CN108872163A - 一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条及其制备和使用方法 - Google Patents

一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条及其制备和使用方法 Download PDF

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Abstract

一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条及其制备和使用方法，它涉及侧流试纸条及其制备和使用方法，它是要解决现有的检测材料对生物分子有热损伤和背景信号高的技术问题。该侧流试纸条由聚氯乙烯支撑背板、检测垫、结合垫、样品垫和吸收垫组成；其中结合垫负载有结合抗体的上转换β‑NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针和结合鼠IgG的上转换β‑NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针。制法：一、制备核：二、包覆壳；三、组装发光探针：四、组装侧流试纸条。使用时用激光对检测线照射检测发射光谱，检测范围是0.05‑50ng/mL，检测限为0.02ng/mL，可用于医疗检测中。

Description

一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试 纸条及其制备和使用方法
技术领域
本发明涉及对血清标记物进行检测的侧流试纸条及其制备方法，属于免疫学检测领域。
背景技术
近年来，随着移动医疗和家庭医疗的不断发展，研究者们不断寻求新型的发光材料作为光学探针，以获取更高灵敏度和稳定性的测试方法。如今，人们已经可以对血清中的各种疾病标记物进行检测，包括心梗标记物(CTNI和MYO)；细菌病毒感染标记物(CRP、SAA和PCT)；糖尿病标记物(糖化血红蛋白)；术前感染性疾病标记物(HIV、梅毒、乙肝和丙肝)等。其中，基于纳米金颗粒的检测方法发展较快，已经在孕检和感染检测等领域得到了快速的应用。但基于纳米金颗粒的检测方法存在明显的缺点：灵敏度低，属于半定量检测。荧光微球和量子点的使用提高了检测方法的灵敏度，并实现了定量化检测，但测试过程中荧光背景信号高，限制了其在低浓度待测物检测中的应用。稀土上转换纳米晶作为新一代的发光材料，具有较大的反stoke发光位移，发射光谱窄，可实现多指标多重检测；无光漂白性，发光稳定性好，可多次重复检测；激发光大多位于980或800nm，不能激发抗原或抗体等生物有机分子，因此，无背景干扰，具有高信噪比。在现阶段稀土上转换纳米晶的应用中，一般通过近红外光(980或800nm)激发，收集发射的可见光用作最终的检测信号。但生物有机分子和水分子对可见光具有较强的吸收和散射作用，特别是在生物分子密度高的区域，这种现象就更加严重，既容易引起对蛋白质等生物分子的热损伤，降低其生物活性，同时又存在较高的背景信号干扰，限制了体系检测灵敏度的提高。
发明内容
本发明是要解决现有的用于生物检测的纳米材料对生物分子有热损伤和检测背景信号高的技术问题，而提供一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条及其制备和方法。
本发明中的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条由聚氯乙烯支撑背板、检测垫、结合垫、样品垫和吸收垫组成；
其中检测垫是由硝化纤维膜及平行画在硝化纤维膜上的检测线和控制线组成；检测线是用1～2mg/mL的血清标记物抗体画出的线，线宽为1～1.2mm，滴加体积量是1～1.2μL/cm；控制线是用1～2mg/mL的IgG抗体溶液画出的线，线宽为1～1.2mm，滴加体积量是1～1.2μL/cm；
结合垫是负载有结合抗体的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针和结合鼠IgG的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针；其中β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4是以NaXF4为壳、以β-NaYF4:Yb,Tm为核的核壳结构纳米晶，β-NaYF4:Yb,Tm是用Yb和Tm掺杂的β-NaYF4，Yb的掺杂摩尔百分数为10％～99.8％，Tm的掺杂摩尔百分数为0.2％～10％；X为Y元素或Lu元素；
检测垫粘贴在聚氯乙烯支撑背板的中部，在检测垫的检测线一侧，结合垫与检测垫搭接，样品垫与结合垫搭接；在检测垫的控制线一侧，吸收垫与检测垫搭接，结合垫、样品垫和吸收垫也都粘贴在聚氯乙烯支撑背板上。
上述的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，按以下步骤进行：
一、制备核β-NaYF4:Yb,Tm，其中β-NaYF4:Yb,Tm中Yb元素的掺杂摩尔百分数为10％～99.8％，Tm元素的掺杂摩尔百分数为0.2％～10％：
a、按照β-NaYF4:Yb,Tm的化学计量比与Yb和Tm的掺杂浓度称取氯化钇、氯化镱、氯化铥、氟化铵和氢氧化钠；
b、先将氯化钇、氯化镱与氯化铥混合于容器中，再加入油酸(OA)与十八烯(ODE)，加热到150～180℃，保持30～50min，以去除其中的水分和氧气，冷却后，得到混合液；
c、将氢氧化钠和氟化铵溶于甲醇中，得到的溶液加入到步骤一得到的混合液中，室温保持30～50min，接着加热到70～100℃，保持30min，以去除其中的甲醇；接着加热到300～320℃，保持60-90min后，反应结束；
d、步骤c得到的液体自然降温后，转移到离心管中，加入乙醇超声震荡洗涤，再离心分离出固相物，重复乙醇震荡洗涤和离心分离操作2-3次，得到β-NaYF4:Yb,Tm，将β-NaYF4:Yb,Tm分散在正己烷中，得到β-NaYF4:Yb,Tm分散液；
二、核壳结构β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4的制备，其中X＝Y或Lu：
e、将氧化钇或氧化镥溶于体积百分浓度为50％的三氟乙酸水溶液中，加热到90～100℃使其全部溶解，持续通入氩气使溶液完全挥发，在三口烧瓶底部可以得到白色粉末，即为制得三氟乙酸稀土盐；
f、待三口烧瓶底部的白色粉末完全干燥后，加入步骤一(d)制备的β-NaYF4:Yb,Tm分散液、OA和ODE，在氩气保护下加热到120～150℃，保持30～60min，除去溶液中的氧气、水及正己烷，然后调整升温速率为12K·min-1加热到300～320℃，保持60～90min，停止反应；
g、待步骤f得到的溶液自然冷却到室温，加入乙醇震荡洗涤，再离心分离出固相物，重复乙醇震荡洗涤和离心分离操作2～3次，得到核壳结构β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4，将核壳结构β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4分散在正己烷中，得到β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4分散液，其中X＝Y或Lu；
三、组装稀土上转换发光探针：
h、将β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4分散液和NOBF4的DMF溶液混合振荡，得到混合液；静置5～10min后再离心分离出固相沉淀，将固相沉淀再分散在DMF中，得到β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4的DMF分散液；
i、按β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4的DMF分散液中β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4与聚丙烯酸(PAA)的摩尔比为1：(50～60)，向β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4的DMF分散液中加入PAA，加热到80～100℃并保持30～60min，然后加入丙酮，静置后离心分离，将沉淀分散到水中，得到PAA包覆的纳米晶的水分散液；
j、向PAA包覆的纳米晶的水分散液中加入EDC溶液和NHS溶液，其中水分散液中PAA包覆的纳米晶与EDC的摩尔比为1：(120～130)，水分散液中PAA包覆的纳米晶与NHS的摩尔比为1：(25～35)，升温至37℃的条件下反应4h后，离心分离，将固相沉淀再分散在水中，得到活化的PAA包覆的纳米晶分散液；
k、取活化的PAA包覆的纳米晶分散液，加入血清标记物抗体溶液，其中活化的PAA包覆的纳米晶分散液中的活化的PAA包覆的纳米晶与血清标记物抗体的摩尔比为1：(50～60)，在37℃的条件下反应6h后，离心分离，将固相沉淀再分散在水中，得到结合抗体的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针的水分散液；
l、取活化的PAA包覆的纳米晶分散液，加入鼠IgG溶液，其中活化的PAA包覆的纳米晶分散液中的活化的PAA包覆的纳米晶与鼠IgG的摩尔比为1:60，在37℃的条件下反应6h后，离心分离，将固相沉淀再分散在水中，得到结合鼠IgG的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针的水分散液；
四、组装基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条：
m、以Tris缓冲液为溶剂，以S9表面活性剂、酪蛋白、PVP-K30、Tween-20为溶质配制混合溶液，将玻璃纤维膜在混合溶液中浸泡2～4h，干燥，得到样品垫4；
n、用浓度为10mmol/L的柠檬酸钠缓冲液为溶剂，以蔗糖、结合抗体的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针的水分散液、结合鼠IgG的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针的水分散液为溶质配制探针溶液；探针溶液中，蔗糖的质量百分浓度为1％～1.2％，结合抗体的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针的水分散液的体积百分浓度为10％～50％，结合鼠IgG的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针的体积百分浓度为10％～30％；将玻璃纤维膜在探针溶液中浸泡，然后在45～50℃下干燥，得到结合垫3；
o、用1～2mg/mL的血清标记物抗体溶液按滴加体积量是1～1.2μL/cm在硝化纤维膜上画出宽度是1～1.2mm的画线，得到检测线2-2；再用1～2mg/mL的鼠IgG抗体溶液按滴加体积量是1～1.2μL/cm在硝化纤维膜上画出平行于检测线的宽度是1～1.2mm的画线，得到控制线2-3，得到检测垫2；
p、将检测垫2粘贴在聚氯乙烯支撑背板1的中部，在检测垫2的检测线2-2一侧，将结合垫3粘贴在聚氯乙烯支撑背板1上，并使结合垫3与检测垫2搭接，样品垫4粘贴在聚氯乙烯支撑背板1上并使样品垫4与结合垫3搭接；在检测垫2的控制线2-3一侧，将吸收垫5粘贴在聚氯乙烯支撑背板1上并使吸收垫5与检测垫2搭接，得到基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条。
本发明的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的使用方法是：将血清样品按(2～3)：1的比例用Tris缓冲溶液进行稀释，然后取50～150μL滴加到侧流试纸条的样品层上，静置10～20min，然后通过980nm的激光对侧流试纸条的检测线和控制线进行发射光谱测试，采集控制线和检测线在800nm处的发射光谱强度，首先观察控制线处的发光情况，如果控制线处无发光，则产品失效；如果控制线处有发光，再观察检测线处的发光情况，如果检测线处无发光，则待测样品中不含相应的血清标记物；如果检测线处有发光，则待测样品中含有相应的血清标记物，根据测的的发光强度与检测标准曲线对比，定量得到血清中标记物的浓度。
本发明通过Yb和Tm的稀土元素掺杂，合成了β-NaYF4:Yb,Tm(六角相)纳米晶，固定激发波段为980nm，利用Yb→Tm的能量传递方式，在选择Yb和Tm的掺杂浓度范围内，在980nm激发下Tm位于800nm的发射强度达到应用要求，然后通过在纳米晶表面包覆一层NaXF4(X＝Y或Lu)壳层，避免了由于稀土纳米晶存在表面缺陷及外界环境中的分子对稀土纳米晶的上转换发光产生不同程度的淬灭作用的影响，得到高亮度发光的β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4稀土上转换发光纳米晶，获得了良好的发光效果。
本发明近红外激发和发射的上转换发光材料β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4表面含有大量油酸配体，利用PAA所含有的多个羧基，将油酸修饰的纳米晶由油溶性转变成水溶性，然后通过EDC/NHS对纳米晶表面裸露的羧基进行活化处理，使羧基与抗体的氨基基团进行共价连接，从而使抗体或鼠IgG连接到纳米晶上，得到了结合抗体的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针和结合的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针。与相应的血清标记物抗体进行组装得到发光探针，实现了血清标记物(肌红蛋白、肌钙蛋白、降钙素原、糖化血红蛋白、HIV、乙肝和丙肝等)检测方法的激发和发射光谱均位于近红外区域。
利用抗体结合的上转换纳米晶探针和鼠IgG结合的上转换纳米晶探针组装成双抗体夹心侧流试纸条，该试纸条的吸收垫通过虹吸作用促进样品的流速，使试剂能够跨过膜运输，在实际血清标记物检测时，需将一定量的血清样品滴加到样品垫上，经过一定时间孵化后，使用980nm的激光对检测垫上的检测线部分进行照射，同时使用检测器对样品的发光进行检测。本发明的β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4系列的纳米晶的激发和发射光谱调制到近红外区域，将其与相应的血清标记物抗体进行交联组装后，得到激发和发射光谱均位于近红外区的发光探针，减小了对蛋白质等生物分子的热损伤；同时消除了各种生物分子和水分子对检测结果的干扰，实现了检测体系的零背景信号干扰，通过与侧流试纸条技术联用，实现了对多种血清标记物(肌红蛋白、肌钙蛋白、降钙素原、糖化血红蛋白、HIV、乙肝和丙肝等)的高灵敏实时检测。
以本发明的近红外激发和发射的上转换发光材料制备的测流试纸条，其检测线性范围是0.05-50ng/mL，检测限为0.02ng/mL，线性范围也较宽，具有很强的适用性。对待测样品的体积要求少，检测所需时间短，能够实现床边检测，因此灵活性较强；不需要专业的人员进行操作，可用于医疗检测中。
附图说明
图1是本发明的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的结构示意图；
图2是实施例1在步骤一(d)得到的核β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm的透射电镜照片
图3是实施例1经步骤二(g)得到的核壳结构β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4的透射电镜照片；
图4是实施例1在步骤一(d)得到的核β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm和经步骤二(g)得到的核壳结构β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4的XRD衍射谱图如图；
图5是实施例1在步骤一(d)得到的核β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm和经步骤二(g)得到的核壳结构β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4在980nm激发下的发射光谱图；
图6用实施例1制备的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条测试不同PCT的浓度与测试结果的柱状图；
图7是用实施例1制备的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条测试的血清样品中PCT浓度与发光强度的关系曲线图；
图8是实施例1制备的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条检测结果与罗氏化学发光检测仪检测结果的回归分析结果图。
图9是实施例2、3、4、5制备的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条检测线的发射光谱图。
具体实施方式
具体实施方式一:本实施方式的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条由聚氯乙烯支撑背板1、检测垫2、结合垫3、样品垫4和吸收垫5组成；
其中检测垫2是由硝化纤维膜2-1及平行画在硝化纤维膜上的检测线2-2和控制线2-3组成；检测线2-2是用1～2mg/mL的血清标记物抗体画出的线，线宽为1～1.2mm，滴加体积量是1～1.2μL/cm；控制线2-3是用1～2mg/mL的IgG抗体溶液画出的线，线宽为1～1.2mm，滴加体积量是1～1.2μL/cm；
结合垫3是负载有结合抗体的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaYF4纳米晶探针和结合鼠IgG的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaYF4纳米晶探针；其中β-NaYF4:Yb,Tm@NaYF4是以NaYF4为壳、以β-NaYF4:Yb,Tm为核的核壳结构纳米晶，β-NaYF4:Yb,Tm是用Yb和Tm掺杂的β-NaYF4，Yb的掺杂摩尔百分数为10％～99.8％，Tm的掺杂摩尔百分数为0.2％～10％，Y、Yb和Tm三种元素的总摩尔百分数为100％；
检测垫2粘贴在聚氯乙烯支撑背板1的中部，在检测垫2的检测线2-2一侧，结合垫3与检测垫2搭接，样品垫4与结合垫3搭接；在检测垫2的控制线2-3一侧，吸收垫5与检测垫2搭接，结合垫3、样品垫4和吸收垫5也都粘贴在聚氯乙烯支撑背板1上。
本实施方式中Yb的掺杂摩尔百分数是指Yb元素占Y、Yb和Tm三种稀土元素的总物质的量的百分比，Tm的掺杂摩尔百分数是指Tm元素占Y、Yb和Tm三种稀土元素的总物质的量的百分比。Y、Yb和Tm三种元素的总摩尔百分数为100％，对于Yb掺杂99.8％和Tm掺杂0.2％这种极端的情况，即表示不加入Y元素。
具体实施方式二：具体实施方式一所述的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，按以下步骤进行：
一、制备核β-NaYF4:Yb,Tm，其中β-NaYF4:Yb,Tm中Yb元素的掺杂摩尔百分数为10％～99.8％，Tm元素的掺杂摩尔百分数为0.2％～10％：
a、按照β-NaYF4:Yb,Tm的化学计量比与Yb和Tm的掺杂浓度称取氯化钇、氯化镱、氯化铥、氟化铵和氢氧化钠；
b、先将氯化钇、氯化镱与氯化铥混合于容器中，再加入油酸(OA)与十八烯(ODE)，加热到150～180℃，保持30～50min，以去除其中的水分和氧气，冷却后，得到混合液；
c、将氢氧化钠和氟化铵溶于甲醇中，得到的溶液加入到步骤一得到的混合液中，室温保持30～50min，接着加热到70～100℃，保持30min，以去除其中的甲醇；接着加热到300～320℃，保持60-90min后，反应结束；
d、步骤c得到的液体自然降温后，转移到离心管中，加入乙醇超声震荡洗涤，再离心分离出固相物，重复乙醇震荡洗涤和离心分离操作2-3次，得到β-NaYF4:Yb,Tm，将β-NaYF4:Yb,Tm分散在正己烷中，得到β-NaYF4:Yb,Tm分散液；
二、核壳结构β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4的制备，其中X＝Y或Lu：
e、将氧化钇或氧化镥溶于体积百分浓度为50％的三氟乙酸水溶液中，加热到90～100℃使其全部溶解，持续通入氩气使溶液完全挥发，在三口烧瓶底部可以得到白色粉末，即为制得三氟乙酸稀土盐；
f、待三口烧瓶底部的白色粉末完全干燥后，加入步骤一(d)制备的β-NaYF4:Yb,Tm分散液、OA和ODE，在氩气保护下加热到120～150℃，保持30～60min，除去溶液中的氧气、水及正己烷，然后调整升温速率为12K·min-1加热到300～320℃，保持60～90min，停止反应；
g、待步骤f得到的溶液自然冷却到室温，加入乙醇震荡洗涤，再离心分离出固相物，重复乙醇震荡洗涤和离心分离操作2-3次，得到核壳结构β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4，将核壳结构β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4分散在正己烷中，得到β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4分散液，其中X＝Y或Lu；
三、组装稀土上转换发光探针：
h、将β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4分散液和NOBF4的DMF溶液混合振荡，得到混合液；静置5～10min后再离心分离出固相沉淀，将固相沉淀再分散在DMF中，得到β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4的DMF分散液；
i、按β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4的DMF分散液中β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4与聚丙烯酸(PAA)的摩尔比为1：(50～60)，向β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4的DMF分散液中加入PAA，加热到80～100℃并保持30～60min，然后加入丙酮，静置后离心分离，将沉淀分散到水中，得到PAA包覆的纳米晶的水分散液；
j、向PAA包覆的纳米晶的水分散液中加入EDC溶液和NHS溶液，其中水分散液中PAA包覆的纳米晶与EDC的摩尔比为1：(120～130)，水分散液中PAA包覆的纳米晶与NHS的摩尔比为1：(25～35)，升温至37℃的条件下反应4h后，离心分离，将固相沉淀再分散在水中，得到活化的PAA包覆的纳米晶分散液；
k、取活化的PAA包覆的纳米晶分散液，加入血清标记物抗体溶液，其中活化的PAA包覆的纳米晶分散液中的活化的PAA包覆的纳米晶与血清标记物抗体的摩尔比为1：(50～60)，在37℃的条件下反应6h后，离心分离，将固相沉淀再分散在水中，得到结合抗体的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针的水分散液；
l、取活化的PAA包覆的纳米晶分散液，加入鼠IgG溶液，其中活化的PAA包覆的纳米晶分散液中的活化的PAA包覆的纳米晶与鼠IgG的摩尔比为1:60，在37℃的条件下反应6h后，离心分离，将固相沉淀再分散在水中，得到结合鼠IgG的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针的水分散液；
四、组装基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条：
m、以Tris缓冲液为溶剂，以S9表面活性剂、酪蛋白、PVP-K30、Tween-20为溶质配制混合溶液，将玻璃纤维膜在混合溶液中浸泡2～4h，干燥，得到样品垫4；
n、用浓度为10mmol/L的柠檬酸钠缓冲液为溶剂，以蔗糖、结合抗体的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针的水分散液、结合鼠IgG的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针的水分散液为溶质配制探针溶液；探针溶液中，蔗糖的质量百分浓度为1％～1.2％，结合抗体的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针的水分散液的体积百分浓度为10％～50％，结合鼠IgG的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针的体积百分浓度为10％～30％；将玻璃纤维膜在探针溶液中浸泡，然后在45～50℃下干燥，得到结合垫3；
o、用1～2mg/mL的血清标记物抗体溶液按滴加体积量是1～1.2μL/cm在硝化纤维膜上画出宽度是1～1.2mm的画线，得到检测线2-2；再用1～2mg/mL的鼠IgG抗体溶液按滴加体积量是1～1.2μL/cm在硝化纤维膜上画出平行于检测线的宽度是1～1.2mm的画线，得到控制线2-3，得到检测垫2；
p、将检测垫2粘贴在聚氯乙烯支撑背板1的中部，在检测垫2的检测线2-2一侧，将结合垫3粘贴在聚氯乙烯支撑背板1上，并使结合垫3与检测垫2搭接，样品垫4粘贴在聚氯乙烯支撑背板1上并使样品垫4与结合垫3搭接；在检测垫2的控制线2-3一侧，将吸收垫5粘贴在聚氯乙烯支撑背板1上并使吸收垫5与检测垫2搭接，得到基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条。
本实施方式中，EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，NHS为N-羟基琥珀酰亚胺，PVP-K30为聚乙烯吡咯烷酮-K30，Tween-20为吐温-20。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤一(b)中氯化钇、氯化镱与氯化铥的总的物质的量与油酸的体积比为1mmol：(6～10)mL；氯化钇、氯化镱与氯化铥的总的物质的量与十八烯的体积比为1mmol：(12～15)mL。其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是步骤一(d)k中β-NaYF4:Yb,Tm分散液中β-NaYF4:Yb,Tm的浓度为10～20mg/mL；。其它与具体实施方式二或三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是步骤二(e)中氧化钇的物质的量与体积百分浓度为50％的三氟乙酸水溶液的体积的比为1mmol：(15～20)mL。其它与具体实施方式二至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一不同的是步骤二(f)中β-NaYF4:Yb,Tm分散液中β-NaYF4:Yb,Tm的质量与油酸的体积比为1mg：(0.1～0.2)mL；β-NaYF4:Yb,Tm分散液中β-NaYF4:Yb,Tm的质量与十八烯的体积比为1mg：(0.15～0.3)mL。其它与具体实施方式二至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二至六之一不同的是步骤三(h)中NOBF4的DMF溶液的浓度为1～2mg/mL。其它与具体实施方式二至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式二至七之一不同的是步骤三(h)中β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4分散液中β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4与NOBF4的摩尔比为1：(90～110)。其它与具体实施方式二至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式二至八之一不同的是步骤三(h)中混合液、正己烷与甲苯的体积比为1:(1～1.1):(1～1.1)。其它与具体实施方式二至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式二至九之一不同的是步骤三(k)中得到的水分散液中结合抗体的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶的浓度为2～3mg/mL。其它与具体实施方式二至九之一相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式二至十之一不同的是步骤三(l)中得到的水分散液中结合鼠IgG的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶的浓度为2～3mg/mL。其它与具体实施方式二至十之一相同。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式二至十一之一不同的是步骤一(d)、步骤二(g)中所述的离心分离是在6000-8000rpm K·min-1的条件下离心5～10min。其它与具体实施方式二至十一之一相同。
具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式二至十二之一不同的是步骤三(h)、(i)、(j)、(k)、(l)中所述的离心分离是在10000rpmK.min-1离心10min。其它与具体实施方式二至十二之一相同。
具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式二至十三之一不同的是步骤四(m)中所述的Tris缓冲液是浓度为20mmol/L、pH＝8.0的。其它与具体实施方式二至十三之一相同。
具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式二至十三之一不同的是步骤四(m)中酪蛋白的质量浓度为0.05％～0.06％、PVP-K30的质量浓度为0.3％～0.4％、Tween-20的质量浓度为0.05％～0.06％。其它与具体实施方式二至十三之一相同。
具体实施方式十六：具体实施方式一所述的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的使用方法是：将血清样品按(2～3)：1的比例用Tris缓冲溶液进行稀释，然后取50～150μL滴加到侧流试纸条的样品层上，静置10～20min，然后通过980nm的激光对侧流试纸条的检测线和控制线进行发射光谱测试，采集控制线和检测线在800nm处的发射光谱强度，首先观察控制线处的发光情况，如果控制线处无发光，则产品失效；如果控制线处有发光，再观察检测线处的发光情况，如果检测线处无发光，则待测样品中不含相应的血清标记物；如果检测线处有发光，则待测样品中含有相应的血清标记物。
具体实施方式十七：本实施方式与具体实施方式十六不同的是：血清标记物的定量检测是根据测出的检测线的发光强度与检测标准曲线对比，定量得到血清中标记物的浓度。其它与具体实施方式十六相同。
用以下的试验验证本发明的有益的效果：
实施例1：本实施例的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，按以下步骤进行：
一、制备核β-NaYF4:Yb,Tm，其中β-NaYF4:Yb,Tm中Yb元素以摩尔百分比计的掺杂浓度为30％，Tm元素以摩尔百分比计的掺杂浓度为0.5％，记为β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm：
a、按照β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm的化学计量比与Yb和Tm的掺杂浓度称取0.2060gYCl3.6H2O、0.1162g YbCl3.6H2O、0.0018g TmCl3.6H2O、将0.1g氢氧化钠和0.1481g氟化铵；
b、先将YCl3.6H2O、YbCl3.6H2O、TmCl3.6H2O混合于250mL的三口烧瓶中，再加入10mL油酸(OA)与15mL十八烯(ODE)，加热到160℃，保持30min，以去除其中的水分和氧气，冷却后，得到混合液；
c、将氢氧化钠和氟化铵溶于10mL甲醇中，得到的溶液加入到步骤一得到的混合液中，室温保持40min，接着加热到80℃，保持30min，以去除其中的甲醇；接着加热到310℃，保持80min后，反应结束；
d、步骤c得到的液体自然降温后，转移到离心管中，加入乙醇，并超声震荡离心管，以6000rpmK·min-1离心5min，重复乙醇洗涤和离心操作3次，得到β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm，将β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm分散在10mL正己烷中，得到β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm分散液；
二、核壳结构β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4的制备：
e、将0.5mmol氧化钇溶于10mL体积百分浓度为50％的三氟乙酸水溶液中，加热到90℃使其全部溶解，持续通入氩气使溶液完全挥发，在三口烧瓶底部可以得到白色粉末，即为制得三氟乙酸稀土盐；
f、待三口烧瓶底部的白色粉末完全干燥后，加入步骤一(d)制备的含β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm为0.5mmol的β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm分散液、10mL OA和10mL ODE，在氩气保护下加热到140℃，保持40min，除去溶液中的氧气、水及正己烷，然后调整升温速率为12K·min-1加热到320℃，保持60min，停止反应；
g、待步骤f得到的溶液自然冷却到室温，加入过量乙醇以8000rpm K·min-1离心5min，重复乙醇洗涤和离心操作3次，得到核壳结构β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4，将核壳结构β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4分散在10mL正己烷中，得到β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4分散液；
三、组装稀土上转换发光探针：
h、将2mLβ-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4分散液和5mL NOBF4的DMF溶液混合振荡，得到混合液；其中NOBF4的DMF溶液的浓度为1mg/mL，然后向混合液中加入7mL正己烷和7mL甲苯，静置5min，再以10000rpm K.min-1离心10min，将固相沉淀再分散在5mL DMF中，得到β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4的DMF分散液；
i、向β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4的DMF分散液中加入300mg PAA，加热到90℃并保持50min，然后加入10mL丙酮，静置后离心分离，将沉淀分散到5mL水中，得到PAA包覆的纳米晶的水分散液；
j、向PAA包覆的纳米晶的水分散液中加入1mL浓度为1M的EDC溶液和0.25mL浓度为1M的NHS溶液，升温至37℃的条件下反应4h后，以10000rpm K.min-1离心10min，将固相沉淀再分散在水中，得到活化的PAA包覆的纳米晶分散液；
k、取活化的PAA包覆的纳米晶分散液，加入PCT抗体溶液，其中活化的PAA包覆的纳米晶分散液中的活化的PAA包覆的纳米晶与PCT抗体的摩尔比为1:60，在37℃的条件下反应6h后，以10000rpm K.min-1离心10min，将固相沉淀再分散在水中，得到结合PCT抗体的上转换β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4纳米晶探针的水分散液；
l、取活化的PAA包覆的纳米晶分散液，加入鼠IgG溶液，其中活化的PAA包覆的纳米晶分散液中的活化的PAA包覆的纳米晶与鼠IgG的摩尔比为1:60，在37℃的条件下反应6h后，以10000rpm K.min-1离心10min，将固相沉淀再分散在水中，得到结合鼠IgG的上转换β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4纳米晶探针的水分散液；
四、组装基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条：
m、以20mM、pH＝8.0的Tris缓冲液为溶剂，按S9表面活性剂的质量浓度为0.5％、酪蛋白的质量浓度为0.05％、PVP-K30的质量浓度为0.3％、Tween-20的质量浓度为0.05％，以S9表面活性剂、酪蛋白、PVP-K30、Tween-20为溶质配制混合溶液；
n、用浓度为10mmol/L的柠檬酸钠缓冲液为溶剂，以蔗糖、结合PCT抗体的上转换β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4纳米晶探针的水分散液、结合鼠IgG的上转换β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4纳米晶探针的水分散液为溶质配制探针溶液；探针溶液中，蔗糖的质量百分浓度为1％，结合抗体的上转换β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4纳米晶探针的水分散液的体积百分浓度为30％，结合鼠IgG的上转换β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4纳米晶探针的水分散液的体积百分浓度为20％；将玻璃纤维膜在探针溶液中浸泡，然后在45℃下干燥，得到结合垫3；
o、用2mg/mL的血清标记物抗体溶液按滴加体积量是1μL/cm在硝化纤维膜上画出宽度是1mm画线，得到检测线；再用2mg/mL的IgG抗体溶液按滴加体积量是1μL/cm在硝化纤维膜上画出平行于检测线宽度是1mm画线，得到控制线，得到检测垫2；
p、将检测垫2粘贴在聚氯乙烯支撑背板1的中部，在检测垫2的检测线2-2一侧，将结合垫3粘贴在聚氯乙烯支撑背板1上，并使结合垫3与检测垫2搭接，样品垫4粘贴在聚氯乙烯支撑背板1上并使样品垫4与结合垫3搭接；在检测垫2的控制线2-3一侧，将吸收垫5粘贴在聚氯乙烯支撑背板1上并使吸收垫5与检测垫2搭接，得到基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条。
本实施例的在步骤一(d)得到的核β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm的透射电镜照片如图2示，从图2以看出，该核β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm为单分散的纳米晶，粒径均一，圆形粒子，直径为26nm；
本实施例经步骤二(g)得到的核壳结构β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4的透射电镜照片如图3所示，从图3可以看出，核壳结构β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4的直径为30nm。
本实施例的在步骤一(d)得到的核β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm和经步骤二(g)得到的核壳结构β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4的XRD衍射谱图如图4示，从图4以看出，β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm和β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4都是六方相的晶相结构。
本实施例的在步骤一(d)得到的核β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm和经步骤二(g)得到的核壳结构β-NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4在980nm激发下的发射光谱图如图5所示，从图5可以看出，通过壳层包覆发光有了数倍的增强。
本实施例制备的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的使用方法是：将血清样品按7：3的比例用浓度为20mmol/L、pH＝8.0的Tris缓冲溶液进行稀释并加入抗凝剂肝素，然后取100μL滴加到侧流试纸条的样品层上，静置15min，然后通过980nm的激光对侧流试纸条的检测线和控制线进行发射光谱测试，采集控制线和检测线在800nm处的发射光谱强度，首先观察控制线处的发光情况，控制线处有发光，再观察检测线处的发光情况，检测线处有发光，则待测样品中含有相应的血清标记物，根据测的的发光强度与检测标准曲线对比，定量得到血清中标记物的浓度。
下面测试本实施例制备的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的检测限，具体方法如下：
一、准备不含有降钙素原(PCT)的血清样品和按PCT的浓度为0.02ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、5ng/mL将PCT添加到不含PCT的血清样品中，得到一系列的血清样品；
二、将各个血清样品按7：3的比例用浓度为20mmol/L、pH＝8.0的Tris缓冲溶液进行稀释并加入抗凝剂肝素，然后取100μL滴加到侧流试纸条的样品层上，静置15min，然后通过980nm的激光对侧流试纸条的检测线和控制线进行发射光谱测试，采集检测线在800nm处的发射光谱强度，各样品的PCT浓度与测试结果的柱状图如图6所示。从图6可以看出，该侧流试纸条的检测限为0.02ng/mL。
测试本实施例制备的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的PCT的检测标准曲线，具体步骤是：
一、准备不含有降钙素原(PCT)的血清样品和添加不同质量的PCT的血清样品，得到一系列的血清样品；
二、将每个血清样品按7：3的比例用浓度为20mmol/L、pH＝8.0的Tris缓冲溶液进行稀释并加入抗凝剂肝素，然后取100μL滴加到侧流试纸条的样品层上，静置15min，然后通过980nm的激光对侧流试纸条的检测线和控制线进行发射光谱测试，采集控制线和检测线在800nm处的发射光谱强度，首先观察控制线处的发光情况，控制线处有发光，再观察检测线处的发光情况，检测线处有发光，记录检测线处的发光强度，得到的血清样品中PCT浓度与发光强度的关系曲线如图7所示，从图7可以看出，该侧流试纸条的检测结果呈良好的线性，其检测线性范围是0.05-50ng/mL。
将本实施例制备的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条进行了临床对比实验，取50份临床标本血清试纸条检测结果与罗氏化学发光检测仪进行了比对。结果表明两组数据之间的回归分析结果如图8所示，结果显示其线性相关性很好，相关系数达到0.93039，说明本实施例的侧流试纸条检测结果具有良好的准确性。
将本实施例制备的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条进行了加标回收率实验测试，结果显示回收率范围为86％-127.2％，变异系数为：6.0％-9.6％。说明该方法的可靠性较好。
表1.系统的加标回收率实验
PCT(ng/mL) 测量值(ng/mL) 回收率(％) CV(％
0.3 0.29 96.7 8.9
3.5 3.01 86 9.6
10.0 12.72 127.2 6.0
将本实施例制备的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条与其他常用的方法在各个方面进行了性能的比较。本方法检出限和最低定量限达到了较低的水平，线性范围也较宽，具有很强的适用性。对待测样品的体积要求少，如今还没有商品化，因此具有较强的商品化价值。检测所需时间最少，能够实现床边检测，因此灵活性较强；不需要专业的人员进行操作，具有极大的市场化应用前景。
实施例2：本实施例与实施例1不同的是步骤一制备的核β-NaYF4:Yb,Tm中Yb元素以摩尔百分比计的掺杂浓度为50％，Tm元素以摩尔百分比计的掺杂浓度为2％，记为β-NaYF4:50％Yb,2％Tm：
a、按照β-NaYF4:50％Yb,2％Tm的化学计量比与Yb和Tm的掺杂浓度称取0.1457gYCl3.6H2O、0.1938g YbCl3.6H2O、0.0076g TmCl3.6H2O、0.1g氢氧化钠和0.1482g氟化铵；
b、先将YCl3.6H2O、YbCl3.6H2O、TmCl3.6H2O混合于250mL的三口烧瓶中，再加入10mL油酸(OA)与15mL十八烯(ODE)，加热到160℃，保持30min，以去除其中的水分和氧气，冷却后，得到混合液；
c、将氢氧化钠和氟化铵溶于10mL甲醇中，得到的溶液加入到步骤一得到的混合液中，室温保持40min，接着加热到80℃，保持30min，以去除其中的甲醇；接着加热到310℃，保持80min后，反应结束；
d、步骤c得到的液体自然降温后，转移到离心管中，加入乙醇，并超声震荡离心管，以6000rpm K·min-1离心5min，重复乙醇洗涤和离心操作3次，得到β-NaYF4:50％Yb,2％Tm，将β-NaYF4:50％Yb,2％Tm分散在10mL正己烷中，得到β-NaYF4:50％Yb,2％Tm分散液；
其它步骤与参数与实施例1相同。
实施例3：本实施例与实施例1不同的是步骤一制备的核β-NaYF4:Yb,Tm中Yb元素以摩尔百分比计的掺杂浓度为60％，Tm元素以摩尔百分比计的掺杂浓度为5％，记为β-NaYF4:60％Yb,5％Tm：
a、按照β-NaYF4:60％Yb,5％Tm的化学计量比与Yb和Tm的掺杂浓度称取0.1062gYCl3.6H2O、0.2325g YbCl3.6H2O、0.0192g TmCl3.6H2O、0.1g氢氧化钠和0.1482g氟化铵；
b、先将YCl3.6H2O、YbCl3.6H2O、TmCl3.6H2O混合于250mL的三口烧瓶中，再加入10mL油酸(OA)与15mL十八烯(ODE)，加热到160℃，保持30min，以去除其中的水分和氧气，冷却后，得到混合液；
c、将氢氧化钠和氟化铵溶于10mL甲醇中，得到的溶液加入到步骤一得到的混合液中，室温保持40min，接着加热到80℃，保持30min，以去除其中的甲醇；接着加热到310℃，保持80min后，反应结束；
d、步骤c得到的液体自然降温后，转移到离心管中，加入乙醇，并超声震荡离心管，以6000rpm K·min-1离心5min，重复乙醇洗涤和离心操作3次，得到β-NaYF4:60％Yb,5％Tm，将β-NaYF4:60％Yb,5％Tm分散在10mL正己烷中，得到β-NaYF4:60％Yb,5％Tm分散液；
其它步骤与参数与实施例1相同。
实施例4：本实施例与实施例1不同的是步骤一制备的核β-NaYF4:Yb,Tm中Yb元素以摩尔百分比计的掺杂浓度为80％，Tm元素以摩尔百分比计的掺杂浓度为7％，记为β-NaYF4:80％Yb,7％Tm：
a、按照β-NaYF4:80％Yb,7％Tm的化学计量比与Yb和Tm的掺杂浓度称取0.0395gYCl3.6H2O、0.3100g YbCl3.6H2O、0.0268g TmCl3.6H2O、0.1g氢氧化钠和0.1482g氟化铵；
b、先将YCl3.6H2O、YbCl3.6H2O、TmCl3.6H2O混合于250mL的三口烧瓶中，再加入10mL油酸(OA)与15mL十八烯(ODE)，加热到160℃，保持30min，以去除其中的水分和氧气，冷却后，得到混合液；
c、将氢氧化钠和氟化铵溶于10mL甲醇中，得到的溶液加入到步骤一得到的混合液中，室温保持40min，接着加热到80℃，保持30min，以去除其中的甲醇；接着加热到310℃，保持80min后，反应结束；
d、步骤c得到的液体自然降温后，转移到离心管中，加入乙醇，并超声震荡离心管，以6000rpm K·min-1离心5min，重复乙醇洗涤和离心操作3次，得到β-NaYF4:80％Yb,7％Tm，将β-NaYF4:80％Yb,7％Tm分散在10mL正己烷中，得到β-NaYF4:80％Yb,7％Tm分散液；
其它步骤与参数与实施例1相同。
实施例5：本实施例与实施例1不同的是步骤一制备的核β-NaYF4:Yb,Tm中Yb元素以摩尔百分比计的掺杂浓度为99.8％，Tm元素以摩尔百分比计的掺杂浓度为0.2％，无Y元素，记为β-NaYbF4:2％Tm：
a、按照β-NaYbF4:2％Tm的化学计量比与Tm的掺杂浓度称取0.3800gYbCl3.6H2O、0.0076g TmCl3.6H2O、0.1g氢氧化钠和0.1482g氟化铵；
b、先将YbCl3.6H2O、TmCl3.6H2O混合于250mL的三口烧瓶中，再加入10mL油酸(OA)与15mL十八烯(ODE)，加热到160℃，保持30min，以去除其中的水分和氧气，冷却后，得到混合液；
c、将氢氧化钠和氟化铵溶于10mL甲醇中，得到的溶液加入到步骤一得到的混合液中，室温保持40min，接着加热到80℃，保持30min，以去除其中的甲醇；接着加热到310℃，保持80min后，反应结束；
d、步骤c得到的液体自然降温后，转移到离心管中，加入乙醇，并超声震荡离心管，以6000rpmK·min-1离心5min，重复乙醇洗涤和离心操作3次，得到β-NaYF4:50％Yb,2％Tm，将β-NaYF4:50％Yb,2％Tm分散在10mL正己烷中，得到β-NaYF4:50％Yb,2％Tm分散液；
其它步骤与参数与实施例1相同。
实施例2、3、4和5制备的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条进行血清样品中PCT的检测，方法如下：每个血清样品按7：3的比例用浓度为20mmol/L、pH＝8.0的Tris缓冲溶液进行稀释并加入抗凝剂肝素，然后取100μL滴加到侧流试纸条的样品层上，静置15min，然后通过980nm的激光对侧流试纸条的检测线和控制线进行发射光谱测试，采集控制线和检测线在800nm处的发射光谱强度，首先观察控制线处的发光情况，控制线处有发光，再观察检测线处的发光情况，检测线处有发光，记录检测线处的发射光谱，实施例2、3、4和5制备的侧流试纸条检测线的发射光谱图如图9所示，从图9可以看出，实施例2、3、4和5制备的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条，都能通过检测线的发射光谱来判定血清样品中存在PCT。
实施例2、3、4和5制备的基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条，与实施例1相比，上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaYF4纳米晶中的核中稀土元素的掺杂量不同，但制备的侧流试纸条在使用时，均可以通过检测线处的发光情况，判断待测样品中含有的相应的血清标记物情况。也可以根据测得的发光强度与检测标准曲线对比，定量得到血清中标记物的浓度。

Claims (10)

1.一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条，其特征在于该侧流试纸条由聚氯乙烯支撑背板(1)、检测垫(2)、结合垫(3)、样品垫(4)和吸收垫(5)组成；
其中检测垫(2)是由硝化纤维膜(2-1)及平行画在硝化纤维膜上的检测线(2-2)和控制线(2-3)组成；检测线(2-2)是用1～2mg/mL的血清标记物抗体画出的线，线宽为1～1.2mm，滴加体积量是1～1.2μL/cm；控制线(2-3)是用1～2mg/mL的IgG抗体溶液画出的线，线宽为1～1.2mm，滴加体积量是1～1.2μL/cm；
结合垫(3)是负载有结合抗体的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针和结合鼠IgG的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针；其中β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4是以NaXF4为壳、以β-NaYF4:Yb,Tm为核的核壳结构纳米晶，β-NaYF4:Yb,Tm是用Yb和Tm掺杂的β-NaYF4，Yb的掺杂摩尔百分数为10％～99.8％，Tm的掺杂摩尔百分数为0.2％～10％；其中X为Y元素或Lu元素；
检测垫(2)粘贴在聚氯乙烯支撑背板(1)的中部，在检测垫(2)的检测线(2-2)一侧，结合垫(3)与检测垫(2)搭接，样品垫(4)与结合垫(3)搭接；在检测垫(2)的控制线(2-3)一侧，吸收垫(5)与检测垫(2)搭接，结合垫(3)、样品垫(4)和吸收垫(5)也都粘贴在聚氯乙烯支撑背板(1)上。
2.一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、制备核β-NaYF4:Yb,Tm，其中β-NaYF4:Yb,Tm中Yb元素的掺杂摩尔百分数为10％～99.8％，Tm元素的掺杂摩尔百分数为0.2％～10％：
a、按照β-NaYF4:Yb,Tm的化学计量比与Yb和Tm的掺杂浓度称取氯化钇、氯化镱、氯化铥、氟化铵和氢氧化钠；
b、先将氯化钇、氯化镱与氯化铥混合于容器中，再加入油酸(OA)与十八烯(ODE)，加热到150～180℃，保持30～50min，以去除其中的水分和氧气，冷却后，得到混合液；
c、将氢氧化钠和氟化铵溶于甲醇中，得到的溶液加入到步骤一得到的混合液中，室温保持30～50min，接着加热到70～100℃，保持30min，以去除其中的甲醇；接着加热到300～320℃，保持60-90min后，反应结束；
d、步骤c得到的液体自然降温后，转移到离心管中，加入乙醇超声震荡洗涤，再离心分离出固相物，重复乙醇震荡洗涤和离心分离操作2-3次，得到β-NaYF4:Yb,Tm，将β-NaYF4:Yb,Tm分散在正己烷中，得到β-NaYF4:Yb,Tm分散液；
二、核壳结构β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4的制备，其中X＝Y或Lu：
e、将氧化钇或氧化镥溶于体积百分浓度为50％的三氟乙酸水溶液中，加热到90～100℃使其全部溶解，持续通入氩气使溶液完全挥发，在三口烧瓶底部可以得到白色粉末，即为制得三氟乙酸稀土盐；
f、待三口烧瓶底部的白色粉末完全干燥后，加入步骤一(d)制备的β-NaYF4:Yb,Tm分散液、OA和ODE，在氩气保护下加热到120～150℃，保持30～60min，除去溶液中的氧气、水及正己烷，然后调整升温速率为12K·min-1加热到300～320℃，保持60～90min，停止反应；
g、待步骤f得到的溶液自然冷却到室温，加入乙醇震荡洗涤，再离心分离出固相物，重复乙醇震荡洗涤和离心分离操作2-3次，得到核壳结构β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4，将核壳结构β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4分散在正己烷中，得到β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4分散液；其中X＝Y或Lu；
三、组装稀土上转换发光探针：
h、将β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4分散液和NOBF4的DMF溶液混合振荡，得到混合液；静置5～10min后再离心分离出固相沉淀，将固相沉淀再分散在DMF中，得到β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4的DMF分散液；
i、按β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4的DMF分散液中β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4与聚丙烯酸的摩尔比为1：(50～60)，向β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4的DMF分散液中加入PAA，加热到80～100℃并保持30～60min，然后加入丙酮，静置后离心分离，将沉淀分散到水中，得到PAA包覆的纳米晶的水分散液；
j、向PAA包覆的纳米晶的水分散液中加入EDC溶液和NHS溶液，其中水分散液中PAA包覆的纳米晶与EDC的摩尔比为1：(120～130)，水分散液中PAA包覆的纳米晶与NHS的摩尔比为1：(25～35)，升温至37℃的条件下反应4h后，离心分离，将固相沉淀再分散在水中，得到活化的PAA包覆的纳米晶分散液；
k、取活化的PAA包覆的纳米晶分散液，加入血清标记物抗体溶液，其中活化的PAA包覆的纳米晶分散液中的活化的PAA包覆的纳米晶与血清标记物抗体的摩尔比为1：(50～60)，在37℃的条件下反应6h后，离心分离，将固相沉淀再分散在水中，得到结合抗体的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针的水分散液；
l、取活化的PAA包覆的纳米晶分散液，加入鼠IgG溶液，其中活化的PAA包覆的纳米晶分散液中的活化的PAA包覆的纳米晶与鼠IgG的摩尔比为1:60，在37℃的条件下反应6h后，离心分离，将固相沉淀再分散在水中，得到结合鼠IgG的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针的水分散液；
四、组装基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条：
m、以Tris缓冲液为溶剂，以S9表面活性剂、酪蛋白、PVP-K30、Tween-20为溶质配制混合溶液，将玻璃纤维膜在混合溶液中浸泡2～4h，干燥，得到样品垫(4)；
n、用浓度为10mmol/L的柠檬酸钠缓冲液为溶剂，以蔗糖、结合抗体的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaYF4纳米晶探针的水分散液、结合鼠IgG的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针的水分散液为溶质配制探针溶液；探针溶液中，蔗糖的质量百分浓度为1％～1.2％，结合抗体的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针的水分散液的体积百分浓度为10％～50％，结合鼠IgG的上转换β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4纳米晶探针的体积百分浓度为10％～30％；将玻璃纤维膜在探针溶液中浸泡，然后在45～50℃下干燥，得到结合垫(3)；
o、用1～2mg/mL的血清标记物抗体溶液按滴加体积量是1～1.2μL/cm在硝化纤维膜上画出宽度是1～1.2mm的画线，得到检测线(2-2)；再用1～2mg/mL的鼠IgG抗体溶液按滴加体积量是1～1.2μL/cm在硝化纤维膜上画出平行于检测线的宽度是1～1.2mm的画线，得到控制线(2-32)，得到检测垫(2)；
p、将检测垫(2)粘贴在聚氯乙烯支撑背板(1)的中部，在检测垫(2)的检测线(2-2)一侧，将结合垫(3)粘贴在聚氯乙烯支撑背板(1)上，并使结合垫(3)与检测垫(2)搭接，样品垫(4)粘贴在聚氯乙烯支撑背板(1)上并使样品垫(4)与结合垫(3)搭接；在检测垫(2)的控制线(2-32)一侧，将吸收垫(5)粘贴在聚氯乙烯支撑背板(1)上并使吸收垫(5)与检测垫(2)搭接，得到基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条。
3.根据权利要求2所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，其特征在于步骤一(b)中氯化钇、氯化镱与氯化铥的总的物质的量与油酸的体积比为1mmol：(6～10)mL；氯化钇、氯化镱与氯化铥的总的物质的量与十八烯的体积比为1mmol：(12～15)mL。
4.根据权利要求2或3所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，其特征在于具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是步骤一(d)k中β-NaYF4:Yb,Tm分散液中β-NaYF4:Yb,Tm的浓度为10～20mg/mL；。其它与具体实施方式二或三相同。
5.根据权利要求2或3所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，其特征在于步骤二(e)中氧化钇的物质的量与体积百分浓度为50％的三氟乙酸水溶液的体积的比为1mmol：(15～20)mL。
6.根据权利要求2或3所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，其特征在于步骤二(f)中β-NaYF4:Yb,Tm分散液中β-NaYF4:Yb,Tm的质量与油酸的体积比为1mg：(0.1～0.2)mL；β-NaYF4:Yb,Tm分散液中β-NaYF4:Yb,Tm的质量与十八烯的体积比为1mg：(0.15～0.3)mL。
7.根据权利要求2或3所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，其特征在于步骤三(h)中NOBF4的DMF溶液的浓度为1～2mg/mL。
8.根据权利要求2或3所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的制备方法，其特征在于步骤三(h)中β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4分散液中β-NaYF4:Yb,Tm@NaXF4与NOBF4的摩尔比为1：(90～110)。
9.一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的使用方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：将血清样品按(2～3)：1的比例用Tris缓冲溶液进行稀释，然后取50～150μL滴加到侧流试纸条的样品层上，静置10～20min，然后通过980nm的激光对侧流试纸条的检测线和控制线进行发射光谱测试，采集控制线和检测线在800nm处的发射光谱强度，首先观察控制线处的发光情况，如果控制线处无发光，则产品失效；如果控制线处有发光，再观察检测线处的发光情况，如果检测线处无发光，则待测样品中不含相应的血清标记物；如果检测线处有发光，则待测样品中含有相应的血清标记物。
10.根据权利要求9所述的一种基于近红外激发和发射的血清标记物发光检测的侧流试纸条的使用方法，其特征在于血清标记物的定量检测是根据测出的检测线的发光强度与检测标准曲线对比，定量得到血清中标记物的浓度。
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