BR112014029505B1 - Método de fazer uma matriz extracelular (ecm) magnética e método de preparar tecido para implantação em um paciente - Google Patents
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Abstract
matriz extracelular magnética métodos de fazer e usar uma ecm magnética são revelados. a ecm compreende nanopartículas positivamente e negativamente carregadas, em que uma das referidas nanopartículas contém um elemento magneticamente responsivo. quando a ecm magnética é semeada com células, as células serão magnetizadas e podem ser levitadas para cultura de célula 3-d.
Description
[0001] O presente pedido reivindica prioridade de 61/659.970, depositado em 14 de junho de 2012, e incorporado a título de referência na íntegra aqui.
[0002] Não aplicável.
[0003] A invenção se refere a materiais, métodos de fazer e métodos de utilizar uma matriz extracelular magnética.
[0004] A matriz extracelular ou “ECM” é a parte extracelular de tecido de animal. Devido a sua natureza diversa e composição, a ECM pode servir a muitas funções. As funções incluem fornecer suporte, segregar tecidos entre si, regular comunicação intercelular e o comportamento dinâmico da célula. Para tornar os assuntos ainda mais complexos, a estrutura e composição da ECM estão mudando constantemente em resposta à atividade metabólica atual da população de células residentes, as demandas mecânicas do tecido e as condições de nicho microambiental prevalentes. Esse conceito de “reciprocidade dinâmica” entre a ECM e a população de células residentes é uma vantagem principal para o uso de materiais de suporte de ECM em relação a materiais sintéticos e enfatiza a importância de manter o máximo possível tanto de composição nativa como de sua ultraestrutura durante a preparação de suportes tridimensionais.
[0005] Os componentes da ECM são produzidos intracelularmente por células residentes e secretadas (e/ou acumuladas) na ECM via exocitose ou morte da célula. Após secretar os mesmos agregam então com a matriz existente. A ECM é composta de uma malha de travamento de glicosaminoglicanos (GAGs) e proteínas fibrosas que são discutidas abaixo.
[0006] GAGs são polímeros de carboidrato e são normalmente ligados a proteínas de matriz extracelular para formar proteoglicanos (ácido hialurônico é uma exceção notável, vide abaixo). Proteoglicanos têm uma carga negativa líquida que atrai íons de sódio positivamente carregados (Na+) que atrai moléculas de água via osmose, mantendo a ECM e as células residentes hidratadas. Proteoglicanos também podem ajudar a reter e armazenar fatores de crescimento na ECM.
[0007] Tipos diferentes de proteoglicano encontrados na matriz extracelular. Sulfato de heparano (HS) é um polissacarídeo linear encontrado nos tecidos de todos os animais. Ocorre como um proteoglicano (PG) no qual duas ou três cadeias HS são ligadas em proximidade estreita à superfície da célula ou proteínas de matriz extracelular. É nessa forma que HS se liga a uma variedade de ligandos de proteína e regula uma ampla variedade de atividades biológicas, incluindo processos de desenvolvimento, angiogênese, coagulação de sangue e metástase de tumor.
[0008] Na matriz extracelular, especialmente membranas basais, as proteínas de multi-domínios perlecan, agrin e colágeno XVIII são as principais proteínas às quais sulfato de heparano é ligado.
[0009] Sulfatos de condroitina contribuem para a resistência à tração de cartilagens, tendões, ligamentos e paredes da aorta. Também são conhecidos como afetando neuroplasticidade.
[00010] Sulfatos de queratano têm um teor de sulfato variável e diferente de muitos outros GAGs, não contêm ácido urônico. Estão presentes na córnea, cartilagem, ossos e chifres de animais.
[00011] Ácido hialurônico (ou “hialuronano”) é um polissacarídeo consistindo em resíduos alternativos de ácido D- glucurônico e N-acetil glucosamina, e diferente de outros GAGs não é encontrado como proteoglicano. Ácido hialurônico no espaço extracelular confere aos tecidos a capacidade de resistir à compressão por fornecer uma força de turgor (inchaço) neutralizante por absorver quantidades significativas de água. Ácido hialurônico é desse modo encontrado em abundância na ECM de articulações que suportam carga. Também é um componente principal do gel intersticial. Ácido hialurônico é encontrado na superfície interna da membrana de célula e é translocado para fora da célula durante biossíntese. Atua como uma sugestão ambiental que regula comportamento de célula durante desenvolvimento embriônico, processos de cicatrização, inflamação e desenvolvimento de tumor, e interage com um receptor de transmembrana específico, CD44.
[00012] Colágenos são a proteína mais abundante na ECM na maioria dos animais. Na realidade, colágeno é a proteína mais abundante no corpo humano e responde por 90% de teor de proteína de matriz do osso. Colágenos estão presentes na ECM como proteínas fibrilares e fornecem suporte estrutural a células residentes. Colágeno é exocitosidado em forma precursora (pró-colágeno) que é então clivada por proteases de pró-colágeno para permitir montagem extracelular.
[00013] O colágeno pode ser dividido em várias famílias de acordo com os tipos de estrutura que formam:. Fibrilar (tipo I, II, III, V, XI). Facit (tipo IX, XII, XIV). Cadeia curta (tipo VIII, X) . Membrana basal (tipo IV). Outros (tipo VI, VII, XIII)
[00014] Elastinas, em contraste com colágenos, fornecem elasticidade a tecidos, permitindo que os mesmos estiquem quando necessário e então retornem a seu estado original. Isso é útil em vasos sanguíneos, pulmões, na pele, e ligamento da nuca, e tais tecidos contêm quantidades elevadas de elastinas. Elastinas são sintetizadas por fibroblastos e células de músculo liso. São muito insolúveis e tropoelastinas são secretadas dentro de uma molécula chaperone, que libera a molécula precursora após contato com uma fibra de elastina madura. Tropoelastinas são então desaminadas para se tornarem incorporadas no filamento de elastina.
[00015] Fibronectinas são glicoproteínas que conectam células com fibras de colágeno na ECM, permitindo que as células movam através da ECM. Fibronectinas ligam colágeno e integrinas de superfície de célula, causando uma reorganização do citoesqueleto da célula e facilitando o movimento da célula. Fibronectinas são secretadas por células em uma forma desdobrada, inativa. A ligação com integrinas desdobra moléculas de fibronectina, permitindo que as mesmas formem dímeros de modo que possam funcionar adequadamente. Fibronectinas também ajudam no local de lesão de tecido por ligar-se a plaquetas durante coagulação do sangue e facilitar o movimento de células para a área afetada durante cicatrização de ferimento.
[00016] Lamininas são proteínas encontradas nas laminas basais virtualmente de todos os animais. Ao invés de formar fibras semelhantes a colágeno, lamininas formam redes de estruturas semelhantes à teia que resistem a forças de tração na lamina basal. Também auxiliam na adesão de células. Lamininas ligam outros componentes de ECM como colágenos, nidogens e entactinas.
[00017] Muitas células se ligam a componentes da matriz extracelular. A adesão de células pode ocorrer em dois modos; por adesões focais, conectando a ECM a filamentos de actina da célula, e hemidesmosomas, conectando a ECM a filamentos intermediários como queratina. Essa adesão de célula a ECM é regulada por moléculas de adesão celular de superfície de célula específica (CAM) conhecidas como integrinas. Integrinas são proteínas de superfície de célula que ligam células a estruturas de ECM, como fibronectina e laminina, e também a proteínas de integrina na superfície das outras células.
[00018] Fibronectinas se ligam a macromoléculas de ECM e facilitam sua ligação a integrinas de transmembrana. A ligação de fibronectina ao domínio extracelular inicia vias de sinalização intracelular bem como associação com o citoesqueleto celular através de um conjunto de moléculas adaptadoras como actina.
[00019] Há muitos tipos de células que contribuem para o desenvolvimento dos vários tipos de matriz extracelular encontrados em pletora de tipos de tecido. Entretanto, fibroblastos são o tipo de célula mais comum em ECM de tecido conectivo, no qual os mesmos sintetizam, mantêm e fornecem uma armação estrutural. Fibroblastos também secretam os componentes precursores da ECM, incluindo a substância triturada. Outros tipos de células incluem células tronco, bem como condrócitos e osteoblastos, entre outros. Condrócitos são encontrados em cartilagem e produzem a matriz cartilaginosa. Osteoblastos são responsáveis por formação de osso.
[00020] A ECM é de interesse médico e científico intenso porque pode ser utilizada para fornecer um suporte para crescimento e regeneração de tecido. Como a ECM nativa guia o desenvolvimento de órgãos, reparo e regeneração fisiológica, provê uma alternativa promissora para suportes sintéticos e uma fundação para esforços regenerativos.
[00021] Nos últimos anos, estudos confirmaram a importância de ECM em regular diferenciação de células tronco em tecido maduro. Muitos dos fatores responsáveis pela influência de ECM em células tronco são relacionados a suas propriedades, incluindo estrutura de matriz, composição, elasticidade e integridade. Como essa propriedades de ECM são frequentemente específicos do tipo de tecido, para desenvolver células diferenciadas a partir de células tronco para aplicações terapêuticas, a capacidade de regenerar tipos de ECM específicos pode ser de grande valor para regular ambientes de célula tronco (Reilly, 2010).
[00022] Uma das mudanças de paradigma recentes em biológica de célula tronco foi a descoberta de que células tronco podem começar a diferenciar em células de tecido maduro quando expostas a propriedades intrínsecas da matriz extracelular (ECM), como estrutura de matriz, elasticidade e composição. Esses parâmetros são conhecidos por modular as forças que uma célula pode exercer sobre sua matriz. Vias mecanossensíveis convertem subsequentemente essas sugestões biofísicas em sinais bioquímicos que confiam à célula uma linhagem específica. Exatamente como com fatores de crescimento bem estudados, parâmetros de ECM são extremamente dinâmicos e são controlados espacial e temporalmente durante desenvolvimento, sugerindo que os mesmos desempenham diferenciação e arranjo de células. Nossa capacidade de regular dinamicamente o nicho de célula tronco o modo em que o mesmo naturalmente ocorre no corpo é provável de ser uma exigência crítica para desenvolver células diferenciadas a partir de células tronco para aplicações terapêuticas.
[00023] ECM foi preparada por colher um tecido apropriado e descelularizar o mesmo com meio químico e/ou enzimático de lise de célula, e/ou meio físico de extrair células, como fluxo forçado sobre ou através do tecido. Entretanto, esses métodos exigem muito tempo, fornecem baixos rendimentos e normalmente um paciente não pode fornecer tal tecido, necessitando de recorrer a cadáveres ou tecidos de animais. Desse modo, a metodologia existente não é ideal.
[00024] Outro método de preparar ECM é fazer a mesma a partir de células cultivadas em cultura. As células cultivadas em monocamada foram utilizadas para fazer ECM, porém a técnica é difícil e sujeita a rendimentos muito baixos. Além disso, culturas de 2D não refletem totalmente e precisamente a organização e estrutura de ECM nativa, novamente tornando esses métodos menos ideais.
[00025] Embora algumas dessas abordagens sejam promissoras, há ainda espaço para métodos aperfeiçoados de preparar e utilizar ECM que evite algumas das desvantagens da técnica anterior e forneça ECM em rendimento elevado que seja tão próximo a ECM nativa quanto possível.
[00026] Aqui, apresentamos novos suportes tridimensionais biomiméticos que podem ser utilizados terapeuticamente para tratar doença. A invenção tira proveito do método de cultura 3D desenvolvido por Nano3D BioSciences™ Inc., e utiliza aqueles métodos para cultivar culturas 3D, das quais uma ECM magnética pode ser preparada.
[00027] No pedido de patente WO2010036957 por Nano3D Biosciences®, células são levitadas em um campo magnético por contatar as células com um “hidrogel” compreendendo um bacteriófago com nanopartículas que são responsivas a um campo magnético. Em particular, fago filamentoso, como bacteriófagos fd, fl, ou M13 são utilizados. O modo como o método funciona não é completamente claro, porém é teorizado que o fago fornece uma montagem ou estrutura semelhante a gel que reveste as células, e de algum modo auxilia as células a absorver ou adsorver as nanopartículas magneticamente responsivas. Desse modo, mesmo quando o hidrogel é retirado por lavagem, as células permanecem magneticamente responsivas, e podem ser levitadas em um campo magnético apropriado.
[00028] Embora o hidrogel seja na maior parte retirado por lavagem, o potencial para infectividade de fago ou transferência de material genético permanece, e desse modo foi desejado fornecer um material que permita absorção ou adsorção de célula sem o uso de fagos. WO2011038370, também de Nano3D Biosciences® descreve, desse modo, uma montagem de nanopartículas de segunda geração, que evita totalmente o uso de bacteriófagos para permitir a magnetização de células. Além disso, uma variação da montagem de nanopartículas reivindicada é agora comercialmente disponível junto a Nano3D Biosciences® Houston, TX), sob o nome comercial NANOSHUTTLE™. Esse novo material magnético provê um método superior de magnetizar células sem o uso de quaisquer agentes tóxicos ou infecciosos, e as células permanecem magnetizadas quando o material é retirado por lavagem.
[00029] Foi descoberto agora que a tecnologia NANOSHUTTLE™ pode ser utilizada para preparar ECM magnética, e levitação magnética utilizada como uma ferramenta para auxiliar na descelularização e manipulação da ECM. Essa descoberta nova é a base para as várias invenções descritas aqui.
[00030] Dito em termos gerais, o método inclui cultivar células em cultura 3D utilizando nanopartículas magnéticas. As nanopartículas magnéticas são absorvidas pelas células, porém eventualmente terminam na ECM, de tal modo que a ECM possa ser magneticamente levitada e/ou separada da estrutura multicelular. A ECM pode ser desse modo retida no lugar utilizando um ímã, e a cultura 3D descelularizada, utilizando qualquer metodologia conhecida, para produzir uma ECM magnética livre de células que pode ser então utilizada para qualquer da variedade de usos para a qual a ECM pode ser empregada.
[00031] As etapas gerais incluem:
[00032] 1. Tratamento de células, misturas de células ou fragmentos de tecido com NANOSHUTTLE™ ou qualquer outra solução de nanopartícula magnética, de tal modo que as células absorvam nanopartículas magnéticas.
[00033] 2. A cultura de célula 3D é realizada para permitir que as células gerassem ECM resultando de formação de estrutura multicelular 3D. preferivelmente, a levitação magnética das células ou misturas de células é realizada devido a sua capacidade de rapidamente gerar estruturas multicelulares 3D, e crescimento de tais culturas 3D até atingir um tamanho desejado. Desde que as células absorvam nanopartículas magnéticas, outros métodos de cultivo 3D podem ser utilizados nessa etapa, como reatores rotativos, andaimes, gota em suspensão, superfícies não aderentes, frascos de fundo redondo ou qualquer biorreator de cultura de células 3D.
[00034] 3. Descelularização da cultura 3D utilizando quaisquer métodos químicos, enzimáticos e/ou físicos.
[00035] 4. Recuperação da ECM magnética agora descelularizada por separação magnética de ECM magnética a partir de resíduos ou qualquer outro método de recuperação.
[00036] 5. Remoção de tensoativo ou outros produtos químicos por lavagem da ECM magneticamente retida, ou qualquer outro método de lavagem.
[00037] 6. As etapas 1 - 5 podem ser repetidas tantas vezes quanto necessário se enriquecimento ou aumento da quantidade de ECM acumulada na ECM de nanopartículas magnética for desejável ou necessário. Isso é realizado por retratar células novas ou tecido na etapa 1 com o produto ECM magnetizado resultante da etapa 5.
[00038] 7. Ressemeadura da ECM e uso adicional como desejado.
[00039] A invenção inclui qualquer uma ou mais das seguintes modalidades, em todas as combinações possíveis:
[00040] - Uma ECM magnética ou CM magnética semeada feita por qualquer método aqui descrito.
[00041] - Um método de fazer uma ECM magnética, o método compreendendo: colocar nanopartículas magnéticas dentro de uma célula; levitar a célula em um campo magnético e cultivar a célula levitada no campo magnético em uma cultura de células 3D; e descelularizar a cultura de célula 3D para produzir uma ECM magnética.
[00042] - Um método de fazer uma ECM magnética, o método compreendendo: misturar células com uma composição compreendendo uma nanopartícula magneticamente responsiva de tal modo que as células absorvam a nanopartícula magneticamente responsiva; levitar as células magnéticas em um campo magnético; cultivar as células levitadas no campo magnético em uma cultura de células 3D; e descelularizar a cultura de células 3D para produzir uma ECM magnética.
[00043] - Um método de fazer uma ECM magnética, o método compreendendo: misturar células com uma composição compreendendo: uma nanopartícula negativamente carregada; uma nanopartícula positivamente carregada; e uma molécula de suporte; em que uma da nanopartícula negativamente carregada ou nanopartícula positivamente carregada contém um elemento magneticamente responsivo, e em que a molécula de suporte retém a nanopartícula negativamente carregada e a nanopartícula positivamente carregada em uma mistura íntima; levitar as células em um campo magnético e cultivar as células levitadas no campo magnético em uma cultura de células 3D; e descelularizar a cultura de célula 3D para produzir uma ECM magnética.
[00044] - Um método de preparar tecido para implantação em um paciente, o método compreendendo: combinar células com nanopartículas magnéticas que são absorvidas pelas células; expor as células a um campo magnético de tal modo que as células coalesçam e levitem; cultivar as células para formar uma cultura de células 3D; descelularizar a cultura de células 3D para fazer uma ECM magnética; semear a ECM magnética com células progenitora ou tronco alogenéicas a partir de um paciente; cultivar a ECM semeada em um campo magnético; e transplantar a ECM semeada no paciente. Se desejado, as células originais também podem ser do paciente, porém isso não é essencial, visto que a ECM é quase totalmente descelularizada.
[00045] Outras modalidades incluem semear a ECM magnética com células e cultivar a ECM semeada em um campo magnético; semear a ECM magnética com células de fibroblasto, e células tronco ou progenitoras, e ainda cultivar a ECM semeada em um campo magnético; semear a ECM magnética com células epiteliais e células tronco ou progenitoras, e cultivar ainda a ECM semeada em um campo magnético; semear a ECM magnética com células de osteoblasto e células tronco ou progenitora, e ainda cultivar a ECM semeada em um campo magnético; semear a ECM magnética com células de fibroblasto autólogas, células epiteliais e células progenitoras ou tronco a partir de um paciente, e cultivar adicionalmente a ECM semeada em um campo magnético; ou semear a ECM com células progenitoras ou tronco a partir do paciente e cultivar adicionalmente a ECM semeada em um campo magnético, e variações e combinações das mesmas.
[00046] Em modalidades preferidas, as células originais e/ou células de ressemear podem ser de qualquer fonte adequada, por exemplo, são de linhagens de células ou células alogênicas, ou combinações das mesmas. Preferivelmente, células alogênicas a partir de um paciente mais jovem são preferidas, visto que células tronco são conhecidas por serem mais facilmente amplificadas utilizando ECM reparada de animais mais novos. As células podem originar na forma de um fragmento de tecido, ou na forma de um fragmento de tecido extraído de um paciente.
[00047] Os tipos e números de células necessárias para recelularização varia significativamente com o órgão bem como com o tamanho e complexidade da ECM, fragmentos de tecido sendo mais simples do que órgãos inteiros. Preferivelmente, os tipos de células selecionados são tais como seriam necessários no tecido de interesse, por exemplo, osteoblastos para tecido ósseo, etc. As células de parênquimas, os tipos de células responsáveis pelas funções específicas do órgão, são de necessidade óbvia, por exemplo, hepatócitos no fígado, cardiomiócitos no coração, epitélio no pulmão, etc. Além disso, células não de parênquimas como fibroblastos e células endoteliais aumentam o fenótipo funcional das células de parênquimas e contribuem para a organização da arquitetura celular do tecido. Células endoteliais são importantes para fornecer uma barreira não trombótica para a matriz de órgão descelularizado e assegurar que fluxo de sangue in vivo seja confinado aos espaços vasculares e as células parênquimas são protegidas da tensão de cisalhamento criada pelo fluxo. O fibroblasto, que secreta e remodela a ECM, é claramente importante e melhoram as funções de células parênquimas em culturas conjuntas. Recentemente, foi mostrado que fibroblastos estão também envolvidos nas propriedades elétricas do miocárdio por acoplar com os cardiomiócitos e auxiliar na propagação dos estímulos elétricos em relação a distâncias mais longas.
[00048] Dependendo do órgão, outros tipos de células também podem ser importantes, se não necessárias, para recelularização funcional. Até a presente data, a complexidade aumentada de lidar com múltiplos tipos de células limitou os estudos de cultura conjunta na maior parte ao uso de células endoteliais e fibroblastos. Lidar com uma mistura de células é um problema combinatório, e como no caso de bexigas construídas de tecido, serendipidade ou teste extenso pode ser necessário para encontrar o protocolo de cultura e semeadura ótimo.
[00049] As células podem ser levitadas com qualquer nanopartícula magnética que possa ser absorvida pela célula ou de outro modo introduzida na célula, por exemplo, por explosão, injeção, eletroporação, transdução, lipossomas catiônicos, hidrogeis, pressão magnética e similares. É antecipado que qualquer meio de introdução será suficiente, embora meio de absorção ativa, como descrito abaixo, possa ser o método de menos perturbação de célula, e desse modo ser preferido.
[00050] Em modalidades preferidas, as células são levitadas com uma composição compreendendo: a) uma nanopartícula negativamente carregada; b) uma nanopartícula positivamente carregada; e c) uma molécula de suporte, em que uma da nanopartícula negativamente carregada ou nanopartícula positivamente carregada contém um material magneticamente responsivo, como ferro ou óxido de ferro, e em que a molécula de suporte retém a nanopartícula negativamente carregada e a nanopartícula positivamente carregada em uma mistura íntima.
[00051] A composição mais preferida é NANOSHUTTLE™ que é conhecida por funcionar e que é comercialmente disponível junto a Nano3D BioSciences (Houston, TX).
[00052] Além disso, como descrito em patentes anteriores, culturas 3D de formato variado podem ser feitas por modificar o formato do campo magnético. Por exemplo, um ímã de anel pode ser utilizado para fazer uma cultura 3D no formato de anel ou rosca. Campos magnéticos podem ser também utilizados para manter ou alterar tal formato durante os processos de descelularização e recelularização.
[00053] A ECM pode ser preparada a partir da cultura 3D por qualquer método conhecido na arte, incluindo, porém não limitado a tratamento com tensoativos, detergentes não iônicos, detergentes iônicos, detergentes zwiteriônicos, tratamento alcalino, tratamento com ácido, proteases, nucleases, endonucleases, exonucleases, pressão osmótica, soluções hipertônicas, soluções hipotônicas, congelar-descongelar, perfusão, sonicação, agitação e combinações dos acima. A cultura 3D pode ser moída ou de outro modo fatiada, cortada em cubos ou fragmentada antes do tratamento, ou a cultura 3D descelularizada intacta.
[00054] A ECM magnética pode ser utilizada em qualquer dos métodos para os quais ECM é utilizada, porém tem aplicação específica quando semeada novamente e cultivada em cultura 3D magneticamente levitada. Por exemplo, a ECM pode ser semeada com células tronco a partir de um paciente, bem como outros tipos de células apropriados para a aplicação, e a cultura 3D resultante utilizada em várias terapias de tecido ou célula.
[00055] Além disso, a ECM magnética pode ser utilizada no estudo de componentes de ECM e/ou a diferenciação de tipos de células, para essa finalidade quaisquer dos componentes da ECM (ou células) podem ser rotulados, por exemplo, com anticorpos, GFP, rótulos fluorescentes e similares.
[00056] As seguintes abreviaturas podem ser utilizadas aqui:
[00057] Por “cultivar” na presente invenção, incluímos cultivar tipos de célula única ou cultivar em conjunto mais de um tipo de célula.
[00058] Como utilizado aqui, uma “ECM magnética” é uma matriz extracelular que foi descelularizada e contém nanopartículas magnéticas suficientes intimamente misturadas com a mesma de tal modo que a ECM magnética levitará em um campo magnético.
[00059] Como utilizado aqui, “descelularizada” significa que pelo menos 95% das células foram removidas, preferivelmente 98%, 99% ou mais.
[00060] Como utilizado aqui, uma “nanopartícula positivamente carregada” ou “nanopartícula positiva” é definida como qualquer partícula menor que 200 nm, preferivelmente 100 nm ou menos, que tem um carga positiva em geral. Preferivelmente, a partícula é não tóxica, porém isso não é essencial, pois as partículas não permanecem com as células.
[00061] Como utilizado aqui, uma “nanopartícula negativamente carregada” ou “nanopartícula negativa” é definida como qualquer partícula menor que 200 nm, preferivelmente 100 nm e mais preferivelmente aproximadamente 2-25 nm, que tem uma carga negativa em geral. Preferivelmente, a partícula é não tóxica, porém isso não é essencial, pois as partículas não permanecem com as células por um longo período de tempo.
[00062] Como utilizado aqui “elemento magneticamente responsivo” pode ser qualquer elemento ou molécula que responderá a um campo magnético. Como detalhado abaixo, uma das nanopartículas deve conter ou ser um elemento magneticamente responsivo.
[00063] Como utilizado aqui “molécula de suporte” se refere a qualquer molécula longa que interagirá com as nanopartículas para criar uma estrutura fibrosa semelhante à esteira ou gel e desse modo manterá a nanopartícula magnética em proximidade estreita com a célula para absorção.
[00064] Por “célula tronco” na presente invenção, incluímos células toti- e multipotentes, a menos que especificamente indicado de outro modo.
[00065] Figura 1. Diagrama esquemático de processo de descelularização utilizando um tipo de célula única.
[00066] Figura 2. Diagrama esquemático de processo de descelularização utilizando dois tipos de células separadas em um processo sequencial, em que o tipo de célula A é utilizado para fazer uma cultura 3D e desse modo gerar ECM A, que é então utilizada para tratar o tipo de célula B. o produto final será ECM magnética A adicionalmente modificada com ECM B. evidentemente, uma mistura de ECM A & B pode ser também preparada por cultivar em conjunto tipos de células A e na cultura 3D inicial, e tal método pode ser preferido.
[00067] Dito em termos gerais, a invenção é uma ECM magnética e métodos de fazer e utilizar a mesma. Um material magnético é utilizado que permite que células absorvam ou adsorvam elementos magneticamente responsivos, e desse modo sejam levitáveis em cultura de célula quando um campo magnético é aplicado.
[00068] Em modalidades preferidas, os materiais magnéticos incluem nanopartículas positivamente e negativamente carregadas, uma das quais deve conter um ou mais elementos magneticamente responsivos, como óxido de ferro de tamanho de nano. Essas nanopartículas são adicionalmente combinadas com um polímero, preferivelmente um polímero celular, ou outra molécula longa que atua como um suporte (aqui chamado uma “molécula de suporte”) para as nanopartículas carregadas e as células, retendo as nanopartículas no lugar para sua absorção ou adsorção pelas células. A inclusão de nanopartículas tanto positivas como negativas permite mistura íntima das nanopartículas e aciona a montagem dos três componentes, desse modo assegura distribuição uniforme e boa absorção. A molécula de suporte combina intimamente todos os três componentes com as células em estrutura semelhante à esteira fibrosa que permite que as células absorvam o elemento magneticamente responsivo.
[00069] Após um período de incubação, o material magnético pode ser retirado por lavagem, permitindo que as células sejam manipuladas em um campo magnético. As nanopartículas magnéticas são eventualmente perdidas a partir das células por 8 dias, porém sabemos agora que as mesmas são retidas pela ECM, permitindo a preparação e uso de uma ECM magnética. Uma cultura de célula 3D intacta pode ser descelularizada por qualquer método conhecido, ou fragmentos de cultura 3D moídos podem ser descelularizados, dependendo do uso final da ECM. A ECM magnética pode ser então semeada com células desejadas, como células tronco autólogas, e cultivadas em um ambiente 3D muito natural.
[00070] O elemento magneticamente responsivo pode ser qualquer elemento ou molécula que responderá a um campo magnético, por exemplo, ímãs de terras raras (por exemplo, cobalto de samário (SmCo) e boro de ferro neodímio (NdFeB)), materiais de ímã cerâmico (por exemplo, ferrita de estrôncio), os elementos magnéticos (por exemplo, ferro, cobalto e níquel e suas ligas e óxidos). São particularmente preferidos materiais paramagnéticos que reagem com um campo magnético, porém não são eles próprios ímãs, visto que isso permite montagem mais fácil dos materiais.
[00071] Preferivelmente, o campo magnético utilizado para levitar tais células ou a ECM magnética é aproximadamente 300G- 1000G. Entretanto, a intensidade de campo varia tanto com distância como com a cultura, e com a quantidade e tipo de elemento de resposta magnética absorvida ou adsorvida pela ECM. Desse modo, a intensidade de campo ótima variará, porém é facilmente determinada empiricamente.
[00072] As nanopartículas negativamente carregadas incluem metais de carga estabilizada (por exemplo, prata, cobre, platina, paládio), porém preferivelmente é uma nanopartícula de ouro.
[00073] As nanopartículas positivamente carregadas incluem tensoativo ou polímero estabilizado ou ligas revestidas e/ou óxidos (por exemplo, ferro elementar, ferro-cobalto, óxido de níquel) e preferivelmente é uma nanopartícula de óxido de ferro.
[00074] Uma das duas nanopartículas deve ser magneticamente responsiva, porém obviamente qualquer uma (ou ambas) poderia conter essa característica.
[00075] As nanopartículas devem ter um tamanho de nano- escala, e desse modo são aproximadamente 100 nm. O tamanho pode variar, entretanto, entre aproximadamente 5-250 nm, 50-200 nm, 75150 nm, porém podem ser menores ou maiores, com a condição somente de que o tamanho seja apropriado para permitir entrada ou adsorção ao tipo de célula em uso. Mostramos em outro trabalho que há um limite superior no tamanho efetivo da nanopartícula magnética, e tamanho de micrômetro é demasiadamente grande para eficácia, embora alguma funcionalidade fosse ainda observada.
[00076] A “molécula de suporte” é genericamente um polímero ou outra molécula longa que serve para manter as nanopartículas e células juntas em uma mistura íntima. A molécula de suporte pode ser positivamente carregada, negativamente carregada, de carga misturada ou neutra, e pode ser combinações de mais de uma molécula de suporte.
[00077] Os exemplos de tais moléculas de suporte incluem os polímeros neutros, como peptídeos, polissacarídeos, ácidos nucléicos, e similares, porém polímeros sintéticos também podem ser empregados. Moléculas de suporte particularmente preferidas incluem poli-lisina, fibronectina, colágeno, laminina, BSA, hialuronano, glicosaminoglicano, aniônico, glicosaminoglicano não sulfatado, gelatina, ácido nucléico, misturas de proteína de matriz extracelular, matrigel, anticorpos, e misturas e derivados dos mesmos.
[00078] Dito em termos gerais, a concentração da molécula de suporte é substancialmente maior do que a concentração das nanopartículas negativamente e positivamente carregadas, variando de 10-1000 vezes maior, 20-500 ou 50-200 vezes maior. Entretanto, quantidades maiores ou menores são possíveis, dependendo de qual tipo de célula está sendo utilizado e qual molécula de suporte e nanopartículas estão sendo utilizadas. Quanto mais longo o polímero, menos pode ser necessário para formar estrutura suficiente para manter as nanopartículas no lugar para absorção.
[00079] Genericamente, as nanopartículas são utilizadas em concentrações muito baixas. Concentrações podem variar entre 1012-10-6 Molar, porém estão preferivelmente na faixa nanomolar, e a(s) molécula(s) de suporte 10-9-10-3 Molar, e estão preferivelmente na faixa micromolar.
[00080] Os três componentes montados por interação eletrostática e desse modo carregados ou moléculas de suporte de carga misturada, como poli-lisina, são p referidos. Entretanto, qualquer dos três componentes pode ser funcionalizado, derivatizado ou revestido de modo a promover adicionalmente interação dos componentes e/ou células. Desse modo, um ou mais membros podem ser funcionalizados, derivatizados, ou revestidos com um anticorpo que, por exemplo, se liga a um antígeno de superfície de célula. Desse modo, integrações entre os componentes e/ou as células seriam adicionalmente promovidos. Outros pares de ligação incluíram receptores-ligandos, biotina-estrepavidina, ácidos nucléicos complementares, aglutinina de germe de trigo (WGA), moléculas contendo ácido siálico e similares.
[00081] Revestimentos também podem incluir revestimentos de passivação ou proteção, particularmente para as nanopartículas, como PVP, dextrano, BSA, PEG e similares. As nanopartículas, especialmente a nanopartícula que compreende o elemento magneticamente responsivo, podem ser rotuladas para visualização, por exemplo, com um fluoroforo, radiorótulo ou similar, particularmente durante o desenvolvimento e teste in vitro de células magnetizadas e tecidos. Entretanto, para usos terapêuticos, pode ser preferido omitir tais rótulos.
[00082] Em outras modalidades, as composições incluem a ECM magnética individualmente ou juntamente com as células que serão cultivadas em conjunto com as mesmas, incluindo, porém não limitadas a, células tronco ou progenitoras, células de câncer, células primárias, células de mamíferos, células humanas (particularmente células autólogas), células extraídas diretamente de tecido novo, bactérias, levedura, células de planta ou misturas dos mesmos.
[00083] Se desejado a montagem de nanopartículas magnéticas pode ser feita isenta de moléculas biológicas, como produtos de célula ou fago porque as moléculas de suporte, como poli-lisina, podem ser facilmente feitas sinteticamente. Ainda assim todos os componentes são genericamente não tóxicos, baratos ou fáceis de fazer. Além disso, as estruturas semelhantes à esteira fibrosa permitem a incorporação de moléculas de suporte de célula adicionais (como componentes de matriz extracelular) a serem incluídas nas montagens magnéticas de nanopartículas.
[00084] A magnetização de células com montagens de nanopartículas magnéticas consiste somente em adicionar montagem a células em meios de cultura de células regulares. Células podem ser magnetizadas em minutos a partir do tratamento de nanopartícula magnética (5 minutos) e células ligadas ou suspensas podem ser tratadas com montagens de nanopartículas magnéticas. As células podem ser cultivadas até se obter um tamanho desejado, e então a cultura 3D descelularizada para produzir ECM magnética.
[00085] A cultura 3D pode ser iniciada com quaisquer células, misturas de células ou fragmentos de tecido. Linhagens de célula, células heterólogas ou preferivelmente autólogas podem ser utilizadas. A ECM magnética resultante preparada a partir das cultuas 3D podem ser então semeadas novamente com os tipos de célula desejados, particularmente com células autólogas a partir de um paciente, de tal modo que algumas células obtidas de um paciente possam ser amplificadas e cultivadas em uma cultura de célula 3D muito natural em uma matriz ECM existente. A cultura 3D final pode ser então utilizada em terapias de célula e tecido, e talvez mesmo em transplante de órgãos no futuro.
[00086] Por exemplo, ECM pode ser preparado por cultura 3D de várias linhagens de células que originam de tecido cardíaco e/ou vários tipos de células cardíacas alogênicas e ECM preparada pelos métodos da invenção. A ECM pode então ser semeada com os próprios fibroblastos de um paciente, células endoteliais, células tronco, células progenitoras, células tronco pluripotentes induzíveis derivadas de adultos e similares, e tratadas com os fatores de crescimento apropriados para encorajar diferenciação em cardiomiócitos, músculo liso vascular, e células endoteliais, etc. O tecido resultante pode ser implantado e utilizado para reparar músculo cardíaco danificado. Como a ECM é cultivada a partir de tipos de célula mais facilmente disponíveis, ainda assim descelularizados e semeados por uma variedade de células autólogas, incluindo algumas células tronco e progenitoras, o método tem as vantagens de fornecer ECM natural e facilmente disponível que pode ser então um suporte para cultivar células derivadas de pacientes raras, porém seguras e desse modo cultivar novamente um tecido viável, seguro para uso de implante.
[00087] Em nossos experimentos de teste, 0,5 ml de NANOSHUTTLE™ foi combinado com 5 ml de fibroblastos primários humanos e células de músculo liso. Essa mistura foi suavemente misturada por ação de pipeta e deixada incubar e assentar por 5 minutos. as células foram então transferidas para prato petri de 3,5 cm e levitadas com um ímã de neodímio no formato de anel (20 x 8,5 x 4,5) x 7 mm; resistência de tração: 13 lbs). Todas as células levitaram e coalesceram em uma cultura 3D em minutos da aplicação de um campo magnético.
[00088] as células foram então cultivadas por 4 dias em meio DMEM com FBS a 10%. Após cultura, as células foram descelularizadas de acordo com técnicas conhecidas (vide os métodos com asterisco abaixo), porém utilizando um ímã para levitar e manter a ECM, enquanto retira por lavagem resíduos. A ECM final foi colorida com DAPI, que mostrou que a ECM não tinha DNA (não mostrado), e positivamente manchada para colágeno e laminina (não mostrados).
[00089] Uma ampla variedade de técnicas para preparação de ECM que podem ser utilizadas com a invenção são listadas abaixo:1. Congelar a -80°C e descongelar em RT. Repetir o ciclo seis vezes. Imergir em 25 mM NH4OH de solução aquosa por 20 min. e lavar com água MIlliQ.2. Tratar com 0,1% de Triton-X100 e 1.5 M KCI em 50 mM de tampão Tris (pH 8,0) por 6 h. Lavar com 10 mM tampão Tris (pH 8,0) e água MilliQ.3. Congelar a -80°C e descongelar em RT. Repetir o ciclo 6 vezes. Lavar com água MilliQ.4. Imergir em 25 mM NH4OH por 1 h e lavar com água MilliQ.5. Imergir em 0,1% TX100 em 50 mM tampão Tris (pH 8,0) por6 h. Lavar com 10 mM tampão Tris (pH 8,0) e água MilliQ.6. Incubar em 1.5M KCl por 6 h e então em água MilliQ por 6 h. Repetir três vezes. Lavar com água MilliQ.7. 6 ciclos de congelamento a -80°C e descongelamento a RT.Três ciclos de choque osmótico com 3 M NaCl a H2O. Lavar com água MilliQ.8. *5x lavagens com 8 mM CHAPS, 1M NaCl, e 25 mM EDTA emPBS (10 mM a pH 7,4), 10X lavagens com PBS, incubar durante a noite a 37°C com PBS + 10% FBS + 10% penicilina/estreptomicina; incubar tecido com benzonase (nuclease, 90U/ml, Sigma-Aldrich) a 37°C por 1 hora; 5X lavagem com PBS + 10% FBS, 10%penicilina/estreptomicina; armazenar ECM descelularizada a 4°C emPBS + 10% FBS, 10% penicilina/estreptomicina 9. *Enxaguar fragmentos de tecido 5X com PBS (10 mM pH 7,4). 5X lavagens em PBS isotônico + 1% (peso/v) Triton X-100; suspender novamente por pipetar suavemente 5X; 5X lavar com PBS isotônico +2% (peso/v) Triton X100; suspender novamente por pipetar suavemente 5X; balançar a amostra durante a noite com PBS isotônico + 3% (peso/v) Triton X-100; 5x lavar com PBS isotônico + 3% (peso/v) Triton X-100; 5 min. incubação em 2% Triton entre lavagens; suspender novamente por utilizar pipetagem suave 5X; 10X lavagem com PBS contendo 0,1% SDS (peso/v); 10x lavagem PBS lavagem, tratamento de benzonase como acima, lavagem e armazenagem.10. Congelar a -80°C 6 h; descongelar em H2O deionizado 8 h; perfundir H2O deionizado; a seguir PBS 37°C 2 h; 0,02% Tripsina 0,05% EDTA 0,05% NaN3 2 h; 4% desoxicolato 2 h; 0,1% ácido peracético; 4% EtOH 1 h.11. 10 μM adenosina 15 min.; 1% SDS 12 h; 1% Triton X-100 30min.; PBS com antibióticos 124 h12. 8 mM CHAPS, 1 M NaCl, 25 mM EDTA 2 h; PBS com antibióticos; 90 U/ml benzonase; PBS com 10% FBS13. 0,1% SDS 120 min; 1% Triton X-100 10 min; PBS com antibióticos 72 h.14. Congelar a -80°C 24 h; 0,02% tripsina 2 h; 3% Triton X 18-24 h; ácido peracético 1 h15. Congelar a -80°C; 4°C PBS durante a noite; 0,01% SDS 24 h; 0,1% SDS 24 h; 1% SDS 24 h; 1% Triton X-100 30 min.; 0,1% ácido peracético 3 h16. Lavar - PBS & congelar 1 semana; congelar/descongelar 24 h; lavar - DMEM 48 h; 11% SDS 5 semanas; DN/Aase 24 h
[00090] Técnicas de semeadura atualmente empregadas em recelularização de ECM incluem injeção de células na ECM, semeadura de dose baixa por perfusão, e semeadura de bolo múltiplo com perfusão. Isso também pode ser obtido por misturar simplesmente células com ECM magnetizada. Vide a figura 1 mostrando a magnetização de células e o crescimento de uma cultura 3D, que eventualmente faz uma ECM magnética que pode ser descelularizada de acordo com técnicas conhecidas. Embora a figura 1 mostre um tipo de célula única sendo utilizada para cultura 3D, uma mistura de tipos de célula poderia ser também utilizada aqui.
[00091] O processo também pode ser utilizado para enriquecer ou modificar a ECM magnetizada purificada com células do mesmo tipo ou tipo diferente, respectivamente, como mostrado na figura 2. Isso seria obtido por recelularizar a ECM magnética preparada como na figura 1 com tipo de célula B, e então repetir o processo para gerar uma ECM misturada feita de dois tipos de células.
[00092] Diversos experimentos foram realizados para mostrar a utilidade da ECM magnética e seu valor em auxiliar células a crescer em um modo mais robusto e natural. Um foi um ensaio de cicatrização de ferimento e o outro um ensaio de diferenciação de osso, em que o desenvolvimento do osso foi indicado por nível de fosfatase alcalina de osso.
[00093] Para fazer uma matriz descelularizada para o ensaio de cicatrização de ferimento, frascos T75 de HPFs foram tratados com NanoShuttle™ (8 μL/cm2 de área superficial) para incubar durante anoite. No dia seguinte, os HPFs foram desprendidos de seu substrato e levitados em placas de 6 cavidades em uma concentração de 2,8 milhões de células/cavidade em 2 mL de meio (DMEM, com soro bovino fetal, FBS, a 10%, e 1% de penicilina/estreptomicina, P/S) e cultivado em 3D por 2 dias.
[00094] Posteriormente, as culturas foram gradualmente descelularizadas com concentrações crescentes de Triton X-100 (1%, 2%, 3%) em PBS, com uma incubação durante a noite com 3% Triton X100. A seguir, as culturas foram lavadas com 0,1% SDS em PBS, a seguir PBS sozinho, antes de ser mecanicamente quebrado com ação de pipeta e incubado durante a noite com 90 U/mL de benzoase em PBS com 1% de P/S a 37°C. No dia seguinte, as culturas descelularizadas foram lavadas duas vezes com PBS e suspensas novamente no mesmo volume de PBS que o volume total de NanoShuttle adicionado aos frascos. Isso fornece ECM magnética a partir de células HPF (mECM-HPF) para uso nos seguintes ensaios.
[00095] Olhamos então o efeito do mECM-HPF sobre a capacidade de cicatrização de ferimento de NNDFs. Frascos T75 de NNDFs foram incubados com NanoShuttle™ (8 μL/cm2 de área superficial). No dia seguinte, as células foram desprendidas do substrato e contadas. Em uma placa de 96 cavidades separada se apoiando no topo de um conjunto de 96 ímãs no formato de anel, adicionamos volumes de mECM-HPF em razões entre 0-2:1 com volumes correspondendo à quantidade de NanoShuttle™ em 200.000 células. O mECM-HPF foi deixado padronizar por 15 min. na cavidade inferior. A seguir, 200.000 células foram adicionadas a cada cavidade e padronizadas por outro período de 15 min. Posteriormente, o campo magnético foi removido e a área do anel foi medida durante 1400 minutos, a seguir traçado contra tempo e concentração. Verificamos que com concentrações crescentes de mECM-HPF, o anel de células foi capaz de fechar em uma taxa mais rápida (tabela 1). Desse modo, EMC magnética de células HPF melhorou a cicatrização de ferimento de NNDFs. Tabela 1. Cicatrização de ferimento de NNDFs
[00096] A seguir, estudamos se a ECM magnética de HPF ajudou a diferenciar NNDFs em um fenótipo de osso. Frascos T75 de NNDFs foram tratados com NanoShuttle™ sozinho, mECM-HPF individualmente, ou 1:1 NanoShuttle™: mECM-HPF, combinado (8 μL/cm2 de área superficial) para incubar durante a noite. No dia seguinte, NNDFs foram desprendidos de seu substrato e levitados em placas de 24 cavidades em uma concentração de 200.000 células/cavidade em 400 μL de meio. Os NNDFs foram adicionalmente divididos entre culturas com meios DMEM, e culturas com meios osteogênicos (DMEM com 10% FBS, 1% P/S, 10 mM β-glicerolfosfato, 100 nM dexametasona, 50 ug/mL de ácido ascórbico).
[00097] Concomitantemente, NNDFs tratados com NanoShuttle™ e NNDFs não tratados foram revestidos em 2D com qualquer dos tipos de meios. As culturas foram cultivadas por 6 dias com trocas de meios a cada 2 dias. Após 6 dias, as culturas 3D foram homogeneizadas em 2% Triton X-100 em PBS, a seguir centrifugadas por 15 min. a 10.000 g a 4°C. Culturas 2D foram similarmente lavadas em 2% Triton X-100 em PBS, a seguir centrifugadas por 10 min. a 2.500 g a 4°C. os sobrenadantes foram coletados e analisados utilizando um kit de ensaio de fosfatase alcalina de osso (SensoLyte®).
[00098] Fosfatase alcalina de osso (BAP) é a isoforma específica de osso de fosfatase alcalina, e a mudança de atividade de fosfatase alcalina é envolvida em uma variedade de eventos fisiológicos e patológicos, como desenvolvimento de osso, doenças relacionadas a osso, doenças relacionadas à gestação e doenças inflamatórias de intestino. Fosfatase alcalina é também uma enzima popular conjugada com anticorpo secundário para ELISA. Fosfato de p-nitrofenila (pNPP) provou ser um substrato cromogênico eficaz para fosfato alcalino.
[00099] As amostras dos sobrenadantes foram divididas em alíquotas e o substrato de fosfatase alcalina, pNPP, foi adicionado em uma concentração de 1:1. As soluções foram misturadas e as absorvências das amostras foram então lidas em um espectrofotômetro a uma absorvência de 405 nm.
[000100] Os resultados são mostrados na tabela 2, e confirmam que a adição de mECM-HPF a culturas 3D com meio osteogênico aumentou a atividade de BAP em relação àquelas culturas 3D sem matriz descelularizada, ou uma razão de 1:1 de NanoShuttle; mECM- HPF e meio osteogênico. Desse modo, a adição de mECM-HPF aumentou desenvolvimento de osso e melhorou a diferenciação de NNDFs em direção a um fenótipo de osso em cultura 3D. Tabela 2: atividade de BAP (em relação a controle não tratado 2D sem meio osteogênico)
[000101] Em experimentos de teste futuros, caracterizaremos e avaliaremos o desempenho da ECM magnética versus células cultivadas com Nanoshuttle somente. Avaliaremos a eficácia de células cultivadas em nossa ECM magnética contra células tratadas com Nanoshuttle. Esse experimento incluirá determinar o rendimento de levitar células versus não levitadas quando tratadas com ECM magnética VS. Nanoshuttle. A seguir, avaliaremos o nível de citosinas inflamatórias, IL-6 e IL-8, no sobrenadante de culturas levitadas e tratadas versus o sistema de controle consistindo em culturas de monocamadas e células tratadas e levitadas com Nanoshuttle somente.
[000102] Investigaremos também o efeito de tempo de levitação sobre a composição da ECM magnética por sondar proteínas de ECM como imunohistoquímica e/ou Western blotting. Também caracterizaremos a ECM magnética gerada a partir de um único tipo de célula, mais de um tipo de célula levitada e cultivada em conjunto ao mesmo tempo, e dois tipos de células onde um tipo de célula gera a primeira batelada de ECM magnética (ECM magnética A) que é então utilizada para tratar um segundo tipo de célula (ECM magnética B) que é levitada para adicionalmente modificar a ECM magnética original (figura 2).
[000103] Finalmente, avaliaremos se a ECM magnética tem qualquer efeito sobre regular a diferenciação de células tronco pré-adipócito (3T3 fibroblastos) em adipócitos versus células tratadas/levitadas com nanoshuttle somente e em 2D. isso será realizado por induzir diferenciação em adipócitos de células levitadas (ECM magnética e NANOSHUTTLE™ tratado) e monocamadas (ECM magnética e NANOSHUTTLE™ tratado e não tratado). Prevemos que nossa ECM magnética fornecerá um ambiente facilmente obtenível e hospitaleiro para o crescimento e diferenciação correta de células tronco para fazer vários tipos de tecido.
[000104] As seguintes referências são incorporadas aqui na íntegra para todas e quaisquer finalidades.
[000105] Lu H., e outros, Comparison of decellularization techniques for preparation of extracellular matrix suportes derived from three-dimensional cell culture, J. Biomed. Mater. Res. 00A:000-000 (2012) (visualização prévia de artigo disponível online).
[000106] Reilly, G.C. & Engler, A.J., Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation, J. Biomech. 43(1): 55-62(2010).
[000107] WO2010036957 & WO2011038370.
[000108] WO2006060171.
[000109] O que é reivindicado é:
Claims (11)
1. Método de fazer uma matriz extracelular (ECM) magnética, o referido método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:a) combinar células com uma composição compreendendo uma nanopartícula magnética de modo que as referidas células absorvam a referida nanopartícula magnética;b) levitar as referidas células em um campomagnético;c) cultivar as referidas células levitadas no referido campo magnético em uma cultura de célula 3D com uma ECM,em que as nanopartículas magnéticas são perdidas a partir das células e retidas pela referida ECM durante a levitação e crescimento das células levitadas no campo magnético; ed) descelularizar a referida cultura de células 3D para produzir uma ECM magnética.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas nanopartículas magnéticas são fornecidas por explosão, injeção, eletroporação, pressão magnética, hidrogéis ou lipossomas catiônicos.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição compreende:i) uma nanopartícula negativamente carregada;ii) uma nanopartícula positivamente carregada; eiii) uma molécula de suporte;em que uma da referida nanopartícula negativamente carregada ou nanopartícula positivamente carregada contém um elemento magneticamente responsivo, e em que a referida molécula de suporte mantém a referida nanopartícula negativamente carregada e a referida nanopartícula positivamente carregada em uma mistura íntima.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda a) em que a molécula de suporte compreende peptídeos, polissacarídeos, ácidos nucleicos, polímeros, poli-lisina, fibronectina, colágeno, laminina, BSA, hialuronano, glicosaminoglicano, glicosaminoglicano não sulfatado aniônico, gelatina, ácido nucleico, misturas de proteína de matriz extracelular, anticorpo, ou misturas dos mesmos, b) em que a referida nanopartícula negativamente carregada é uma nanopartícula de ouro, e c) em que a nanopartícula positivamente carregada é uma nanopartícula de óxido de ferro.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda semear a referida ECM magnética com células e cultivar a referida ECM semeada em um campo magnético.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda semear a referida ECM magnética com fibroblasto e/ou células epiteliais e/ou osteoblastos, mais células tronco e/ou progenitoras, e cultivar adicionalmente a referida ECM semeada em um campo magnético.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas células estão na forma de um fragmento de tecido extraído de um paciente.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende ainda semear a referida ECM com células tronco ou progenitoras do referido paciente, e cultivar adicionalmente a referida ECM semeada em um campo magnético.
9. Método de preparar tecido para implantação em um paciente, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:a) combinar células com nanopartículas magnéticas que são absorvidas pelas referidas células;b) expor as referidas células a um campo magnético de tal modo que as referidas células coalesçam e levitem;c) cultivar as referidas células para formar uma cultura de célula 3D com uma ECM,em que as nanopartículas magnéticas são perdidas a partir das células e retidas pela referida ECM durante a levitação e crescimento das células levitadas no campo magnético;d) descelularizar a referida cultura de célula 3D para fazer uma ECM magnética;e) semear a referida ECM magnética com células tronco alogenéicas ou progenitoras de um paciente;f) cultivar a referida ECM semeada em um campo magnético; eg) em que a ECM semeada a partir da etapa f) se destina a ser transplantada para o referido paciente.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas nanopartículas magnéticas compreendem ainda:i) uma nanopartícula negativamente carregada;ii) uma nanopartícula positivamente carregada; eiii) uma molécula de suporte;em que uma da referida nanopartícula negativamente carregada ou nanopartícula positivamente carregada contém um elemento magneticamente responsivo, e em que a referida molécula de suporte mantém a referida nanopartícula negativamente carregada e a referida nanopartícula positivamente carregada em uma mistura íntima.
11. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas nanopartículas magnéticas são introduzidas na célula por explosão, injeção, eletroporação, pressão magnética, hidrogeis ou lipossomas catiônicos.
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