JP7210054B2 - ナノバーコードを使用することによって、幹細胞の細胞付着・分化を調整する方法 - Google Patents

Description

本発明は、幹細胞の付着・分化の調整に用いられるナノバーコード、そのナノバーコードを用いた幹細胞の付着・分化を調整する方法に関するものであり、具体的には、上記のナノバーコードを用いて、幹細胞の付着・分化を調整する方法に関するものである。

幹細胞は、自己再生による増殖が可能であり、骨、脂肪、筋肉、心筋、血管、軟骨など様々な細胞に分化する能力を有する。近年、これらの特性を活用して損傷を受けた組織、臓器を再生するために幹細胞、或いは幹細胞から分化した細胞の移植する技術が幅広く研究されている。その上、幹細胞が特定の細胞に分化できるように補助する生体材料の研究も活発に行われている。

このように、幹細胞の再生効果を効率的に制御するための方法として、リガンドの提示による体内技術が開示されている。しかしながら、従来のマイクロスケールのインテグリンリガンドペプチド（ＲＧＤ）の脱着（ｕｎｃａｇｉｎｇ）は、宿主幹細胞の付着は調整するが、幹細胞の分化に関する調整は行わないという問題を抱えている。

韓国公開特許第２０１８－００３９７２４号公報

本発明の目的は、リガンドが結合されたナノバーコードと、並びに、ナノバーコードに結合されたリガンドの周期性と配列の順序を制御して、幹細胞の付着・分化を調整する方法を提供することである。

本発明は、鉄（Ｆｅ）を含む第１のセグメントと、金（Ａｕ）を含む第２のセグメントとが繰り返し形成されたナノバーコードと、
ナノバーコードの第２のセグメントに結合されたインテグリンリガンドペプチドを含む、幹細胞の付着・分化調整用のナノバーコードを提供する。

また、本発明は、鉄（Ｆｅ）を含む第１のセグメントと、金（Ａｕ）を含む第２のセグメントとが繰り返し形成されたナノバーコードを用意するステップと、
ナノバーコードと、第１の懸濁液とを混合して、第１のセグメントにカルボン酸塩置換基を置換するステップと、
ナノバーコードをインテグリンリガンドペプチド（ＲＧＤ）を含む第２の懸濁液と混合するステップと、を含む、請求項１～５のうちいずれか１項に記載の幹細胞の付着・分化調整用のナノバーコードの製造方法を提供する。

更に本発明は、上述の幹細胞の付着・分化調整用のナノバーコードを含む溶液に表面が活性化された基板を担持してナノバーコード提示基板を製造するステップと、
前記ナノバーコード提示基板を培養液で処理した後、幹細胞の付着・分化を調整するステップと、を含む、幹細胞の付着・分化を調整する方法を提供する。

本発明による幹細胞の付着・分化調整用のナノバーコードは、ナノバーコードにコーティングされたリガンドペプチドの周期性と配列の順序を制御し、幹細胞の付着・分化を容易に調整することができる。

また、本発明による幹細胞の付着・分化を調整する方法は、上記のナノバーコードを含む基板に磁場を印加することで可逆的な制御も可能であり、体内・体外での幹細胞の付着・分化を効率的に調整することができる。

本発明の一実施例による幹細胞の付着・分化調整用のナノバーコード、これを含む基板、並びに、これを用いた幹細胞の付着・分化を調整する方法を示した模式図 本発明の一実施例による、ナノバーコードの高角度環状暗視野走査透過型電子顕微鏡（ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ）の画像、エネルギー分散型分光法（ＥＤＳ）マッピング、電界放出形走査電子顕微鏡（ＦＥ－ＳＥＭ）の画像を示したもの 本発明の一実施例による、ナノバーコードの模式図（ａ）、ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭの結果から計算された各ＦｅとＡｕ（Ｆｅ／Ａｕ）ナノバーコードの長さの合計（ｂ）、直径（ｃ）、表面積（ｄ）を示したグラフ 本発明の一実施例によるナノバーコードのＸ線回折分析グラフ 本発明の一実施例によるナノバーコードの振動試料に対する、磁力計の測定結果のグラフ 本発明の一実施例によるナノバーコードを含む基板を製造するステップを図式化した画像 本発明の一実施例によるナノバーコードに対してフーリエ変換赤外分光法（ＦＴ－ＩＲ）により分析を行った結果 本発明の一実施例によるナノバーコードを用いて培養された幹細胞（４８時間後）のＦ－アクチン、核、ビンキュリン、ＹＡＰの共焦点免疫蛍光画像（スケールバーは２０μｍ） 共焦点免疫蛍光画像データから、幹細胞培養の４８時間後の付着細胞密度、細胞面積、焦点付着数、アスペクト比（主軸／副軸比）、核／細胞質のＹＡＰ比率を定量的に計算したグラフ 共焦点免疫蛍光画像データから、幹細胞培養の４８時間後の付着細胞密度、細胞面積、焦点付着数、アスペクト比（主軸／副軸比）、核／細胞質のＹＡＰ比率を定量的に計算したグラフ （ａ）は、本発明の比較例によるスクランブルＲＡＤナノバーコードを用いて培養された幹細胞（４８時間後）のＦ－アクチン、核、ビンキュリン、ＹＡＰに対してナノ周期を調整した場合の共焦点免疫蛍光画像（スケールバーは５０μｍ）、（ｂ）は、上記の共焦点免疫蛍光画像データから、幹細胞培養の４８時間後の付着細胞密度、細胞面積、焦点付着数、アスペクト比（主軸／副軸比）、核／細胞質のＹＡＰ比率を定量的に計算したグラフ ナノバーコードを用いた、リガンド配列におけるナノ周期の調整により試験管内・体内の幹細胞の機械的形質導入に関する実験の結果 本発明によるナノバーコードを用いて、共焦点免疫蛍光画像をもとに、ナノ周期を有するナノバーコードを含む基板に幹細胞を７日間培養した後、核／細胞質のＲＵＮＸ２蛍光比及びアルカリホスファターゼ陽性細胞を定量的に分析したグラフ 本発明の一実施例によるナノバーコードを用いて、共焦点免疫蛍光画像をもとに、ナノ周期を有するナノバーコードを含む基板に幹細胞を７日間培養した後、核／細胞質のＲＵＮＸ２及びＡＬＰ遺伝子発現プロファイルを定量的に分析したグラフ 本発明の一実施例によるナノバーコードを用いて、リガンド配列においてナノ周期とリガンド配列の順序の調整により試験管内の幹細胞の機械的形質導入に関する実験の結果 本発明の一実施例によるナノバーコードを用いた、幹細胞培養の４８時間後のインテグリンβ１、ＦＡＫ、ｐ－ＦＡＫ、ＲｈｏＡ、Ｆ－アクチン、核の共焦点免疫蛍光画像 （ａ）は、本発明の一実施例によるナノバーコードを用いてアクチン重合阻害剤（サイトカラシンＤ）を有する幹細胞を４８時間培養した後の、ＴＡＺ、ビンキュリン、Ｆ－アクチン核の共焦点免疫蛍光画像（スケールバーは５０μｍ）、（ｂ）は、上記の共焦点免疫蛍光画像から計算された核／細胞質のＴＡＺ蛍光比を計算したグラフ （ａ）は、本発明の一実施例によるナノバーコードを用いて、アクチン重合阻害剤（サイトカラシンＤ）とミオシンII阻害剤（ブレビスタチン）を有する幹細胞を培養して４８時間後の、ＹＡＰ、Ｆ－アクチン、核の共焦点免疫蛍光画像（スケールバーは５０μｍ）、（ｂ）は、上記の共焦点免疫蛍光画像から計算されたＹ２７６３２、サイトカラシンＤ、ブレビスタチンの阻害剤による核／細胞質のＹＡＰ蛍光比を計算したグラフ 本発明の一実施例によるナノバーコードを用いた体内の宿主幹細胞の付着の調整の実験の結果 本発明の一実施例によるナノバーコードを用いて、体内宿主幹細胞の焦点付着を介する機械的形質導入の実験の結果であり、図１２ｃに図示された共焦点免疫蛍光画像から皮下移植された基板上にＨｍｓｃが注射されて６時間後の細胞の拡散面積、焦点付着数、アスペクト比（主軸／副軸比）、核／細胞質のＹＡＰ蛍光比を計算したグラフ

以下、本発明をより具体的に説明するために、本発明による好ましい実施例を、添付の図面を参照しながらより詳しく説明する。ただし本発明は、本願で説明している実施例に限られず、他の形態で具体化されてもよい。

本発明は、鉄（Ｆｅ）を含む第１のセグメントと、金（Ａｕ）を含む第２のセグメントとが繰り返し形成されたナノバーコードと、
ナノバーコードの第２のセグメントに結合されたインテグリンリガンドペプチドを含む、幹細胞の付着・分化調整用のナノバーコードを提供する。

図１は、本発明による幹細胞の付着・分化調整用のナノバーコード、当該ナノバーコードと結合された基板、並びに、これを用いた幹細胞の付着・分化を調整する方法を示した模式図である。

図１によると、本発明のナノバーコードは、鉄（Ｆｅ）を含む第１のセグメントと、金（Ａｕ）を含む第２のセグメントとが繰り返し形成されたナノバーコード、ナノバーコードの第２のセグメントに結合されたインテグリンリガンドペプチドを含み、当該インテグリンリガンドペプチドは、インテグリンペプチドである。

具体的には、ナノバーコードは、下記の式（１）又は式（２）を満足するバー状である。

［Ｌ（Ｍ_１Ｍ_２）ｑ］ （１）
［Ｌ（Ｍ_１Ｍ_２Ｍ_２Ｍ_１）ｑ］ （２）
ここにおいて、
Ｍ_１は第１のセグメント、Ｍ_２は第２セグメントであり、
ｑは第１及び第２のセグメントの繰り返し回数であり、
Ｌは第１及び第２のセグメントの長さである。

具体的には、Ｌは、１０～５００、１０～１００、３０～７５、又は１５０～５００の整数であり、Ｍ_１及びＭ_２は互いに独立的な数字を表し、ｑは１～１０、２～１０、又は１～２の整数である。

例えば、当該ナノバーコードにおいて、式（１）及び（２）は、［３０（Ｍ_１Ｍ_２）_１０］、［７５（Ｍ_１Ｍ_２）_４］、［７５（Ｍ_１Ｍ_２Ｍ_２Ｍ_１）_２］、［１５０（Ｍ_１Ｍ_２）_２］、［１５０（Ｍ_１Ｍ_２Ｍ_２Ｍ_１）_１］、［３００（Ｍ_１Ｍ_２）_１］のうちいずれかで表されてもよい。この時、Ｍ_１は第１のセグメント、Ｍ_２は第２セグメントである。具体的には、当該ナノバーコードは、［３０（０１）_１０］、［７５（０１）_４］、［７５（０１１０）_２］、［１５０（０１）_２］、［１５０（０１１０）_１］、［３００（０１）_１］のうちいずれかを満足するバー状であってもよい。

式（１）を満足するナノバーコードは、第１及び第２のセグメントの長さ（Ｌ）を調整することにより、第２のセグメントに結合されたリガンドペプチドの周期性を調節することができ、式（２）を満足するナノバーコードは、式（１）を満足するナノバーコードと比較して、第２のセグメントに結合されたリガンドペプチドの周期と配列の順序のうちいずれか一つ以上を調整することができる。

第１のセグメントは、カルボン酸塩が置換された構造であってもよい。カルボン酸塩置換基は、アミノ酸誘導体、具体的にはアミノカプロン酸であってもよい。上記のように、第１のセグメントがカルボン酸塩が置換された構造を有すると、基板との結合力が向上され、優れた耐久性を示すことができる。

第２のセグメントに結合されたインテグリンリガンドペプチドは、チオール化インテグリンリガンドペプチドを含み、当該インテグリンリガンドペプチドのチオール基と第２のセグメントとが化学的に結合された構造であってもよい。

上記のように、第２のセグメントにインテグリンリガンドペプチドを結合させ、該リガンドペプチドの周期性や配列の順序を制御することにより、幹細胞の付着・分化を効率的に制御することができる。

図２（ａ）は、本発明による幹細胞の付着・分化調整用のナノバーコードの、高角度環状暗視野走査透過型電子顕微鏡と電界放出形走査電子顕微鏡から得た画像であり、ナノバーコードの大きさを知ることができる。具体的には、当該ナノバーコードは、断面が円形のバー状であり、直径は５０～１００ｎｍであってもよい。より具体的には、当該ナノバーコードは、直径が６０ｎｍ～９０ｎｍ、或いは５０ｎｍ～８０ｎｍであってもよい。また、当該ナノバーコードは、バー状で、長さは２００ｎｍ～１０００ｎｍであってもよい。当該ナノバーコードの長さが２００ｎｍ未満の場合には、インテグリンリガンド結合の効率が低下し、１０００ｎｍを超える場合には、基板上に結合されるとき、分散度が低下する。より具体的には、当該ナノバーコードは、
長さが５００ｎｍ～８００ｎｍ、或いは６００ｎｍ～９００ｎｍであってもよい。上記のようなナノバーコードを含むことにより、ナノバーコードの構造に応じて、幹細胞の付着・分化を調整することができる。

また、本発明は、鉄（Ｆｅ）を含む第１のセグメントと、金（Ａｕ）を含む第２のセグメントとが繰り返し形成されたナノバーコードを用意するステップと、
ナノバーコードと、第１の懸濁液とを混合して、第１のセグメントにカルボン酸塩置換基を置換するステップと、
ナノバーコードをインテグリンリガンドペプチド（ＲＧＤ）を含む第２の懸濁液と混合するステップと、を含む、請求項１～５のうちいずれか１項に記載の幹細胞の付着・分化調整用のナノバーコードの製造方法を提供する。

ナノバーコードを用意するステップは、陽極酸化ナノテンプレートを用いて、第１の電流で鉄を、第１の電流より低い第２の電流で金を、ナノテンプレートの細孔（Ｐｏｒｅ）に交互に充填させて鉄－金の多層ナノワイヤを形成する電気めっき工程と、陽極酸化ナノテンプレートをエッチングする工程とを含むことができる。

ナノテンプレートとしては、陽極酸化アルミニウム（Ａｎｏｄｉｃ Ａｌｕｍｉｎｕｍ Ｏｘｉｄｅ、ＡＡＯ）ナノテンプレート、無機材料（Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ）ナノテンプレート、或いは高分子ナノテンプレートを使用する。ここでは、陽極酸化アルミニウムナノテンプレートを用いる。陽極酸化アルミニウムナノテンプレートの細孔（Ｐｏｒｅ）の直径によってナノワイヤの寸法が定められ、ナノワイヤの形成時間と速度によってナノワイヤの長さが定められる。

陽極酸化アルミニウムナノテンプレートは、直径が２００ナノメートルの細孔を複数有する。

電気めっきの前に電子ビーム蒸着法（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｂｅａｍ Ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）により陽極酸化アルミニウムナノテンプレートの底面に厚さ２５０ｎｍの銀（Ａｇ）電極層を形成する。この電極層は、電気めっきの際に陰極として機能する。ここで、電極層として他の金属や導電性材料からなる層を使用してもよい。

高電圧や高電流ではＦｅ層が合成され、低電圧や低電流ではＡｕ層が合成されるように、交互に電圧や電流を印加するパルスめっき法により、陽極酸化アルミニウムナノテンプレートの細孔中にＦｅ／Ａｕバーコードナノワイヤを合成する。

１つのメッキ槽において、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物（ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、２７８．０２ｇ／ｍｏｌ）とシアン化金（Ｉ）カリウム（ＫＡｕ（ＣＮ）_２、２８８．１０ ｇ／ｍｏｌ）とを一定の比となるようにモール（ｍｏｌｅ）の濃度を調整しながら、前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）として用いる電気めっき用電解液を調製する。電流の恒常性を維持するためにホウ酸（Ｈ_３ＢＯ_３）を緩衝液に加える。

ここで、一つのメッキ槽に二種類の前駆体を一緒に入れて二つの元素がそれぞれ一層をなすナノワイヤを合成する必要があるので、前駆体を選ぶ時、二種の前駆体が反応を起こして化合物を生成してはならない。

また、還元性の良い元素のイオン含有量と還元性の悪い元素の含有量との比率を調整し、多層構造からそれぞれの元素を分離できるようにする必要がある。使用した溶液において鉄イオンと金イオンのモル濃度の比は、４０：１～４：１の範囲（好ましくは１６：１）がよく、貴重（Ｎｏｂｌｅ）な金属である金の濃度を相対的に低くすると、二種の元素がそれぞれ一層をなすナノワイヤを合成することができる。

電解液は、超純水（Ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ Ｗａｔｅｒ）を用いて製造し、水素イオン化濃度（ｐＨ Ｖａｌｕｅ）をホウ酸（Ｈ_３ＢＯ_３）を用いて一定値に維持し、電流の恒常性を維持できるようにする。

ナノテンプレートにパルス電気めっきを施し、Ｆｅ／Ａｕ多層構造バーコード型ナノワイヤを形成する。鉄イオンの電気めっきのために、１０ｍＡ／ｃｍ^２の電流を印加し、金イオンの電気めっきのために１．０ｍＡ／ｃｍ^２の電流を印加した。

鉄と金の標準還元電位（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）はそれぞれ異なるが、このような還元電位の差を以って、上述したように、比較的に高い電流では鉄メッキが、比較的に低い電流では金メッキを行うことができる。これにより、Ｆｅ／Ａｕ多層薄膜ナノワイヤの製造が可能となる。

次いで、個々の多層薄膜ナノワイヤを得るために、陽極酸化ナノテンプレートに、常温で１時間、１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液で処理を施すと、ナノテンプレートと電極層の両方が溶解し、バーコード型の鉄／金の多層薄膜ナノワイヤを分離することができる。

ナノワイヤの直径は、細孔の大きさが異なる陽極酸化アルミニウムナノテンプレートを用いることにより制御でき、ナノワイヤにおける鉄層や金層の厚さは、電気めっきの時間を変更することにより制御できる。

更に、第１のセグメントにカルボン酸塩（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）置換基を置換するステップは、当該ナノバーコードと第１の懸濁液とを混合して、８～２０時間、或いは１０～１５時間反応させることで成し遂げることができる。第１懸濁液はカルボン酸塩の置換基を含むアミノ酸誘導体を含んでもよく、具体的に、当該アミノ酸誘導体は、アミノカプロン酸であってもよい。上記のような第１の懸濁液と反応させると、鉄セグメントの酸化物層にカルボキシレート置換基が置換され、基板と容易に結合することができる。

更に、第２の懸濁液と混合するステップは、ナノバーコードをインテグリンリガンドペプチド（ＲＧＤ）を含む第２の懸濁液に１時間～５時間、或いは１時間～３時間撹拌することで成し遂げることができる。このとき、ナノバーコードの第２セグメントにチオール化ＲＧＤペプチドリガンドが結合することがある。当該溶媒は、ジメチルホルムアルデヒド（ＤＭＦ）やジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のいずれか１つ以上を含んでもよい。上記のように、第２のセグメントにインテグリンリガンドペプチドが結合されると、ナノバーコードのリガンドの周期性や配列の順序を制御することができる。つまり、当該ナノバーコードを用いて、幹細胞の付着・分化を容易に調整することができる。

更に、本発明は、上述した幹細胞の付着・分化調整用のナノバーコードを含む溶液に、表面が活性化された基板を担持して、ナノバーコード提示基板を製造するステップと、ナノバーコード提示基板を培養液で処理した後、幹細胞の付着・分化を調整するステップと、を含む、幹細胞の付着・分化を調整する方法を提供する。

図１ｂは、本発明の一実施例による幹細胞の付着・分化を調整する方法を図式化した図である。図１ｂによると、ナノバーコードの第２のセグメントに結合されたインテグリンリガンドペプチドの周期と配列の順序を調整して幹細胞の付着及び機械感受性を促進し、炎症性Ｍ１表現型と再生性Ｍ２表現型を調整して活性化させている。

具体的には、ナノバーコード提示基板を製造するステップは、基板の表面を酸性溶液に浸漬させるステップと、浸漬済みの基板をアミノシラン溶液に担持して基板の表面を活性化させるステップと、を含んでもよい。

当該基板の表面を酸性溶液に浸漬させるステップでは、塩酸と硫酸のうちいずれか１つ以上を含む酸性溶液に３０分～２時間、或いは３０分～１時間浸漬させてもよい。これにより、当該基板の表面に水酸化基を結合させ、アミノシラン溶液のアミノ基との結合が容易になるよう、基板の表面活性化を効果的に行うことができる。

当該基板の表面を活性化させるステップは、アミノシラン溶液に基板を担持し、基板の表面を活性化させてもよい。アミノシラン溶液は、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を含んでもよい。このとき、基板の表面を活性化させるということは、基板の表面を正に帯電させるということであり、具体的には、基板上にアミン基を結合させて活性化させることができる。上記のようにアミノシラン溶液に浸漬して、基板の表面を活性化させ、基板の表面を正に帯電させると、当該基板は、ナノバーコードの鉄セグメントと化学的に結合することができる。

例えば、該ナノバーコード提示基板はポリエチレングリコール誘導体を含む溶液に担持し、ナノバーコードが結合されていない基板の表面を不活性化させたものであってもよい。

幹細胞の付着・分化を調整するステップは、ナノバーコード提示基板のナノバーコードに結合されたリガンドの周期と配列の順序のうちいずれか一つ以上を変化させて成し遂げることができる。

具体的には、幹細胞の付着・分化を調整するステップで、下記の式（１）を満足するバー状のナノバーコードを含む基板を使用する場合、幹細胞の付着・機械感受性分化が低下してもよい。

［Ｌ（Ｍ_１Ｍ_２）ｑ］ （１）
ここにおいて、
Ｍ_１は第１のセグメント、Ｍ_２は第２セグメントであり、
ｑは第１及び第２のセグメントの繰り返し回数、ｑは２～１０の整数であり、
Ｌは第１及び第２のセグメントの長さである。

また、幹細胞の付着・分化を調整するステップで、下記の式（２）を満足するバー状のナノバーコードを含む基板を使用する場合、幹細胞の付着・機械感受性分化が促進され得る。

［Ｌ（Ｍ_１Ｍ_２Ｍ_２Ｍ_１）ｑ］ （２）
ここにおいて、
Ｍ_１は第１のセグメント、Ｍ_２は第２セグメントであり、
ｑは第１及び第２のセグメントの繰り返し回数、ｑは１～５の整数であり、
Ｌは第１及び第２のセグメントの長さである。

より具体的には、式（１）において、Ｌは１０～１００、或いは３０～７５の整数であってもよい。また、式（２）でＬは１５０～５００、或いは１５０～３００の整数であってもよく、ｑは１～２の整数であってもよい。

例えば、当該ナノバーコードにおいて、式（１）及び（２）は、［３０（Ｍ_１Ｍ_２）_１０］、［７５（Ｍ_１Ｍ_２）_４］、［７５（Ｍ_１Ｍ_２Ｍ_２Ｍ_１）_２］、［１５０（Ｍ_１Ｍ_２）_２］、［１５０（Ｍ_１Ｍ_２Ｍ_２Ｍ_１）_１］、［３００（Ｍ_１Ｍ_２）_１］のうちいずれかで表されてもよい。この時、Ｍ_１は第１のセグメント、Ｍ_２は第２セグメントである。具体的には、当該ナノバーコードは、［３０（０１）_１０］、［７５（０１）_４］、［７５（０１１０）_２］、［１５０（０１）_２］、［１５０（０１１０）_１］、［３００（０１）_１］のうちいずれかを満足するバー状であってもよい。

上記のような構造式を有するナノバーコードの第２のセグメントにインテグリンリガンドペプチドを結合させ、ナノバーコード上にインテグリンリガンドペプチドの周期と配列と順序を制御することで、幹細胞の付着性や分化を効果的に調整することができる。

以下、本発明の実施例を説明する。しかしながら下記の実施例は本発明の好ましい一実施例に過ぎず、本発明の請求の範囲が下記の実施例に限られる訳ではない。

[製造例]

製造例１～６
ナノバーコードの製造
Ｆｅ／Ａｕナノバーコードは、基板上に、様々なリガンドナノ周期とリガンド配列を現すように製造した。パルス電着工程の鋳型として細孔径が７０ｎｍの多孔性ポリカーボネート膜（ＰＣＭ）を使用した。電子ビーム蒸発器を用いて多孔質ポリカーボネート膜細孔内にＡｇ（銀）を沈着させた。ＰＣＭ細工をナノバーコードで充填するために、０．０６Ｍ硫酸第一鉄水和物（ＦｅＳＯ_４７Ｈ_２Ｏ）、０．０１Ｍシアン化金（Ｉ）カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｄｉｃｙａｎｏａｕｒａｔｅ、ＫＡｕ（ＣＮ）_２）、０．６Ｍホウ酸（Ｈ_３ＢＯ_３）で前駆体溶液を製造した。多孔性ポリカーボネート膜細孔を前駆体溶液で充填した後、白金（Ｐｔ）プレートを相対電極として使用しながら、電気化学的反応を誘発するためにパルス電流を印加した。

ＦｅとＡｕは著しく異なる還元電位を有するため、明らかに異なる電流密度を有する印加パルス電流に反応してＦｅ及びＡｕが、所定の順番で個別的に減少した。パルスの持続時間を調整することにより、ＦｅやＡｕセグメント（ｓｅｇｍｅｎｔ）の長さを制御した。

調整可能なナノ周期を有する、６つの周期的にシーケンシングされたＦｅ／Ａｕナノバーコード、並びに、ＦｅセグメントとＡｕセグメントの大きさを調整していない配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、パルス電流密度と持続時間を最適化することにより、正確に製造した。周期的にシーケンシングされたＦｅ／Ａｕナノバーコード４つを、同じナノ 配列を有する調整可能なＦｅ及びＡｕのナノ周期を示すように製造した。

１０個の繰り返し配列を有する長さ３０ｎｍのＦｅセグメント及びＡｕのセグメントで形成されたナノバーコード［３０（０１）_１０］（製造例１）は、まず、それぞれ０．７秒の間４ｍＡ／ｃｍ^２、並びに９秒の間０．２５ｍＡ／ｃｍ^２を交互に適用して製造した。ナノバーコードの構造には、下記のように命名している。ＡｕセグメントとＦｅセグメントを、それぞれ１と０とする。［３０（０１）_１０］ナノバーコードでは、３０は各セグメントの長さ（ｎｍ）、１０は各セグメントの繰り返しシーケンスである。４つの繰り返し配列を有する長さ７５ｎｍのＦｅセグメント及びＡｕのセグメントで形成されたナノバーコード［７５（０１）_４］（製造例２）は、それぞれ１．７秒の間４ｍＡ／ｃｍ^２、並びに２２秒の間０．２５ｍＡ／ｃｍ^２を交互に適用して製造した。２つの繰り返し配列を有する長さ１５０ｎｍのＦｅセグメント及びＡｕのセグメントに形成されたナノバーコード［１５０（０１）_２］（製造例３）は、それぞれ３．６秒の間４ｍＡ／ｃｍ^２、並びに４５秒の間０．２５ｍＡ／ｃｍ^２をそれぞれ交互に適用して製造した。長さ３００ｎｍのＦｅセグメント及びＡｕセグメント［３００（０１）_１］（製造例４）は、それぞれ７．２秒の間４ｍＡ／ｃｍ^２、並びに９０秒の間０．２５ｍＡ／ｃｍ^２を交互に適用して製造した。

ナノ周期や配列の順序を調整するために、２つの周期的にシーケンシングされたＦｅ／Ａｕナノバーコードを製造した。２つの繰り返し配列を有する長さ７５ｎｍのＦｅセグメント、長さ１５０ｎｍのＡｕセグメント、長さ７５ｎｍのＦｅセグメントで形成されたナノバーコード［７５（０１１０）_２］（製造例５）は、それぞれ１．７秒の間４ｍＡ／ｃｍ^２、４４秒の間０．２５ｍＡ／ｃｍ^２、１．７秒の間４ｍＡ／ｃｍ^２を、順次交互に適用して製造した。長さ１５０ｎｍのＦｅセグメント、長さ３００ｎｍのＡｕセグメント、長さ１５０ｎｍの長さのＦｅセグメントで形成されたナノバーコード［１５０（０１１０）_１］（製造例６）は、それぞれ３．６秒の間４ｍＡ／ｃｍ^２、９０秒間０．２５ｍＡ／ｃｍ^２、３．６秒の間４ｍＡ／ｃｍ^２を順次適用して製造した。調整可能なナノ周期を有する、６つの周期的にシーケンシングされたＦｅ／Ａｕナノバーコード及び配列は、多孔性ポリカーボネート膜（ＰＣＭ）からＡｇ層を物理的に分離してジクロロメタンとクロロホルムでそれぞれ１．５時間と０．５時間、多孔性ポリカーボネート膜を化学的に除去することにより、得た。続いて、ナノバーコードをアセトンとエタノールで３回洗浄し、基板結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）のために機能化する前に、保存を目的としてこれを脱イオン水（ＤＩ）１ｍＬに分散させた。

比較製造例１
負に帯電されたチオール化ＲＧＤペプチド（ＣＤＤＲＧＤ、ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ）を添加していないことを除いて、製造例１と同様の方法でナノバーコードを製造した。

［実施例］
製造例１～６
ナノバーコード提示基板の製造
製造例１～６で製造した周期的にシーケンシングされたナノバーコード６つを化学的に機能化して、リガンド配列の様々なナノ－ 周期を現すように、基板にグラフトした。アミン基は天然酸化物層にカップリングすることができるので、アミノカプロン酸（ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ）のアミン基は、表面機能化の後、カルボキシレート基を現すために、ナノバーコードで鉄（Ｆｅ）セグメントの天然酸化物層にカップリングするために用いられた。ナノバーコード１ｍＬ及び６ｍＭアミノカプロン酸溶液１ｍＬの混合溶液を１２時間室温で撹拌した後、遠心分離を施して脱イオン水で洗浄した。２２ｍｍ×２２ｍｍの平面で細胞培養クラスのガラス基板をアミン化させ、６つの異なるナノバーコードの表面にてカルボキシレート基が基板上のアミン基と結合されるようにする。基板を、まず３０分間、塩酸とメタノールを１：１で混合した混合物で洗浄し、脱イオン水で濯いだ。基板に水酸化基を硫酸で１時間活性化させ、脱イオン水で洗浄した。基板を暗室で３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）とエタノール（１：１）で１時間アミノ化し、エタノールで洗浄した後、１００℃で１時間乾燥させた。脱イオン水１ｍＬでアミノカプロン酸が結合された周期的にシーケンシングされたナノバーコード６つを２０ｍＭ Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）（ＥＤＣ）０．５ｍＬと２０ｍＭ Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ＮＨＳ）０．５ｍＬでＥＤＣ／ＮＨＳ反応により３時間活性化させ、その後、脱イオン水で洗浄した。

周期的にシーケンシングされたナノバーコード６つをアミノ化された基板に結合させ、基板に結合されたナノバーコードとリガンドの密度を調整せずとも、周期的にシーケンシングされたナノバーコード６つで、ナノバーコードの濃度（１～２ｍＬ）と反応時間（２～３時間）とを正確に最適化することにより、調整可能なリガンドのナノ周期と配列を提示する。チオール化ＲＧＤペプチドリガンド（ｔｈｉｏｌａｔｅｄ ＲＧＤ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄ）は、ナノバーコード結合基板からＡｕセグメントにグラフトされた。０．２５％Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）と１０Ｍｍトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）を有するジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で、０．２ ｍＭチオール化ＲＧＤペプチドリガンド（ＧＣＧＹＣＦＣＤＳＰＧ、 ＧＬＢｉｏｃｈｅｍ）を使用し、ナノバーコード結合された基板を２時間培養し、その後、脱イオン水で洗浄した。周りを暗くし、２時間、脱イオン水中で、０．２％Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を有する１００Μｍメトキシ－ポリ（エチレングリコール）－スクシンイミジルカルボキシメチルエステル（ｍｅｔｈｏｘｙ－ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） － ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）で基板のナノバーコードがコーティングされていない領域を遮断した後、脱イオン水で洗浄し、非ＲＧＤリガンド特異的幹細胞の付着性を最小限に抑える。

比較例１
上記の比較製造例１で製造したナノバーコードを使用したことを除いては、同様の方法で、ナノバーコード提示された基板を製造した。

［実験例］
実験例１
本発明によるナノバーコードの形と化学的特性を確認するために、製造されたナノバーコードに対して高角度環状暗視野走査透過型電子顕微鏡（ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ）、エネルギー分散型分光分析（Ｅｎｅｒｇｙ ｄｉｓｐｅｒｓｉｖｅ Ｘ－ｒａｙ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＥＤＳ）、Ｘ線回折分析（Ｘ－ｒａｙ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ、ＸＲＤ）、振動試料型磁力測定（Ｖｉｂｒａｔｉｎｇ－ｓａｍｐｌｅｍＡｇｎｅｔｏｍｅｔｒｙ、ＶＳＭ）、フーリエ変換赤外分光分析（Ｆｏｕｒｉｅｒ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＦＴ－ＩＲ）を行い、結果を図２及び図６に図示した。

具体的には、調整可能なナノ周期と配列を有する周期的にシーケンシングされたＦｅ／Ａｕナノバーコード６つのサイズと形状を特徴付けるために、高角度環状暗視野走査透過型電子顕微鏡（ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ）の撮像を既に実証された手順に従って行った。ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ撮像は０．５～１．０μｍの球面収差（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ、Ｃ３）で、プローブＣｓを補正したＪＥＭ ＡＲＭ２００ＣＦ（ＪＥＯＬ Ｌｔｄ．）を用いて２００ｋＶで行われ、２７～２８ｍｒａｄの像を得た。ＨＡＡＤＦの収集半角は９０～３７０ｍｒａｄであるのに対し、撮影のための収束半角は２１ｍｒａｄである。８Ｃ及び９Ｃ（ＪＥＯＬで定義）の電子プローブサイズで、それぞれ１．２８Åと１．２Åで測定し、２０４８×２０４８ピクセルの領域に対してピクセル滞留時間を１０～１５μｓとし、で顕微鏡写真を得た。８～１３Μａの放出電流を用いると、１０～２０Ｐａのプローブ電流範囲が算出される。絞りを４０μｍにすると、α＝２７．５ｍｒａｄのビーム収束半角が生成される。画像ごとに導入された電子線量は倍率に応じて約１０００～２０００ｅ／Ųの範囲である。取得した画像から、暗い色合いと明るい色合いは、それぞれＦｅセグメントとＡｕセグメントを示す。ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ画像を用いて、ナノバーコードで鋭い界面を持つＦｅセグメント及びＡｕセグメントのそれぞれ、或いは全てのナノスケール寸法（長さ、直径、表面積）を計算した。当該計算により、調整可能なナノ周期と配列を有する周期的にシーケンシングされたＦｅ／Ａｕナノバーコード６つにおいて、Ｆｅセグメント及びＡｕセグメントが類似の寸法を有することを確認した。周期的にシーケンシングされたＦｅ／Ａｕナノバーコード６つにおいて、鋭いインタフェースを持つＦｅセグメント及びＡｕセグメントは、２つのＳＯＤ検出器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用するＥＤＳマッピングで具体的に識別された。Ｆｅ及びＡｕ元素マッピングは、パルス、電流セグメント、製造時間を厳しく調整することで得られた調整可能なナノ周期と、周期的にシーケンシングされたナノバーコード６つからでＦｅセグメント及びＡｕセグメントを識別するために、個別的に使用された。

更に、Ｘ線回折分析（Ｄ／ＭＡＸ－２５００Ｖ／ＰＣ、Ｒｉｇａｋｕ）測定を行って、周期的にシーケンシングされたナノバーコード６つで繰り返されるＦｅセグメント及びＡｕセグメントの共存を確認した。Ｆｅ相（ＰＤＦ＃８７０７２２）とＡｕ相（ＰＤＦ＃０４０７８４）の粉末回折ファイル（Ｐｏｗｄｅｒ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｆｉｌｅ、ＰＤＦ）データを用いて、ピークは周期的にシーケンシングされたナノバーコード６つに存在するＦｅ相とＡｕ相の結晶面でインデックスが作成された。

振動試料型磁力測定（Ｖｉｂｒａｔｉｎｇ ｓａｍｐｌｅｍＡｇｎｅｔｏｍｅｔｒｙ、ＶＳＭ）は、周期的にシーケンシングされたナノバーコード６つでＦｅセグメントの磁気特性を適用した磁場（Ｈ）の下、室温でＶＳＭ測定（ＥＶ９、Ｍｉｃｒｏｓｅｎｓｅ）により分析を行った。該当する磁気モーメント（Ｍ）は、それぞれのナノバーコードで磁気モーメントの最大値に正規化した後、ヒステリシス曲線で表示される。

図２は、本発明による、ナノバーコードの高角度環状暗視野走査透過型電子顕微鏡（ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ）の画像、エネルギー分散型分光法（ＥＤＳ）マッピング、電界放出形走査電子顕微鏡（ＦＥ－ＳＥＭ）の画像を示したものである。図２によると、ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ画像で交互するＦｅセグメントとＡｕセグメントは、それぞれ暗い領域と明るい領とに識別され、ＦｅとＡｕ要素ごとのＥＤＳマッピング画像で、合金形成のない鋭いインタフェースを有することを確認した。

図２の（ｂ）によると、ナノバーコードのそれぞれ、或いは全体のＦｅセグメント及びＡｕセグメントのナノサイズ（長さ、直径、表面積）を正確に定量化している。具体的には、ナノバーコードでそれぞれのＦｅ／Ａｕセグメントの長さは、［３０（０１）_１０］群で３０．８±０．３ｎｍ／２８．１±１．８ｎｍ、［７５（０１）_４］群で７２．３±１．４ｎｍ／７４．６±４．３ｎｍ、［１５０（０１）_２］群で１３２．７±１９．２ｎｍ／１４２．５±６．１ｎｍ、［３００（０１）_１］群で３１０．７±１３．０ｎｍ／２９４．７±９．５ｎｍ、［７５（０１１０）_２］群で６９．３±３．０ｎｍ／１４９．７±１３．７ｎｍ、［１５０（０１１０）_１］群で１５４．２±１．３ｎｍ／３０２．１±３．６ｎｍである。これにより、ナノ周期及び配列が合成されている間、パルス電流ともと持続時間を正確に調整することで、６つの異なるナノバーコードから体系的に調整されたことが分かる。

図３は本発明で製造されたナノバーコードの模式図（ａ）、ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭの結果から計算された各ＦｅとＡｕ（Ｆｅ／Ａｕ）ナノバーコードの長さの合計（ｂ）、直径（ｃ）、表面積（ｄ）を示したグラフである。図３によると、それぞれのナノバーコードでＦｅセグメントとＡｕセグメントの長さの合計は、６つの異なるナノバーコードで、それぞれ２７０．７～３０６．２ｎｍ、２７９．９～２８９．１ｎｍの範囲であり、有意な差はなかった。それぞれのＦｅ／Ａｕナノバーコードの直径は６つの異なるナノバーコードで６３．２～６６．９ｎｍの範囲であって、大きな差はなかった。それぞれのナノバーコードにおいてＦｅセグメント及びＡｕセグメントの総表面積は、６つの異なるナノバーコードでそれぞれ５７５００～６１４２０ｎｍ^２、５６２７０～６０３３０ｎｍ^２の範囲であり、有意な差はなかった。これによって、周期的にシーケンシングされたＦｅ／Ａｕナノバーコード６つが、Ｆｅセグメント及びＡｕセグメントの総寸法を調整せずとも、調整可能なリガンドナノ周期及び配列を表すように正確に製造されたことが分かる。このとき、Ａｕセグメント及びＦｅセグメントは、それぞれ括弧内の１と０の数字で表し、Ａｕセグメント及びＦｅセグメントの長さ（ｎｍ）は、それぞれ、３０、７５、１５０、３００である。

図４は、本発明によるナノバーコードのＸ線回折分析グラフである。図４によると、ナノバーコードにおいてＦｅセグメント及びＡｕセグメントの結晶相をＸ線回折によって分析し、Ｆｅ相とＡｕ相に該当する回折ピークが６つの異なるナノバーコードで同様に共存することが分かる。これにより、周期的にシーケンシングされたＦｅ／Ａｕナノバーコード６つが同様の特性を示していることがわかる。

図５は、本発明によるナノバーコードの振動試料に対する、磁力計の測定結果のグラフである。具体的には、Ｆｅセグメントの存在によるナノバーコードの磁気特性を分析し、これは６つの異なるナノバーコードとも明らかなヒステリシスを有せず、類似の自己挙動を示すことを確認した。これらの磁気特性のために、外部磁場を以って、本発明のナノバーコードは可逆的な遠隔制御に用いることができる。

実験例２
本発明によるナノバーコードを含む基板の特性を確認するために、ナノバーコードを含む基板を、電界放出形走査電子顕微鏡で撮影し、フーリエ変換赤外分光分析（Ｆｏｕｒｉｅｒ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＦＴ－ＩＲ）を行った。その結果を図２ｂ及び図７に示した。

フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）は、ナノバーコードの化学的結合特性を確認するため、ＧＸ１（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、ＵＳＡ）を用いて行われた。化学的結合特性の変化の分析を経たサンプルを分析する前に、凍結乾燥させ、ＫＢｒペレットで密度高くパッキングした。

図６は、本発明によるナノバーコードを含む基板を製造するステップを図式化した画像である。図６によると、周期的にシーケンシングされたナノバーコード６つは、基板にグラフトされる前に、化学的に機能化された。アミノカプロン酸のアミン基は、表面にカルボキシレート基を表示するために、ナノバーコードのＦｅセグメントの天然酸化物層にカップリングされた。アミノカプロン酸がコーティングされたナノバーコードでカルボキシレート基を活性化させ、アミノ化された基板に移植し、ナノバーコード濃度と反応時間を正確に最適化して、基板に結合されたナノバーコードとリガンドの密度を調整せずとも、リガンド配列の様々なナノ周期を確認した。続いて、チオール化ＲＧＤリガンドをナノバーコード結合された基板でＡｕセグメントにグラフトされた。Ｆｅセグメント及びＡｕセグメントの全体の寸法のみならず、基板－結合リガンド提示ナノバーコードの密度を同様に維持し、基板のリガンド密度の効果は分離させる。

図２ｂによると、基板に結合されたリガンド提示ナノバーコードを、電界放出形走査電子顕微鏡を使用して確認し、これは断層で均一な分布を示した。これの密度は１μｍ^２当たり０．０２６～０．０２９範囲であり、全ての基板結合リガンド提示ナノバーコードに大きな差がなく同様に維持されることが分かる。下記の実験により、該密度では、細胞の付着や幹細胞の分化を効率的に調整できることを確認した。

図７は、本発明によるナノバーコードに対してフーリエ変換赤外分光法（ＦＴ－ＩＲ）により分析を行った結果である図７によると、アミノカプロン酸がコーティングされたナノバーコードの化学的結合特性を把握することができる。具体的には、１５６０～１５６５ｃｍ^－１と１３８７～１３８９ ｃｍ^－１でＣＯＯ^－結合を確認し、３４３２～３４４８ｃｍ^－１でＮＨ結合を確認した。これにより、アミノカプロン酸が６つの異なるナノバーコードに正常に結合されたことが分かる。

実験例３
本発明によるナノバーコードのナノ周期とリガンド配列が、幹細胞の付着に及ぼす影響を確認するために、次のような実験を行い、その結果を図８～図１１に図示した。

幹細胞の焦点付着、機械感受性（ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｎｇ）、分化に対して、リガンドのナノ周期と配列の順序を制御することの効果をナノバーコード提示基板を用いて評価した。基板を使用する前に、基板を紫外線で１時間滅菌した。人間の中間葉幹細胞（ｈＭＳＣ、Ｌｏｎｚａからの継代５）を約９，５００細胞／ｃｍ^２の密度で滅菌された基板にプレーティングし、５％ＣＯ_２・３７℃で培養した。本発明による［３０（０１）_１０］、［７５（０１）_４］、［１５０（０１）_２］、［３００（０１）_１］リガンド配列のナノバーコードで、ナノ周期のみを調整しながら、幹細胞の焦点付着性及び機械感受性を評価した。また、［７５（０１）_４］、［７５（０１１０）_２］、［１５０（０１）_２］、［１５０（０１１０）_１］リガンド配列のナノバーコードで、ナノ周期とリガンド配列を両方とも調整した状態における、幹細胞の焦点付着性及び機械感受性を評価した。加えて、スクランブルリガンド（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｌｉｇａｎｄ、ＲＡＤ）で調整可能なナノ周期を有する基板を使用し、幹細胞の焦点付着の調整に対してＲＧＤリガンド配列でのナノ周期が及ぼす影響について評価した。

幹細胞の機械的形質転換－介入分化は、ＲＯＣＫ（５０μＭＹ２７６３２）、ミオシンＩＩ（１０μＭブレイクビスタティーン）、又はアクチン重合（２μｇ／ ｍＬサイトカラシンＤ）阻害剤を有する、［７５（０１）_４］群、［７５（０１１０）_２］群、［３００（０１）_１］群を使用し、ナノ周期の調整について評価した。付着幹細胞の分化は、骨形成誘導培地の培養後、高ナノ周期及びリガンド配列を両方とも調節する条件で評価した。

図８は、本発明によるナノバーコードを用いて培養された幹細胞（４８時間後）のＦ－アクチン、核、ビンキュリン、ＹＡＰの共焦点免疫蛍光画像であって、スケールバーは２０μｍを示す。（ａ）は、ナノ周期を調整した場合であり、（ｂ）はナノ周期とリガンド配列の順序を調整した場合の結果である。

図９は、図８ａの共焦点免疫蛍光画像データから、幹細胞培養の４８時間後の付着細胞密度、細胞面積、焦点付着数、アスペクト比（主軸／副軸比）、核／細胞質のＹＡＰ比率を定量的に計算したグラフである。

図８ａ及び図９によると、共焦点免疫蛍光画像から、リガンド配列でナノ周期性が増加するほど（３０から３００）、より強い付着性と幹細胞の増殖を促進したことが分かる。これは、細胞密度、拡散面積、焦点付着数、ビンキュリン発現によって確認された。これにより、本発明によるナノバーコードの高リガンドナノ周期を有する群は、焦点の付着を促進させ、幹細胞からＹＡＰ機械的形質変換の核電位を刺激したことが分かる。

図１０は、図８ａの共焦点免疫蛍光画像データから、幹細胞培養の４８時間後の付着細胞密度、細胞面積、焦点付着数、アスペクト比（主軸／副軸比）、核／細胞質のＹＡＰ比率を定量的に計算したグラフである。

図１１の（ａ）は、本発明の比較例によるスクランブルＲＡＤナノバーコードを用いて培養された幹細胞（４８時間後）のＦ－アクチン、核、ビンキュリン、ＹＡＰに対してナノ周期を調整した場合の共焦点免疫蛍光画像であり、スケールバーは５０μｍを示す。（ｂ）は、上記の共焦点免疫蛍光画像データから、幹細胞培養の４８時間後の付着細胞密度、細胞面積、焦点付着数、アスペクト比（主軸／副軸比）、核／細胞質のＹＡＰ比率を定量的に計算したグラフである。図１１によると、スクランブルＲＡＤリガンド配列でナノ周期を調整することは、幹細胞の付着に影響を及ぼさない。

図８ｂ及び図１１に図示されているように、ナノ周期とリガンド配列の順序を両方とも調整した異なるナノバーコード群４つを準備した：［７５（０１）_４］、［７５（０１１０）_２］、［１５０（０１）_２］、［１５０（０１１０）_１］。高ナノ周期を有するナノバーコードは、幹細胞の焦点付着と機械感受性を促進させた：［１５０（０１１０）_１］対［７５（０１１０）_２］、［１５０（０１）_２］対［７５（０１）_４］。これにより、高リガンドナノ周期を有するナノバーコードは、リガンド密度を調整せずとも、より近いリガンド提示で向上された細胞付着性を示すことを確認した。具体的には、同じナノ周期を有するナノバーコードでリガンド配列のみを変化させ、リガンドがナノバーコードの末端配列でのみ利用可能な［１５０（０１）_２］は、リガンドが、ナノバーコードの内部配列でのみ利用可能な［７５（０１１０）_２］と比べ、幹細胞の焦点付着と機械感受性を刺激する。これにより、異なるリガンド配列の順序を有するナノバーコードにおいて、リガンド間隔の調整により細胞の付着性を調整できることが分かる。

従って、ナノバーコードの配列リガンドの位置とリガンドの間隔を調整して、幹細胞の付着性を調整することができる。

実験例４
本発明によるナノバーコードを用いて、リガンド配列のナノ周期の調整が幹細胞の焦点付着及び機械感受性を制御するか否かに関する実験を下記のように行い、その結果を図１２～図１８に図示した。

幹細胞の焦点付着及び機械感受性は、これらの骨形成分化を調整することであり、リガンド配列でナノ周期を有する群を対象として評価した：［７５（０１）_４］、［７５（０１１０）_２］、［３００（０１）_１］。

図１２は、ナノバーコードを用いた、リガンド配列におけるナノ周期の調整により体外・体内の幹細胞の機械的形質導入に関する実験の結果である。図１２（ａ）は、ＲＯＣＫ阻害（Ｙ２７６３２）とＡＬＰ染色を有するＲＵＮＸ２、Ｆ－アクチン、核、ＹＡＰの共焦点免疫蛍光画像であり、スケールバーは５０μｍである。（ｂ）は、体内でリガンドナノ周期を有するナノバーコードを含んでいる基板が皮下に移植された後、ｈＭＳＣが注入されたことを図式化した画像でああって、上記のｈＭＳＣが注入された場合のビンキュリン、Ｆ－アクチン、核、ＹＡＰの共焦点免疫蛍光画像であり、スケールバーは２０μｍである。

図１３は、図１２ａの共焦点免疫蛍光画像をもとに、ナノ周期を有するナノバーコードを含む基板に幹細胞を７日間培養した後、核／細胞質のＲＵＮＸ２蛍光比及びアルカリホスファターゼ陽性細胞を定量的に分析したグラフである。

図１４は、図１２ａの共焦点免疫蛍光画像をもとに、ナノ周期を有するナノバーコードを含む基板に幹細胞を７日間培養した後、核／細胞質のＲＵＮＸ２及びＡＬＰ遺伝子発現プロファイルを定量的に分析したグラフである。

図２ａ、図１３及び図１４によると、リガンド配列の高ナノ周期は、試験管内及び体内の幹細胞の機械的形質導入を容易にし、それらの分化を調整することがわかる。

図１５は、本発明によるナノバーコードを用いた、リガンド配列においてナノ周期とリガンド配列の順序の調整により試験管内の幹細胞の機械的形質導入に関する実験の結果である。（ａ）は、ＲＯＣＫ阻害（Ｙ２７６３２）及びＲＵＮＸ２、Ｆ－アクチン、核、ＹＡＰの共焦点免疫蛍光画像、ＡＬＰ染色画像であり、スケールバーは５０μｍである。（ｂ）は、基板に幹細胞を７日間培養した後、核／細胞質のＲＵＮＸ２蛍光比、及びアルカリホスファターゼ陽性細胞を定量的に分析したグラフである。図１５によると、幹細胞の分化は、リガンド配列で高ナノ周期によって促進されることがわかる：［３０（０１）_１０］、［１５０（０１１０）_１］、［１５０（０１）_２］。

図１６は、本発明によるナノバーコードを用いた、幹細胞培養の４８時間後のインテグリンβ１、ＦＡＫ、ｐ－ＦＡＫ、ＲｈｏＡ、Ｆ－アクチン、核の共焦点免疫蛍光画像である。図１６によると、高ナノ周期を有するナノバーコードを含んでいる場合には、インテグリンβ１を活性化させ、これは焦点付着キナーゼ（ＦＡＫ）と、ＲｈｏＡ及びＴＡＺの機械的形質導入を活性化させるリン酸化（ｐ－ＦＡＫ）とを介し、細胞内の機械感受性信号を連続的に刺激した。

図１７の（ａ）は、本発明によるナノバーコードを用いてアクチン重合阻害剤（サイトカラシンＤ）を有する幹細胞を４８時間培養した後の、ＴＡＺ、ビンキュリン、Ｆ－アクチン核の共焦点免疫蛍光画像であり、スケールバーは５０μｍである。（ｂ）は、上記の共焦点免疫蛍光画像から計算された核／細胞質のＴＡＺ蛍光比を計算したグラフである。

図１８の（ａ）は、本発明によるナノバーコードを用いて、アクチン重合阻害剤（サイトカラシンＤ）とミオシンII阻害剤（ブレビスタチン）を有する幹細胞を培養して４８時間後の、ＹＡＰ、Ｆ－アクチン、核の共焦点免疫蛍光画像であり、スケールバーは５０μｍである。（ｂ）は、上記の共焦点免疫蛍光画像から計算されたＹ２７６３２、サイトカラシンＤ、ブレビスタチンの阻害剤による核／細胞質のＹＡＰ蛍光比を計算したグラフである。

図１７及び図１８によると、最も高いナノ周期を有する［３００（０１）_１］ナノバーコードは、サイトカラシンＤによるアクチン重合、ｒｈｏ－関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）、ミオシンIIの抑制時のビンキュリン発現とＹＡＰの核電位が著しく減少した。これにより、ナノバーコードのナノ周期性が高い場合、幹細胞の機械的形質導入を介する分化を誘導して、焦点付着アセンブリを容易にすることができる。

実験例５
本発明によるナノバーコードを用いて、体内宿主幹細胞の付着及び機械的形質導入を調整することを確認するために、下記のような実験を行い、その結果を図１９～図２０に図示した。

図１２ｂのようにｈＭＳＣが注入されたヌードマウスの皮下にナノバーコードを含む基板を移植して実験を行った。

図１９は、本発明によるナノバーコードを用いた体内宿主幹細胞の付着の調整に関する実験の結果である。（ａ）は、皮下移植された基板にｈＭＳＣが注入されてから６時間後に別のナノ周期を持つナノバーコードを含む場合の人間特異的核抗原（ＨｕＮｕ）、Ｆ－アクチン、核の共焦点免疫蛍光画像であり、スケールバーは２０μｍである。（ｂ）は、上記の共焦点免疫蛍光画像から付着性細胞の密度を計算したグラフである。図１９によると、人間特異的核抗原（ＨｕＮｕ）に対する免疫蛍光は、［７５（０１）_４］、［７５（０１１０）_２］、［３００（０１）_１］のナノバーコードが含まれている場合、ＨｕＮｕとｄａｐｉに染色された核の共同局所化によりＨｍｓｃが体内で基板に付着されることを確認した。ｈＭＳＣは、リガンド配列で、ナノ周期が増加するほど、より高い付着性細胞密度で付着された。また、移植後の延長された時間にわたってリガンド配列でナノ周期が増加するにつれて、宿主の免疫細胞を募集して、より高い付着性細胞密度で基板に付着させた。

図２０は、本発明によるナノバーコードを用いて、体内宿主幹細胞の焦点付着を介する機械的形質導入の実験の結果であり、図１２ｃに図示された共焦点免疫蛍光画像から皮下移植された基板上にＨｍｓｃが注射されて６時間後の細胞の拡散面積、焦点付着数、アスペクト比（主軸／副軸比）、核／細胞質のＹＡＰ蛍光比を計算したグラフである。

図１２ｃ及び図２０によると、免疫蛍光画像は、体内でリガンド配列において高ナノ周期を有する場合、幹細胞の焦点付着、拡散、機械的形質導入を容易にすることができる。これは、相当高い付着性細胞の拡散面積、焦点付着数、ＦＡ複合体におけるビンキュリン発現、ＹＡＰ機械的形質導入の核電位により確認できる。これにより、リガンド配列で、ナノ周期の調整により、体外・体内の条件での幹細胞の焦点付着と機械感受性を効果的に制御できることが分かる。

Claims (15)

1. 鉄（Ｆｅ）を含む第１のセグメントと、金（Ａｕ）を含む第２のセグメントとが繰り返し形成されたナノバーコードと、
   前記ナノバーコードの第２のセグメントに結合されたインテグリンリガンドペプチドを含む、幹細胞の付着・分化調整用のナノバーコードであって、前記幹細胞は、前記第２のセグメントに結合する、幹細胞の付着・分化調整用のナノバーコード。
2. 前記ナノバーコードは、下記の式（１）又は式（２）を満足するバー状であることを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞の付着・分化調整用のナノバーコード。
   ［Ｌ（Ｍ_１Ｍ_２）ｑ］ （１）
   ［Ｌ（Ｍ_１Ｍ_２Ｍ_２Ｍ_１）ｑ］ （２）
   ここにおいて、
   Ｍ_１は第１のセグメント、Ｍ_２は第２のセグメントであり、
   ｑは第１及び第２のセグメントの繰り返し回数であり、
   Ｌは第１及び第２のセグメントの長さ（ｎｍ）である。
3. 前記の式（１）及び（２）は、［３０（Ｍ_１Ｍ_２）_１０］、［７５（Ｍ_１Ｍ_２）_４］、［７５（Ｍ_１Ｍ_２Ｍ_２Ｍ_１）_２］、［１５０（Ｍ_１Ｍ_２）_２］、［１５０（Ｍ_１Ｍ_２Ｍ_２Ｍ_１）_１］、［３００（Ｍ_１Ｍ_２）_１］のうちいずれかであることを特徴とする、請求項２に記載の幹細胞の付着・分化調整用のナノバーコード。
4. 前記第１のセグメント及び前記第２のセグメントは、それぞれバー状であり、前記第１のセグメントの長さと前記第２のセグメントの長さは同じである、請求項１に記載の幹細胞の付着・分化調整用のナノバーコード。
5. 前記第１のセグメントは、カルボン酸塩により官能化された構造であることを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞の付着・分化調整用のナノバーコード。
6. 前記ナノバーコードは、直径５０ｎｍ～１００ｎｍ、長さ２００～１０００ｎｍ、断面が円形のバー状である、請求項１に記載の幹細胞の付着・分化調整用のナノバーコード。
7. 前記インテグリンリガンドペプチドは、チオール化インテグリンリガンドペプチドを含み、
   前記インテグリンリガンドペプチドのチオール基と第２のセグメントとが化学的に結合された構造である、請求項１に記載の幹細胞の付着・分化調整用のナノバーコード。
8. 鉄（Ｆｅ）を含む第１のセグメントと、金（Ａｕ）を含む第２のセグメントとが繰り返し形成されたナノバーコードを用意するステップと、
   ナノバーコードと、第１の懸濁液とを混合して、第１のセグメントにカルボン酸塩置換基を置換するステップと、
   前記ナノバーコードをインテグリンリガンドペプチド（ＲＧＤ）を含む第２の懸濁液と混合するステップと、を含む、請求項１～７のうちいずれか１項に記載の幹細胞の付着・分化調整用のナノバーコードの製造方法。
9. 前記第１の懸濁液はカルボン酸塩の置換基を含むアミノ酸誘導体を含み、
   前記インテグリンリガンドペプチドは、チオール化インテグリンリガンドペプチドを含む、請求項８に記載の幹細胞の付着・分化調整用のナノバーコードの製造方法。
10. 請求項１～７のうちいずれか１項に記載の幹細胞の付着・分化調整用のナノバーコードを含む溶液に、表面が活性化された基板を担持して、ナノバーコード提示基板を製造するステップと、
    前記ナノバーコード提示基板に幹細胞を処理した後、幹細胞の付着・分化を調整するステップと、を含む、幹細胞の付着・分化を調整する方法。
11. 前記ナノバーコード提示基板を製造するステップは、
    基板の表面を酸性溶液に浸漬させるステップと、
    浸漬済みの基板をアミノシラン溶液に担持して前記基板の表面を活性化させるステップと、を含む、請求項１０に記載の幹細胞の付着・分化を調整する方法。
12. 前記ナノバーコード提示基板をポリエチレングリコール誘導体を含む溶液に担持し、ナノバーコードが結合されていない基板の表面を不活性化することを特徴とする、請求項１０に記載の幹細胞の付着・分化を調整する方法。
13. 前記幹細胞の付着・分化を調整するステップは、ナノバーコード提示基板のナノバーコードを構成する前記セグメントの周期と配列順序のいずれか一つ以上を変化させることによって、前記第２のセグメントに結合されたリガンドペプチドの周期と配列順序のいずれか一つ以上を変化させることを含む、請求項１０に記載の幹細胞の付着・分化を調整する方法。
14. 前記幹細胞の付着・分化を調整するステップで、下記の式（１）を満足するバー状のナノバーコードを含む基板を使用する場合、幹細胞の付着・機械感受性分化が低下することを示す、請求項１０に記載の幹細胞の付着・分化を調整する方法。
    ［Ｌ（Ｍ_１Ｍ_２）ｑ］ （１）
    ここにおいて、
    Ｍ_１は第１のセグメント、Ｍ_２は第２のセグメントであり、
    ｑは第１及び第２のセグメントの繰り返し回数、ｑは２～１０の整数であり、
    Ｌは第１及び第２のセグメントの長さ（ｎｍ）である。
15. 前記幹細胞の付着・分化を調整するステップで、下記の式（２）を満足するバー状のナノバーコードを含む基板を使用する場合、幹細胞の付着・機械感受性分化が促進されることを示す、請求項１０に記載の幹細胞の付着・分化を調整する方法。
    ［Ｌ（Ｍ_１Ｍ_２Ｍ_２Ｍ_１）ｑ］ （２）
    ここにおいて、
    Ｍ_１は第１のセグメント、Ｍ_２は第２のセグメントであり、
    ｑは第１及び第２のセグメントの繰り返し回数、ｑは１～５の整数であり、
    Ｌは第１及び第２のセグメントの長さ（ｎｍ）である。
    

Images