ES2898883T3

ES2898883T3 - Uso de células magnéticas para manipular células no magnéticas

Info

Publication number: ES2898883T3
Application number: ES18756094T
Authority: ES
Inventors: Glauco Souza
Original assignee: Greiner Bio One North America Inc
Current assignee: Greiner Bio One North America Inc
Priority date: 2017-08-08
Filing date: 2018-08-01
Publication date: 2022-03-09
Anticipated expiration: 2038-08-01
Also published as: WO2019032345A1; PL3665269T3; EP3665269B1; EP3665269A1; JP2020530773A; JP7136885B2; BR112020002694A2; US20200239833A1; HUE057208T2

Abstract

Un procedimiento de aislamiento de células diana de una mezcla de células, que comprende: a) combinar una mezcla de células que comprende células diana y células no diana con células de presentación magnetizadas que presentan uno o más ligandos en sus superficies, siendo dichos ligandos específicos para un compañero de unión en una superficie de dichas células diana; b) permitir que dicho ligando se una a dicho compañero de unión para producir células de presentación magnetizadas unidas a dichas células diana; c) aplicar un campo magnético para obtener dichas células de presentación magnetizadas unidas a dichas células diana; y d) lavar las células no diana, aislando, de este modo, dichas células diana.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de células magnéticas para manipular células no magnéticas

APLICACIONES RELACIONADAS ANTERIORES

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a materiales, procedimientos de preparación y procedimientos de uso de células magnéticas como herramienta para obtener y manipular otras células, así como a un complejo de células magnéticas que comprende al menos una célula de presentación magnetizada y al menos una célula diana.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El uso de microesferas magnéticas para seleccionar y enriquecer células se conoce desde hace mucho tiempo. De hecho, existen varios proveedores comerciales de tecnologías de separación celular basadas en microesferas magnéticas, incluyendo Mojosort, EasySep, MACS MicroBead Technology, Dynabeads, por nombrar solo algunas pocas. Por tanto, la tecnología está bien desarrollada y es bien conocida en la técnica.

Existen muchas variaciones en las técnicas de separación de células magnéticas, pero un procedimiento importante usa anticuerpos para seleccionar como diana las células de interés y, a continuación, un campo magnético para obtener esas células seleccionadas como diana, normalmente por medio de un segundo anticuerpo que se conjuga a una microesfera magnética.

Normalmente, un combinado de anticuerpos se unirá a la célula de interés (selección positiva) o las células de no interés (selección negativa). Después de una breve incubación, la adición de microesferas de nanopartículas magnéticas a la mezcla de células une, a continuación, los anticuerpos de la incubación previa, a menudo por medio de un anticuerpo secundario que se ha conjugado a la microesfera magnética. Después de otra breve incubación, las células se pueden colocar, a continuación, en un campo magnético. Después de unos minutos, las células unidas a anticuerpo se atraerán hacia el imán, se pueden obtener las células unidas o bien las no unidas. Esta tecnología permite un aislamiento rápido y fácil de poblaciones de células a partir de poblaciones en masa, y se han desarrollado una variedad de aplicaciones en base a estos principios básicos.

Sin embargo, el aislamiento de células basado en anticuerpos magnéticos implica alguna inversión inicial en la compra de imanes (que rondan los 1000 $) y kits de anticuerpos (que oscilan entre 300 $ y 700 $). Además, las microesferas no son naturales y, por tanto, se retiran para su cultivo adicional o bien se retienen, pero contribuyen al carácter artificial del entorno. Por tanto, aunque estos enfoques basados en microesferas son muy útiles, todavía existe margen para procedimientos de aislamiento de células mejorados que eviten el uso de costosas microesferas para anticuerpos conjugados magnéticamente, eviten el uso de productos químicos y materiales de microesferas artificiales y proporcionen la mejor obtención de células posible, para otras técnicas, tales como ensayo o cultivo, especialmente cultivo en 3D.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En el presente documento, se presenta un nuevo uso para células magnetizadas o una pequeña agrupación de células magnetizadas ensambladas en 3D, en el que las células están genomanipuladas para presentar anticuerpos antidiana que se unirán a células diana. Estas células de presentación magnetizadas se pueden usar en lugar de microesferas magnéticas para el enriquecimiento de células. Por tanto, las microesferas ya no son necesarias, ni tampoco es necesario un segundo anticuerpo.

Las células de presentación magnetizadas presentan preferentemente anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos en sus superficies, pero se podría usar cualquier otro receptor, ligando, producto químico o un miembro de un par de unión específico de diana. Dichos "marcadores de superficie de presentación" pueden ser naturales, genomanipulados, sobreexpresados o se pueden añadir químicamente a las células. Además, se podrían usar las células magnetizadas de órganos específicos que sean dianas de metástasis de tipos de células cancerosas específicas, así como células irradiadas o células no proliferantes. La clave es que las células de presentación magnetizadas tienen características físicas o químicas particulares para seleccionar como diana las células de interés, uniéndose, de este modo, a las mismas. Todas estas células se llaman en el presente documento "células de presentación magnetizadas".

Las células de presentación magnetizadas también pueden tener moléculas o átomos fluorescentes, por ejemplo, proteínas de fluorescencia verde (GFP), u otros marcadores, que se pueden usar para identificar acontecimientos de unión célula-célula o se pueden usar para facilitar la separación celular. Estas células se llaman "células de presentación marcadas magnetizadas" y también se podrían llamar "células de presentación fluorescentes magnetizadas", donde el marcador es un marcador fluorescente.

En la medida en que las células de fibroblastos se usen como células de presentación magnetizadas, se pueden retener, a continuación, en el cultivo para su uso, por ejemplo, como células alimentadoras o sustituto de estroma natural. Esto es, en particular, beneficioso en el caso de cultivos en 3D, que se beneficien del cultivo con células alimentadoras, por ejemplo, cuando se reprograman condicionalmente células y se cultivan células tumorales circulantes, células madre y células primarias.

Además, en la medida en que las células inmunitarias se usen como células de presentación magnetizadas, se pueden retener en el cultivo para su uso como, por ejemplo, macrófagos, linfocitos T y células presentadoras de antígeno. Esto es, en particular, beneficioso en el caso de capturar tanto células presentadoras de antígeno como linfocitos T magnetizando células presentadoras de antígeno. Esto también podría beneficiar al proceso de activación, así como captura, de células inmunitarias.

Para prevenir que los fibroblastos o células inmunitarias se apoderen del cultivo de células, se retira el agente selectivo y las células, que, a menudo, se genomanipulan para presentar marcadores de superficie, lo que ralentizará su crecimiento debido a la carga de expresión, lo que permitirá que las células diana seleccionadas compitan más eficazmente. De forma alternativa, se podrían usar otras presiones selectivas negativas, tales como la retirada de un nutriente esencial en un mutante condicional, selección de temperatura (mutante p-53 sensible a temperatura y mutantes de SV40), irradiación y similares.

Es bien conocida la creación de células que presentan anticuerpos diana en sus superficies. Desde hace mucho tiempo se ha usado la presentación en fagos para la maduración en afinidad de los anticuerpos in vitro y también se han desarrollado sistemas de presentación en superficie de células bacterianas y de levadura. Ahora se han desarrollado sistemas de "presentación de células de mamífero", lo que evita potencialmente, por tanto, cualquier etapa necesaria para transferir los genes de anticuerpo seleccionados a otro tipo de célula. También se podría usar cualquier otro procedimiento.

Con más detalle, la estrategia de presentación de células de mamífero desarrollada por Ho, 2009, usó células de riñón embrionario humano 293T (HEK-293T), pero se pueden usar otros tipos de células, especialmente células de fibroblastos. La presentación de células de mamífero se basa en la transfección transitoria del ADN que codifica el anticuerpo para promover niveles muy altos de expresión de anticuerpo en células de mamífero. Además, los anticuerpos de ratón o humanos expresados pueden contener las modificaciones postraduccionales que se requieren para la función del anticuerpo. Se ha sugerido que la presentación de células de mamífero se podría usar para expresar los fragmentos de anticuerpo recombinante que no se pueden expresar en E. coli.

Para presentar el Fv en la superficie celular, el scFv se fusiona al dominio transmembranario del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano (PDGFR) (FIG. 1), aunque se podrían usar otras proteínas transmembranarias. El vector de expresión contenía, por ejemplo, el promotor de citomegalovirus, la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señal de la cadena de IgK murina (METDTLLLWVLLLWVPGSTGD), el scFv, una etiqueta myc y el dominio transmembranario (aminoácidos Ala513-Arg561) de PDGFR. Se usó la etiqueta de epítopo myc en el carboxilo terminal del scFv para medir el nivel de expresión. Ho expresó scFv anti-CD22 (RFB4) en células HEK-293T (FIG. 2). La localización en superficie de la fusión scFv-PDGFR se verificó por microscopia de fluorescencia confocal y citometría de flujo. Se examinaron células marcadas simultáneamente con proteínas CD22-Fc biotiniladas y un mAb anti-c-myc por microscopia confocal de barrido láser (no mostrado).

A continuación, las células se seleccionan, por ejemplo, por separación FACS, y los genes de scFV se recuperan y colocan en cualquier tipo de célula deseada. De forma alternativa, las células de presentación seleccionadas se pueden magnetizar como tales y usar directamente en los procedimientos descritos en el presente documento.

Las células de presentación se magnetizan por incubación con un material de nanopartículas magnéticas, tales como los descritos en los documentos WO2010036957 y WO2011038370 por Nano3D Biosciences®. De forma alternativa, una variación del ensamblaje de nanopartículas está disponible comercialmente en Nano3D Biosciences® (Houston TX), bajo el nombre comercial NANOSHUTTLE™. Este nuevo material magnético proporciona un procedimiento superior de magnetización de células sin el uso de ningún agente tóxico o infeccioso, y las células permanecen magnetizadas cuando el material se lava.

Las células de presentación también se podrían magnetizar con cualquier nanopartícula magnética que se pueda captar por la célula o introducir de otro modo en la célula, por ejemplo, por bombardero, inyección, electroporación, transducción, liposomas catiónicos, hidrogeles, presión magnética y similares. Se anticipa que cualquier medio de introducción será suficiente, aunque NanoShuttle puede ser el procedimiento menos perturbador de las células y, por tanto, es preferente. Usando NanoShuttle, las nanopartículas magnéticas se captan por las células de presentación y retienen durante aproximadamente 2 semanas. Cuando se usa una pequeña agrupación de células de presentación magnetizadas ensambladas en 3D, la magnetización se puede retener durante meses. Por tanto, las células están ahora magnetizadas, además, presentan los sitios de unión a antígeno u otro marcador de superficie que seleccionará como diana la célula de interés.

A continuación, las células de presentación magnéticas se combinan con las células diana y se incuban para permitir que los sitios de unión a antígeno se unan a algún epítopo en la superficie de las células diana. A continuación, estas células se pueden obtener por la aplicación de un campo magnético intenso. Por tanto, las células de presentación magnéticas se pueden usar en cualquier procedimiento donde se hayan usado previamente microesferas magnéticas, incluyendo en manipulaciones de células, cambio de medios, aislamiento o enriquecimiento de células, expansión de células, cultivo de células en 3D, levitación de células, agregación de células, "tinta" para aplicaciones de bioimpresión, y para localizar células de presentación magnetizadas in vivo con el uso de campos magnéticos dirigidos.

Las etapas generales del procedimiento incluyen:

1. Seleccionar células de presentación de anticuerpos o regiones variables para la célula diana de interés. Esta etapa puede ser opcional si las células de presentación de anticuerpos o las células de presentación de ligandos ya están disponibles, como a menudo es el caso. Sin embargo, se puede necesitar transferir los genes requeridos a otro tipo de célula, dependiendo de la aplicación.

2. Tratar las células de presentación con NANOSHUTTLE™, o cualquier otro procedimiento, de modo que las células capten nanopartículas magnéticas.

3. Incubar la célula de presentación magnética con células diana y permitir que las células de presentación magnéticas se unan a las células diana.

4. Obtener células magnéticas y células unidas a las mismas con un campo magnético. Las células se pueden lavar una o más veces, cambiar los medios y similares.

5. Opcionalmente, cultivar células en 2D o 3D a partir de las células de presentación magnetizadas y mezcla de células diana.

6. Opcionalmente, realizar cualquier ensayo o procedimiento de formación de imágenes que sea de interés para la aplicación, o usar el cultivo de células en 3D para tratamientos in vivo.

7. Opcionalmente, bioimprimir las células de presentación magnetizadas y mezcla de células diana.

La invención incluye uno cualquiera o más de los siguientes modos de realización, en todas las combinaciones posibles:

- Un procedimiento de aislamiento de células diana de una mezcla de células, que comprende:

a) combinar una mezcla de células que comprende células diana y células no diana con células de presentación magnetizadas que presentan uno o más ligandos en sus superficies, siendo dichos ligandos específicos para un compañero de unión en una superficie de dichas células diana;

b) permitir que dicho ligando se una a dicho compañero de unión para producir células de presentación magnetizadas unidas a dichas células diana;

c) aplicar un campo magnético para obtener dichas células de presentación magnetizadas unidas a dichas células diana; y

d) lavar las células no diana, aislando, de este modo, dichas células diana.

- Cualquier procedimiento en el presente documento, en el que dichos ligandos que comprenden sitios de unión a antígeno y dicho compañero de unión comprende un antígeno que se reconoce por dichos sitios de unión a antígeno. - Cualquier procedimiento en el presente documento, en el que dichas células de presentación magnetizadas son fibroblastos o células inmunitarias.

- Cualquier procedimiento en el presente documento, en el que dichas células de presentación magnetizadas son de una línea de células derivada de fibroblastos.

- Cualquier procedimiento en el presente documento, en el que dichas células diana y dichas células de presentación magnetizadas son humanas.

- Cualquier procedimiento en el presente documento, que comprende la otra etapa de cultivar en 3D dichas células de presentación magnetizadas unidas a dichas células diana.

- Cualquier procedimiento en el presente documento, que comprende la otra etapa de cultivar en 3D dichas células de presentación magnetizadas unidas a dichas células diana en un campo magnético, de modo que dichas células de presentación magnetizadas unidas a dichas células diana se hagan levitar.

- Cualquier procedimiento en el presente documento, que comprende la otra etapa de someter a ensayo dichas células diana.

- Cualquier procedimiento en el presente documento, que comprende la otra etapa de bioimprimir dichas células de presentación magnetizadas unidas a dichas células diana.

- Cualquier procedimiento en el presente documento, en el que dichas células de presentación magnetizadas se proporcionan tratando células que presentan uno o más ligandos con nanopartículas magnéticas.

- Cualquier procedimiento en el presente documento, en el que dichas nanopartículas magnéticas se introducen en dichas células que presentan uno o más ligandos por bombardeo, inyección, electroporación, presión magnética, hidrogeles o liposomas catiónicos.

- Cualquier procedimiento en el presente documento, en el que dichas nanopartículas magnéticas se introducen en dichas células que presentan uno o más ligandos con una composición que comprende:

a) una nanopartícula cargada negativamente;

b) una nanopartícula cargada positivamente; y

c) una molécula de soporte,

d) en la que una de dicha nanopartícula cargada negativamente o nanopartícula cargada positivamente es un elemento o compuesto magnéticamente sensible, y en la que dicha molécula de soporte mantiene dicha nanopartícula cargada negativamente y dicha nanopartícula cargada positivamente en una mezcla íntima formando una estructura fibrosa similar a estera.

a) combinar células que presentan uno o más sitios de unión a antígeno en sus superficies con una composición para formar células de presentación magnetizadas, comprendiendo dicha composición:

i) una nanopartícula cargada negativamente;

ii) una nanopartícula cargada positivamente; y

iii) una molécula de soporte;

iv) en la que una de dicha nanopartícula cargada negativamente o nanopartícula cargada positivamente es un elemento o compuesto magnéticamente sensible, y en la que dicha molécula de soporte mantiene dicha nanopartícula cargada negativamente y dicha nanopartícula cargada positivamente en una mezcla íntima formando una estructura fibrosa similar a estera;

b) combinar una mezcla de células que comprende células diana y células no diana con dichas células de presentación magnetizadas;

c) permitir que dicho(s) sitio(s) de unión a antígeno se una(n) a una o más células diana que presentan un antígeno que se reconoce por dicho(s) sitio(s) de unión a antígeno;

d) aplicar un campo magnético para obtener células de presentación magnetizadas unidas a dichas células diana; y e) lavar las células no diana, aislando, de este modo, las células de presentación magnetizadas unidas a dichas células diana.

- Cualquier procedimiento divulgado en el presente documento, que comprende la otra etapa de separar las células de presentación magnetizadas de las células diana.

- Cualquier procedimiento divulgado en el presente documento, en el que la otra etapa de separar las células de presentación magnetizadas de las células diana comprende el uso de un exceso de ligando no unido para la unión competitiva, uso de enzimas que escinden sitios específicos de un miembro del par de unión, en particular, del antígeno o el/los sitio(s) de unión a antígeno, o uso de enzimas que escinden de forma inespecífica proteínas de superficie de los miembros del par de unión, en particular, tripsina, papaína, dispasa, colagenasa, hialuronidasa o una mezcla de las mismas.

i) una nanopartícula cargada negativamente;

ii) una nanopartícula cargada positivamente; y

iii) una molécula de soporte;

d) aplicar un campo magnético para obtener células de presentación magnetizadas unidas a dichas células diana; y e) lavar las células no diana, aislando, de este modo, las células de presentación magnetizadas unidas a dichas células diana; y

f) cultivar en 3D dichas células de presentación magnetizadas en aislamiento unidas a dichas células diana en un campo magnético suficiente como para hacer levitar dichas células magnetizadas en aislamiento unidas a dichas células diana.

- Cualquier procedimiento en el presente documento, a) en el que la molécula de soporte comprende péptidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, polímeros, poli-lisina, fibronectina, colágeno, laminina, BSA, hialuronano, glucosaminoglucano, glucosaminoglucano aniónico no sulfatado, gelatina, ácido nucleico, mezclas de proteínas de la matriz extracelular, anticuerpos o mezclas o derivados de los mismos, b) en el que dicha nanopartícula cargada negativamente es una nanopartícula de oro, y c) en el que dicha nanopartícula cargada positivamente es una nanopartícula de óxido de hierro.

- Un procedimiento de manipulación de células diana, que comprende:

a) combinar células diana con células de presentación magnetizadas que presentan uno o más ligandos en sus superficies, dichos ligandos para unir específicamente una molécula diana en una superficie de dichas células diana; b) permitir que dichos ligandos se unan a dicha molécula diana para producir células de presentación magnetizadas unidas a dichas células diana;

c) aplicar un campo magnético para obtener dichas células de presentación magnetizadas unidas a dichas células diana, permitiendo, de este modo, la manipulación de dichas células diana.

En modos de realización preferentes, las células se hacen levitar con una composición que comprende: a) una nanopartícula cargada negativamente; b) una nanopartícula cargada positivamente; y c) una molécula de soporte, en la que una de dicha nanopartícula cargada negativamente o nanopartícula cargada positivamente contiene un material magnéticamente sensible, tal como hierro u óxido de hierro, y en la que dicha molécula de soporte mantiene dicha nanopartícula cargada negativamente y dicha nanopartícula cargada positivamente en una mezcla íntima.

Lo más preferente, la composición es NANOSHUTTLE™, que se sabe que es muy eficaz y que está disponible comercialmente de Nano3D BioSciences (Houston TX).

Además, como se describe en patentes anteriores, se pueden preparar cultivos en 3D en diversas formas modificando la forma del campo magnético. Por ejemplo, se puede usar un imán anular para preparar un cultivo en 3D en forma de anillo o rosquilla. También se pueden usar campos magnéticos para mantener o cambiar dicha forma durante los procesos de descelularización y recelularización.

- Un complejo de células magnéticas, que comprende:

a) al menos una célula de presentación magnetizada que muestra al menos un ligando en una superficie de la al menos una célula de presentación magnetizada; y

b) al menos una célula diana que tiene al menos un compañero de unión en una superficie de la al menos una célula diana;

en el que dicho al menos un ligando en las superficies de la al menos una célula de presentación magnetizada se une a dicho compañero de unión en la superficie de la al menos una célula diana para formar el complejo de células magnéticas.

- Cualquier complejo de células magnéticas en el presente documento, en el que dicho al menos un ligando comprende (un) sitio(s) de unión a antígeno y dicho al menos un compañero de unión comprende un antígeno que se reconoce por dicho sitio(s) de unión a antígeno.

- Cualquier complejo de células magnéticas en el presente documento, en el que al menos una célula de presentación magnetizada comprende nanopartículas magnéticas.

- Cualquier complejo de células magnéticas en el presente documento, en el que la al menos una célula de presentación magnetizada comprende nanopartículas magnéticas, comprendiendo dichas nanopartículas magnéticas: i) una nanopartícula cargada negativamente;

ii) una nanopartícula cargada positivamente; y

iii) una molécula de soporte;

iv) en la que una de dicha nanopartícula cargada negativamente o nanopartícula cargada positivamente es un elemento o compuesto magnéticamente sensible, y en la que dicha molécula de soporte mantiene dicha nanopartícula cargada negativamente y dicha nanopartícula cargada positivamente en una mezcla íntima formando una estructura fibrosa similar a estera.

- Cualquier complejo de células magnéticas en el presente documento, obtenible, en particular, obtenido, por cualquiera de los procedimientos de aislamiento de células diana de una mezcla de células en el presente documento. - Cualquier complejo de células magnéticas en el presente documento, obtenible, en particular, obtenido, por el procedimiento de manipulación de células diana.

En el presente documento, se pueden usar las siguientes abreviaturas:

(continuación)

Por "cultivar" en el presente documento, se incluye el cultivo de tipos de células individuales o el cocultivo de más de un tipo de célula.

Como se usa en el presente documento, una "nanopartícula cargada positivamente" o "nanopartícula positiva" se define como cualquier partícula de menos de 200 nm, preferentemente de 100 nm o menos, que tiene una carga positiva global. Preferentemente, la partícula no es tóxica, pero esto no es esencial, ya que las partículas no permanecen en las células.

Como se usa en el presente documento, una "nanopartícula cargada negativamente" o "nanopartícula negativa" se define como cualquier partícula de menos de 200 nm, preferentemente de 100 nm, y lo más preferentemente de aproximadamente 2-25 nm, que tiene una carga negativa global. Preferentemente, la partícula no es tóxica, pero esto no es esencial, ya que las partículas no permanecen en las células durante un largo periodo de tiempo.

Como se usa en el presente documento, "elemento magnéticamente sensible" puede ser cualquier elemento o molécula que responderá a un campo magnético. Como se detalla a continuación, una de las nanopartículas debe contener o ser un elemento magnéticamente sensible.

Como se usa en el presente documento, "molécula de soporte" se refiere a cualquier molécula larga que interacciona con las nanopartículas para crear una estructura fibrosa similar a estera o gel y, por tanto, mantiene a la nanopartícula magnética en estrecha proximidad con la célula para su captación. Una molécula de soporte preferente es poli-lisina. Por "célula madre" en el presente documento se incluyen células totipotentes y multipotentes, a menos que se indique específicamente de otro modo.

Por "presentación de anticuerpos" se entiende que la célula presenta el sitio de unión a antígeno de un antígeno particular en su superficie celular. Sin embargo, no es necesario usar todo el gen de anticuerpo y típicamente no lo es. En su lugar, se fusiona con alguna otra proteína, típicamente una proteína transmembranaria. No obstante, la proteína de fusión retendrá las propiedades de unión específicas de un anticuerpo.

Por "célula de presentación" lo que se entiende es una célula que presenta una molécula de superficie, en particular, uno o más ligandos, preferentemente al menos un sitio de unión a antígeno y/o anticuerpo, que se puede usar para adherirse a una célula diana.

Por "marcador de superficie de presentación" o "marcador de superficie" lo que se entiende son aquellos marcadores, productos químicos o átomos presentados en superficie que permiten la unión específica a una célula diana de interés. Las moléculas de superficie preferentes incluyen sitios de unión a antígeno, anticuerpos y similares, pero también se podrían usar otros ligandos, receptores o productos químicos. El "marcador de superficie de presentación" y su "miembro de unión relacionado" son conocidos conjuntamente como "pares de unión". En la FIG. 3 se muestran otros pares de unión y se enumeran aquí:

1. Interacciones ligando receptor

2. Interacción de proteínas homotípicas o heterotípicas

3. Interacciones del receptor acoplado a proteína G (GPCR).

4. EpCam para capturar células tumorales circulantes

5. Receptores en superficie celular

6. Proteínas transmembranarias

7. Integrinas

8. Proteínas de la matriz extracelular, es decir, colágeno, laminina, fibronectina

9. Interacción lípido lípido

10. Interacción lípido proteína

11. Interacción quelante, tal como iones metálicos y polipéptido histidina u otras moléculas quelantes.

Por "pares de unión" se entiende a dos átomos o moléculas que se unen entre sí, incluso cuando se necesita un miembro terciario o un miembro de puente.

Por "células de presentación magnetizadas" lo que se entiende son células o agrupaciones de células que presentan una molécula de superficie que se puede usar para adherirse a un miembro de unión relacionado en la superficie de una célula diana, y que contiene en la misma (o en la MEC o en un recubrimiento superficial) una cantidad suficiente de nanopartículas magnéticas, de modo que la célula se pueda atraer por un campo magnético.

En el contexto de la presente invención, el término "complejo de células magnéticas" se refiere a un complejo, en particular, un ensamblaje de al menos una célula de presentación magnética y al menos una célula diana. Por tanto, un "complejo de células magnéticas" como se usa en el presente documento se refiere a un ensamblaje de una célula de presentación magnetizada individual y una célula diana individual, pero también a un ensamblaje de una célula de presentación magnetizada individual con más de una célula diana y viceversa. El término además engloba un ensamblaje en el que al menos una célula de presentación magnética se une a al menos una célula diana, que, de nuevo, se une a al menos otra célula de presentación magnética y así sucesivamente. El "complejo de células magnéticas" de la presente invención se caracteriza, en particular, porque la al menos una célula de presentación magnetizada presenta al menos un ligando en su superficie celular y la al menos una célula diana tiene al menos un compañero de unión en su superficie celular, en el que el al menos un ligando en la superficie celular de la al menos una célula de presentación magnetizada se une al compañero de unión en la superficie celular de la al menos una célula diana para formar el complejo de células magnéticas.

Como se usa en el presente documento, "manipular" en todas sus conjugaciones se refiere a cualquier tipo de interferencia. En particular, en el contexto de la presente invención, el término se usa para describir cualquier acto o influencia externa adecuada para interferir en las células, en particular, las células diana. En un modo de realización específica, "manipulación de células diana" se refiere a influir en las células diana unidas a células de presentación magnetizadas por aplicación de un campo magnético.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

FIG. 1. Diagrama de un plásmido de expresión para la presentación de scFv en células de mamífero. PCMV, promotor de citomegalovirus; IgK SP, péptido señal de la cadena de IgK murina; VH, región variable de la cadena pesada; VL, región variable de la cadena ligera; conector, un conector sintético flexible entre VH y VL; myc, una etiqueta de epítopo para medir el nivel de expresión de scFv; PDGFR, el dominio transmembranario del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano; PSV40/ori, promotor de SV40 y origen que facilita la replicación episómica en células de mamífero que expresan el antígeno T grande de SV40; Neo/KanR, gen de resistencia a neomicina y kanamicina. De Ho, 2009.

FIG. 2. Ilustración esquemática de la presentación en superficie en células de mamífero. Se fusionó una etiqueta de epítopo de 10 aminoácidos (c-myc) adicional al extremo C del scFv (en base al modelo estructural Fv anti-CD22 RFB4), permitiendo la cuantificación de la presentación de fusión con mAb 9E10 independiente de la unión a antígeno (CD22). Se usó la fusión a la porción N terminal del dominio transmembranario de PDGFR para anclar scFv en la superficie de células de mamífero (HEK-293T). Ho, 2009.

FIG. 3. Ilustración esquemática de interacciones generales entre células de presentación magnetizadas y células diana.

FIG. 3A. Interacción, incluyendo proteína-proteína, lípido-lípido, lípido-proteína, electrostática, Van der Waals. En el caso de obtener y ensamblar células que existen en cantidades bajas en muestras sometidas a prueba, tales como sangre con células tumorales circulantes (CTC) o pequeñas muestras de biopsia de tejido. Las células de presentación magnetizadas pueden funcionar como capa de soporte o de alimentación para soportar el crecimiento de CTC o células de biopsia.

FIG. 3B. Interacción entre proteínas en la superficie celular, tales como interacciones anticuerpo-antígeno o proteína-proteína.

FIG. 3C. Interacción mediada o desencadenada por adición de un ligando de acoplamiento o puente (molécula o proteína o ion metálico) que interacciona con proteínas o anticuerpos presentes en la superficie de ambos tipos de células. Estas moléculas también podrían ser proteínas, ADN en forma de aptámeros y/o metal si un polipéptido quelante, tal como polihistidina, media en la interacción célula-célula.

FIG. 3D. Similar a C, pero aquí las células de presentación magnetizadas se incuban con moléculas que se capturarán por el anticuerpo/proteína de superficie, las moléculas libres/no unidas se retiran y, a continuación, la magnetizada se combina con la célula diana.

FIG. 3E. Similar a D, pero aquí las células diana se incuban con la molécula que se va a capturar por su anticuerpo/proteína de superficie, las moléculas libres/no unidas se retiran, a continuación, las células de presentación magnetizadas se combinan con la célula diana.

FIG. 3F. Las células de presentación magnetizadas se modifican con moléculas o polímeros de modificación de superficie celular, tales como proteínas de la matriz extracelular, poli-L-lisina, fibronectina, colágeno, laminina y similares. Las moléculas añadidas promueven la interacción entre la célula de presentación magnetizada con la célula diana.

FIG. 4A-E. Ilustración esquemática de cómo disociar la interacción entre las células de presentación magnetizadas y las células diana. La acción de disociación incluye: A. digestión enzimática, cambio en la fuerza iónica, cambio en la composición de los medios, cambio en el pH, cambio en la temperatura, acción del tensioactivo; B. disociación por una o más acciones de disociación; C. adición de ligando en exceso; D. ligando en exceso o molécula quelante, tal como EDTA; E. disociación por acción de disociación.

FIG 5. Diseño experimental, donde se magnetizaron células musculares lisas (CML) traqueales primarias (célula de presentación magnetizada) y no se magnetizaron células de adenocarcinoma de cáncer de pulmón A549 (célula diana). Las CML traqueales son parte del sistema de tejido pulmonar/de pulmón, por lo tanto, se espera afinidad entre las CML y la célula diana de adenocarcinoma de cáncer de pulmón. El número de células usadas fue de: 50K, 40K, 30K, 20K, 10K (siendo K la abreviatura de mil) y 0 o ninguna célula, como se indica en los marcadores de la matriz de placas.

FIG. 6. Fotomicrografías (aumento de 2,5X) de células de acuerdo con el diseño experimental mostrado en la FIG. 5 en el tiempo 0. El tiempo cero es inmediatamente después de que los dos tipos de células, uno magnetizado y el otro no, se agregen magnéticamente o se bioimpriman en la parte inferior de una placa de 384 pocillos repelente de células después de que se permitiese que los dos tipos de células interaccionaran durante de 15 a 30 minutos.

FIG 7. Fotomicrografías (aumento de 2,5X) de células de acuerdo con el diseño experimental enumerado en la FIG. 5 y mostrado en la FIG. 6 después de 24 horas de cultivo de estas células.

DESCRIPCIÓN DE MODOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN

En términos generales, la invención es un procedimiento de uso de una célula de presentación magnética en cualquiera de las maneras en que se usaban previamente las microesferas magnéticas. El uso de células, en lugar de microesferas artificiales, significa que nunca se necesitará usar ningún polímero o agente de reticulación o activador. Adicionalmente, ya no se necesita el uso de conectores y química asociada, puesto que las células magnetizadas ya presentan los sitios de unión de antígeno pertinentes en la superficie celular. Además, se pueden retener las células y, si los fibroblastos, incluyendo los fibroblastos irradiados, pueden servir como células alimentadoras para cultivos posteriores.

Las secuencias de selección como diana incluyen preferentemente sitios de unión a antígeno, pero se podría usar cualquier proteína o reactivo que seleccione como diana células. Como otra opción, se podrían usar células que se unen naturalmente a las células diana, por ejemplo, células inmunitarias, células cancerosas, células musculares lisas, células endoteliales, células óseas, células epiteliales y similares.

En modos de realización preferentes, los materiales magnetizantes incluyen nanopartículas cargadas positiva y negativamente, una de las cuales debe contener uno o más elementos magnéticamente sensibles, tales como óxido de hierro nanométrico. Estas nanopartículas se combinan además con un polímero, preferentemente un polímero celular o sintético, u otra molécula larga que actúa como soporte (en el presente documento llamada "molécula de soporte") para las nanopartículas cargadas y las células, lo que mantiene las nanopartículas en su lugar para su captación o adsorción por las células. La inclusión de tanto nanopartículas positivas como negativas permite la mezcla íntima de las nanopartículas y promueve el ensamblaje de los tres componentes, lo que garantiza, por tanto, una distribución uniforme y una buena captación. La molécula de soporte combina íntimamente los tres componentes con las células en una estructura fibrosa similar a estera que permite que las células capten el elemento magnéticamente sensible.

Después de un periodo de incubación, el material magnetizante se puede lavar, lo que permite que las células se manipulen en un campo magnético. Las nanopartículas magnéticas finalmente se pierden de las células en 8 días, pero ahora se sabe que se retienen por la MEC durante la duración del cultivo.

El elemento magnéticamente sensible puede ser cualquier elemento o molécula que responda a un campo magnético, por ejemplo, imanes de tierras raras (por ejemplo, samario-cobalto (SmCo) y neodimio-hierro-boro (NdFeB)), materiales de imanes cerámicos (por ejemplo, ferrita de estroncio), los elementos magnéticos (por ejemplo, hierro, cobalto y níquel y sus aleaciones y óxidos). Son, en particular, preferentes los materiales paramagnéticos que reaccionan a un campo magnético, pero que no son imanes por sí mismos, ya que esto permite un ensamblaje más fácil de los materiales.

Preferentemente, el campo magnético usado para hacer levitar dichas células o la MEC magnética es de aproximadamente 300G-1000G. Sin embargo, la intensidad de campo varía tanto con la distancia desde el cultivo como con la cantidad y el tipo de elemento de respuesta magnética captado o adsorbido por las células. Por tanto, la intensidad de campo óptima varía, pero se determina fácilmente de forma empírica.

Las nanopartículas cargadas negativamente incluyen metales estabilizados con carga (por ejemplo, plata, cobre, platino, paladio), pero preferentemente es una nanopartícula de oro.

Las nanopartículas cargadas positivamente incluyen aleaciones y/u óxidos estabilizados o recubiertos con tensioactivos o polímeros (por ejemplo, hierro elemental, hierro-cobalto, óxido de níquel), y preferentemente es una nanopartícula de óxido de hierro.

Una de las dos nanopartículas debe ser sensible magnéticamente, pero obviamente una (o ambas) podría contener este rasgo característico.

Las nanopartículas deben tener un tamaño de nanoescala y, por tanto, de aproximadamente 50 nm. El tamaño puede variar, sin embargo, entre aproximadamente 5-250 nm, 50-200 nm, 75-150 nm, pero pueden ser más pequeños o más grandes o un ensamblaje de nanopartículas, siempre que solo el tamaño sea apropiado para permitir la entrada o adsorción al tipo de célula en uso. Las partículas más grandes son menos eficaces en la entrada celular. En otro trabajo se ha demostrado que existe un límite superior en el tamaño eficaz de la nanopartícula magnética, y el tamaño en micrómetros es demasiado grande para la eficacia, aunque todavía se observó alguna funcionalidad.

La "molécula de soporte" es, en general, un polímero u otra molécula larga que sirve para mantener juntas las nanopartículas y las células en una mezcla íntima, como una estera de fieltro enredada. La molécula de soporte puede estar cargada positivamente, cargada negativamente, ser de carga mixta, o neutra, y pueden ser combinaciones de más de una molécula de soporte.

Los ejemplos de dichas moléculas de soporte incluyen polímeros naturales, tales como péptidos, polisacáridos, ácidos nucleicos y similares, pero también se pueden emplear polímeros sintéticos. Las moléculas de soporte, en particular, preferentes incluyen poli-lisina, fibronectina, colágeno, laminina, BSA, hialuronano, glucosaminoglucano, glucosaminoglucano aniónico no sulfatado, gelatina, ácido nucleico, mezclas de proteínas de la matriz extracelular, matrigel, anticuerpos y mezclas y derivados de los mismos.

En términos generales, la concentración de la molécula de soporte es sustancialmente mayor que la concentración de las nanopartículas cargadas negativa y positivamente, que varía de 10-1000 veces mayor, 20-500 o 50-200 veces mayor. Sin embargo, son posibles cantidades mayores o menores, dependiendo del tipo de célula que se esté usando y qué molécula de soporte y nanopartículas se estén usando. Cuanto más largo sea el polímero, menos se necesita para formar una estructura suficiente para mantener las nanopartículas en su lugar para su captación.

En general, se usan las nanopartículas en concentraciones muy bajas. Las concentraciones pueden variar entre 10_6-10"12 molar, pero preferentemente están en el intervalo nanomolar, y la(s) molécula(s) de soporte 10_3-10"9 molar, y preferentemente están en el intervalo micromolar. Se necesita al menos 1 nanopartícula magnética por célula, pero preferentemente existen cientos o miles, ya que más nanopartículas significa que se necesita una menor intensidad de campo.

Los tres componentes se ensamblan por interacción electrostática y, por tanto, son preferentes las moléculas de soporte cargadas o de carga mixta, tales como poli-lisina. Sin embargo, cualquiera de los tres componentes se puede funcionalizar, derivatizar o recubrir para promover además la interacción de los componentes y/o las células. Por tanto, uno o más miembros se pueden funcionalizar, derivatizar o recubrir con un anticuerpo que, por ejemplo, se una a un antígeno de superficie celular. Por tanto, se promoverían además las interacciones entre los componentes y/o las células. Otros pares de unión incluían receptores-ligandos, biotina-estrepavidina, ácidos nucleicos complementarios, aglutinina de germen de trigo (WGA), moléculas que contienen ácido siálico y similares.

Los recubrimientos también pueden incluir recubrimientos protectores o pasivantes, en particular, para las nanopartículas, tales como PVP, dextrano, BSA, PEG, poli-L-lisina y similares. Las nanopartículas, especialmente la nanopartícula que comprende el elemento magnéticamente sensible, se pueden marcar para su visualización, por ejemplo, con un fluoróforo, radiomarcador o similar, en particular, durante el desarrollo y las pruebas in vitro de tejidos y células magnetizadas. Sin embargo, para usos terapéuticos, puede ser preferente omitir dichos marcadores.

Si se desea, el ensamblaje de nanopartículas magnéticas se puede preparar libre de moléculas biológicas, tales como fagos o productos celulares, porque las moléculas de soporte, tales como poli-lisina, se pueden preparar fácilmente de forma sintética. Sin embargo, todos los componentes son, en general, no tóxicos, económicos o fáciles de preparar. Además, las estructuras enredadas y fibrosas similares a estera o fieltro permiten la incorporación de moléculas de soporte celular adicionales (tales como componentes de la matriz extracelular) para incluirse en los ensamblajes magnéticos de nanopartículas.

La magnetización de células con ensamblajes de nanopartículas magnéticas solo consiste en añadir ensamblaje a las células, por ejemplo, en medios de cultivo de células regulares. Las células se pueden magnetizar en minutos a partir del tratamiento con nanopartículas magnéticas (5 minutos) y las células fijadas o bien suspendidas se pueden tratar con ensamblajes de nanopartículas magnéticas.

Las células de presentación de anticuerpos magnetizadas se incuban, a continuación, con las células diana, tales como sangre o un homogeneizado tisular, y la célula diana se unirá, a continuación, a los sitios de unión a antígeno de las células magnetizadas, lo que permite su obtención en un campo magnético intenso. Estas se pueden lavar una o más veces si se desea. Las células obtenidas se pueden usar como tales o se pueden cultivar adicionalmente antes de su uso.

Si se desea separar las células de presentación magnetizadas de las células diana, en la FIG. 4 se muestran algunos procedimientos. Se podría usar un exceso de ligando no unido para una unión competitiva con interacciones célula-célula. Otros procedimientos usan enzimas que escinden sitios específicos de un miembro del par de unión y la célula, y dichos sitios se podrían incluso genomanipular en la molécula de presentación. También se podría usar tripsinización o digestión enzimática general con una mezcla de enzimas, tales como papaína, dispasa, colagenasa, hialuronidasa y tripsina, y, a continuación, retirar las células magnéticas con un imán. Un breve "choque" de temperatura también puede disociar algunas interacciones. Finalmente, también se podría añadir EDTA si la interacción célula-célula está mediada por proteínas o moléculas quelantes, tales como el polipéptido histidina.

En un modo de realización preferente, las células magnetizadas son células de fibroblastos o células de un órgano diana, y se inicia un cultivo en 3D usando los fibroblastos como células alimentadoras o células de un órgano diana. El cultivo en 3D se puede iniciar por la aplicación de un campo magnético, que levita o bioimprime las células, que rápidamente se someten a coalescencia en una estructura en 3D. La forma del cultivo en 3D también se puede cambiar cambiando la forma del campo mágico. A continuación, el cultivo en 3D final se puede usar en tratamientos con células y tejidos, y quizás incluso en el trasplante de órganos en el futuro.

La FIG. 5 muestra el diseño experimental o de placas, mientras que la FIG. 6 muestra los resultados. La FIG. 6 demuestra que el tipo de célula asociado con el tejido en el que un tipo particular de cáncer crece in vivo, cuando se magnetiza, se puede usar para obtener y cultivar células cancerosas diana.

Las cuatro filas superiores y las seis columnas (cuadrante superior izquierdo) eran una mezcla de los dos tipos de células, donde el número total de células se mantuvo constante (a 50K células), pero la proporción entre los dos tipos de células se varía como se indica. Las cuatro filas superiores eran réplicas de las condiciones establecidas para cada columna para mostrar reproducibilidad. Las columnas de siete a doce y las cuatro filas superiores (cuadrante superior derecho) son los controles para el cuadrante superior izquierdo, donde no está presente ninguna célula diana (adenocarcinoma de pulmón). En las cuatro filas inferiores y las columnas de la derecha de siete a doce (cuadrante inferior derecho), el número de células de presentación magnetizadas (CML) se mantiene constante a 25K células por pocillo y el número de células diana (adenocarcinoma A549) varió de 0 a 50K células, como se indica. En las cuatro filas inferiores y las primeras seis columnas de la izquierda (cuadrante inferior izquierdo) no había células magnetizadas (CML) y el número de células diana (adenocarcinoma A549) varió de 0 a 50K células.

Más específicamente, las células musculares lisas (CML) traqueales primarias se magnetizan (célula de presentación magnetizada) y se deja que interaccionen con adenocarcinoma de cáncer de pulmón A549 diana (célula diana) que no se magnetiza. De los pocillos de cultivo presentados, solo los pocillos donde se presentaron células de presentación magnetizadas generaron las estructuras circulares bioimpresas magnéticamente (cuadrantes superior izquierdo, superior derecho e inferior derecho). En los pocillos en el cuadrante inferior izquierdo (cuatro filas inferiores y las seis primeras columnas de la izquierda), a los que solo se añadieron células diana, las células se dispersaron en el pocillo, no se generó un patrón circular porque estas células no estaban magnetizadas, por lo tanto, no se guiaron hacia patrón circular magnético.

El protocolo para mezclar células de presentación magnetizadas y células no magnetizadas es el siguiente:

1. Separar y contar ambos tipos de células, una para magnetizarse (célula de presentación magnetizada) y la otra no magnetizada (célula diana).

2. Llevar ambos tipos de células a una concentración de 1 millón por mililitro.

3. Para que las células se magneticen, añadir NanoShuttle a una concentración de 1 pl por cada 10 mil células y centrifugar la mezcla 3x a 100 g durante 5 minutos. Las células se resuspenden con cuidado después de cada procedimiento de centrifugación. De forma alternativa, las células se pueden magnetizar incubando durante la noche con NanoShuttle mientras están en un cultivo monocapa.

4. Añadir la cantidad deseada o desconocida de las células no magnetizadas al pocillo.

5. Añadir la cantidad deseada de células magnetizadas al pocillo.

6. Añadir medios al pocillo para llevar el volumen total a 300 pl.

7. Dejar que las células interaccionen durante 15 minutos con agitación cuidadosa de la placa de micropocillos cada 3 minutos, mantener las células en la estufa de incubación a un 5 % de CO2, 37 °C.

8. Colocar la placa en la unidad de imán durante 15 minutos para ensamblar entre sí las células obtenidas, células magnetizadas y diana.

9. Retirar la placa de la unidad de imán e incubar a un 5 % de CO2, 37 °C.

La FIG. 7 muestra las diferencias morfológicas entre los cuatro cuadrantes como resultado del diferente número de células por pocillo y la proporción entre células de presentación magnetizadas y células diana (no magnetizadas). Más específicamente, el cuadrante superior derecho (solo células de presentación magnetizadas) muestra una morfología, forma y tamaño distintos en relación con el cuadrante superior izquierdo con la célula diana presente. Más específicamente, en el cuadrante superior izquierdo, el tamaño global se mantiene casi igual a medida que el número de células de presentación magnetizadas disminuye de 50K (pocillos de la izquierda) a 0K o ninguna célula (pocillos de la derecha), pero el tamaño se mantuvo casi igual, con la excepción de los pocillos sin células de presentación magnetizadas (0K CML, pocillos de la derecha). Esto indica que la célula de presentación magnetizada se obtiene y se facilita el crecimiento de la célula diana.

A continuación, en el cuadrante inferior derecho, donde el número de células de presentación magnetizadas se mantuvo constante a 25K y el número de células diana (no magnetizadas) se incrementó, las estructuras en 3D se incrementaron en tamaño a medida que se incrementaba el número de células diana. De nuevo, esto demuestra que las células diana se obtienen y se facilita el crecimiento por las células de presentación magnetizadas.

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Documento US20060063252 Cell culture method and cell sheet

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Documento US8815231 Systems and methods for magnetic guidance and patterning of materials

Documento 14/723.461, MAGNETIC STEM CELL THERAPY FOR LESIONS, también documento 62/005.383, 30 de mayo de 2014, 62/033.017, 4 de agosto de 2014.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de aislamiento de células diana de una mezcla de células, que comprende:

d) lavar las células no diana, aislando, de este modo, dichas células diana.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dichos ligandos que comprenden sitios de unión a antígeno y dicho compañero de unión comprende un antígeno que se reconoce por dichos sitios de unión a antígeno.

3. El procedimiento de la reivindicación 1-2, en el que dichas células de presentación magnetizadas son fibroblastos.

4. El procedimiento de la reivindicación 1-2, en el que dichas células de presentación magnetizadas son de una línea de células derivada de fibroblastos.

5. El procedimiento de la reivindicación 1-4, en el que dichas células diana y dichas células de presentación magnetizadas son humanas.

6. El procedimiento de las reivindicaciones 1-5, que comprende la otra etapa de cultivar en 3D dichas células de presentación magnetizadas unidas a dichas células diana.

7. El procedimiento de las reivindicaciones 1-5, que comprende la otra etapa de cultivar en 3D dichas células de presentación magnetizadas unidas a dichas células diana en un campo magnético, de modo que dichas células de presentación magnetizadas unidas a dichas células diana se hagan levitar.

8. El procedimiento de las reivindicaciones 1-7, en el que dichas células de presentación magnetizadas se proporcionan tratando células que presentan uno o más ligandos con nanopartículas magnéticas.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dichas nanopartículas magnéticas se introducen en dichas células que presentan uno o más ligandos por bombardeo, inyección, electroporación, presión magnética, hidrogeles o liposomas catiónicos.

10. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dichas nanopartículas magnéticas se introducen en dichas células que presentan uno o más ligandos con una composición que comprende:

a) una nanopartícula cargada negativamente;

b) una nanopartícula cargada positivamente; y

c) una molécula de soporte,

11. Un procedimiento de aislamiento de células diana de una mezcla de células, que comprende:

) una nanopartícula cargada negativamente;

i) una nanopartícula cargada positivamente; y

ii) una molécula de soporte;

v) en la que una de dicha nanopartícula cargada negativamente o nanopartícula cargada positivamente es un elemento o compuesto magnéticamente sensible, y en la que dicha molécula de soporte mantiene dicha nanopartícula cargada negativamente y dicha nanopartícula cargada positivamente en una mezcla íntima formando una estructura fibrosa similar a estera;

12. El procedimiento de la reivindicación 11, que comprende la otra etapa de separar las células de presentación magnetizadas de las células diana.

13. El procedimiento de la reivindicación 11, que comprende la otra etapa de cultivar en 3D dichas células de presentación magnetizadas en aislamiento unidas a dichas células diana en un campo magnético suficiente como para hacer levitar dichas células magnetizadas en aislamiento unidas a dichas células diana.

14. El procedimiento de las reivindicaciones 11-13, a) en el que la molécula de soporte comprende péptidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, polímeros, poli lisina, fibronectina, colágeno, laminina, BSA, hialuronano, glucosaminoglucano, glucosaminoglucano aniónico no sulfatado, gelatina, ácido nucleico, mezclas de proteínas de la matriz extracelular, anticuerpos o mezclas o derivados de los mismos, b) en el que dicha nanopartícula cargada negativamente es una nanopartícula de oro, y c) en el que dicha nanopartícula cargada positivamente es una nanopartícula de óxido de hierro.

15. Un procedimiento de manipulación de células diana, que comprende:

16. Un complejo de células magnéticas que comprende:

b) al menos una célula diana que tiene al menos un compañero de unión en una superficie de la al menos una célula diana,

17. El complejo de células magnéticas de la reivindicación 16, en el que dicho al menos un ligando comprende sitio(s) de unión a antígeno y dicho al menos un compañero de unión comprende un antígeno que se reconoce por dicho(s) sitio(s) de unión a antígeno.

18. El complejo de células magnéticas de las reivindicaciones 16-17, en el que la al menos una célula de presentación magnetizada comprende nanopartículas magnéticas.