（１０ｍＭβ−グリセロリン酸（β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、５０μＭアスコルビン酸−２−リン酸塩（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ−２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、１００ｎＭテクサメタ手（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）を充填した基本的な成長培地）。
また、ナノリガンドのスライドのＩｎ ｓｉｔｕ制御の下で幹細胞分化の分析を目的とするアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）染色 ベースの分析は、以下のように行われた。骨形成分化培地で培養した後、幹細胞をＰＢＳで洗浄し、癌条件の下、室温で３０分間ＢＣＩＰ／ＮＢＴ液体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理し、その後、ＰＢＳで洗浄した。上記のように処理された幹細胞を４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、光学顕微鏡を用いて可視化した。上記のＡＬＰ陽性細胞は、核（ＤＡＰＩ）染色による総細胞数から計算した。
図１７は、一実施例によるスライド可能なナノリガンドのＩｎ ｓｉｔｕ磁気引力Ｉｎ ｓｉｔｕ ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ）の、幹細胞の機械感受性介在分化（ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｎｇ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）に対する免疫蛍光画像である。（ａ）は、磁石のある場合における、幹細胞でＦ−アクチン、核・ＡＬＰ発現を有するＲＵＮＸ２とＹＡＰに対する免疫蛍光である。（ｂ）は、Ｆ−アクチンと核を有するＴＡＺ、インテグリンβ１、ＦＡＫ、ＲｈｏＡ、ＲＯＣＫ阻害下のＹＡＰ（Ｙ２７６３２）、磁気条件下の幹細胞からミオシンII阻害（ブレビスタチン）下のビンキュリンに対する免疫蛍光である。スケールバーは５０μｍである。図１７によると、スライド可能なナノリガンドのＩｎ ｓｉｔｕ磁気的引力（Ｉｎ ｓｉｔｕ ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ）が、幹細胞の機械感受性介在分化（ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｎｇ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を促進することが分かる。
図１８は、比較例として、ＲＧＤリガンド及び永久磁石のない場合における、免疫蛍光の共焦点画像である。具体的には、７日間の幹細胞培養後のＲＵＮＸ２、Ｆ−アクチン、核のみならず、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）に対する免疫蛍光、又は培養２日後のＹＡＰ、Ｆ−アクチン、核の免疫蛍光の共焦点画像である。付着性幹細胞は、概略的な図面で赤の点線の枠で示されているように、基板が左側中央から撮像されている。「ＲＧＤなし（Ｎｏ ＲＧＤ）」群と、「磁石なし（Ｎｏ Ｍａｇｎｅｔ）」群を比較群として使用した。スケールバーは５０μｍを示す。図１８によると、ＲＧＤリガンドを含んでいないか（Ｎｏ ＲＧＤ）、或いは、磁気制御がない状態（Ｎｏ Ｍａｇｎｅｔ）では、ナノリガンドのスライドによる幹細胞の分化が効果的に調整されていない。
図１７ａ及び図１８によると、免疫蛍光及びアルカリホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）陽性細胞でＲＵＮＸ２の非常に高い核局所化（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、基板の左側（磁石側）で観察された。同時に、機械感受性（ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）転写調整剤であるＹＡＰの核局所化が左側から著しく向上した。基板の左側（磁石側）で、図１４及び図１５での幹細胞付着の時間的切り替えと一致する。
図１９は、一実施例によるスライド可能なナノリガンドの磁気引力に対する幹細胞の機械的形質導入・分化実験の結果であって、幹細胞を培養した後、核と細胞質のＲＵＮＸ２蛍光比、アルカリホスファターゼ陽性細胞及び核と細胞質のＹＡＰ蛍光比を計算したグラフである。具体的には、基板の「左下」に永久磁石が位置して幹細胞を培養した後、核と細胞質のＲＵＮＸ２蛍光比、アルカリホスファターゼ陽性細胞と核と細胞質のＹＡＰ蛍光比を計算したものであり、上記の計算は、図１７ａ及び図１８に示されている免疫蛍光の共焦点画像を使用して行われた。データは、平均±標準誤差（ｎ＝３０）と表される。統計学的に有意な差は、異なるアルファベットで表示される。図１９によると、スライド可能なナノリガンドの磁気的引力は、幹細胞のメカノトランスダクション及び分化を促進する。
図２０は、一実施例によるナノリガンドのスライドのＩｎ ｓｉｔｕ時間的制御実験の免疫蛍光の共焦点画像、並びに、核と細胞質のＲＵＮＸ２蛍光比を計算したグラフである。（ａ）は、永久磁石を基板の左下に位置させる（「ＯＮ」）、或いは基板から除去（「ＯＦＦ」）て、幹細胞の培養から７日後のＲＵＮＸ２、Ｆ−アクチン、核の免疫蛍光の共焦点画像である。「ＯＮ」・「ＯＦＦ」の条件を（ＲＵＮＸ２の）培養７日間連続的に適用する、或いは培養１２時間後に切り替えた。幹細胞は、基板の「左側」の中心と「右側」の中心から撮像した。スケールバーは５０μｍを示す。（ｂ）は、核と細胞質のＲＵＮＸ２蛍光比を計算したグラフである。データは、平均±標準誤差（ｎ＝３０）と表される。統計学的に有意な差は、異なるアルファベットで表示される。図２０によると、本発明のスライド可能なナノリガンドは、磁場を用いて、時間的に幹細胞の分化を調整することができる。
図２１は、一実施例においてスライド可能なナノリガンドの時間規制制御による機械形質導入に関する実験の結果である。（ａ）は、永久磁石を基板の左下に位置させる（「ＯＮ」）、或いは基板から除去（「ＯＦＦ」）て、培養２日後のＲＵＮＸ２、Ｆ−アクチン、核の免疫蛍光の共焦点画像である。（ｂ）は、核と細胞質のＹＡＰ蛍光比を計算したグラフである。図２１によると、本発明のスライド可能なナノリガンドは、時間制御により幹細胞のメカノトランスダクションを調整することができる。
図２０ａ〜ｂ、図２１ａ〜ｂにより、幹細胞の分化とメカノトランスダクションは、「ＯＮ」の条件の下でＲＵＮＸ２とＹＡＰのより著しい核局所化に刺激された。
図２２は、一実施のスライド可能なナノリガンドに対して基板の「左下」に位置する永久磁石で幹細胞を培養して７日後、ＲＵＮＸ２とＡＬＰの遺伝子発現プロファイルであり、データは平均±標準誤差（ｎ＝３０）に表示される。統計学的に有意な差は、異なるアルファベットで表示される。
図２２によると、遺伝子発現の解析は、「ＯＮ」の条件の下で左側（磁石側）からＲＵＮＸ２とＡＬＰの発現が非常に高かった。興味深いことに、左側（磁石側）において、「ＯＦＦ−ＯＮ」と「ＯＮ−ＯＦＦ」の条件は、「ＯＮ」状態と比肩するくらいのＲＵＮＸ２とＹＡＰの著しい核局所化を示した。これは、ナノリガンドが磁石に向かって引き寄せられ、予め定められた時点で細胞の信号伝達イベントを活性化させることができるため、幹細胞のメカノトランスダクション及び幹細胞の分化を促進するために磁石が初期、或いは以降に配置され得ることを表す。これにより、スライド可能なナノリガンドを磁気的に引き寄せるＩｎ ｓｉｔｕ制御を介して幹細胞の分化を刺激できることが分かる。
また、本発明は、メカノトランスダクション（ｍｅｃｈａｎｏｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）信号のインテグリン結紮 − 介在活性化でＩｎ ｓｉｔｕナノリガンドのスライドの下で幹細胞の分化を促進する方法を調べている。本発明では、基板の左下に磁石を配置し、様々な細胞内の機械感受性の経路を探した。
図２３は、一実施例においてスライド可能なナノリガンドの磁気引力（ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ）に対する免疫蛍光画像から計算した結果を示したものである。（ａ）は、図４ｂに示したＴＡＺに対する免疫蛍光の共焦点画像から得た、核と細胞質のＴＡＺ蛍光比の定量である。（ｂ）は、Ｆ−アクチンと核を有するｐ−ＦＡＫに対する免疫蛍光の共焦点画像である。図１７ｂに図示された（ｃ）ＲＯＣＫ阻害（Ｙ２７６３２を有する）の下、核と細胞質のＹＡＰ蛍光比と、（ｄ）ミオシンII阻害（ブレビスタチンを有する）の細胞面積を計算したグラフである。幹細胞を基板の「左下」に位置する永久磁石で、２日間培養した。付着性幹細胞は、基板の「左側」の中心と 「右側」の中心から撮像した。スケールバーは５０μｍを示す。データは、平均±標準誤差（ｎ＝３０）と表される。統計学的に有意な差は、異なるアルファベットで表示される。図２３によると、本発明のスライド可能なナノリガンドは、磁気引力の制御により幹細胞の焦点付着と機械感受性を促進している。
図１７ｂ、図２３ａ〜ｄによると、免疫蛍光でＴＡＺ、転写共同活性化、インテグリンβ１活性化がより高い核の位置は、基板の左側（磁石側）であった。ＦＡ複合体の安定的な形成は、機械感受性ＲｈｏＡを活性化させるためにリン酸化する焦点付着キナーゼ（ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｋｉｎａｓｅ、ＦＡＫ）を含んでいる。左側（磁石側）において、ＦＡＫが高く発現され、これはｐＦＡＫを刺激するためにリン酸化且つ活性化された。メカノトランスダクションの焦点付着介在活性化は、左からＲｈｏＡを刺激し、これは、Ｙ２７６３２によるＲＯＣＫ阻害によって明らかになったように、ＹＡＰの核局所化を誘導するため、ｒｈｏ−関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）を活性化した。また、ブレビスタチン（ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ）によるミオシンＩＩ阻害は左側の細胞拡散面積を大幅に減らした。これらの結果から、スライド可能なナノリガンド人材のＩｎ ｓｉｔｕ制御はライン細胞の機械感受性介在分化を活性化するＦＡ組立体を形成するインテグリン結紮を促進することが分かる。
実験例５
本発明によるスライド可能なナノリガンドが、Ｉｎ ｓｉｔｕ制御によって体内の幹細胞の付着を空間的に調整できることを確認するために、下記のように実験を行った。
本発明のスライド可能なナノリガンドを用いたナノリガンドのスライドのＩｎ ｓｉｔｕ遠隔制御は、体内でも適用させることができる。最近では、ＵＶ光を体内での細胞付着の空間調整のために用いている。しかしながら、本研究で、ＵＶ光は、体内の生体組織で高度に吸収されるため、深刻な細胞毒性を誘発し得ることが明らかになった。それに対して、体内における細胞付着の空間調整に外部磁場ベースの制御を適用することは、望ましい組織透過性と細胞適合性（ｃｙｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）を保証する。
体内における幹細胞の付着に対するナノリガンドのスライドＩｎ ｓｉｔｕ効果を調べるために、スライド可能なナノリガンドを含む基板を約８週齢のヌードマウス１４匹に皮下移植を行った。移植前に、ヌードマウスに、５μＬのゾルレチル（ｚｏｌｅｔｉｌ）、２μＬのロムプン（ｒｏｍｐｕｎ）、３μＬの生理食塩水の混合物を腹腔内注射で投与した。マウスの背面を２ｃｍの長さで切開した。移植後、ｈＭＳＣを１００ｋ／ｍＬと基板に注入し、永久磁石を基板の左側（腹部側）の下に取り付け、ナノリガンドの左に向かってのスライドを促進させた。免疫蛍光の共焦点の撮像のために基板が採取されるまで麻酔を維持した。
図２４は、一実施例に係るスライド可能なナノリガンドのスライドナノリガンド引力の磁気制御（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ）実験の結果である。（ａ）は、ナノリガンドの磁気制御の実験を図式化した画像、（ｂ）は、磁石と共に（「ＯＮ」）、或いは磁石無しに（「ＯＦＦ」）皮下移植後のスライド可能なリガンド提示基板に注入された幹細胞のアクチン及び核を持つ人間特異的ＨｕＮｕに対する免疫蛍光の結果である。（ｃ）は、体内に付着した細胞密度と面積の定量を示す。スケールバーは５０μｍである。図２４によると、スライド可能なナノリガンドは、磁気制御により体内における幹細胞付着を促進する。
本発明では、図２４ａに図示されているように、ｈＭＳＣを注入されたヌードマウスの背中にスライド可能なナノリガンドを表す基板を皮下移植で挿入した。その後、基板の左側（マウス腹部）の下に磁石を置いて（「ＯＮ」）、比較実験として、磁石を配置しなかった（「ＯＦＦ」）。結果として図２４ｂ〜ｃによると、アクチンと核を持つ人間特異的核抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）（ＨｕＮｕ）に対する免疫蛍光の共焦点画像は、全ての付着性細胞がｈＭＳＣであり、これは「ＯＮ」の条件の下で基板の左側（磁石側）に７５％のかなり高い密度で付着され、細胞の面積を右側より約４４％拡散させた。それに対して、幹細胞は、「ＯＦＦ」の条件の下で互換性のある細胞密度と面積にて左右に付着された。これらの結果から、ナノリガンドのスライドのＩｎ ｓｉｔｕ遠隔制御は、幹細胞の付着を空間的に調整するために、複雑な体内環境にも適用できることが分かる。更に、これらのＩｎ ｓｉｔｕ遠隔制御は、体内において様々な宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）の空間調整に効果的であることを確認した。
従って、本発明によるスライド可能なナノリガンドの磁場ベースの時空間的制御は、体外内で幹細胞付着とメカノトランスダクション調整による分化の結果を効果的に制御することができる。
上記の実験例において、ナノリガンドのスライドのＩｎ ｓｉｔｕ制御の下、幹細胞の付着や分化の免疫蛍光染色ベース分析を、以下のように行った。培養後の幹細胞を４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで室温にて１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄した。固定された細胞を、３０分間室温でＰＢＳ中３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び０．１％（ｖ／ｖ）トリトン−Ｘ（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）でブロックした。ブロックされた細胞を、１次抗体（インテグリン
Figure 2021137004
ビンキュリン、ＲＵＮＸ２、ＹＡＰ、ＴＡＺ、ｐ−ＦＡＫ、ＦＡＫ、ＲｈｏＡ、ＨｕＮｕ）を以って４℃で１６時間処理し、ＰＢＳで洗浄した。上記の細胞を、２次抗体、ファロイジン（ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）、ＤＡＰＩで室温にて３０分間処理し、ＰＢＳで洗浄した。免疫蛍光染色を施した細胞を全ての比較群に対して同じ露出条件にて共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７００、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で撮像し、その後、上記のように、ＩｍａｇｅＪソフトウェアで分析した。
また、ナノリガンドのスライドの下で幹細胞の付着、分化、機械感受性を定量化するために、免疫蛍光染色を施した画像は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて分析した。インテグリンβ１の場合には、ヒストグラム（ｈｉｓｔｏｇｒａｍ）機能により、５つの異なる画像から染色強度を計算した。付着性細胞密度の場合には、５つの異なるＤＡＰＩ染色画像から細胞核の数を計算した。付着性細胞の面積と縦横比（主軸、副軸）の場合、５つの異なるファロイジン染色画像を計算に使用した。焦点付着数の場合、以前に報告されているように、５つのビンキュリン（ｖｉｎｃｕｌｉｎ）染色画像を、１μｍ２より大きいサイズを有するクラスタを計算するために使用した。幹細胞の分化（ＲＵＮＸ２）及びメカノトランスダクション（ＹＡＰ）の場合には、５つの異なる画像からの幹細胞の核と細胞質の蛍光比を計算に使用した。
更に、ナノリガンドのスライドのＩｎ ｓｉｔｕ制御の下で幹細胞の分化のために逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）ベースの分析は、以下のように行った。骨形成分化培地で培養した後、幹細胞を、ＲＮＡを抽出するために、基板（左右に分離）に適用したトリゾル（群当たり１ｍＬ）により採取した。各群に対し、１μｇのＲＮＡを高容量ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡキットを用いてｃＤＮＡへの逆転写に使用した。ＳｔｅｐＯｎｅ ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ ａｓｓａｙｓによるリアルタイムＰＣＲ反応に使用された。標的遺伝子（ＲＵＮＸ２とＡＬＰ）の発現をＧＡＰＤＨの発現に正規化し、その後、フォールディング発現に表示された。

Claims (12)

  1. 磁性ナノ粒子を含むコアと、
    前記コアを包み込むように設けられ、インテグリン結合リガンドペプチドを含むコーティング層と、
    前記コアと前記コーティング層の間に備えられるリンカーと、を含み、
    前記インテグリン結合リガンドペプチドは、負に荷電されたことを特徴とする、幹細胞の細胞付着・分化促進用ナノリガンド。
  2. 前記磁性ナノ粒子は、シリカが表面に結合されたことを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞の細胞付着・分化促進用ナノリガンド。
  3. 前記コアと前記コーティング層との間をリンカーで連結した構造であり、
    前記リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系リンカーである、請求項１に記載の幹細胞の細胞付着・分化促進用ナノリガンド。
  4. 前記ナノリガンドは、直径が３０ｎｍ〜６０ｎｍであり、前記磁性ナノ粒子は、直径が５ｎｍ〜３０ｎｍである、請求項１に記載の幹細胞の細胞付着・分化促進用ナノリガンド。
  5. 前記インテグリン結合リガンドペプチドは、負に荷電されたチオール化インテグリン結合リガンドペプチドを含み、
    前記ナノリガンドの表面は負に荷電されている、請求項１に記載の幹細胞の細胞付着・分化促進用ナノリガンド。
  6. 磁性ナノ粒子を含むコアを用意するステップと、
    前記コアをリンカーを含む第１の懸濁液と混合してリンカーが結合されたコアを製造するステップと、
    前記リンカーが結合されたコアをインテグリン結合リガンドペプチド（ＲＧＤ）を含む第２の懸濁液と混合するステップと、を含む、請求項１〜５のうちいずれか１項に記載の幹細胞の細胞付着・分化促進用ナノリガンドの製造方法。
  7. 請求項１〜５のうちいずれか１項に記載の幹細胞の細胞付着・分化促進用ナノリガンドを含む溶液に、表面が活性化された基板を担持して、ナノリガンド提示基板を製造するステップと、
    前記ナノリガンド提示基板に幹細胞を処理した後、外部の磁場を印加し、幹細胞の付着・分化を調整するステップと、を含む、幹細胞の付着・分化を促進する方法。
  8. 前記ナノリガンド提示基板を製造するステップは、
    基板の表面を酸性溶液に浸漬させるステップと、
    浸漬済みの基板をアミノシラン溶液に担持して前記基板の表面を活性化させるステップと、
    活性化された基板を室温で超音波を利用して処理するステップと、を含む、請求項７に記載の幹細胞の細胞付着・分化を促進する方法。
  9. 前記表面が活性化された基板は、アミノシラン溶液に基板を担持して表面を活性化させることを特徴とする、請求項７に記載の幹細胞の細胞付着・分化を促進する方法。
  10. 前記幹細胞の付着・分化を調整するステップは、体内及び体外に前記ナノリガンド提示基板を位置させた後、１００〜７００ｍＴの磁場を１２時間〜４８時間印加して行う、請求項７に記載の幹細胞の細胞付着・分化を促進する方法。
  11. 前記幹細胞の付着・分化を調整するステップは、基板に印加される磁場の位置を変化させて行う、請求項７に記載の幹細胞の細胞付着・分化を促進する方法。
  12. 前記幹細胞の付着・分化を調整するステップは、基板に印加される磁場の位置を時間に応じて変化させて行う、請求項７に記載の幹細胞の細胞付着・分化を促進する方法。
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