BR112020002694A2

BR112020002694A2 - uso de células magnéticas para manipular células não magnéticas

Info

Publication number: BR112020002694A2
Application number: BR112020002694-8A
Authority: BR
Inventors: Glauco R. Souza
Original assignee: Greiner Bio-One North America, Inc.
Priority date: 2017-08-08
Filing date: 2018-08-01
Publication date: 2020-08-25
Also published as: US20200239833A1; JP7136885B2; HUE057208T2; ES2898883T3; JP2020530773A; WO2019032345A1; EP3665269B1; EP3665269A1; PL3665269T3

Abstract

Métodos de uso de células de visualização magnéticas para substituir anticorpos secundários e esferas magnéticas em quaisquer métodos de manipulação de células. Células que exibem ligantes para células alvo são magnetizadas e, então, usadas para se ligar às células alvo. O complexo pode, então, ser coletado em um campo magnético e, assim, ser manipulado de acordo com as necessidades da aplicação.

Description

USO DE CÉLULAS MAGNÉTICAS PARA MANIPULAR CÉLULAS NÃO MAGNÉTICAS PEDIDOS ANTERIORES RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica a prioridade do pedido norte americano em série nº 62/542,745, depositado em 8 de agosto de 2017, e incorporado por referência em sua totalidade para todas as finalidades.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A invenção se refere a materiais, métodos de produção e métodos de uso de células magnéticas como uma ferramenta para coletar e manipular outras células, bem como a um complexo de células magnéticas compreendendo pelo menos uma célula de visualização magnetizada e pelo menos uma célula alvo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] O uso de esferas magnéticas para selecionar e enriquecer células é conhecido há muito tempo. De fato, existem diversos fornecedores comerciais de tecnologias de classificação de células com base em esferas magnéticas, incluindo Mojosort, EasySep, MACS MicroBead Technology, Dynabeads, para citar apenas alguns. Assim, a tecnologia está bem desenvolvida e é bem conhecida no estado da técnica.

[0004] Existem muitas variações nas técnicas de separação de células magnéticas, porém, um método importante utiliza anticorpos para marcar as células de interesse e, então, um campo magnético para coletar estas células marcadas, usualmente por meio de um segundo anticorpo que está conjugado a uma esfera magnética.

[0005] Usualmente, um coquetel de anticorpos irá se ligar tanto à célula de interesse (seleção positiva) ou à célula de não interesse (seleção negativa). Após uma curta incubação, a adição de esferas de nanopartículas magnéticas à mistura de células, então, se ligam aos anticorpos da incubação prévia, com frequência, por meio de um anticorpo secundário que tenha sido conjugado à esfera magnética. Após outra curta incubação, as células podem, então, ser posicionadas dentro de um campo magnético. Após poucos minutos, o anticorpo ligado às células será atraído em direção ao ímã e tanto as células ligadas ou as células não ligadas podem ser coletadas. Esta tecnologia permite o isolamento rápido e fácil de populações de células a partir de populações em massa e uma variedade de aplicações foram desenvolvidas com base nestes princípios básicos.

[0006] No entanto, o isolamento de células com base em anticorpos magnéticos envolve algum investimento inicial na compra de ímãs (por volta de $ 1000) e kits de anticorpo (que variam de $ 300 - $ 700). Em adição, as esferas não são naturais e, portanto, são removidas para posterior cultura ou são retidas, porém, contribuem para a artificialidade do ambiente. Assim, embora essas abordagens com base em esferas sejam muito úteis, ainda há espaço para métodos aprimorados de isolamento de células que evitam o uso de esferas de anticorpos magneticamente conjugadas caras, evitam o uso de materiais de esferas artificiais e produtos químicos e fornecem a melhor coleta possível de células, para técnicas adicionais, tais como ensaio ou cultura, especialmente cultura em 3D.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] Aqui, apresentamos um novo uso para células magnetizadas ou pequenos aglomerados de células magnetizadas montadas em 3D, em que as células são projetadas para exibir anticorpos anti-alvo que irão se ligar às células alvo. Estas células de visualização magnetizadas podem ser usadas no lugar de esferas magnéticas para o enriquecimento celular. Então, as esferas não são mais necessárias, nem um segundo anticorpo é necessário.

[0008] As células de visualização magnetizadas exibem, preferencialmente, anticorpos ou porções de ligação de antígeno dos mesmos em suas superfícies, porém, qualquer outro receptor, ligante, produto químico ou um membro de um par de ligação específico para o alvo pode ser usado. Tais “marcadores de superfície de exibição” podem ser nativos, geneticamente projetados, super-expressos ou podem ser quimicamente adicionados às células. Em adição, as células magnetizadas de órgãos específicos que são alvos de metástase de tipos celulares de cânceres específicos podem ser usadas, bem como podem ser células irradiadas ou células não proliferativas. O ponto é que as células de visualização magnetizadas carregam características químicas ou físicas particulares a fim de marcar as células de interesse, assim, se ligando às mesmas. Todas estas células são aqui chamadas “células de visualização magnetizadas”.

[0009] As células de visualização magnetizadas podem também carregar montado em moléculas ou átomos fluorescentes, por exemplo, proteínas de fluorescência verde (GFP), ou outros marcadores, os quais podem ser usados para identificar eventos de ligação células-célula ou podem ser usados para facilitar a classificação das células. Essas células são chamadas de “células de exibição marcadas magnetizadas” e também podem ser chamadas de “células de exibição fluorescentes magnetizadas”, nas quais o marcador é um marcador fluorescente.

[00010] Na medida em que as células de fibroblastos são usadas como células de visualização magnetizadas, elas podem ser retidas na cultura para uso como, por exemplo, células alimentadoras ou substituto do estroma nativo. Isso é particularmente benéfico no caso de culturas em 3D, as quais se beneficiam da cultura com células alimentadoras, por exemplo, ao reprogramar condicionalmente as células e cultivar células tumorais circulantes, células tronco e células primárias.

[00011] Além disso, na medida em que células imunes são usadas como células de visualização magnetizadas, elas podem, então, ser retidas na cultura para uso como, por exemplo, macrófago, células T e células apresentadoras de antígeno. Isso é particularmente benéfico no caso de captura de células apresentadoras de antígenos e células T por meio da magnetização das células apresentadoras de antígenos. Isso também pode beneficiar o processo de ativação de células imunes, bem como a captura.

[00012] A fim de impedir que o fibroblasto ou as células imunes ultrapassem a cultura de células, o agente seletivo é removido e as células, as quais são geralmente geneticamente projetadas para exibir marcadores de superfície, retardam seu crescimento devido à carga de expressão, permitindo que as células alvo selecionadas compitam de forma mais eficaz. Alternativamente, outras pressões seletivas negativas podem ser usadas, tais como a remoção de um nutriente essencial em um mutante condicional, a seleção da temperatura (mutante p-53 sensível à temperatura e mutantes de SV40), irradiação e similares.

[00013] A criação de células que exibem anticorpos alvo em suas superfícies é bem conhecida. Phage display tem sido usada há muito tempo na maturação de anticorpo por afinidade in vitro e sistemas de exibição de superfícies de células bacterianas e de leveduras também foram desenvolvidos. Os sistemas de “exibição em células de mamíferos” já foram desenvolvidos, assim, evitando potencialmente quaisquer etapas necessárias na transferência dos genes de anticorpo selecionados para outro tipo de célula. Qualquer outro método poderia ser também utilizado.

[00014] Em maiores detalhes, a estratégia de exibição em células de mamíferos desenvolvida por Ho, 2009, usou células renais embrionárias humanas 293T (HEK-293T), porém, outros tipos de células, especialmente células de fibroblastos, podem ser usados. A exibição em células de mamíferos depende da transfecção transitória do DNA que codifica o anticorpo para promover níveis muito altos de expressão de anticorpo em células de mamíferos. Além disso, os anticorpos de camundongo ou humano expressos podem conter as modificações pós traducionais que são necessárias para a função do anticorpo. Foi sugerido que a exibição em células de mamíferos poderia ser usada para expressar os fragmentos de anticorpo recombinante que não podem ser expressos em E. coli.

[00015] Para exibir o Fv na superfície celular, o scFv é fundido ao domínio transmembrana do receptor do fator de crescimento humano derivado de plaquetas (PDGFR) (FIG. 1), embora outras proteínas transmembrana possam ser utilizadas. O vetor de expressão continha, por exemplo, o promotor do citomegalovírus, a sequência de nucleotídeos que codifica o peptídeo sinal da cadeia Igκ de murino (METDTLLLWVLLLWVPGSTGD), o scFv, um marcador myc e o domínio transmembrana (aminoácidos Ala513 - Arg561) do PDGFR. O marcador do epítopo myc no terminal carboxila do scFv foi usado para medir o nível de expressão. Ho expressou scFv anti-CD22 (RFB4) em células HEK-293T (FIG. 2). A localização da superfície da fusão scFv - PDGFR foi verificada por microscopia confocal de fluorescência e citometria de fluxo. As células marcadas simultaneamente com proteínas CD22-Fc biotiniladas e um mAb anti-c-myc foram examinadas por microscopia confocal de varredura a laser (não mostrada).

[00016] As células são, então, selecionadas por, por exemplo, classificação FACS, e os genes scFV são recuperados e colocados em qualquer tipo de célula desejado. Alternativamente, as células de exibição selecionadas podem ser magnetizadas como estão e usadas diretamente nos métodos acima descritos.

[00017] As células de exibição são magnetizadas por incubação com um material de nanopartículas magnéticas, tais como aqueles descritos no WO 2010/036957 e no WO 2011/038370 por Nano3D Biosciences®. Alternativamente, uma variação do conjunto de nanopartículas está comercialmente disponível por Nano3D Biosciences® (Houston TX), sob o nome comercial NANOSHUTTLE™. Esse novo material magnético fornece um método superior de magnetização de células sem o uso de agentes tóxicos ou infecciosos, e as células permanecem magnetizadas quando o material é lavado.

[00018] As células de exibição podem também ser magnetizadas com qualquer nanopartícula magnética que pode ser ocupada pela célula ou, de outra forma, introduzida na célula, por exemplo, por jateamento, injeção, eletroporação, transdução, lipossomas catiônicos, hidrogeis, pressão magnética, e similares. É antecipado que quaisquer meios de introdução serão suficientes, embora o NanoShuttle, por ser o método que menos perturba a célula, é, então, preferido. Usando NanoShuttle, as nanopartículas magnéticas são ocupadas pelas células de exibição e retidas por cerca de 2 semanas. Ao usar pequenos aglomerados de células de visualização magnetizadas montadas em 3D, a magnetização pode ser retida por meses. As células, então, são agora magnetizadas e ainda exibem os sítios de ligação de antígeno ou outro marcador de superfície que irá direcionar a célula de interesse.

[00019] As células de visualização magnéticas são, então, combinadas com as células alvo e incubadas para permitir sítios de ligação de antígeno para se ligar a algum epítopo na superfície das células alvo. Estas células podem, então, ser coletadas pela aplicação de um forte campo magnético. As células de exibição magnética podem, então, ser usadas em qualquer método nos quais as esferas magnéticas foram previamente usadas, incluindo em manipulações de célula, mudança de meio, isolamento ou enriquecimento de células, expansão de célula, cultura de célula em 3D, levitação de célula, agregação de célula, “coramento” para aplicação em bio impressão e para localizar células de visualização magnetizadas in vivo com o uso de campos magnéticos direcionados.

[00020] As etapas gerais do método incluem:

1. Selecionar o anticorpo ou células que exibem região variável para a célula alvo de interesse. Esta etapa pode ser opcional se as células que exibem anticorpo ou células que exibem ligante já estiverem disponíveis, como é frequentemente o caso. Pode, no entanto, ser necessário transferir os genes requeridos para outros tipos de célula, dependendo da aplicação.

2. Tratar as células de exibição com NANOSHUTTLE™ ou qualquer outro método, de modo que as células captem nanopartículas magnéticas.

3. Incubar a célula de exibição magnética com células alvo e permitir que as células de visualização magnéticas se liguem às células alvo.

4. Coletar as células magnéticas e células ligadas às mesmas com um campo magnético. As células podem ser lavadas uma ou mais vezes, o meio pode ser modificado e similares.

5. Opcionalmente, a cultura de célula em 2D ou 3D das células de visualização magnetizadas e mistura de células alvo.

6. Opcionalmente, realizar qualquer ensaio ou imagem é de interesse para a aplicação ou uso da cultura de célula em 3D para a terapêutica in vivo.

7. Opcionalmente, a bio impressão das células de visualização magnetizadas e mistura de células alvo.

[00021] A invenção inclui qualquer uma ou mais das seguintes concretizações, em todas as possíveis combinações:

[00022] Um método para o isolamento de células alvo a partir de uma mistura de células, compreendendo: a) combinar uma mistura de células compreendendo células alvo e células não alvo com células de visualização magnetizadas que exibem um ou mais ligantes em suas superfícies, os referidos ligantes específicos para um parceiro de ligação em uma superfície das referidas células alvo; b) permitir que o referido ligante se ligue ao referido parceiro de ligação para produzir células de visualização magnetizadas ligadas às referidas células alvo; c) aplicar um campo magnético para coletar as referidas células de visualização magnetizadas ligadas às referidas células alvo; e d) lavar as células não alvo, isolando, assim, as referidas células alvo.

[00023] Qualquer método daqui, em que os referidos ligantes compreendendo sítios de ligação de antígeno e o referido parceiro de ligação compreende um antígeno que é reconhecido pelos referidos sítios de ligação de antígeno.

[00024] Qualquer método daqui, em que as referidas células de visualização magnetizadas são fibroblastos ou células imunes.

[00025] Qualquer método daqui, em que as referidas células de visualização magnetizadas são de uma linhagem celular derivada de fibroblasto.

[00026] Qualquer método daqui, em que as referidas células alvo e as referidas células de visualização magnetizadas são humanas.

[00027] Qualquer método daqui, compreendendo a etapa adicional de cultura em 3D das referidas células de visualização magnetizadas ligadas às referidas células alvo.

[00028] Qualquer método daqui, compreendendo a etapa adicional de cultura em 3D das referidas células de visualização magnetizadas ligadas às referidas células alvo em um campo magnético de modo que as referidas células de visualização magnetizadas ligadas às referidas células alvo são levitadas.

[00029] Qualquer método daqui, compreendendo a etapa adicional de ensaio das referidas células alvo.

[00030] Qualquer método daqui, compreendendo a etapa adicional de bio impressão das referidas células de visualização magnetizadas ligadas às referidas células alvo.

[00031] Qualquer método daqui, em que as referidas células de visualização magnetizadas são fornecidas pelo tratamento das células que exibem um ou mais ligantes com nanopartículas magnéticas.

[00032] Qualquer método daqui, em que as referidas nanopartículas magnéticas são introduzidas nas referidas células que exibem um ou mais ligantes por jateamento, injeção, eletroporação, pressão magnética, hidrogeis ou lipossomas catiônicos.

[00033] Qualquer método daqui, em que as referidas nanopartículas magnéticas são introduzidas nas referidas células que exibem um ou mais ligantes com uma composição compreendendo: a) uma nanopartícula negativamente carregada; b) uma nanopartícula positivamente carregada; e c) uma molécula de suporte, d) em que uma da referida nanopartícula negativamente carregada ou nanopartícula positivamente carregada é um elemento ou composto magneticamente responsivo e em que a referida molécula de suporte mantém a referida nanopartícula negativamente carregada e a referida nanopartícula positivamente carregada em uma mistura íntima que forma uma estrutura fibrosa semelhante a um tapete.

[00034] Um método para o isolamento de células alvo a partir de uma mistura de células, compreendendo: a) combinar células que exibem um ou mais sítio(s) de ligação de antígeno em suas superfícies com uma composição para formar células de visualização magnetizadas, a referida composição compreendendo: i) uma nanopartícula negativamente carregada; ii) uma nanopartícula positivamente carregada; e iii) uma molécula de suporte;

iv) em que uma da referida nanopartícula negativamente carregada ou nanopartícula positivamente carregada é um elemento ou composto magneticamente responsivo e em que a referida molécula de suporte mantém a referida nanopartícula negativamente carregada e a referida nanopartícula positivamente carregada em uma mistura íntima que forma uma estrutura fibrosa semelhante a um tapete; b) combinar uma mistura de células compreendendo células alvo e células não alvo com as referidas células de visualização magnetizadas; c) permitir que o(s) referido(s) sítio(s) de ligação de antígeno se liguem a uma ou mais célula(s) alvo exibindo um antígeno que é reconhecido pelo(s) referido(s) sítio(s) de ligação de antígeno; d) aplicar um campo magnético para coletar células de visualização magnetizadas ligadas às referidas células alvo; e e) lavar as células não alvo, isolando, assim, células de visualização magnetizadas ligadas às referidas células alvo.

[00035] Qualquer método aqui descrito, compreendendo a etapa adicional de separação das células de visualização magnetizadas das células alvo.

[00036] Qualquer método aqui descrito, em que a etapa adicional de separação das células de visualização magnetizadas das células alvo compreende o uso de um excesso de ligante não ligado para a ligação competitiva, uso de enzimas que clivam sítios específicos de um membro do par de ligação, em particular do antígeno ou dos sítio(s) de ligação de antígeno, ou uso de enzimas que clivam, de forma não específica, proteínas de superfície dos membros do par de ligação, em particular, tripsina, papaína, dispase, colagenase, hialuronidase ou uma mistura das mesmas.

[00037] Um método para o isolamento de células alvo a partir de uma mistura de células, compreendendo: a) combinar células que exibem um ou mais sítio(s) de ligação de antígeno em suas superfícies com uma composição para formar células de visualização magnetizadas, a referida composição compreendendo: i) uma nanopartícula negativamente carregada; ii) uma nanopartícula positivamente carregada; e iii) uma molécula de suporte; iv) em que uma da referida nanopartícula negativamente carregada ou nanopartícula positivamente carregada é um elemento ou composto magneticamente responsivo e em que a referida molécula de suporte mantém a referida nanopartícula negativamente carregada e a referida nanopartícula positivamente carregada em uma mistura íntima que forma uma estrutura fibrosa semelhante a um tapete; b) combinar a mistura de células compreendendo células alvo e células não alvo com as referidas células de visualização magnetizadas; c) permitir que o(s) referido(s) sítio(s) de ligação de antígeno se liguem a uma ou mais célula(s) alvo que exibem um antígeno que é reconhecido pelo referido sítio(s) de ligação de antígeno; d) aplicar um campo magnético para coletar células de visualização magnetizadas ligadas às referidas células alvo; e e) lavar células não alvo, isolando, assim, células de visualização magnetizadas ligadas às referidas células alvo; e f) cultivar em 3D as referidas células de visualização magnetizadas isoladas ligadas às referidas células alvo em um campo magnético suficiente para levitar as referidas células magnetizadas isoladas ligadas às referidas células alvo.

[00038] Qualquer método daqui, em que: a) a molécula de suporte compreende peptídeos, polissacarídeos, ácidos nucleicos, polímeros, poli-lisina, fibronectina, colágeno, laminina, BSA, hialuronana, glicosaminoglicana, glicosaminoglicana aniônica não sulfatada, gelatina, ácido nucleico, misturas de proteínas da matriz extracelular, anticorpo ou misturas ou derivados dos mesmos, b) a referida nanopartícula negativamente carregada é uma nanopartícula de ouro, e c) a referida nanopartícula positivamente carregada é uma nanopartícula de óxido de ferro.

[00039] Um método de manipulação de células alvo , compreendendo: a) combinar células alvo com células de visualização magnetizadas que exibem um ou mais ligantes em suas superfícies, os referidos ligantes por ligarem-se, de forma específica, a uma molécula alvo em uma superfície das referidas células alvo;

b) permitir que os referidos ligantes se liguem à referida molécula alvo para produzir células de visualização magnetizadas ligadas às referidas células alvo; c) aplicar um campo magnético para coletar as referidas células de visualização magnetizadas ligadas às referidas células alvo, permitindo, assim, a manipulação das referidas células alvo.

[00040] Em concretizações preferidas, as células são levitadas com uma composição compreendendo: a) uma nanopartícula negativamente carregada; b) uma nanopartícula positivamente carregada; e c) uma molécula de suporte, em que uma da referida nanopartícula negativamente carregada ou nanopartícula positivamente carregada contém um material magneticamente responsivo, tal como ferro ou óxido de ferro, e em que a referida molécula de suporte mantém a referida nanopartícula negativamente carregada e a referida nanopartícula positivamente carregada em uma mistura íntima.

[00041] Mais preferida, a composição é o NANOSHUTTLE™, que é conhecido por ser muito eficaz e o qual está comercialmente disponível por Nano3D BioSciences (Houston TX).

[00042] Além disso, tal como descrito em patentes anteriores, culturas em 3D de formatos variados podem ser feitas modificando o formato do campo magnético. Por exemplo, um ímã em anel pode ser usado para fazer uma cultura 3D em forma de anel ou rosca. Os campos magnéticos também podem ser usados para manter ou alterar essa forma durante os processos de descelularização e recelularização.

[00043] Um complexo de células magnéticas compreendendo: a) pelo menos uma célula de visualização magnetizada que exibe pelo menos um ligante em uma superfície de pelo menos uma célula de visualização magnetizada; e b) pelo menos uma célula alvo que apresenta pelo menos um parceiro de ligação em uma superfície de pelo menos uma célula alvo; em que o referido pelo menos um ligante na superfície de pelo menos uma célula de visualização magnetizada se liga ao referido parceiro de ligação na superfície de pelo menos uma célula alvo de modo a formar o complexo de células magnéticas.

[00044] Qualquer complexo de células magnéticas daqui, em que o referido pelo menos um ligante compreende sítio(s) de ligação de antígeno e o referido pelo menos um parceiro de ligação compreende um antígeno que é reconhecido pelo(s) referido(s) sítio(s) de ligação de antígeno.

[00045] Qualquer complexo de células magnéticas daqui, em que a pelo menos uma célula de visualização magnetizada compreende nanopartículas magnéticas.

[00046] Qualquer complexo de células magnéticas daqui, em que a pelo menos uma célula de visualização magnetizada compreende nanopartículas magnéticas, as referidas nanopartículas magnéticas compreendendo: i) uma nanopartícula negativamente carregada;

ii) uma nanopartícula positivamente carregada; e iii) uma molécula de suporte; iv) em que uma da referida nanopartícula negativamente carregada ou nanopartícula positivamente carregada é um elemento ou composto magneticamente responsivo e em que a referida molécula de suporte mantém a referida nanopartícula negativamente carregada e a referida nanopartícula positivamente carregada em uma mistura íntima que forma uma estrutura fibrosa semelhante a um tapete.

[00047] Qualquer complexo de células magnéticas daqui, capaz de ser obtido, em particular, por qualquer um dos métodos de isolamento de células alvo a partir de uma mistura de células daqui.

[00048] Qualquer complexo de células magnéticas daqui, capaz de ser obtido, em particular, pelo método de manipulação de células alvo.

[00049] As seguintes abreviações podem ser aqui utilizadas: Abreviação Definição BAP Fosfatase alcalina óssea BrEpic Epitelial brônquico 3-[(3-colamido propil) dimetil amônio]-1

CHAPS – propano sulfonato cepa de ácido nucleico fluorescente 4',

DAPI 6-diamidino-2-fenil indol- a. DMEM Meio de Eagle modificado por Dulbecco ECM Matriz extracelular EDTA Ácido etileno diamina tetra acético FBS Soro bovino fetal

HEK Rim embrionário humano HPF fibroblasto primário humano mECM ECM magnético mECM - HPF ECM magnético a partir de células HPF NNDF fibroblastos dérmicos neonatais humanos - NP nanopartícula negativamente carregada + NP nanopartícula positivamente carregada NS NANOSHUTTLE™ P / S Penicilina / Estreptomicina PBS Solução salina tamponada com fosfato PL Poli-lisina pNPP p-nitro fenil fosfato RT Temperatura ambiente SDS Dodecil sulfato de sódio SM Molécula de suporte SMC Células do músculo liso TX100 Triton - X100

[00050] Aqui, por “cultura”, incluímos a cultura de tipos de única célula ou a co-cultura de mais de um tipo de célula.

[00051] Como aqui utilizado, uma “nanopartícula positivamente carregada” ou “nanopartícula positiva” é definida como qualquer partícula menor do que 200 nm, preferencialmente 100 nm ou menos, que apresenta uma carga geral positiva. Preferencialmente, a partícula é não tóxica, porém, esta não é essencial uma vez que as partículas não permanecem com as células.

[00052] Como aqui utilizado, uma “nanopartícula negativamente carregada” ou “nanopartícula negativa” é como definida como qualquer partícula menor do que 200 nm, preferencialmente 100 nm e mais preferencialmente cerca de 2 - 25 nm, que apresenta uma carga geral negativa. Preferencialmente, Preferencialmente, a partícula é não tóxica, porém, esta não é essencial uma vez que as partículas não permanecem com as células por um longo período de tempo.

[00053] Como aqui utilizado “elemento magneticamente responsivo” pode ser qualquer elemento ou molécula que responda a um campo magnético. Conforme detalhado abaixo, uma das nanopartículas deve conter ou ser um elemento magneticamente responsivo.

[00054] Como aqui utilizado “molécula de suporte” se refere a qualquer molécula longa que interaja com as nanopartículas para criar uma estrutura fibrosa tipo tapete ou gel e, assim, mantenha a nanopartícula magnética próxima à célula para absorção. Uma molécula de suporte preferida é a poli-lisina.

[00055] Aqui, por “célula tronco”, incluímos células totipotentes e multipotentes, a menos que seja especificamente indicado de outra forma.

[00056] Por “exibição de anticorpo”, queremos dizer que a célula exibe o sítio de ligação de antígeno de um antígeno específico em sua superfície celular. No entanto, todo o gene do anticorpo não precisa ser usado e, normalmente, não é. Em vez disso, este é fundido com alguma outra proteína, tipicamente uma proteína transmembrana. No entanto, a proteína de fusão irá reter as propriedades específicas de ligação de um anticorpo.

[00057] Por “célula de exibição”, queremos dizer uma célula que exibe uma molécula de superfície, em particular um ou mais ligantes, preferencialmente, pelo menos um sítio de ligação de antígeno e / ou anticorpo, que pode ser usado para aderir a uma célula alvo.

[00058] Por “marcador de superfície de exibição” ou “marcador de superfície”, queremos dizer aqueles marcadores, produtos químicos ou átomos exibidos na superfície que permitem a ligação específica a uma célula alvo de interesse. Moléculas de superfície preferidas incluem sítios de ligação de antígeno, anticorpos e similares, porém, outros ligantes, receptores ou produtos químicos podem ser também utilizados. O “marcador de superfície de exibição” e seu “membro de ligação cognato” são juntos conhecidos como “pares de ligação”. Outros pares de ligação são mostrados na FIG. 3 e aqui listados:

1. Interações ligante - receptor

2. Interações de proteína homotípicas ou heterotípicas

3. Interações do receptor acoplado à proteína G (GPCR)

4. EpCam para a captura de células tumorais circulantes

5. Receptores de superfície celular

6. Proteínas transmembrana

7. Integrinas

8. Proteínas de matriz extracelular, isto é, colágeno, laminina, fibronectina

9. Interação lipídeo - lipídeo

10. Interação lipídeo - proteína

11. Interação de quelação, tal como íon metálico e polipeptídeo histidina ou outras moléculas quelantes.

[00059] Por “pares de ligação”, queremos dizer dois átomos ou moléculas que se ligam uma a outra, mesmo quando um membro terciário ou membro ponte é necessário.

[00060] Por “células de visualização magnetizadas”, queremos dizer células ou aglomerados de células que exibem uma molécula de superfície que pode ser usada para aderir a um membro de ligação cognato na superfície de uma célula alvo, e o qual contém (ou no ECM ou em um revestimento de superfície) uma quantidade suficiente de nanopartículas magnéticas, de modo que a célula pode ser atraída por um campo magnético.

[00061] No contexto da presente invenção, o termo “complexo de células magnéticas” se refere a um complexo, em particular, um conjunto de pelo menos uma célula de exibição magnética e pelo menos uma célula alvo. Logo, um “complexo de células magnéticas“ como aqui utilizado se refere a um conjunto de uma única célula de visualização magnetizada e uma única célula alvo porém, também, a um conjunto de únicas células de visualização magnetizadas com mais do que uma célula alvo e vice versa. O termo ainda abrange um conjunto no qual pelo menos uma célula de exibição magnética está ligada a pelo menos uma célula alvo, a qual novamente está ligada a pelo menos uma outra célula de exibição magnética e assim por diante. O “complexo de células magnéticas“ da presente invenção está, em particular, caracterizado de modo que pelo menos uma célula de visualização magnetizada exibe pelo menos um ligante em sua superfície celular e a pelo menos uma célula alvo apresenta pelo menos um parceiro de ligação em sua superfície celular, em que o pelo menos um ligante na superfície celular da pelo menos uma célula de visualização magnetizada se liga ao parceiro de ligação na superfície celular da pelo menos uma célula alvo para formar o complexo de células magnéticas.

[00062] Como aqui utilizado “manipular”, em todas as suas conjugações, se refere a qualquer tipo de interferência. Em particular, no contexto da presente invenção, o termo é usado para descrever qualquer ato externo ou influência adequada para interferir com as células, em particular as células alvo. Em uma concretização específica “manipulação de células alvo” se refere a influência das células alvo ligadas às células de visualização magnetizadas pela aplicação de um campo magnético.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00063] A FIG. 1 é um diagrama de um plasmídeo de expressão para exibição de scFv em células de mamíferos. PCMV - promotor de citomegalovírus; Igκ SP - peptídeos sinal da cadeia Igκ de murinos; VH - região variável da cadeia pesada; VL - região variável da cadeia leve; Ligante - um ligante sintético flexível entre VH e VL; myc, uma tag de epítopo para medir o nível de expressão de scFv; PDGFR - o domínio transmembrana do receptor do fator de crescimento humano derivado de plaquetas; PSV40 / ori - promotor SV40 e replicação epissomal facilitadora da origem em células de mamíferos que expressam SV40; grande antígeno T; genes de resistência a Neo / KanR, neomicina e canamicina. Ho, 2009.

[00064] A FIG. 2 é uma ilustração esquemática da exibição em superfície em células de mamíferos. Uma tag de epítopo adicional de 10 aminoácidos (c-myc) foi fundida ao C terminal do scFv (com base no modelo estrutural anti-CD22 RFB4 Fv), permitindo a quantificação da exibição da fusão com o mAb 9E10 independente da ligação com o antígeno (CD22). A fusão com a porção N terminal do domínio transmembrana de PDGFR foi usada para ancorar o scFv na superfície celular do mamífero (HEK-293T). Ho, 2009.

[00065] A FIG. 3 é uma ilustração esquemática das interações gerais entre as células de visualização magnetizadas e as células alvo.

[00066] A FIG. 3A é a interação, incluindo proteína - proteína, lipídio - lipídio, proteína - lipídio, eletrostática, Van der Walls. No caso da coleta e montagem de células que existem em baixo número em amostras sondadas, tais como células tumorais circulantes (CTCs) ou pequenas amostras de biópsia de tecido. As células de visualização magnetizadas podem funcionar como camada de suporte ou de alimentação para suportar o crescimento de CTCs ou células de biópsia.

[00067] A FIG. 3B é a interação entre proteínas na superfície celular, tal como interações anticorpo - antígeno ou proteína - proteína.

[00068] A FIG. 3C é a interação mediada ou desencadeada pela adição de um ligante de acoplamento ou ponte (molécula ou proteína ou íon metálico) o qual irá interagir com as proteínas ou anticorpos presentes na superfície de ambos os tipos de célula. Estas moléculas podem também ser proteína, DNA na forma de aptâmeros e / ou metais se um polipeptídeo quelante, tal como poli histidina, media a interação célula - célula.

[00069] A FIG. 3D é similar a C, porém aqui as células de visualização magnetizadas são incubadas com moléculas que serão capturadas pela proteína de superfície / anticorpo, moléculas livres / não ligadas são removidas, então, a magnetizada é combinada com a célula alvo.

[00070] A FIG. 3E é similar a D, porém aqui as células alvo são incubadas com moléculas para serem capturadas pela proteína de superfície / anticorpo, moléculas livres / não ligadas são removidas e, então, células de visualização magnetizadas são combinadas com célula alvo.

[00071] A FIG. 3F são células de visualização magnetizadas modificadas com moléculas de modificação da superfície celular ou polímeros, tais como proteínas da matriz extracelular, poli-L-lisina, fibronectina, colágeno, laminina e similares. As moléculas adicionadas promovem a interação entre a célula de visualização magnetizada com a célula alvo.

[00072] A FIG. 4A – E é uma ilustração esquemática de como dissociar a interação entre as células de visualização magnetizadas e as células alvo. A ação de dissociação inclui: A. digestão enzimática, mudança na força iônica, mudança na composição do meio, mudança no pH, mudança na temperatura, ação do tensoativo. B. dissociação por uma ou mais ações de dissociação. C. Adição do excesso de ligante. D. Excesso de ligantes ou moléculas quelantes, tais como EDTA. E. Dissociação por ação de dissociação.

[00073] A FIG 5 é um layout experimental, no qual as células primárias do músculo liso da traqueia (SMC) foram magnetizadas (célula de visualização magnetizada) e células A549 de adenocarcinoma de câncer de pulmão (célula alvo) não foram magnetizadas. O SMC traqueal faz parte do sistema pulmonar / do tecido pulmonar; portanto, é esperada uma afinidade entre o SMC e as células alvo de adenocarcinoma do câncer de pulmão. O número de células utilizadas foi: 50K, 40K, 30K, 20K, 10K, e 0 ou nenhuma célula, conforme indicado nas etiquetas do conjunto de placas.

[00074] A FIG. 6 são fotomicrografias (ampliação de 2,5X) das células de acordo com o layout experimental mostrado na FIG. 5 no tempo 0. O tempo zero está imediatamente após os dois tipos de célula, um magnetizado e o outro não, serem magneticamente agregados ou bio impressos na parte inferior de uma placa de 384 poços repelente de células, depois que os dois tipos de células foram permitidos interagir por 15 a 30 minutos.

[00075] A FIG. 7 são fotomicrografias (ampliação de 2,5X) das células de acordo com o layout experimental mostrado na FIG. 5 e mostrado na FIG. 6 após 24 horas de cultura destas células.

DESCRIÇÃO DAS CONCRETIZAÇÕES DA INVENÇÃO

[00076] De forma geral, a invenção é um método de uso de uma célula de exibição magnética em qualquer uma das maneiras nas quais esferas magnéticas foram previamente utilizadas. O uso das células, em vez de esferas artificiais, significa que nenhum polímero ou agentes de reticulação ou ativadores não precisarão ser utilizados. Adicionalmente, o uso de ligantes e química associada não é mais necessária, uma vez que células magnetizadas já exibem os sítios de ligação de antígeno relevantes na superfície celular. Além disso, as células podem ser retidas e, se fibroblastos, incluindo fibroblastos irradiado, podem servir como células alimentadoras para culturas subsequentes.

[00077] As sequências alvo, preferencialmente, incluem sítios de ligação de antígeno, porém qualquer célula que direciona para uma proteína ou reagente pode ser usada. Como outra opção, as células que se ligam naturalmente às células alvo podem ser usadas, por exemplo, células imunes, células cancerígenas, células de músculo liso, células endoteliais, células ósseas, células epiteliais e similares.

[00078] Em concretizações preferidas, os materiais de magnetização incluem nanopartículas positivamente e negativamente carregadas, uma das quais deve conter um ou mais elementos magneticamente responsivos, tais como óxido de ferro de tamanho nanométrico. Estas nanopartículas são ainda combinadas com um polímero, preferencialmente um polímero celular ou sintético, ou outra molécula longa que atua como um suporte (aqui chamada "molécula de suporte") para as nanopartículas carregadas e as células, mantendo as nanopartículas no lugar para a sua absorção ou adsorção pelas células. A inclusão de ambas as nanopartículas positivas e negativas permite a mistura íntima das nanopartículas e impulsiona a montagem dos três componentes, garantindo, assim, uma distribuição uniforme e uma boa absorção. Uma molécula de suporte combina intimamente todos os três componentes com as células em uma estrutura fibrosa tipo tapete que permite que as células absorvam o elemento magneticamente responsivo.

[00079] Após um período de incubação, o material magnetizante pode ser lavado, permitindo que as células sejam manipuladas em um campo magnético. As nanopartículas magnéticas são eventualmente perdidas das células em 8 dias, porém, sabemos agora que elas são retidas pelo ECM durante a duração da cultura.

[00080] O elemento magneticamente responsivo pode ser qualquer elemento ou molécula que irá responder a um campo magnético, por exemplo, ímãs de terras raras (por exemplo, cobalto de samário (SmCo) e boro de ferro neodímio (NdFeB)), materiais magnéticos cerâmicos (por exemplo, ferrite de estrôncio), elementos magnéticos (por exemplo, ferro, cobalto, níquel e suas ligas e óxidos). São particularmente preferidos os materiais paramagnéticos que reagem a um campo magnético, porém que não são ímãs em si, uma vez que isso permite uma montagem mais fácil dos materiais.

[00081] Preferencialmente, o campo magnético usado para levitar tais células ou o ECM magnético é de cerca de 300G - 1000G. No entanto, a força do campo varia com ambos a distância da cultura e com a quantidade e tipo de elemento de resposta magnética absorvido ou adsorvido pelas células. Assim, a força de campo ótima variará, porém é facilmente determinada empiricamente.

[00082] As nanopartículas negativamente carregadas incluem metais de carga estabilizada (por exemplo, ferro, cobre, platina, paládio), porém, preferencialmente é uma nanopartícula de ouro.

[00083] As nanopartículas positivamente carregadas incluem tensoativos ou ligas poliméricas estabilizadas ou revestidas e/ou óxidos (por exemplo, ferro elementar, ferro - cobalto, óxido de níquel), e preferencialmente é uma nanopartícula de óxido de ferro.

[00084] Uma das duas nanopartículas deve ser magneticamente responsiva, porém, obviamente, uma (ou ambas) pode conter esta característica.

[00085] As nanopartículas devem apresentar um tamanho de escala nanométrica e, portanto, são de cerca de 50 nm. O tamanho pode variar, no entanto, entre cerca de 5 - 250 nm, 50 - 200 nm, 75 - 150 nm, porém eles podem ser menores ou maiores ou um conjunto de nanopartículas, desde que o tamanho seja apropriado para permitir a entrada ou adsorção do tipo de célula em uso. Partículas maiores são menos eficientes na entrada da célula. Mostramos em outros trabalhos que existe um limite superior para o tamanho efetivo da nanopartícula magnética e o tamanho do micrômetro é muito grande para a eficácia, embora algumas funcionalidades ainda tenham sido observadas

[00086] A “molécula de suporte” é, em geral, um polímero ou outra molécula longa que sirva para manter as nanopartículas e células juntas em uma mistura íntima, como um tapete de feltro emaranhado. A molécula de suporte pode estar positivamente carregada, negativamente carregada, ser de carga mista ou neutra, e pode estar em combinações de mais do que uma molécula de suporte.

[00087] Exemplos de tais moléculas de suporte incluem os polímeros naturais, tais como peptídeos, polissacarídeos, ácidos nucleicos e similares, porém polímeros sintéticos também podem ser empregados. Moléculas de suporte particularmente preferidas incluem poli-lisina, fibronectina, colágeno, laminina, BSA, hialuronana, glicosaminoglicana, glicosaminoglicana aniônica não sulfatada, gelatina, ácido nucleico, misturas de proteínas da matriz extracelular, matrigel, anticorpos e misturas e derivados dos mesmos.

[00088] De forma geral, a concentração da molécula de suporte é substancialmente maior do que a concentração das nanopartículas positivamente e negativamente carregadas, variando de 10 - 1000 vezes maior, 20 – 500 ou 50 - 200 vezes maior. No entanto, quantidades maiores ou menores são possíveis, dependendo de qual o tipo de célula está sendo usado e qual molécula de suporte e nanopartículas estão sendo utilizadas. Quanto maior o polímero, menos pode ser necessário para formar uma estrutura suficiente para manter as nanopartículas no lugar para a absorção.

[00089] Em geral, as nanopartículas são usadas em concentrações muito baixas. As concentrações podem variar entre 10–6 – 10-12 Molar, porém estão preferencialmente na faixa nanomolar, e a(s) molécula(s) de suporte 10–3 – 10-9 Molar, e estão preferencialmente na faixa micromolar. Pelo menos uma nanopartícula magnética é necessária por célula, porém, preferencialmente, existem centenas ou milhares uma vez que mais nanopartículas significa que uma menor força de campo é necessária.

[00090] Os três componentes montados por interação eletrostática e, assim, moléculas de suporte carregadas ou de carga mista, tais como a poli-lisina, são preferidas. No entanto, qualquer um dos três componentes pode ser funcionalizado, derivatizado ou revestido de modo a ainda promover a interação dos componentes e / ou das células. Assim, um ou mais membros podem ser funcionalizados, derivatizados, ou revestidos com um anticorpo que, por exemplo, se liga a um antígeno de superfície celular. Assim, as interações entre os componentes e / ou as células seriam ainda mais promovidos. Outros pares de ligação incluem receptores - ligantes, biotina - estrepavidina, ácidos nucleicos complementares, aglutinina de gérmen de trigo (WGA), ácido siálico contendo moléculas e similares.

[00091] Os revestimentos também podem incluir revestimentos de proteção ou passivação, particularmente para as nanopartículas, tais como PVP, dextrano, BSA, PEG, poli-L-lisina e similares. As nanopartículas, especialmente a nanopartícula que compreende o elemento magneticamente responsivo, podem ser marcadas para visualização, por exemplo, com um fluoróforo, rádio marcação ou similares, particularmente durante o desenvolvimento e teste in vitro das células e tecidos magnetizados. No entanto, para usos terapêuticos, pode ser preferível omitir tais marcações.

[00092] Se desejado, o conjunto de nanopartículas magnéticas pode ser feito livre de moléculas biológicas, tais como produtos de fago ou célula, porque as moléculas de suporte, tais como a poli-lisina, podem ser facilmente produzidas de forma sintética. No entanto, todos os componentes são geralmente não tóxicos, baratos ou fáceis de fazer. Além disso, as estruturas emaranhadas, fibrosas, tipo tapete ou feltro, permitem a incorporação de moléculas de suporte de células adicionais (tais como componentes de matriz extracelular) para serem incluídas nos conjuntos magnéticos de nanopartículas.

[00093] A magnetização de células com conjuntos de nanopartículas magnéticas consiste apenas na adição de conjuntos às células em, por exemplo, meios regulares de cultura de células. As células podem ser magnetizadas dentro de minutos a partir do tratamento de nanopartículas magnéticas (5 minutos) e tanto as células ligadas quanto as células suspensas podem ser tratadas com conjuntos de nanopartículas magnéticas.

[00094] As células que exibem anticorpos magnetizados são, então, incubadas com as células alvo, tais como sangue ou um tecido homogeneizado, e a célula alvo irá, então, se ligar aos sítios de ligação de antígeno das células magnetizadas, permitindo a sua coleta em um campo magnético forte. Estas podem ser lavadas uma ou mais vezes, se desejado. As células coletadas podem ser usadas como estão ou podem ser cultivadas antes da sua utilização.

[00095] Se for desejado separar as células de visualização magnetizadas das células alvo, alguns métodos são mostrados na FIG. 4. Pode-se usar o excesso de ligante não ligado para a ligação competitiva com as interações célula - célula. Outros métodos utilizam enzimas que clivam sítios específicos de um membro do par de ligação, e célula, e tais locais poderiam até ser projetados na molécula de exibição. Poderíamos também usar tripsinização, ou digestão enzimática geral com mistura enzimática, tal como papaína, dispase, colagenase, hialuronidase e tripsina e, depois, remover as células magnéticas com um ímã. Um breve "choque" de temperatura também pode dissociar algumas interações. Por fim, o EDTA também pode ser adicionado se a interação célula - célula for mediada por proteínas ou moléculas quelantes, tal como o polipeptídeo histidina.

[00096] Em uma concretização preferida, as células magnetizadas são células de fibroblasto ou células de um órgão alvo e uma cultura em 3D é iniciada, usando os fibroblastos como células alimentadoras ou células de um órgão alvo. A cultura em 3D pode ser iniciada pela aplicação de um campo magnético, o qual levita ou bio imprime as células, as quais rapidamente coalescem em uma estrutura em 3D. O formato da estrutura em 3D pode também ser modificado pela mudança do formato do campo magnético. A cultura em 3D final pode, então, ser usada em terapias com células e tecidos e, talvez, até mesmo no transplante de órgãos no futuro.

[00097] A FIG. 5 mostra o layout experimental ou de placas, enquanto a FIG. 6 mostra os resultados. A FIG. 6 demonstra que o tipo de célula associada ao tecido no qual um determinado tipo de câncer cresce in vivo, quando magnetizado, pode ser usado para coletar e cultivar as células cancerígenas alvo.

[00098] As quatro fileiras superiores e seis colunas (quadrante superior esquerdo) eram uma mistura dos dois tipos de células, na qual o número total de células foi mantido constante (em 50K células), porém a proporção entre os dois tipos de células varia conforme indicado. As quatro fileiras superiores eram réplicas das condições estabelecidas para cada coluna para mostrar reprodutibilidade. As colunas sete a doze e as quatro fileiras superiores (quadrante superior direito) são os controles para o quadrante superior esquerdo, no qual não há célula alvo (adenocarcinoma pulmonar). Nas quatro fileiras inferiores e sete a doze colunas direitas (quadrante inferior direito), o número de células de visualização magnetizada (SMC) é mantido constante em 25K células por poço e o número de células alvo (adenocarcinoma A549) variou de 0 a 50K células, conforme indicado. Nas quatro linhas inferiores e as seis primeiras colunas esquerdas (quadrante inferior esquerdo), não havia células magnetizadas (CMS) e o número de células alvo (adenocarcinoma A549) variou de 0 a 50K células.

[00099] Mais especificamente, células musculares lisas traqueais primárias (SCM) são magnetizadas (célula de visualização magnetizada) e permitidas a interagir com o adenocarcinoma A549 (célula alvo) do câncer de pulmão alvo que não está magnetizado. Dos poços de cultura expostos, apenas os poços nos quais a célula de visão magnetizada foi apresentada geraram as estruturas circulares magneticamente bio impressas (quadrantes superior esquerdo, superior direito e inferior direito). Os poços no quadrante inferior esquerdo (quatro filas inferiores e seis primeiras colunas esquerdas), aos quais foram adicionadas apenas células alvo, as células foram dispersas no poço, não foi gerado um padrão circular porque estas células não foram magnetizadas, portanto não foram guiadas para o padrão circular magnético.

[000100] O protocolo para a mistura de células de visualização magnetizadas e células não magnetizadas é como segue:

1. Separar e contar ambos os tipos de células, um para ser magnetizado (célula de visualização magnetizada) e o outro não magnetizado (célula alvo).

2. Colocar ambos os tipos de células em uma concentração de 1 milhão por mililitro.

3. Para que as células sejam magnetizadas, adicionar NanoShuttle® em uma concentração de 1 µL por 10 mil células e centrifugar a mistura 3 x a 100G por 5 minutos. As células são suavemente ressuspensas após cada método de centrifugação. Alternativamente, as células podem ser magnetizadas durante a noite pela incubação do NanoShuttle enquanto em uma cultura de monocamada.

4. Adicione a quantidade desejada ou desconhecida das células não magnetizadas ao poço.

5. Adicionar a quantidade desejada de células magnetizadas ao poço.

6. Adicionar meio ao poço para aumentar o volume total para 300 µL.

7. Deixas as células interagirem por 15 minutos com agitação suave da placa de micro poços a cada 3 minutos - manter as células na incubadora a 5 % de CO2, 37 °C.

8. Posicionar a placa na unidade de ímã por 15 minutos para montar as células coletadas, magnetizadas e células alvo.

9. Remover a placa da unidade de ímã e incubar a 5 % de CO2, 37 °C.

[000101] A FIG. 7 mostra diferenças morfológicas entre todos os quatro quadrantes como um resultado do diferente número de células por poço e proporção entre as células de visualização magnetizadas e células alvo (não magnetizadas). Mais especificamente, quadrante superior direito (apenas células de visualização magnetizadas) mostram morfologia, formato e tamanho distintos em relação ao quadrante superior esquerdo com a célula alvo presente. Mais especificamente, no quadrante superior esquerdo, o tamanho geral é mantido quase o mesmo que o número de células de visualização magnetizadas diminui de 50K (poços da esquerda) para 0K ou nenhuma célula (poços da direita), porém o tamanho permaneceu aproximadamente o mesmo, com a exceção dos poços com nenhuma célula de visualização magnetizadas (0K SMC, poços da direita). Isto indica que a célula de visualização magnetizada é coletada e facilita o crescimento da célula alvo.

[000102] Em seguida, no quadrante inferior direito, no qual o número de células de visualização magnetizadas foi mantido constante em 25K e o número de células alvo (não magnetizadas) aumentou, as estruturas em 3D aumentaram de tamanho à medida que o número de células alvo aumentou.

Novamente, isso mostra que as células alvo estão sendo coletadas e facilitadas a crescer pelas células de visualização magnetizadas.

[000103] As referências a seguir são aqui incorporadas em sua totalidade por toda e qualquer finalidade.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para o isolamento de células alvo a partir de uma mistura de células, caracterizado pelo fato de compreender: a) combinar uma mistura de células que compreendem células alvo e células não alvo com células de visualização magnetizadas que exibem um ou mais ligantes em suas superfícies, os referidos ligantes específicos para um parceiro de ligação em uma superfície das referidas células alvo; b) permitir que o referido ligante se ligue ao referido parceiro de ligação para produzir células de visualização magnetizadas ligadas às referidas células alvo; c) aplicar um campo magnético para coletar as referidas células de visualização magnetizadas ligadas às referidas células alvo; e d) lavar as células não alvo, isolando, assim, as referidas células alvo.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de os referidos ligantes compreenderem sítios de ligação de antígeno e o referido parceiro de ligação compreender um antígeno que é reconhecido pelos referidos sítios de ligação de antígeno.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de as referidas células de visualização magnetizadas serem fibroblastos.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de as referidas células de visualização magnetizadas serem de uma linhagem celular derivada de fibroblasto.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de as referidas células alvo e as referidas células de visualização magnetizadas serem humanas.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de compreender a etapa adicional de cultura 3D das referidas células de visualização magnetizadas ligadas às referidas células alvo.

7. Método, de acordo com qualquer umas das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de compreender a etapa adicional de cultura 3D das referidas células de visualização magnetizadas ligadas às referidas células alvo em um campo magnético de modo que as referidas células de visualização magnetizadas ligadas às referidas células alvo são levitadas.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de as referidas células de visualização magnetizadas serem fornecidas pelo tratamento de células que exibem um ou mais ligantes com nanopartículas magnéticas.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de as referidas nanopartículas magnéticas serem introduzidas nas referidas células que exibem um ou mais ligantes por jateamento, injeção, eletroporação, pressão magnética, hidrogeis ou lipossomas catiônicos.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de as referidas nanopartículas magnéticas serem introduzidas nas referidas células que exibem um ou mais ligantes com uma composição compreendendo: a) uma nanopartícula negativamente carregada; b) uma nanopartícula positivamente carregada; e c) uma molécula de suporte, d) em que uma da referida nanopartícula negativamente carregada ou nanopartícula positivamente carregada é um elemento ou composto magneticamente responsivo; e em que a referida molécula de suporte mantém a referida nanopartícula negativamente carregada e a referida nanopartícula positivamente carregada em uma mistura íntima que forma uma estrutura fibrosa semelhante a um tapete.

11. Método para o isolamento de células alvo a partir de uma mistura de células caracterizado pelo fato de compreender: a) combinar células que exibem um ou mais sítio(s) de ligação de antígeno em suas superfícies com uma composição para formar células de visualização magnetizadas, a referida composição compreendendo: i) uma nanopartícula negativamente carregada; ii) uma nanopartícula positivamente carregada; e iii) uma molécula de suporte; iv) em que uma da referida nanopartícula negativamente carregada ou nanopartícula positivamente carregada é um elemento ou composto magneticamente responsivo, e em que a referida molécula de suporte mantém a referida nanopartícula negativamente carregada e a referida nanopartícula positivamente carregada em uma mistura íntima que forma uma estrutura fibrosa semelhante a um tapete; b) combinar uma mistura de células compreendendo células alvo e células não alvo com as referidas células de visualização magnetizadas; c) permitir que os referidos sítio(s) de ligação de antígeno se liguem a uma ou mais célula(s) alvo(s) que exibem um antígeno que é reconhecido pelo(s) referido(s) sítio(s) de ligação de antígeno; d) aplicar um campo magnético para coletar as células de visualização magnetizadas ligadas às referidas células alvo; e e) lavar as células não alvo, isolando, assim, as células de visualização magnetizadas ligadas às referidas células alvo.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de compreender a etapa adicional de separar as células de visualização magnetizadas das células alvo.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de compreender a etapa adicional de cultura 3D das referidas células de visualização magnetizadas isoladas ligadas às referidas células alvo em um campo magnético suficiente para levitar as referidas células magnetizadas isoladas ligadas às referidas células alvo.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de: a) a molécula de suporte compreender peptídeos,

polissacarídeos, ácidos nucleicos, polímeros, poli-lisina, fibronectina, colágeno, laminina, BSA, hialuronana, glicosaminoglicana, glicosaminoglicana aniônica não sulfatada, gelatina, ácido nucleico, misturas de proteínas da matriz extracelular, anticorpo ou misturas ou derivados dos mesmos, b) em que a referida nanopartícula negativamente carregada é uma nanopartícula de ouro, e c) em que a referida nanopartícula positivamente carregada é uma nanopartícula de óxido de ferro.

15. Método de manipulação de células alvo caracterizado pelo fato de compreender: a) combinar células alvo com células de visualização magnetizadas que exibem um ou mais ligantes em suas superfícies, os referidos ligantes por se ligarem, de forma específica, a uma molécula alvo em uma superfície das referidas células alvo; b) permitir que os referidos ligantes se liguem à referida molécula alvo para produzir células de visualização magnetizadas ligadas às referidas células alvo; c) aplicar um campo magnético para coletar as referidas células de visualização magnetizadas ligadas às referidas células alvo, permitindo, assim, a manipulação das referidas células alvo.

16. Complexo de células magnéticas caracterizado pelo fato de compreender: a) pelo menos uma célula de visualização magnetizada que exibe pelo menos um ligante em uma superfície de pelo menos uma célula de visualização magnetizada; e b) pelo menos uma célula alvo que apresenta pelo menos um parceiro de ligação em uma superfície de pelo menos uma célula alvo, em que o referido pelo menos um ligante nas superfícies da pelo menos uma célula de visualização magnetizada se liga ao referido parceiro de ligação na superfície da pelo menos uma célula alvo de modo a formar o complexo de células magnéticas.

17. Complexo de células magnéticas, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de o referido pelo menos um ligante compreender sítio(s) de ligação de antígeno e o referido pelo menos um parceiro de ligação compreender um antígeno que é reconhecido pelo(s) referido(s) sítio(s) de ligação de antígeno.

18. Complexo de células magnéticas, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de pelo menos uma célula de visualização magnetizada compreender nanopartículas magnéticas.